Summary
Qui, presentiamo un protocollo per tubercolosi umana modello in un adulto zebrafish utilizzando la sua naturale agente patogeno Mycobacterium marinum. Estratti di DNA e RNA da organi interni di zebrafish infetto può essere utilizzato per rivelare che il totale micobatterico carichi nel pesce e le risposte immunitarie dell'ospite con qPCR.
Abstract
Tubercolosi del micobatterio è attualmente il più letale agente patogeno umano causando le infezioni 10,4 milioni e 1,7 milioni di morti ogni anno. L'esposizione a questo batterio provoca uno spettro di vasta malattia negli esseri umani che vanno da un'infezione sterilizzati ad una malattia mortale attivamente di progressione. La forma più comune è la tubercolosi latente, che è asintomatico, ma ha il potenziale per riattivare in una malattia fulminante. Zebrafish adulto e sua naturale agente patogeno Mycobacterium marinum hanno recentemente dimostrato di essere un modello applicabile per studiare lo spettro di vasta malattia di tubercolosi. Soprattutto, spontaneo latenza e riattivazione, nonché risposte immunitarie nel contesto dell'infezione micobatterica può essere studiate in questo modello. In questo articolo, descriviamo i metodi per l'infezione sperimentale di zebrafish adulto, l'insieme degli organi interni per l'estrazione degli acidi nucleici per la misurazione dei carichi micobatteriche e risposta immune dell'ospite mediante PCR quantitativa. L'in-house-sviluppato, M. marinum -qPCR specifici test è più sensibile rispetto ai metodi tradizionali di placcatura, come rileva anche il DNA da micobatteri divisione, dormienti o morti di recente. Come sia DNA che RNA sono estratti dallo stesso individuo, è possibile studiare le relazioni tra lo stato malato e l'espressione genica di ospite e patogeno. Il modello di zebrafish adulto per la tubercolosi, così si presenta come un sistema altamente applicabile, non mammiferi in vivo per studiare le interazioni ospite-patogeno.
Introduction
Zebrafish (Danio rerio) è un modello animale ampiamente usato nella ricerca biomedica ed è un modello per la biologia dei vertebrati comune accettato. Zebrafish è stato adattato a molti campi di ricerca malattie umane di modellazione e disturbi che vanno da cancro1 e malattia cardiaca2 infezione e studi immunologici di diversi batteri 3 e infezioni virali4 , 5. Inoltre, lo sviluppo di ex utero degli embrioni di zebrafish ha reso zebrafish un modello popolare in biologia dello sviluppo6 e tossicologia7,8.
In molti campi della ricerca, tra cui biologia di infezione, le larve di zebrafish otticamente trasparenti sono comunemente usate. Le prime cellule immuni vengono visualizzati all'interno di fertilizzazione di 24h post (hpf), quando i macrofagi primitivi sono rilevati9. I neutrofili sono le cellule immunitarie prossime a comparire circa 33 hpf10. Larve di zebrafish sono dunque fattibile per lo studio delle prime fasi di infezione e il ruolo dell'immunità innata in assenza di cellule del sistema immunitario adattativo11. Tuttavia, zebrafish adulto con il suo sistema immunitario adattativo completamente funzionale fornisce un ulteriore livello di complessità per gli esperimenti di infezione. Le cellule di T possono essere rilevate intorno 3 giorni dopo la fecondazione12, e le cellule B sono in grado di produrre anticorpi funzionali da 4 settimane post fertilizzazione13. Zebrafish adulto ha tutte le controparti principali del sistema immunitario innato e adattivo dei mammiferi. Le principali differenze tra la immune systems di pesce e gli esseri umani si trovano in isotipi di anticorpo pure come l'anatomia dei tessuti linfoidi. Zebrafish ha anticorpi solo tre classi14, mentre gli esseri umani hanno cinque15. In assenza di midollo osseo e nei linfonodi, organi linfoidi primari nel pesce sono il rene e il timo16 e la milza, il rene e l'intestino servono come organi linfoidi secondari17. Nonostante queste differenze, con il suo arsenale completo sistema immunitario delle cellule innate e adattive, zebrafish adulto è un modello altamente applicabile, easy-to-use, non mammiferi per studi di interazione ospite-patogeno.
Zebrafish ultimamente è stato stabilito come un possibile modello per studiare la tubercolosi18,19,20,21,22. La tubercolosi è una malattia airborne causata dalla tubercolosi del Mycobacterium. Secondo l'organizzazione mondiale della sanità, la tubercolosi ha causato1.7 milione morti nel 2016 ed è la principale causa di morte da un singolo agente patogeno in tutto il mondo23. Topi24,25, conigli26 e27 di primati non umani sono che l'animale più noto modelli nella ricerca di tubercolosi ma ogni faccia loro limitazioni. Il modello di primate non umano dell'infezione di tubercolosi del M. è simile alla malattia umana più strettamente, ma utilizzando questo modello è limitato a causa di gravi considerazioni etiche. Altri modelli animali sono ostacolati dalla specificità dell'ospite-di M. tuberculosis che colpisce la patologia di malattia. Probabilmente il problema più grande nel modellare la tubercolosi è l'ampio spettro di esiti di infezione e malattia nella malattia umana: la tubercolosi è una malattia molto eterogenea, che vanno da sterilizzare l'immunità all'infezione latente, attiva e riattivato28 , che può essere difficile da riprodurre e modello sperimentalmente.
Mycobacterium marinum è un parente stretto di M. tuberculosis con proteine orthologous ~ 3.000 con 85% dell'amminoacido identità29. M. marinum infetta naturalmente zebrafish producendo granulomi, i tratti distintivi della tubercolosi, nei suoi organi interni19,30. A differenza di altri modelli animali utilizzati nella ricerca di tubercolosi, zebrafish produce molti figli, richiede solo uno spazio limitato e d'importanza, neurophysiologically è il modello di tubercolosi vertebrati meno sviluppato disponibile. Inoltre, l'infezione di M. marinum provoca infezione latente, malattia attiva o anche sterilizzazione dell'infezione micobatterica in zebrafish adulto che imita molto attentamente lo spettro di risultati di malattia di tubercolosi umana19, 31 , 32. qui, descriviamo i metodi per il modello sperimentale tubercolosi di zebrafish adulto iniettando M. marinum nella cavità addominale e utilizzando la PCR quantitativa per misurare i carichi micobatteriche e risposte immunitarie dallo zebrafish campioni di tessuto.
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Protocol
Tutti gli esperimenti di zebrafish sono stati approvati dal comitato di esperimento animale in Finlandia (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Metodi vengono eseguite secondo la legge (497/2013) e il decreto del governo (564/2013) sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici o educativi in Finlandia.
1. coltura di Mycobacterium marinum
Nota: Poiché il marinum del micobatterio è un agente patogeno in grado di causare infezioni superficiali in esseri umani, trovare le linee guida locale per la sicurezza personale e rischio biologico dei rifiuti prima di iniziare a lavorare con questo batterio.
- Cultura M. marinum su un 7 H 10 piastra supplementato con 10% OADC (acido oleico, albumina, destrosio, catalasi) arricchimento e 0,5% v/v di glicerolo a 29 ° C per almeno 5 giorni. Mantenere M. marinum culture prendendo batteri freschi dal freezer ogni due settimane e trasferire su di un piatto nuovo ogni due settimane.
Nota: M. marinum è un agente patogeno di pesce naturale infettare specie acquatiche ed è importante prendere precauzioni per non contaminare gli stock di zebrafish con i batteri. Zebrafish infetti e gli articoli contaminati con batteri devono essere tenuti separati dagli impianti di allevamento. - Utilizzare un ciclo di inoculazione sterile 1-µ l per trasferire asetticamente un loopful di M. marinum massa batterica in un matraccio di cultura cellulare contenente 10 mL di 7h 9 medie con arricchimento di ADC (albumina, destrosio, catalasi) 10%, 0,2% v/v polisorbato 80 e 0,2% v/v di glicerolo. Cultura per 3 – 4 giorni a circa un OD600 (densità ottica) di 0,7 a 29 ° C al buio senza agitazione. Lasciare il tappo allentato, o utilizzare un tappo del filtro, per consentire lo scambio sufficiente di gas.
Nota: Polisorbato 80 è aggiunto al medium per impedire l'aggregazione dei batteri. Inoltre, l'esposizione alla luce comporta cambiamenti fenotipici in colonie batteriche (ad es., le modifiche di colore dal bianco al giallo). Per evitare questo problema, è necessario mantenere le culture al buio. - Misurare il valore di600OD con uno spettrofotometro. Diluire la coltura liquida a un OD600 di 0,07-0,09 e continuare la coltura per 2 giorni a 29 ° C al buio senza agitazione. Lasciare il tappo allentato.
Nota: Durante questi due giorni, la sospensione batterica raggiungerà un OD600di circa 0,5 corrisponde a una registro-fase in anticipo.
2. preparazione della soluzione batterica per infettare Zebrafish adulto
- Trasferire la sospensione batterica in una provetta sterile grande o un tubo da 15 mL e posizionarlo al buio a temperatura ambiente per 15 minuti consentire il più grandi ciuffi di stabilirsi.
- Trasferire la top 5 – 7 mL di sospensione in una provetta pulita o una cuvetta e misurare il OD600. Utilizzare questa fase superiore della sospensione per le infezioni.
- Prelevare 1 mL di coltura di M. marinum in una nuova provetta e centrifugare per 3 min a 10.000 x g. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di PBS 1X sterile.
- Diluire a raggiungere la concentrazione batterica desiderata utilizzando sterile 1 x PBS con 0,3 mg/mL rosso fenolo come tracciante. Dividere la sospensione diluita in tre aliquote.
Nota: Utilizzare un predeterminato OD600 vs CFU (unità formanti colonia) / curva µ l per stimare la diluizione necessaria per ottenere il numero desiderato di batteri nel 5 µ l iniezione volume34. La correlazione tra OD600 e concentrazione della sospensione batterica deve essere convalidato prima di iniziare gli esperimenti di infezione reale. Prenotare due settimane per la raccolta di questi dati di convalida. - Usando una siringa da 1 mL, lentamente tirare la sospensione attraverso un G 27 ago x 3. Per ciascuna aliquota, eseguire questo passaggio solo prima dell'uso.
Nota: Non utilizzare la stessa soluzione batterica per più di 2 h.
3. sperimentale M. marinum infezione con l'iniezione intraperitoneale
- Dispensare una goccia di 5 µ l della soluzione diluita batterica su un pezzo di pellicola parafilm e tirare la goccia in un ago da insulina 30 G.
- Utilizzare 5 – 8 mese-vecchio selvaggio-tipo pesce e il pesce mutante rag1−/−hu1999 per l'esperimento. Anestetizzare zebrafish adulto in acqua serbatoio con 0,02% 3-aminobenzoic estere etilico dell'acido (pH 7.0). Posizionare il lato ventrale del pesce fino in una fessura su un umido schiuma di plastica.
Nota: Rag-/- pesci mutanti non sono in grado di subire la ricombinazione somatica e produrre cellule T e B funzionali. - Iniettare l'ago tra le pinne pelviche a un angolo di circa 45°. Tenere l'apertura dell'ago verso l'alto per osservare che tutta l'apertura è all'interno della cavità addominale. Iniettare lentamente la sospensione batterica e rimuovere con cautela l'ago.
Nota: nel caso in cui il tracciante rosso è fuoriuscita il pesce una volta iniettato, è possibile escludere i pesci dall'esperimento. - Immediatamente dopo l'iniezione, è possibile trasferire il pesce in un serbatoio di recupero con acqua fresca.
- Prendere campioni della sospensione batterica su 7H 10 piastre ogni 15 min dal batterico aliquota in uso e incubare i batteri a 29 ° C per 5 giorni e verificare la dose di infezione contando le colonie sulle piastre.
- Controllare regolarmente il benessere dei pesci ed eutanasia qualsiasi pesce con i sintomi dell'infezione con oltre 0,02% concentrazione di estere etilico dell'acido 3-aminobenzoic (pH 7.0).
Nota: Circa, 7% di zebrafish adulto infettato con 34 ± 15 CFU e 30% di zebrafish è infettato da 2029 ± 709 CFU avrà avuto sintomi da 8 settimane19. I sintomi possono includere nuoto anormale, mancanza di risposta al tocco, ansimante, edema o sprecare osservabile. - Mantenere il zebrafish secondo le norme comuni35.
4. raccolta degli organi interni
- Eutanasia zebrafish con una overdose di estere etilico dell'acido 3-aminobenzoic (oltre 0,02% di concentrazione, pH 7.0) nell'acqua del serbatoio.
- Inserire un perno posteriore per i raggi branchiostegal e l'altro attraverso la coda per virare il pesce sulla piattaforma.
- Aprire la cavità addominale intero con un bisturi e raccogliere gli organi interni tramite un piccolo cucchiaio e pinzette sharp-si è conclusa. A partire da cuore e lavorare lungo la colonna vertebrale verso la coda per scollegare tutti gli organi interni in un unico blocco.
Nota: Assicuratevi di raccogliere tutto il tessuto del rene da raschiare lungo la spina dorsale con il cucchiaio. - Infine, utilizzare pinzette per staccare l'intestino accanto alla cloaca e trasferire gli organi in una provetta da 1,5 mL omogeneizzazione con sei perle di ceramica di 2,8 mm. Posizionare immediatamente il ghiaccio secco per congelare il campione. Il campione può essere conservato a-80 ° C fino a quando non omogeneizzato.
- Risciacquare gli strumenti con etanolo al 70% tra gli individui.
5. omogeneizzazione e RNA estrazione da un blocco di organo.
Nota: Il metodo è modificato dalla Stanford University protocolli36.
- Aggiungere guanidina tiocianato-fenolo soluzione utilizzati per l'estrazione dell'acido nucleico (Tabella materiali) sulla parte superiore del campione per un volume totale di 1.500 µ l. garantire che il campione copre un massimo del 10% del volume totale.
Attenzione: Il volume previsto del tessuto raccolto è 100 µ l. guanidina tiocianato-fenolo soluzione contiene tossica e irritante composti e richiede indumenti protettivi, guanti in nitrile e lavorare in una cappa aspirante. Non combinare con candeggina come questo causerà la formazione di gas tossici. Leggere il foglio di dati materiale di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. - Omogeneizzare campioni usando un omogeneizzatore del branello-battendo 3 volte per 40 s a 3.200 giri/min. Raffreddare in ghiaccio per 30 s tra i cicli. Sonicare i campioni omogeneizzati in un bagno d'acqua per 9 min.
- Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C e spostare 1.000 µ l di omogenato liquidato in un tubo del microcentrifuge fresco.
- Aggiungere 200 µ l di cloroformio, immediatamente mescolare nel Vortex per 15 s e incubare per 2 min a temperatura ambiente.
Attenzione: Il cloroformio è una sostanza tossica e irritante composto se inalato, ingerito o a contatto con la pelle o gli occhi. Utilizzare dispositivi di protezione adeguati per la protezione personale e lavorare in una cappa aspirante. Leggere il foglio di dati materiale di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. - Centrifugare a 12.000 x g per 15 min a 4 ° C per separare le fasi acquose e organiche.
- Trasferire con cautela, 500 µ l della fase superiore in una nuova provetta per evitare di contaminare il RNA. Rimuovere e scartare il resto della fase acquosa (~ 100 µ l) e conservare l'interfase e fase organica a 4 ° C per l'estrazione del DNA.
Nota: La fase superiore contiene il RNA. - Aggiungere 500 µ l di 2-propanolo e immediatamente mescolare nel Vortex per 15 s. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente precipitare il RNA.
- Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C a pellet il RNA. Rimuovere il surnatante di pipettaggio.
- Aggiungere 1 mL di etanolo al 75% e vortexare per 10 s.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui, e i campioni tenuti durante la notte a 4 ° C. - Centrifuga a 7.500 x g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante di pipettaggio.
- Ripetere i passaggi di lavaggio 5.9 – 5,10. Rimuovere il surnatante con attenzione pipettando e lasciate che il pellet asciugare in una cappa aspirante.
- Dissolva la pallina del RNA in 500 µ l di acqua priva di nucleasi e mantenere i campioni su ghiaccio. Misurare le concentrazioni con uno spettrofotometro di microvolume o con attrezzatura equivalente. Memorizzare il RNA a-80 ° C.
6. purificazione di Zebrafish co-estratti e DNA micobatterico
- Preparare un tampone di retro-estrazione (BEB) sciogliendo 118,2 g di tiocianato di guanidina (concentrazione finale di 4 M), 3,68 g di citrato di sodio (concentrazione finale di 50 mM) e 30,29 g di Tris base libera (concentrazione finale di 1 M) in 120 mL di acqua priva di nucleasi (questo può richiedono mescolando durante la notte). Aggiungere acqua priva di nucleasi ad un volume finale di 250 mL e filtro per sterilizzare la soluzione.
Nota: Questo tampone può essere conservato a temperatura ambiente fino a 6 mesi. Non combinare BEB con candeggina come reagiscono per produrre gas tossici come acido cloridrico e acido cianidrico. - Utilizzare l'interfase e la fase organica del campione per estrarre DNA micobatterico. Aggiungere 500 μL di BEB in ogni provetta. Mix estesamente per 10 min di inversione a temperatura ambiente.
- Centrifugare le provette a 12.000 x g per 30 min a temperatura ambiente e attentamente trasferire 500 µ l della fase acquosa superiore contenente il DNA ad un nuovo tubo.
- Aggiungere 400 μL di 2-propanolo. Miscelare accuratamente capovolgendo e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 15 min a 4 ° C. Una pallina che contiene il DNA deve essere visibile a questo punto. Rimuovere con cautela il supernatante di pipettaggio.
- Aggiungere 800 μL di etanolo al 70%. Lavare la pallina di inversione. Non centrifugare i campioni a questo punto, come il DNA genomico si rompe facilmente.
- Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 15 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante di pipettaggio. Ripetere il lavaggio di etanolo (passaggi 6.6 e 6.7).
- Rimuovere l'etanolo pipettando attentamente. Lasciare che i campioni asciugare all'aria per 5 – 10 min. Dissolva la pallina in 200 μL di acqua priva di nucleasi.
- Misurare le concentrazioni di DNA con uno spettrofotometro di microvolume o con attrezzatura equivalente. DNA può essere conservato a 4 ° C o a-20 ° C per la conservazione a lungo termine.
7. quantitative PCR per misurare i carichi micobatteriche
- Preparare miscele di reazione qPCR con no-ROX (carboxy-X-rodamina) contro il distanziatore trascritto interno di M. marinum (ITS) tra 16S-23S ITS secondo le istruzioni del produttore con primer MMITS1 (tabella 1). Pipettare il mix di reazione e diluizioni di esempio come duplicati su una piastra a 96 pozzetti adatto per qPCR. Includono una serie di diluizione normale del DNA di una quantità nota di batteri in ogni esecuzione.
Nota: L'atteso M. marinum carico per ogni pesce può variare da 0 CFU a 1.000.000 CFU alle 4 wpi. Il dosaggio di qPCR può essere eseguito anche con altri kit di qPCR ma la temperatura di ricottura per il primer deve essere ri-ottimizzato. - Sigillare la piastra con un film otticamente trasparente e centrifugare la piastra a 2.000 x g per 2 min a 4 ° C.
- Eseguire il programma di qPCR mostrato in tabella 2.
- Utilizzando la curva standard, calcolare il numero di batteri nel campione intero pesce.
8. dnasi trattamento dei campioni di RNA
- Per rimuovere eventuali tracce rimanenti possibili di DNA genomic dal RNA, effettuare dnasi I trattamento. Scongelare i campioni di RNA su ghiaccio.
Nota: Assicurarsi di utilizzare solo apparecchiature RNAsi-libera e soluzioni e pulire la superficie di lavoro e le pipette con un reagente di decontaminazione eliminando RNasi (Tabella materiali) prima di iniziare a lavorare. Indossare un camice a maniche lunghe e guanti per proteggere i vostri campioni. - Preparare 10 μL dnasi sono miscele di reazione sul ghiaccio secondo le istruzioni del produttore. Mescolare 1 μL di dnasi I, 1 μL di tampone di dnasi 10x e 8 μL di RNA del campione incluso un massimo di 1 μg di RNA.
- Delicatamente mescolare le reazioni (nessun Vortex) e incubare per 30 min a 37 ° C.
- Prima dell'inattivazione termica, aggiungere 1 µ l di 50 mM EDTA per ogni 10 µ l di campione. Se non viene aggiunto EDTA, il RNA sarà sottoposti a degradazione chimica quando riscaldato.
- Incubare per 10 minuti a 65 ° C a-inattivare con il calore della dnasi I. continuare direttamente alla sintesi di cDNA o memorizzare il RNA dnasi-trattati a-80 ° C.
9. sintesi del cDNA
- Conservare tutti i reagenti e campioni su ghiaccio e preparare le miscele di reazione secondo le istruzioni del produttore. Per un mix di reazione 5 μL, includono 1 μL di invertire trascrizione Master Mix, 3 μL di acqua esente da nucleasi e 1 μL di dnasi trattati RNA.
- Mescolare delicatamente le reazioni di retrotrascrizione e brevemente girare il tubo, se necessario.
- I campioni in una macchina PCR e utilizzare il programma mostrato nella tabella 3.
- Diluire il cDNA in acqua priva di nucleasi per qPCR ad una concentrazione massima di 2,5 ng/μL, se necessario. cDNA possa essere conservato a-20 ° C.
10. misurare l'espressione genica di Zebrafish mediante PCR quantitativa
- Preparare un mix master qPCR su ghiaccio secondo le istruzioni del produttore e proteggerlo dalla luce. Utilizzare il primer introdotto nella tabella 1.
Nota: Per calcolare la piega di induzione per ogni gene, misurare l'espressione anche da un campione di pool basale estratto dallo zebrafish sano 6. - Repliche di ciascun campione di preparare e dispensare le miscele di reazione su un piatto di qPCR. Sigillare la piastra con un film otticamente trasparente e centrifugare la piastra a 2.000 x g per 2 min a 4 ° C prima di iniziare la corsa.
- Eseguire la qPCR programma riportato in tabella 4 con la temperatura di ricottura a seconda della coppia di primer utilizzati (tabella 1).
- Analizzare il rapporto di espressione genica rispetto ad un gene house-keeping (loopern437) con il metodo di ΔCt mediante l'equazione:
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Representative Results
L'agente patogeno di pesce naturale Mycobacterium marinum infetta gli organi interni di zebrafish e produce un'infezione sistematica con i granulomi istologicamente visibile19. Zebrafish adulto sono infettati con M. marinum tramite un'iniezione intraperitoneale. Il DNA e RNA sono estratte e micobatterica è misurato da reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) utilizzando il DNA come il modello. La struttura del metodo è illustrata nella Figura 1.
Il numero iniziale di micobatteri utilizzato per infettare il pesce è un determinante critico per l'esito dell'infezione. Una dose elevata di infezione di M. marinum (~ 2.000 CFU) conduce ad una malattia progressiva in cui i carichi micobatterici continuano ad aumentare fino a quando il carico batterico medio raggiunge circa 5 milioni batteri (Figura 2A), infine, uccidendo i pesci. Una dose bassa (~ 20 – 90 CFU) di M. marinum conduce allo sviluppo di uno spettro di malattia simile a quello osservato nella tubercolosi umana (Figura 2B). La carica batterica continua ad aumentare fino a circa 4 – 7 settimane (Figura 2A e 3A cifra), dopo di che nella maggior parte dei pesci la malattia raggiunge uno stato stazionario. Figura 2B Mostra un esempio della distribuzione dei risultati di malattia con un'infezione dose bassa: circa il 7% di zebrafish infetti erano in grado di limitare la crescita batterica. Questi individui hanno sviluppato una malattia progressiva primaria e sono morti entro due mesi dopo l'infezione. Circa 10% degli individui ha eliminato l'infezione micobatterica di 4 settimane. Il restante 65% della popolazione ittica ha sviluppato un'infezione micobatterica latente con costante degli oneri batterici. Tuttavia, tra 8 e 32 settimane di infezione, nel 18%, l'infezione latente riattivato spontaneamente leader alla progressione della malattia.
Utilizzando rag-/- pesci mutanti, è possibile studiare il ruolo della risposta immunitaria adattativa in pesce adulto. Rag-/- pesci mutanti sufficientemente non possono limitare la crescita dei micobatteri che conduce a più alti carichi batterici (Figura 3A) e un aumento della morbilità (Figura 3B), dimostrando chiaramente l'importanza dell'immunità adattativa in controllo di infezione micobatterica. Inoltre, l'importanza di risposte adattative nell'evocazione di determinate risposte di citochina nell'infezione micobatterica può essere studiata in questo modello. Qui, indichiamo che la risposta adattativa è necessaria per l'induzione efficiente dell'interleuchina 4 (IL4) (Figura 3) ma non è indispensabile per l'induzione dell'interferone-γ (IFNγ) a 4 wpi (Figura 3D). Interferone-γ è una citochina che guida la risposta contro gli agenti patogeni intracellulari, considerando che l'interleuchina 4 è un mediatore comune nella risposta immunitaria adattativa contro patogeni extracellulari. Significativamente più alti livelli di espressione di il4 nel gruppo selvaggio-tipo rispetto al rag-/- pesci mutanti si riferisce a risposte umorali adattive importante nell'infezione micobatterica (Figura 3).
Figura 1: flusso di lavoro di studiare lo sviluppo dei carichi micobatteriche in zebrafish adulto. Zebrafish adulto sono infettati con un'iniezione intraperitoneale di M. marinum. DNA e RNA sono estratti da organi interni del pesce e il carico di M. marinum e le risposte immunitarie dell'ospite sono analizzate con reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Iniezione di M. marinum in zebrafish adulto provoca uno spettro di Stati di malattia. Zebrafish (A) sono stati iniettati con un basso (34 ± 15 CFU) o una dose elevata (2029 ±709 CFU) di M. marinum. Carichi per 5 pesci di media (ad eccezione della dose elevata di 32 settimane, n = 2) sono mostrati con le statistiche della basso-dose di SD.: * p < 0,05 rispetto a 1 settimana, * * p < 0,05 rispetto a 1 e 2 settimana. Statistiche della alto-dose: * * * p < 0,05 rispetto a 1, 2, 8, 11 e 20 settimana ¤ dose bassa vs dose elevata p < 0.05. Modificato da Parikka et al. 201219. (B) distribuzione tipica degli esiti di malattia all'interno di una popolazione di selvaggio-tipo zebrafish infettati con una dose bassa di M. marinum. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: immunità adattativa colpisce il corso dell'infezione micobatterica in zebrafish adulto. Adulto wild-type (wt) e rag1 (−/−) zebrafish sono stati infettati con una dose bassa (n = 30) di M. marinum. (A) la media micobatterica carichi sono stati misurati da qPCR a 2, 4 e 7 settimane post infezione (wpi) (n = 10) * P < 0.05. (B) i pesci sono stati eutanasizzati con lo sviluppo dei sintomi della malattia e sopravvivenza appezzamenti sono stati creati. (C). sono stati misurati i livelli di espressione di il4 alle 4 wpi. Wpi 4 sono stati misurati i livelli (D) l'espressione di IFNγ . (A e B) modifica da Parikka et al. 201219. (C e D) Modificato da Hammarén et al 201438. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Gene | Sequenza più superelegante | Temperatura di annealing |
| MMITS1 | F: CACCACGAGAAACACTCCAA | 65 |
| AB548718 Locus 16s – 23SITS per la quantificazione di M. marinum | R: ACATCCCGAAACCAACAGAG | |
| loopern4 | F: TGAGCTGAAACTTTACAGACACAT | 61 |
| Espresso elementi ripetitivi | R: AGACTTTGGTGTCTCCAGAATG | |
| IL4 | GCAGGAATGGCTTTGAAGGG | 59,5 |
| ZDB-GENE-100204-1 | GCAGTTTCCAGTCCCGGTAT | |
| ifnγ1-2 | F: GGGCGATCAAGGAAAACGACCC, | 61 |
| ZDB-GENE-040629-1 | R: TAGCCTGCCGTCTCTTGCGT |
Tabella 1: sequenze Primer e temperature di ricottura. Le sequenze dei primer utilizzati e loro temperature di ricottura ottimizzate. I primers per la trascrizione di rRNA 16S-23S M. marinum sono stati ottimizzati per un kit di qPCR No-ROX e gli altri iniettori per un ROX qPCR kit incluso.
| Passo | Tempo | Temperatura |
| 1 | 3 min | 95 ° C |
| 2 | 5 s | 95 ° C |
| 3 | 10 s | 65 ° C |
| 4 | 5 s | 72 ° C (rilevazione di fluorescenza) |
| 5 | Andare al passaggio 2. 39 volte | |
| 6 | Fusione di analisi della curva di 55-95° C con intervalli di 0,5 ° C | |
| 7 | Per sempre | 4 ° C |
Tabella 2: qPCR programma per misura M. marinum DNA. Un protocollo di qPCR progettato secondo le istruzioni del produttore e ottimizzato per la misura M. marinum del DNA dai campioni di zebrafish.
| Tempo | Temperatura |
| 5 min | 25 ° C |
| 30 min | 42 ° C |
| 5 min | 85 ° C |
| per sempre | 4 ° C |
Tabella 3: programma di sintesi di cDNA. Protocollo per la sintesi di cDNA dal RNA estratto di un zebrafish infetto secondo le istruzioni del produttore.
| Passo | Tempo | Temperatura |
| 1 | 30 s | 95 ° C |
| 2 | 12 s | 95 ° C |
| 3 | 30 s | Ricottura ° C |
| 4 | Andare al passaggio 2. per 39 volte | |
| 5 | Fusione di analisi della curva di 65 – 95 ° C con intervalli di 0,5 ° C | |
| 6 | Per sempre | 4 ° C |
Tabella 4: programma di qPCR per misurare l'espressione genica dell'host. Un protocollo di qPCR progettato secondo le istruzioni del produttore e ottimizzato per misurare l'espressione di geni diversi zebrafish.
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Discussion
Qui descriviamo un'applicazione basata su qPCR per misurare micobatteriche carichi da DNA Estratto da tessuti infettati sperimentalmente zebrafish adulto. Questa applicazione è basata su primer disegnati intorno ai 16S-23S rRNA distanziatore interno trascritto sequenza40. Il carico totale micobatterico in un campione di pesce è stimato utilizzando una curva standard preparata dal DNA Estratto da un numero noto di micobatteri coltivati e supponendo che un batterio ha una copia del suo genoma in un dato momento. Limite di rilevabilità della qPCR M. marinum -è di circa 100 unità18di formazione di colonie. Un chiaro vantaggio del metodo rispetto al tradizionale placcatura è che sia attivi e divisione batteri dormienti possono essere rilevati. Inoltre, un problema comune di contaminante crescita su piastre di coltura dai tessuti di zebrafish è aggirato da questo approccio. Tuttavia, come il DNA è utilizzato come modello, è possibile che alcune copie misurate può essere derivato dal DNA dei batteri che sono morti molto recentemente. Un vantaggio significativo del protocollo basati su acido nucleico è che come sia DNA e RNA (nonché proteine, non descritte qui) possono essere estratti dallo stesso individuo, micobatterica dell'individuo possa essere combinato con dati di espressione genica di entrambi i host e i batteri.
Il dosaggio di M. marinum è un determinante critico dell'esito dell'infezione. Il basso M. marinum (~ 20 – 90 CFU) dose di infezione produce uno spettro di Stati di malattia con latenza come la forma più comune. Se la dose di infezione è nell'ordine di migliaia, una malattia più progressiva si sviluppa nella maggior parte degli individui. Poiché la dose infettiva naturale è noto per essere bassi in tubercolosi umana41, usando una dose bassa di M. marinum nel modello zebrafish è in grado di produrre un'infezione più naturale. Per raggiungere la dose corretta, assicurarsi di convalidare il rapporto tra il OD600 e unità formanti colonie prima di iniziare qualsiasi esperimenti. La normale variazione delle dosi placcato infezione è circa il 30% e non è considerata un problema. Tuttavia, è importante verificare che il volume intero 5 µ l della sospensione batterica rimane dentro il pesce. Fuoriuscita della soluzione iniezione causerà ulteriore variazione della dose di infezione. Oltre alla dose di infezione, il ceppo di batteri può influenzare la progressione di malattia. È stato dimostrato che la virulenza dei diversi M. marinum ceppi possono alterare tra i ceppi. I due ceppi più comunemente utilizzati sono ATCC927 (sforzo isolato utilizzato in questi esperimenti di pesce) e il ceppo di M. Tuttavia, questi ceppi differiscono notevolmente nella loro virulenza. Il ceppo isolato umano di M si sviluppa una malattia più progressiva, considerando che il ceppo isolato pesce produce una malattia più lieve pozzo-adatto per studiare la forma latente della infezione micobatterica33. La virulenza dei batteri all'interno di un ceppo può anche alterare se i batteri è in serie trasferita da una cultura a altra, che può essere evitato prendendo micobatteri freschi da un freezer stock abbastanza spesso.
In vitro coltura di lentamente divisione M. marinum senza antibiotici è soggetta a contaminazioni. Di conseguenza, la gestione dei batteri richiede rigoroso approccio asettico effettuato in cappa a flusso laminare. Possibili contaminazioni nella cultura possono essere rilevata come troppo alto un valore di600 OD, strana sospensione batterica o colonie. M. marinum colonie sono normalmente fuzzy-edged, piatto e opaco colore bianco. M. marinum culture sono sensibili alla luce e iniziano a produrre il pigmento giallo quando esposto alla luce. Questo pigmento giallo può essere utilizzato per distinguere le colonie di M. marinum da altri batteri dopo le infezioni. Contaminanti possono causare il pesce a morire presto dopo l'infezione. Di solito, i primi sintomi di un'infezione della basso-dose non prima di 3 settimane dopo l'infezione e qualsiasi mortalità prima di questo punto di tempo sono probabilmente dovuto contaminazione nella sospensione batterica o trauma indotto durante l'iniezione.
Zebrafish adulto sono molto sensibili a estere etilico dell'acido 3-aminobenzoic e non sopravvivere se il tempo di esposizione è troppo lungo o la concentrazione di anestetico è troppo alto. Pertanto, quando infettare, zebrafish deve essere esposta all'anestetico solo per il minimo di tempo per raggiungere buona anestesia (~ 1 – 2 min). Dopo l'infezione, zebrafish adulto sono allevati in gruppi alla temperatura dell'acqua di 26 – 28 ° C. Se la temperatura è superiore o inferiore a questo, potrebbe influenzare il tasso di crescita di M. marinum e cinetica dell'infezione. Inoltre, la qualità dell'acqua serbatoio (qualità microbiologica, concentrazione salina, pH, saturazione dell'ossigeno) è una parte importante garantire un esperimento riuscito. Monitoraggio dell'integrità dei pesci deve essere effettuata tutti i giorni e pesci che mostrano sintomi di infezione devono essere rimossi dal gruppo ed eutanasia. Se i pesci muoiono nel serbatoio, l'altro pesce potrebbe diventare re-infettato attraverso l'intestino, che interesserà la progressione dell'infezione.
Il modello larvale di zebrafish comunemente usati della tubercolosi è applicabile studio dell'immunità innata, che dirige gli esperimenti di un sottoinsieme limitato di interazioni ospite-microbo. L'uso di zebrafish adulto permette di studiare le risposte immunitarie sia innate che adattative in un modello versatile18,32,39. Zebrafish adulto si presenta come un conveniente modello vertebrato per studiare l'intero spettro della tubercolosi. Con esposizione a basse dosi di M. marinum, 7% della popolazione ittica sviluppare malattia progressiva primaria, 10% sono in grado di sterilizzare l'infezione, 65% sviluppare malattia latente e nel 18% riattivazione spontanea si verifica (Figura 2). Lo spettro di malattia molto simile a quello visto in tubercolosi umana, in cui la stragrande maggioranza sviluppa una malattia latente, circa 4 – 14% produrre infezione primaria attiva entro i primi cinque anni dopo l'infezione42, 10 – 20% di pesantemente persone esposte sembrano essere in grado di sterilizzare l' infezione43 e44riattivare il 5 – 10% delle infezioni latenti. Differenze nella genetica dei padroni di casa colpisce la suscettibilità per la tubercolosi e la progressione di malattia45. Questo è visto anche nella popolazione zebrafish che è geneticamente molto eterogenea a differenza di molti altri laboratorio animali46,47. La variazione genetica naturale lo rende un modello altamente applicabile nella ricerca di risposte immunitarie ottimale in questa malattia multifattoriale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal finlandese Cultural Foundation (H.L.), Tampere tubercolosi Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), Fondazione dell'associazione anti-tubercolosi finlandese (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius Foundation (M.P.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane e Aatos Erkko Foundation (M.P.) e Accademia di Finlandia (M.P.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo e Jenna Ilomäki sono riconosciuti per la loro assistenza tecnica. Gli autori riconoscono il laboratorio di Zebrafish Tampere per il loro servizio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27 G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30 G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 mL homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
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