Summary
Здесь мы представляем протокол к модели людских туберкулезом в взрослых рыбок данио, используя свой естественный возбудитель Mycobacterium marinum. Извлечения ДНК и РНК от внутренних органов зараженных данио рерио может использоваться для показывают, что всего микобактериальной загружает в рыбы и хозяина иммунной реакции с ПЦР.
Abstract
Микобактерии туберкулеза в настоящее время смертоносных человеческий патоген, вызывая 1,7 миллиона смертей и 10,4 миллиона инфекций каждый год. Воздействие эта бактерия вызывает широкий болезни спектра в организме человека, начиная от стерилизованные инфекции активно прогрессирующей смертельной болезни. Наиболее распространенной формой является латентный туберкулез, который протекает бессимптомно, но имеет потенциал, чтобы активировать в молниеносный заболевание. Взрослый данио рерио и его природного патогена Mycobacterium marinum недавно оказались применимыми модель для изучения заболевание широкий спектр туберкулеза. Важно отметить, что спонтанное задержки и возобновления, а также адаптивного иммунного ответа в контексте микобактериальной инфекции могут быть изучены в этой модели. В этой статье мы описываем методы для экспериментальной инфекции взрослых рыбок данио, коллекции внутренних органов для извлечения нуклеиновых кислот для измерения микобактериальной нагрузок и принимающих иммунные реакции путем количественного PCR. В-дом-развитых, м. marinum -конкретного ПЦР анализа более чувствительны, чем традиционных покрытий методами, как он также обнаруживает ДНК от-деления, спящие или недавно мертвых микобактерий. Как ДНК и РНК извлекаются из того же лица, это возможно для изучения взаимосвязи между состояние больного и хозяин и возбудителя экспрессии генов. Взрослый zebrafish модель для туберкулеза таким образом позиционирует себя как очень применимо, не млекопитающих в естественных условиях системы для изучения взаимодействия хост патогена.
Introduction
Данио рерио (Danio рерио) широко используется модель животных в биомедицинских исследованиях и это принятой модели для общей биологии позвоночных. Данио рерио была адаптирована для многих областях исследований, моделирования человеческих заболеваний и расстройств, начиная от1 рак и болезни сердца2 инфекции и иммунологических исследований ряда бактериальных 3 и вирусных инфекций4 , 5. Кроме того, бывший внутриутробное развитие зародышей данио рерио сделал данио рерио популярная модель в биологии развития6 и токсикологии7,,8.
Во многих областях исследований, включая инфекции биологии оптически прозрачные данио рерио личинки обычно используются. Первый иммунные клетки появляются в течение 24 ч пост оплодотворение (hpf), когда примитивные макрофаги обнаружены9. Нейтрофилы являются следующий иммунные клетки появляться около 33 hpf10. Данио рерио личинки таким образом целесообразно для изучения на ранних стадиях инфекции и роль врожденного иммунитета при отсутствии адаптивных иммунные клетки11. Однако взрослые данио рерио с ее полностью функциональный адаптивной иммунной системы обеспечивает дополнительный уровень сложности для инфекции экспериментов. Т-клетки могут быть обнаружены вокруг 3 дней после оплодотворения12, и B клетки способны производить функциональных антител 4 недели поста оплодотворение13. Взрослый данио рерио обладает всеми основными партнерами врожденного и адаптивного иммунной системе млекопитающих. Основные различия между immune systems рыбы и люди находятся в антитела изотипов, а также Анатомия лимфоидной ткани. Данио рерио имеет только три антитела классов14, тогда как люди имеют пять15. В отсутствие лимфатических узлов и костного мозга первичных лимфоидных органов рыб являются почки и тимуса16 и селезенка, почки и кишечник служат в качестве вторичных лимфоидных органов17. Несмотря на эти различия, с его полной иммунной Арсенал врожденного и адаптивного клеток взрослых рыбок данио — весьма возможно, easy-to-use, не млекопитающих модель для исследования взаимодействия хост патогена.
Данио рерио в последнее время был создан как возможно модель для изучения туберкулеза18,19,20,21,22. Бортовых заболевание, вызываемое микобактериями туберкулезаявляется туберкулез. По данным Всемирной организации здравоохранения туберкулеза умерли1,7 миллионов в 2016 году и является ведущей причиной смерти во всем мире один возбудитель23. Мышей24,25, кроликов26 и27 нечеловеческих приматов являются наиболее известных животных моделей исследования туберкулеза, но каждое лицо их ограничения. Нечеловеческих приматов модель микобактерий инфекции напоминает человеческие заболевания наиболее тесно, но с помощью этой модели ограничена из-за серьезных этических соображений. Другие животные модели препятствуют хост специфика микобактерий туберкулеза , которая влияет на заболевания патология. Вероятно, самая большая проблема в моделировании туберкулеза является широкий спектр инфекции и болезни результатов в заболеваний человека: туберкулез является болезнью весьма неоднородной, начиная от стерилизации иммунитет к скрытой, активных и возобновленные инфекции28 , который может быть трудно воспроизвести и модель экспериментально.
Mycobacterium marinum является близким родственником микобактерий туберкулеза с ~ 3000 orthologous белки с 85% аминокислот личность29. М. marinum естественно заражает данио рерио, производство гранулемы, признаки туберкулеза, в его внутренних органов19,30. В отличие от других животных моделей, используемых в исследованиях туберкулеза данио рерио производит много потомства, он требует только ограниченное пространство и главное, это neurophysiologically наименее развитых позвоночных туберкулезом модель доступна. Кроме того м. marinum инфекция вызывает латентной инфекции, активной болезни или даже стерилизации микобактериальной инфекции в взрослых рыбок данио, тесно имитирует спектр заболеваний результаты человека туберкулезом19, 31 , 32. здесь, мы описываем методы для экспериментальной туберкулезом модель взрослых рыбок данио путем впрыскивать marinum м. в брюшной полости и количественного PCR для измерения микобактериальной нагрузок и иммунные реакции от данио рерио образцы тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все данио рерио эксперименты были одобрены Советом эксперимент животное в Финляндии (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Методы выполняются согласно закону (497/2013) и постановление правительства (564/2013) о защите животных, используемых для научных или образовательных целях в Финляндии.
1. выращивание из Mycobacterium marinum
Примечание: Поскольку Mycobacterium marinum является патогеном, способных вызвать поверхностные инфекции в организме человека, Узнайте местные руководящие принципы для личной безопасности и биологически опасных отходов перед началом работы с этой бактерии.
- Культуры м. marinum на 7 H 10 пластины дополнена 10% OADC (олеиновая кислота, альбумина, декстроза, каталаза) обогащения и 0,5% v/v глицерина в 29 ° C в течение 5 дней. Поддерживать м. marinum культур, принимая свежие бактерии из морозилки каждые две недели и перенос на новую пластину каждую неделю.
Примечание: М. marinum является естественным рыбы патогена, заражение водных видов, и важно принять меры предосторожности, чтобы не загрязнить данио рерио запасов с бактериями. Зараженных данио рерио и предметы, загрязненные бактериями должны храниться отдельно от разведению. - Используйте цикл прививка стерильные 1-мкл асептически перевести loopful м. marinum бактериальной массы в колбу культуры клетки, содержащие 10 мл 7 ч 9 средних с ADC (альбумин, декстроза, каталаза) обогащения 10%, 0,2% v/v Полисорбат 80 и 0,2% v/v глицерин. Культура для 3 – 4 дня до примерно ОД600 (оптическая плотность) 0,7 на 29 ° C в темноте без встряхивания. Оставьте крышку свободно, или использовать крышку фильтра, чтобы позволить для достаточного обмена газов.
Примечание: Полисорбат 80 добавляется средство для предотвращения агрегации бактерий. Кроме того воздействие света приводит к фенотипические изменения в колонии бактерий (например, изменения цвета от белого до желтого). Чтобы избежать этого, держите культур в темноте. - Измерьте значение600ОД спектрофотометром. Разбавить культур в жидкой среде ОД600 0,07-0,09 и продолжить культивирования в течение 2 дней на 29 ° C в темноте без встряхивания. Оставьте крышку свободно.
Примечание: В течение этих двух дней, бактериальный подвеска достигнет ОД600примерно 0,5 соответствует ранних лаг фазы.
2. Подготовка бактериальных решение для заражения взрослых рыбок данио
- Перевести бактериальных подвеска в большой стерильные кювета или 15 мл и поместите его в темноте при комнатной температуре 15 минут позволить больших сгустков урегулировать.
- Перевести Топ 5 – 7 мл суспензии в чистой трубки или кювет и измерить ОД600. Используйте этот верхний этап подвески для инфекций.
- Соберите 1 мл м. marinum культуры в свежий трубки и центрифуги для 3 мин на 10000 x g. Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл стерильного ПБС.
- Разбавить достичь желаемого бактериальных концентратов с использованием стерильных 1 x PBS с 0.3 мг/мл фенола Красного как трассировщик. Разделите на три аликвоты разреженных подвеска.
Примечание: Используйте заранее ОД600 против кое (образуя колонии единиц) / мкл кривой для оценки разбавления обязаны получить разыскиваемых количество бактерий в 5 мкл инъекции объем34. Корреляция между ОД600 и концентрации бактериальных подвеска должна быть проверена перед началом фактической инфекции экспериментов. Заповедник две недели для сбора этой проверки данных. - С помощью 1 мл шприца, медленно вытяните подвеска через 27 G игла 3 x. Для каждого Алиготе выполните этот шаг только перед использованием.
Примечание: Не используйте то же бактериальных решение для более чем 2 ч.
3. экспериментальный м. marinum инфекции с внутрибрюшинной инъекции
- Пипетка 5 мкл капля разбавленного бактериальных решение на кусок парафина фильма и тянуть капли в иглой 30 G инсулина.
- Используйте 5 – 8 месяц-старый одичал тип рыб и rag1−/−hu1999 черепашки для эксперимента. Анестезировать взрослых рыбок данио в резервуар для воды с 0,02% 3-аминобензойной кислоты этилового эфира (рН 7,0). Расположите вентральной стороне рыбы вверх в щель на влажные пенопласта.
Примечание: Rag-/- мутант рыбы не способны пройти соматическая рекомбинация и производить функциональных T и B клетки. - Инъекционные иглы между брюшные плавники на примерно под углом 45°. Держите открытия иглы вверх, чтобы наблюдать, что весь открытие находится внутри брюшной полости. Медленно вводить бактериальных подвеска и осторожно снимите иглу.
Примечание: В случае, если красный трассировщик протекает из рыбы после инъекции, исключите рыб из эксперимента. - Сразу же после инъекции передача рыбы в резервуар восстановления с свежий резервуар для воды.
- Взять образцы бактерий подвески на 7H 10 тарелки каждые 15 мин от бактериальных аликвота в использовании и инкубировать бактерий на 29 ° C за 5 дней и проверить доза инфекции путем подсчета колоний на тарелках.
- Регулярно проверяйте благополучия рыбы и усыпить любую рыбу с симптомами инфекции с более чем на 0,02% концентрации 3-аминобензойной кислоты этилового эфира (рН 7,0).
Примечание: Приблизительно 7% взрослых рыбок данио инфицированы 34 ± 15 CFU и 30% данио рерио, инфицированных 2029 ± 709 CFU имели симптомы 8 недель19. Симптомы могут включать аномальные плавание, отсутствие реакции на touch, затрудненное дыхание, отек или наблюдаемых тратить. - Поддерживать данио рерио согласно общих стандартов35.
4. сбор внутренних органов
- Усыпить данио рерио с передозировкой 3-аминобензойной кислоты этилового эфира (более 0,02% концентрации, pH 7.0) в резервуар для воды.
- Вставьте один контактный задняя branchiostegal лучей и другой через хвост лавировать рыбы на платформу.
- Откройте всей брюшной полости с помощью скальпеля и собирать внутренних органов с помощью небольшой ложкой и закончился острые щипчики. Начните от сердца и работать вдоль позвоночника к хвосту чтобы отсоединить все внутренние органы в одном блоке.
Примечание: Не забудьте собрать все ткани почки соскабливания вдоль позвоночника с ложкой. - Наконец используйте пинцет для отсоединения кишечнике рядом с клоаку и передачи органов в 1,5 мл гомогенизации трубку с шестью 2,8 мм керамический бисер. Сразу же место на сухой лед для замораживания образца. Образец может храниться при температуре-80 ° C до гомогенизированный.
- Промывайте инструменты с 70% этанол между людьми.
5. гомогенизации и РНК добыча из блока органа.
Примечание: Метод изменяется от Стэнфордского университета протоколы36.
- Добавить гуанидина тиоцианат фенола раствор используется для извлечения нуклеиновой кислоты (Таблица материалов) на вершине образца к общим объемом 1 500 мкл. Убедитесь, что образец охватывает максимум 10% от общего объема.
Предупреждение: Ожидаемый объем заготовленной ткани — 100 мкл. гуанидина тиоцианат фенола раствор содержит токсичные и раздражающих соединений и требует защитную одежду, перчатки из нитрила и работающих в зонта. Не следует сочетать с отбеливателем, как это приведет к образованию токсичных газов. Перед использованием прочитайте паспорт безопасности материала (MSDS). - Однородный образцы с использованием гомогенизатора шарик избиение 3 раза для 40 s при 3200 об/мин. Прохладный на льду для 30 s между циклами. Sonicate гомогенизированных образцов в водяной бане за 9 мин.
- Центрифугуйте образцы на 12000 x g 10 мин при температуре 4 ° C и переместить 1000 мкл очищается огневки в свежий microcentrifuge трубку.
- Добавить 200 мкл хлороформ, сразу смешать vortexing для 15 s и инкубировать в течение 2 минут при комнатной температуре.
Предупреждение: Хлороформ токсичных и раздражающие соединения при вдыхании, проглотил или контактировать с кожей или глазами. Использовать необходимое оборудование безопасности для личной охраны и работать в зонта. Перед использованием прочитайте паспорт безопасности материала (MSDS). - Центрифуга на 12000 x g 15 мин при 4 ° C для разделения водные и органические фазы.
- Осторожно передачи 500 мкл Топ фазы в свежий трубку, чтобы избежать загрязнения РНК. Удаление и отбросить все остальное водной фазы (~ 100 мкл) и хранить межфазной и органические фазы при 4 ° C для экстракции ДНК.
Примечание: Верхний этап содержит РНК. - 500 мкл 2-пропанол и сразу же mix vortexing за 15 s. инкубировать 10 мин при комнатной температуре осадить РНК.
- Центрифуга на 12000 x g 10 мин при 4 ° C для пеллет РНК. Удалите супернатант, закупорить.
- Добавить 1 мл 75% этанола и вихревые для 10 s.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь, и образцы хранится на ночь при 4 ° C. - Центрифуга на 7500 x g 5 мин при 4 ° C. Удалите супернатант, закупорить.
- Повторите шаги мыть 5,9-5.10. Тщательно удалить супернатант, закупорить и пусть гранулы просушите в зонта.
- Растворяют гранулы РНК в 500 мкл нуклеиназы свободной воды и Храните образцы на льду. Измерьте концентрации с microvolume спектрофотометром или эквивалентные оборудования. Магазин РНК-80 ° c.
6. Очистка совместно извлеченные данио рерио и микобактериальной ДНК
- Подготовка буфера обратно добыча (BEB) путем растворения 118,2 g гуанидина тиоцианат (конечная концентрация 4 М), 3,68 г натрия цитрат (конечная концентрация 50 мм) и 30.29 g трис бесплатные базы (конечная концентрация 1 М) в 120 мл нуклеиназы свободной воды (в мае требует перемешивания на ночь). Добавьте воды, свободной от нуклеиназы окончательный общий объем 250 мл и фильтр для стерилизации решения.
Примечание: Этот буфер может храниться при комнатной температуре до 6 месяцев. Не следует сочетать BEB с хлоркой, как они реагируют на производство токсичных газов, как хлористый водород и цианистый водород. - Используйте межфазной и органические фазы образца для извлечения микобактериальной ДНК. Добавьте 500 мкл BEB каждой трубы. Смешать широко за 10 мин, инверсии при комнатной температуре.
- Центрифуга для трубы на 12000 x г за 30 мин при комнатной температуре и тщательно передачи 500 мкл верхней водной фазы, содержащих ДНК к новой пробке.
- Добавление 2-пропанол 400 мкл. Смешайте по преобразованию и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
- Центрифугуйте образцы на 12000 x g 15 мин при 4 ° C. Гранулы, содержащие ДНК должны быть видны в данный момент. Тщательно удалите супернатант, закупорить.
- Добавьте 800 мкл на 70% спирте. Помыть лепешка, инверсии. Сделать не вихревой образцы в данный момент, как легко ломается геномной ДНК.
- Центрифугуйте образцы на 12000 x g 15 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант, закупорить. Повторите мыть этанола (шаги 6.6 и 6.7).
- Удалите этанола, тщательно закупорить. Пусть образцы воздушно-сухой для 5 – 10 мин растворяют гранулы в 200 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
- Измерять концентрации ДНК с microvolume спектрофотометром или эквивалентные оборудования. ДНК может храниться при температуре 4 ° C или при-20 ° C для длительного хранения.
7. Количественная ПЦР для измерения микобактериальной нагрузок
- Подготовка смеси реакции ПЦР с без-ROX (карбоксильную X-родамин) против м. marinum внутренней трансляции распорку (СТС) между 16 23 его согласно инструкциям изготовителя с MMITS1 грунтовки (Таблица 1). Пипетка смесь реакции и образец разведениях как дубликаты на плиту 96-хорошо подходит для ПЦР. Включать серию стандартных разрежения ДНК известных количество бактерий в каждом run.
Примечание: Ожидается marinum м. нагрузка на рыб может варьироваться от 0 кое до 1000000 кое на 4 Изв. ПЦР анализа могут быть также выполнены с другие наборы ПЦР, но отжига температура для грунтовки должна быть повторно оптимизации. - Уплотнение пластины с оптически прозрачная пленка и центрифуги пластину на 2000 x g на 2 мин при 4 ° C.
- Запустите программу ПЦР, показано в таблице 2.
- С помощью стандартной кривой, Рассчитайте количество бактерий в образце всю рыбу.
8. DNase лечение образцов РНК
- Чтобы удалить любые возможные оставшиеся следы геномной ДНК РНК, осуществить DNase I лечения. Оттепель образцов РНК на льду.
Примечание: Не забудьте использовать только РНКазы бесплатно оборудование и решения и протрите рабочую поверхность и пипетки с реагента Обеззараживание устраняя полиадениновый (Таблица материалов) перед началом работы. Одежда с длинными рукавами лаборатории пальто и перчатки, чтобы защитить ваши образцы. - Подготовка 10 мкл DNase I реакция смеси на льду согласно инструкциям производителя. Смешайте 1 мкл DNase I, 1 мкл 10 x буфер DNase и 8 мкл РНК образца, включая максимум 1 мкг РНК.
- Аккуратно перемешать реакций (не vortexing) и Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C.
- До тепла инактивации добавьте 1 мкл 50 мм ЭДТА каждый 10 мкл пример. Если ЭДТА не добавляется, РНК подвергаются химической деградации при нагревании.
- Проинкубируйте втечение 10 мин при 65 ° C тепла инактивирует DNase I. продолжить непосредственно для синтеза cDNA или хранить DNase лечение РНК-80 ° c.
9. синтез cDNA
- Держите все реагенты и образцы на льду и подготовить реакция смеси согласно инструкциям производителя. Смесь реакции 5 мкл, включают в себя 1 мкл вспять транскрипции Мастер микс, 3 мкл нуклеиназы свободной воды и 1 мкл DNase лечение РНК.
- Осторожно смешать реакции обратной транскрипции и кратко спина трубки, если это необходимо.
- Поместите образцы в машину ПЦР и использовать программы, показаны в таблице 3.
- Разбавьте cDNA в свободной от нуклеиназы воды для ПЦР для максимальной концентрации 2,5 нг/мкл, при необходимости. cDNA может храниться при температуре-20 ° C.
10. Измерение экспрессии генов данио рерио, количественного PCR
- Подготовка мастер смесь ПЦР на льду согласно инструкциям производителя и защищать от света. Используйте грунты, представлен в таблице 1.
Примечание: Чтобы вычислить в лоно индукции для каждого гена, измерьте выражение также из пула базового образца, извлеченные из 6 здоровых рыбок данио. - Подготовить реплицирует каждого образца и Пипетка реакция смеси на ПЦР пластину. Печать пластины с оптически прозрачная пленка и центрифуги пластину на 2000 x g на 2 мин при температуре 4 ° C до начала выполнения.
- Запустите ПЦР программа, показано в таблице 4 с отжига температура в зависимости от пары грунтовка используется (Таблица 1).
- Анализировать соотношение выражение гена, по сравнению с дом поддержанию ген (loopern437) с помощью метода ΔCt с помощью уравнения:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Природные рыбы возбудителя Mycobacterium marinum заражает внутренних органов у рыбок данио и производит системной инфекции с гистологически видимых гранулемы19. С . м. marinum взрослых рыбок данио заражены внутрибрюшинной инъекции. ДНК и РНК извлекаются, и микобактериальной нагрузки измеряется количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью ДНК в качестве шаблона. Краткое изложение метода показан на рисунке 1.
Начальное количество микобактерий, используемых для заражения рыба является важнейшим фактором, определяющим для исхода инфекции. Высокий инфекции доза marinum м. (~ 2,000 CFU) приводит к прогрессирующее заболевание в котором микобактериальной нагрузок по-прежнему увеличиваться, пока средняя бактериальной нагрузки достигает около пяти миллионов бактерий (рисунок 2A) в конечном итоге убить рыбу. Низкие дозы (~ 20 – 90 CFU) м. marinum приводит к развитию болезни спектра, аналогичного тому, которое наблюдалось в человека туберкулеза (Рисунок 2Б). Бактериальная нагрузка продолжает увеличиваться до около 4-7 недель (рисунок 2A и 3A рисунок), после чего в большинстве рыб болезни достигнет устойчивого состояния. Рисунок 2B показывает пример распределения результатов болезни с низкой дозы инфекции: около 7% зараженных данио рерио смогли ограничить рост бактерий. Эти люди разработали первичный прогрессирующее заболевание, и они умерли в течение двух месяцев после инфицирования. Около 10% лиц, очистили микобактериальных инфекций на 4 недели. Остальные 65% населения рыбы разработал латентной микобактериальных инфекций с устойчивый бактериальной нагрузки. Однако от 8 до 32 недель инфекции, в 18%, латентной инфекции спонтанно повторная активация приводит к прогрессирование болезни.
С помощью тряпка-/- мутант рыбы, это возможно для изучения роли адаптивного иммунного ответа у взрослых рыб. Rag-/- мутант рыбы не могут достаточно ограничить рост микобактерий, приводит к более высокой бактериальной нагрузки (рис. 3A) и повышенной заболеваемости (рис. 3B), четко продемонстрировав важность адаптивного иммунитета в Управление микобактериальной инфекции. Кроме того важное значение адаптационного реагирования в вызывающие ответы некоторых цитокинов в микобактериальной инфекции могут изучаться в этой модели. Здесь, мы покажем, что адаптивный ответ требуется для эффективной индукции интерлейкинов 4 (IL4) (рис. 3 c), но необязательным для индукции интерферона гамма (IFNγ) на 4 ИЗВ (Рисунок 3D). Интерферон γ является цитокинов вождения ответ против внутриклеточных возбудителей, тогда как интерлейкин 4 общих посредником в адаптивного иммунного ответа против внеклеточных патогенов. Значительно более высокие уровни выражения il4 в группе одичал тип, по сравнению с тряпка-/- мутант рыба относится к важным адаптационного реагирования гуморального микобактериальной инфекции (рис. 3 c).
Рисунок 1: процесс изучения развития микобактериальной нагрузок в взрослых рыбок данио. Данио рерио взрослых заражены внутрибрюшинного введения marinum м.. ДНК и РНК извлекаются из внутренних органов рыб и с количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализируются marinum м. нагрузки и хозяина иммунной реакции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Инъекции м. marinum в взрослых рыбок данио вызывает спектр болезни государства. (A) данио рерио вводили с низким (34 ±15 CFU) или высокой дозе (2029 ±709 CFU) м. marinum. Средняя нагрузок для 5 рыб (за исключением 32 недели высокой дозе, n = 2) отображаются с SD. низкодозированные Статистика: * p < 0,05, по сравнению с 1 неделя, ** p < 0,05 по сравнению с 1 и 2 недели. Высок дозы Статистика: *** p < 0,05 по сравнению с 1, 2, 8, 11 и 20 wk. ¤ низкая доза vs. p высокой дозы < 0,05. Изменение от Parikka и др. 201219. (B) типичный распределение исходов болезней одичал тип данио рерио населения, инфицированных с низкой дозой marinum м.. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: адаптивного иммунитета влияет на курс микобактериальной инфекции у взрослых рыбок данио. Взрослый одичал тип (wt) и rag1 данио рерио (−/−) были инфицированы с низкой дозой (n = 30) от м. marinum. (A) средний микобактериальной нагрузок были измерены по ПЦР на 2, 4 и 7 недель пост инфекции (ИЗВ) (n = 10) * P < 0,05. (B) рыбы были умерщвлены на развитие симптомов болезни и выживания участки были созданы. (C). уровни выражения il4 были измерены в 4 Изв. (D) выражения уровни IFNγ были измерены в 4 Изв. (A и B) изменение от Parikka et al. 201219. (C и D) Изменение от Хаммарен et al. 201438. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Джин | Грунтовка последовательность | Отжига температура |
| MMITS1 | F: CACCACGAGAAACACTCCAA | 65 |
| 16S – 23SITS Локус AB548718 для квантификации marinum м. | R: ACATCCCGAAACCAACAGAG | |
| loopern4 | F: TGAGCTGAAACTTTACAGACACAT | 61 |
| Выражена повторяющихся элементов | R: AGACTTTGGTGTCTCCAGAATG | |
| IL4 | GCAGGAATGGCTTTGAAGGG | 59,5 |
| ZDB-ГЕН-100204-1 | GCAGTTTCCAGTCCCGGTAT | |
| ifnγ1-2 | F: GGGCGATCAAGGAAAACGACCC, | 61 |
| ZDB-ГЕН-040629-1 | R: TAGCCTGCCGTCTCTTGCGT |
Таблица 1: грунтовка последовательности и температуры нагрева при отжиге. Последовательности используется грунты и их оптимизации температуры нагрева при отжиге. Праймеры для м. marinum 16S-23S рРНК Стенограмма были оптимизированы для No-ROX комплект ПЦР и других праймеров для ROX, включая комплект ПЦР.
| Шаг | Время | Температура |
| 1 | 3 мин | 95 ° C |
| 2 | 5 s | 95 ° C |
| 3 | 10 s | 65 ° C |
| 4 | 5 s | 72 ° C (флуоресценции обнаружения) |
| 5 | Перейдите к шагу 2. 39 раз | |
| 6 | Плавления анализа кривой 55-95° C с интервалом 0,5 ° C | |
| 7 | Навсегда | 4 ° C |
Таблица 2: Программа ПЦР для измерения м. marinum ДНК. ПЦР протокол разработан в соответствии с инструкциями производителя и оптимизирован для измерения м. marinum ДНК от данио рерио образцов.
| Время | Температура |
| 5 мин | 25 ° C |
| 30 мин. | 42 ° C |
| 5 мин | 85 ° C |
| Навсегда | 4 ° C |
Таблица 3: программа синтеза cDNA. Протокол для синтеза cDNA от извлеченного РНК зараженных данио рерио согласно инструкциям производителя.
| Шаг | Время | Температура |
| 1 | 30 s | 95 ° C |
| 2 | 12 s | 95 ° C |
| 3 | 30 s | Отжиг ° C |
| 4 | Перейдите к шагу 2. для 39 раз | |
| 5 | Плавления анализа кривой 65 – 95 ° C с интервалом 0,5 ° C | |
| 6 | Навсегда | 4 ° C |
Таблица 4: ПЦР программа для измерения экспрессии генов хозяина. ПЦР протокол разработан в соответствии с инструкциями производителя и оптимизирован для измерения экспрессии генов, различных данио рерио.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем ПЦР-приложения на основе измерения микобактериальной нагрузок от ДНК, извлеченные из экспериментально зараженных взрослых рыбок данио тканей. Это приложение основано на грунты, построена вокруг 16S-23S рРНК внутренней трансляции распорку последовательности40. Общая нагрузка микобактерий в образце рыбы оценивается с использованием стандартной кривой, приготовленный из ДНК, извлеченные из известных количество культивируемых микобактерий и предполагая, что это одна бактерия имеет одну копию генома в любой момент. Предел обнаружения ПЦР marinum м. -это примерно 100 колонии, образующих18единиц. Явным преимуществом метода по сравнению с традиционными обшивка является, что могут быть обнаружены как активных, так и без деления неактивных бактерий. Кроме того общая проблема загрязняющих роста на культуре тарелки из тканей данио рерио обойти этот подход. Однако как ДНК используется в качестве шаблона, вполне возможно, что некоторые из копий измеряется могут быть получены от ДНК бактерий, которые совсем недавно умер. Значительное преимущество протокола на основе нуклеиновых кислот, что как ДНК и РНК (как так белки, здесь не описывается) могут быть извлечены из того же лица, микобактериальной нагрузки личности могут быть объединены с данными выражения гена обоих хозяин и бактерий.
Дозирование м. marinum является важнейшим фактором, определяющим результат инфекции. Низкая marinum м. (~ 20 – 90 CFU) инфекции доза производит спектр болезней государств с задержкой как наиболее распространенной формой. Если инфекции доза составляет порядка тысячи, более прогрессивные болезнь развивается в большинстве отдельных лиц. Как естественный инфекционных доза известно считается низким в41людских туберкулезом, с помощью низкой дозой м. marinum в zebrafish модель является скорее всего производить более естественным инфекции. Чтобы достичь правильную дозу, убедитесь, что проверить связь между OD600 и образуя колонии единиц до начала каких-либо экспериментов. Нормальные вариации доз покрытием инфекции составляет примерно 30% и не считается проблемой. Однако важно, чтобы убедиться, что весь 5 мкл объем бактериальных подвеска остается внутри рыбы. Утечка инъекционного раствора вызовет дополнительные изменения в доза инфекции. В дополнение к инфекции доза штамм бактерий может влиять на прогрессирование болезни. Это было показано, что вирулентности из различных м. marinum штаммы могут изменить между штаммами. Два наиболее часто используемых штаммы являются ATCC927 (рыба изолированного штамма, используемые в этих экспериментах) и штамм М. Однако эти штаммы различаются в их вирулентности. Человека изолированный штамм M развивается более прогрессирующее заболевание, а рыба изолированный штамм производит мягкий болезни хорошо подходит для изучения скрытой форме микобактериальных инфекций33. Вирулентности бактерий в штамм может также изменить если бактерии последовательно передается из одной культуры в другую, которые могут быть предотвращены путем принимать свежие микобактерий из фризера складе достаточно часто.
В vitro культивирования медленно деления м. marinum без антибиотиков подвержен загрязнений. Таким образом обработка бактерий требует строгих асептических подход осуществляется в Ламинарный шкаф. Возможное загрязнение в культуре может быть обнаружен как слишком высокое значение ОД600 , странный бактериальных подвеска или колонии. М. marinum колонии являются обычно нечетких краями, плоские и матовый белый цвет. М. marinum культуры чувствительны к свету, и они начинают производить желтого пигмента при воздействии света. Этот желтый пигмент может использоваться для различения м. marinum колоний от других бактерий после инфекции. Загрязнители могут вызвать рыбы умирают вскоре после инфицирования. Как правило первые симптомы инфекции низкой дозы не появляются до 3 недель после инфицирования и любой смертность до этого момента времени, вероятно, из-за загрязнения в бактериальных подвеска или травмы, вызванные во время инъекции.
Взрослый данио рерио очень чувствительны к 3-аминобензойной кислоты этилового эфира и не выжить, если время экспозиции является слишком длинным или слишком высока концентрация анестетика. Таким образом, при заражении, данио рерио должны подвергаться анестезии только за минимум времени для достижения хорошего наркоза (~ 1-2 мин). После заражения взрослых рыбок данио хранятся в группах при температуре воды 26 – 28 ° c. Если температура выше или ниже, чем это, это может повлиять на темпы роста м. marinum и кинетика инфекции. Кроме того качество воды бак (микробиологического качества, концентрация соли, рН, насыщение кислородом) является важным элементом обеспечения успешного эксперимента. Мониторинг работоспособности рыб должна осуществляться ежедневно и рыбы, которые показывают, что симптомы инфекции должны быть удалены из группы и умерщвлены. Если рыбы умирают в баке, другой рыбы может стать вновь инфицированных через кишечник, который будет влиять на прогрессирование инфекции.
Часто используемые данио рерио личиночной модель туберкулеза применима к исследование врожденного иммунитета, который руководит эксперименты на ограниченное подмножество хост микробных взаимодействий. Использование взрослых рыбок данио делает возможным изучение врожденного и адаптивного иммунного ответа в18,,32универсальная модель39. Взрослый данио рерио позиционирует себя как удобный позвоночных модель для изучения всего спектра туберкулеза. С низкой дозы облучения marinum м.7% из населенности рыбы развивать основной прогрессирующее заболевание, 10% возможность стерилизовать инфекции, 65% развивать скрытые болезни и в 18% спонтанное восстановление происходит (рис. 2). Спектр заболеваний тесно напоминает видели человека туберкулеза, в котором подавляющее большинство развивать скрытые болезни, примерно 4 – 14% сильно производят первичного активной инфекции в течение первых пяти лет после заражения42, 10 – 20% подвергаются лица, как представляется, сможет стерилизовать инфекции43 и 5 – 10% от латентных инфекций реактивировать44. Различия в хозяев генетика влияет на восприимчивость к туберкулезом и прогрессирования болезни45. Это также наблюдается в данио рерио населения, которое является генетически весьма неоднородной, в отличие от многих других лабораторных животных46,47. Естественный генетической вариации делает его весьма применима модель в поисках оптимального иммунных реакций в этой многофакторных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа оказывает поддержку путем финский культурный фонд (H.L.), Тампере туберкулезом Foundation (H.L., л-м.в., M.M.H., м.п.), Фонд финской ассоциации борьбы с туберкулезом (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., м.п.), Зигрид Jusélius фонда (м.п.), Эмиля Аалтонена фонда (M.M.H.), Джейн и Aatos Эркко фонда (м.п.) и Академия Финляндии (м.п.). Leena Мякинен, Ханна-Леена Piippo и Дженна Ilomäki признаны за их технической помощи. Авторы признают Тампере данио рерио лаборатории для их обслуживания.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27 G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30 G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 mL homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
References
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
- Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
- Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
- Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis--heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
- Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
- Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
- Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
- Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
- Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A.
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
- Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
- World Health Organization. WHO Global tuberculosis report 2017. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
- Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
- Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
- Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
- Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
- Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L.
- Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
- Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
- Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
- Madigan, M., Martinko, J. Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish:a practical approach. , Oxford University Press. Oxford. (2002).
- Anonymous Stanford University Protocols. , Available from: http://med.stanford.edu/labs/vanderijn-west/Protocols.html (2018).
- Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
- Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S.
- Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
- Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
- Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
- Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
- Guryev, V., et al.
- Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).
