Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Modellering tuberkulose i Mycobacterium marinum inficeret voksen zebrafisk

Published: October 8, 2018 doi: 10.3791/58299
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Oral and Maxillofacial Unit, Tampere University Hospital

Summary

Vi præsenterer her, en protokol til model menneskelige tuberkulose i en voksen zebrafisk ved hjælp af dens naturlige patogen Mycobacterium marinum. Ekstraherede DNA og RNA fra de indre organer hos inficerede zebrafisk kan bruges til at afsløre alt mykobakterielle belastninger i fisk og værtens immunrespons med qPCR.

Abstract

Mycobacterium tuberkulose er i øjeblikket den dødeligste menneskelige patogen forårsager 1,7 millioner dødsfald og 10,4 millioner infektioner hvert år. Eksponering for denne bakterie forårsager en bred sygdom spektrum i mennesker lige fra en steriliseret infektion til et aktivt fremadskridende dødelig sygdom. Den mest almindelige form er den latent tuberkulose, som er asymptomatiske, men har potentiale til at genaktivere i et fulminant sygdom. Voksen zebrafisk og dens naturlige patogen Mycobacterium marinum har for nylig vist sig for at være en relevant model til at studere det brede sygdom spektrum af tuberkulose. Vigtigere, kan spontane ventetid samt reaktivering og adaptive immunrespons i forbindelse med mykobakterielle infektion studeres i denne model. I denne artikel vil beskrive vi metoder for eksperimentel infektion af voksen zebrafisk, indsamling af indre organer til udvinding af nukleinsyrer til måling af mykobakterielle belastninger og vært immunrespons ved kvantitativ PCR. Den i in-House udviklede, M. marinum -specifikke qPCR analyse er mere følsomme end de traditionelle plating metoder som det registrerer også DNA fra ikke-dividere, sovende eller for nylig døde mykobakterier. Som både DNA og RNA er udvundet fra den samme person, er det muligt at studere forholdet mellem den syge stat og vært og patogen genekspressionen. Voksen zebrafisk model for tuberkulose dermed præsenterer sig selv som en yderst relevant, ikke-pattedyr i vivo system at studere vært-patogen interaktioner.

Introduction

Zebrafisk (Danio rerio) er et udbredt dyremodel i biomedicinsk forskning, og det er en accepteret model for fælles hvirveldyr biologi. For zebrafisk er blevet tilpasset til mange forskningsområder modellering menneskelige sygdomme og lidelser lige fra kræft1 og hjertesygdom2 til infektion og immunologiske undersøgelser af flere bakterielle 3 og virusinfektioner4 , 5. Derudover ex utero udviklingen af zebrafisk embryoner har gjort zebrafisk en populær model i udviklingsmæssige biologi6 og toksikologi7,8.

I mange områder af forskning, herunder infektion biologi, er optisk gennemsigtig zebrafisk larver almindeligt anvendt. De første immunceller vises inden for 24 timer post befrugtning (hpf), når primitive makrofager er opdaget9. Neutrofiler er de næste immunceller at dukke op omkring 33 hpf10. Zebrafisk larver er således muligt for at studere de tidlige stadier af infektion og rollen af medfødt immunitet i mangel af adaptive immunceller11. Men de voksne zebrafisk med sit fuldt funktionel adaptive immunsystem giver et ekstra lag af kompleksitet til infektion eksperimenter. T-celler kan påvises omkring 3 dage efter befrugtningen12, og B-celler er i stand til at producere funktionelle antistoffer ved 4 uger post befrugtning13. Den voksne zebrafisk har alle de vigtigste modstykker af de pattedyr medfødte og adaptive immunsystem. De væsentligste forskelle mellem immune systems af fisk og mennesker er fundet i antistof isotypes såvel som i anatomi af lymfoide væv. For zebrafisk har kun tre antistof klasser14, der henviser til, at mennesker har fem15. I mangel af knoglemarven og lymfeknuderne, den primære lymfoide organer i fisk nyre og thymus16 og milten, nyrerne og tarmen tjene som sekundære lymfoide organer17. Trods disse forskelle, med dens fulde immun arsenal af medfødte og adaptive celler, er de voksne zebrafisk en yderst relevant, nem at bruge, ikke-pattedyr model for vært-patogen interaktion undersøgelser.

For zebrafisk er sidst blevet etableret som en mulig model til at studere tuberkulose18,19,20,21,22. Tuberkulose er en luftbåren sygdom forårsaget af Mycobacterium tuberkulose. Ifølge World Health Organization, tuberkulose forårsaget1,7 million dødsfald i 2016 og er den hyppigste årsag til død af en enkelt patogen verdensomspændende23. Mus24,25, kaniner26 og ikke-menneskelige primater27 er det mest kendte dyr modeller i tuberkulose forskning men hvert ansigt deres begrænsninger. Primat model af M. tuberkulose -infektion ligner den menneskelige sygdom mest tæt, men ved hjælp af denne model er begrænset på grund af alvorlige etiske overvejelser. Andre animalske modeller er hæmmet af værtsspecificitet M. tuberkulose , der påvirker sygdommen patologi. Sandsynligvis det største problem i modellering tuberkulose er den bredt spektrum af infektion og sygdom resultater i den menneskelige sygdomme: tuberkulose er en meget heterogen sygdom spænder fra sterilisering immunitet til latente, aktive og reaktiveret infektion28 , som kan være svært at reproducere og model eksperimentelt.

Mycobacterium marinum er en nær slægtning af M. tuberkulose med ~ 3.000 orthologous proteiner med 85% aminosyre identitet29. M. marinum inficerer naturligt zebrafisk producerer granulomer, kendetegnende for tuberkulose, i sit indre organer19,30. I modsætning til andre animalske modeller anvendes i tuberkulose forskning, zebrafisk producerer mange afkom, det kræver kun en begrænset plads og vigtigst, det er neurophysiologically de mindst udviklede hvirveldyr tuberkulose model tilgængelig. Derudover forårsager M. marinum infektion latent infektion, aktiv sygdom eller endda Sterilisation af mykobakterielle infektion i voksen zebrafisk nøje efterligne spektrum af sygdom resultater af menneskelig tuberkulose19, 31 , 32. her, vi beskriver metoder til den eksperimentelle tuberkulose model af voksne zebrafisk ved at indsprøjte M. marinum ind i bughulen og bruge kvantitativ PCR til at måle mykobakterielle belastninger og immunrespons fra zebrafisk vævsprøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle zebrafisk eksperimenter er blevet godkendt af dyr eksperiment bestyrelsen i Finland (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Metoder er udført efter loven (497/2013) og regeringsbekendtgørelse (564/2013) om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige eller uddannelsesformål i Finland.

1. dyrkning af Mycobacterium marinum

Bemærk: Da Mycobacterium marinum er en patogen kan forårsage overfladiske infektioner hos mennesker, finde ud af de lokale retningslinjer for personlig sikkerhed og smittefarligt affald bortskaffelse før du begynder at arbejde med denne bakterie.

  1. Kultur M. marinum på en 7 H 10 plade suppleret med 10% OADC (oliesyre, albumin, dextrose, katalase) berigelse og 0,5% v/v i glycerol ved 29 ° C i mindst 5 dage. Vedligeholde M. marinum kulturer ved at tage friske bakterier fra fryseren hver anden uge og overføre på en ny tallerken hver anden uge.
    Bemærk: M. marinum er en naturlig fisk patogen inficerer akvatiske arter og det er vigtigt at tage forholdsregler for ikke at forurene zebrafisk bestande med bakterier. Inficerede zebrafisk og forurenet med bakterier skal holdes adskilt fra avl faciliteter.
  2. Bruge en steril 1-µL podning loop til aseptisk overføres en oejefuld af M. marinum bakteriel massen til en celle kultur målekolbe indeholdende 10 mL af 7 H 9 medium med 10% ADC (albumin, dextrose, katalase) berigelse, 0,2% v/v Polysorbat 80 og 0,2% v/v i glycerol. Kultur i 3 – 4 dage til ca en OD600 (ekstinktionen) på 0,7 ved 29 ° C i mørke uden rystelser. Forlade fælles landbrugspolitik løs, eller bruge et filter cap, at give mulighed for tilstrækkelig udveksling af gasser.
    Bemærk: Polysorbat 80 er føjet til medium til at forhindre en sammenlægning af bakterier. Derudover medfører udsættelse for lys fænotypiske forandringer i bakteriel kolonier (f.eks, de farveændringer fra hvid til gul). For at undgå dette, skal du holde kulturerne i mørke.
  3. Måle værdien OD600med et spektrofotometer. Fortynd den flydende kultur til en OD600 af 0,07-0,09 og fortsat dyrkning i 2 dage ved 29 ° C i mørke uden rystelser. Forlade fælles landbrugspolitik løs.
    Bemærk: I løbet af disse to dage, den bakterielle suspension vil nå en OD600ca 0,5 svarende til en tidlig log-fase.

2. forberedelse af bakteriel løsning til at inficere voksen zebrafisk

  1. Overføre den bakterielle suspension i en stor sterile kuvette eller en 15 mL tube og placere den i mørke ved stuetemperatur i 15 min. at tillade de største klumper at bilægge.
  2. Den top 5-7 mL af suspensionen overføres til en ren rør eller en kuvette og måle OD600. Brug denne top fase af suspension for infektioner.
  3. Indsamle 1 mL af M. marinum kultur i en frisk rør og centrifugeres i 3 min 10,000 x g. Fjern supernatanten og resuspenderes i 1 mL sterilt 1 x PBS.
  4. Fortyndet til at nå den ønskede bakterielle koncentration ved hjælp af steril 1 x PBS med 0,3 mg/mL phenol rød som en tracer. Opdele den fortyndede suspension i tre delprøver.
    Bemærk: Brug en forudbestemt OD600 vs CFU (kolonidannende enheder) / µL kurve til at anslå fortyndingen påkrævet for at få det ønskede antal bakterier i 5 µL injektion bind34. Sammenhængen mellem OD600 og koncentrationen af den bakterielle suspension skal valideres, før du starter de egentlige infektion eksperimenter. Reserver to uger til at indsamle denne valideringsdata.
  5. Bruger en 1 mL sprøjten, langsomt trække suspension gennem en 27 G nål 3 x. For hver delprøve, udføre dette trin lige før brug.
    Bemærk: Brug ikke den samme bakterielle løsning for mere end 2 h.

3. eksperimentelle M. marinum infektion med Intraperitoneal injektion

  1. Med pipette overfoeres 5 µL dråber af den fortyndede bakterielle løsning på et stykke af parafilm film og trække slipværktøjet til en 30 G insulin nål.
  2. Bruge 5 – 8 måned-gamle wild-type og rag1−/−hu1999 mutant fisk for eksperimentet. Bedøver voksen zebrafisk i tank vand med 0,02% 3-aminobenzoic syre ethylester (pH 7,0). Placer fisk ventrale side op ind i en spalte på en fugtig opskummet plast.
    Bemærk: Rag-/- mutant fisk er ikke i stand til at gennemgå somatisk rekombination og producerer funktionelle T- og B-cellerne.
  3. Injicere nål mellem Bugfinnerne på en cirka 45° vinkel. Hold nålen åbningen opad for at konstatere, at hele åbningen inde i bughulen. Langsomt injicere den bakterielle suspension og forsigtigt fjerne nålen.
    Bemærk: I tilfælde af den røde tracer siver ud af fisk ved injektion, udelukke fisk fra eksperimentet.
  4. Umiddelbart efter injektion, overføre fiskene ind i et opsving tank med frisk vand.
  5. Tage prøver af den bakterielle suspension på 7H 10 plader hver 15 min fra bakteriel alikvot i brug og Inkuber bakterier ved 29 ° C i 5 dage og kontrollere infektion dosis ved optælling af kolonierne på pladerne.
  6. Regelmæssigt kontrollere fisken trivsel og aflive enhver fisk med symptomer på infektion med over 0,02% koncentration af 3-aminobenzoic syre ethylester (pH 7,0).
    Bemærk: Ca, 7% af den voksne zebrafisk inficeret med 34 ± 15 CFU og 30% af zebrafisk inficeret med 2029 ± 709 CFU har haft symptomer ved 8 uger19. Symptomerne kan omfatte unormal svømning, manglende respons til touch, gispende, ødem eller observerbare spilde.
  7. Vedligeholde zebrafisk ifølge den fælles standarder35.

4. opkrævning af indre organer

  1. Aflive zebrafisk med en overdosis af 3-aminobenzoic syre ethylester (over 0,02% koncentration, pH 7,0) i tank vand.
  2. Indsæt en pin posteriort for branchiostegal stråler og en anden gennem halen til tack fisk på platformen.
  3. Åbne i hele bughulen med en skalpel og indsamle de indre organer ved hjælp af en lille ske og skarp-ended pincet. Start fra hjertet og arbejde langs rygsøjlen imod halen at løsrive alle indre organer i én blok.
    Bemærk: Sørg for at indsamle alle nyrevæv ved at skrabe langs rygsøjlen med skeen.
  4. Endelig, bruge pincet til at frigøre gut ved siden af kloak og overføre organerne til en 1,5 mL homogenisering tube med seks 2,8 mm keramik perler. Straks sted på tøris til at fryse prøven. Prøven kan opbevares ved-80 ° C indtil homogeniseret.
  5. Skyl instrumenterne med 70% ethanol mellem individer.

5. homogenisering og RNA udvinding fra et orgel blok.

Bemærk: Metoden er ændret fra Stanford University protokoller36.

  1. Tilføje guanidin kaliumthiocyanat-phenol løsning anvendes til nukleinsyre udvinding (Table of Materials) på toppen af prøven til et samlet volumen på 1.500 µL. sikre, at prøven dækker et maksimum på 10% af den samlede mængde.
    Forsigtig: Den forventede mængde af den høstede væv er 100 µL. guanidin kaliumthiocyanat-phenol løsning indeholder giftige og irriterende forbindelser og kræver beskyttelsesbeklædning, nitrilhandsker og arbejder i et stinkskab. Ikke kombinere med blegemiddel som dette vil medføre dannelse af giftige gasser. Læs det materielle sikkerhedsdatabladet (MSDS) før brug.
  2. Homogeniseres prøver ved hjælp af en perle-slå homogeniseringsapparat 3 gange for 40 s ved 3.200 omdrejninger i minuttet. Cool på isen for 30 s mellem cyklusser. Der sonikeres de homogeniserede prøver i et vandbad i 9 min.
  3. Centrifugeres prøver på 12.000 x g i 10 min. ved 4 ° C og flytte 1.000 µL af den ryddet homogenatet ind i en frisk microcentrifuge rør.
  4. Tilføje 200 µL chloroform, straks mix af vortexing for 15 s og inkuberes i 2 min. ved stuetemperatur.
    Forsigtig: Chloroform er en giftig og lokalirriterende stof indånding, indtagelse eller kontaktet med hud eller øjne. Brug nødvendigt sikkerhedsudstyr til personlig beskyttelse og arbejde i et stinkskab. Læs det materielle sikkerhedsdatabladet (MSDS) før brug.
  5. Der centrifugeres ved 12.000 x g i 15 min. ved 4 ° C for at adskille de vandige og den organiske fase.
  6. Omhyggeligt, overføre 500 µL af den øverste fase til en frisk rør til at undgå at forurene RNA. Fjern og kassér resten af den vandige fase (~ 100 µL) og gemme interphase og organiske fase ved 4 ° C for DNA-ekstraktion.
    Bemærk: Den øverste fase indeholder RNA.
  7. Tilsættes 500 µL af 2-propanol og straks blandes ved vortexing for 15 s. Incubate i 10 min ved stuetemperatur til at udfælde RNA.
  8. Der centrifugeres ved 12.000 x g i 10 min. ved 4 ° C og pellet RNA. Fjern supernatanten ved pipettering.
  9. Der tilsættes 1 mL af 75% ethanol og vortex for 10 s.
    Bemærk: Protokollen kan blive standset her, og prøverne opbevares natten over ved 4 ° C.
  10. Der centrifugeres ved 7.500 x g i 5 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten ved pipettering.
  11. Gentag trinene vask 5.9 – 5.10. Fjern supernatanten omhyggeligt af pipettering og lad pelleten lufttørre i et stinkskab.
  12. Opløse RNA pellet i 500 µL nukleasen-gratis vand og holde prøver på is. Bestemmelse af koncentrationen med Spektrofotometer microvolume eller tilsvarende udstyr. Gemme RNA ved-80 ° C.

6. rensning af co udpakkede zebrafisk og mykobakterielle DNA

  1. Forberede en back-ekstraktionsbuffer (BEB) ved at opløse 118.2 g af guanidin kaliumthiocyanat (slutkoncentration 4 M), 3.68 g natrium citrat (slutkoncentration 50 mM) og 30.29 g af Tris gratis base (slutkoncentration 1 M) i 120 mL nukleasen-gratis vand (maj kræve omrøring natten over). Tilføje nukleasen-gratis vand til en endelige samlede rumfang 250 mL og filter til at sterilisere løsningen.
    Bemærk: Denne buffer kan opbevares ved stuetemperatur i op til 6 måneder. Kombiner ikke BEB med blegemiddel, som de reagerer for at producere giftige gasser såsom hydrogen chlorid og hydrogencyanid.
  2. Bruge interphase og organiske fase af prøven til at udtrække mykobakterielle DNA. Tilsæt 500 μL af BEB at hver tube. Blandes grundigt i 10 min ved inversion ved stuetemperatur.
  3. Centrifugeres rør på 12.000 x g i 30 min. ved stuetemperatur og omhyggeligt overføre 500 µL af den øverste vandige fase indeholder DNA til en ny tube.
  4. Tilføj 400 μL 2-propanol. Mix af invertere og inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur.
  5. Centrifugeres prøver på 12.000 x g i 15 min. ved 4 ° C. En pellet, der indeholder DNA skal være synlig på dette punkt. Fjern forsigtigt supernatanten af pipettering.
  6. Tilføje 800 μL af 70% ethanol. Afvaske pelleten ved inversion. Gøre ikke vortex prøverne på dette punkt, som genomisk DNA nedbryder let.
  7. Centrifugeres prøver på 12.000 x g i 15 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten ved pipettering. Gentag ethanol vask (trin 6.6 og 6.7).
  8. Fjern ethanol ved omhyggeligt pipettering. Lad prøverne lufttørre for 5-10 min. Opløs pellet i 200 μl nukleasen-gratis vand.
  9. Foranstaltning DNA koncentrationer med Spektrofotometer microvolume eller tilsvarende udstyr. DNA kan opbevares ved 4 ° C eller ved-20 ° C til langtidsopbevaring.

7. kvantitativ PCR for måling mykobakterielle belastninger

  1. Forberede qPCR reaktion blander med no-ROX (carboxy-X-rodamin) mod den M. marinum interne transskriberede spacer (ITS) mellem 16S-23S ITS ifølge producentens anvisninger med MMITS1 primere (tabel 1). Afpipetteres reaktion mix og prøve fortyndinger som dubletter på en 96-brønd plade egnet til qPCR. Omfatte en DNA standard fortyndingsrække af en kendt mængde af bakterier i hver analyseserie.
    NOTE: Den forventede M. marinum belastning pr. fisk kan variere fra 0 CFU til 1.000.000 CFU på 4 wpi. QPCR assay kan udføres også med andre qPCR kits men den udgloedning temperatur for primere skal re optimeret.
  2. Forsegle pladen med en optisk gennemsigtig film og centrifugeres plade på 2.000 x g i 2 min. ved 4 ° C.
  3. Køre programmet qPCR vist i tabel 2.
  4. Du bruger standardkurven, beregne antallet af bakterier i eksemplet hele fisk.

8. DNase behandling af RNA prøver

  1. For at fjerne eventuelle resterende spor af genomisk DNA fra RNA, foretage DNase I behandling. Tø RNA prøver på is.
    Bemærk: Sørg for at bruge kun RNase-fri udstyr og løsninger og tørre den arbejdende overflade og pipetter med en dekontaminering reagens eliminerer RNases (Table of Materials) før du begynder at arbejde. Bære en langærmet laboratoriekittel og handsker til at beskytte dine prøver.
  2. Forberede 10 μL DNase jeg reaktion blander på is efter fabrikantens anvisninger. Mix 1 μL af DNase jeg, 1 μl af 10 x DNase buffer og 8 μL af RNA sample, herunder et maksimum på 1 μg af RNA.
  3. Forsigtigt blandes reaktioner (ingen vortexing) og Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
  4. Før varme-inaktivering, tilføje 1 µL af 50 mM EDTA til hver 10 µL prøve. Hvis EDTA ikke er tilføjet, vil RNA undergå kemisk forringelse, når det opvarmes.
  5. Der inkuberes i 10 min. ved 65 ° C varme-inaktivere DNase I. fortsætte direkte til cDNA syntese eller gemme den DNase-behandlede RNA ved-80 ° C.

9. cDNA syntese

  1. Holde alle reagenser og prøver på is og forberede reaktion blandet ifølge producentens anvisninger. For en 5 μl mastermix, omfatter 1 μL af Reverse transkription Master Mix, 3 μL nukleasen-gratis vand og 1 μL DNase behandlet RNA.
  2. Forsigtigt blandes reverse transkription reaktioner og kortvarigt spin røret, hvis det er nødvendigt.
  3. Placer prøver i en PCR-maskine og bruge programmet vist i tabel 3.
  4. Fortynd cDNA i nukleasen-gratis vand til qPCR til en maksimal koncentration af 2,5 ng/μl, hvis nødvendigt. cDNA kan opbevares ved-20 ° C.

10. måling zebrafisk genekspression af kvantitativ PCR

  1. Forberede en qPCR master mix på is efter fabrikantens anvisninger og beskytte mod lys. Bruge primere indført i tabel 1.
    Bemærk: Hvis du vil beregne fold af induktion for hvert gen, måle udtryk også fra en poolet baseline prøve udvundet fra 6 sunde zebrafisk.
  2. Forberede replikater af hver prøve og afpipetteres reaktion blander på en qPCR tallerken. Forsegle pladen med en optisk gennemsigtig film og centrifugeres plade på 2.000 x g i 2 min. ved 4 ° C før du starter kørslen.
  3. Kør qPCR programmet vist i tabel 4 med den udgloedning temperatur afhængigt af primer par bruges (tabel 1).
  4. Analysere gen expression forholdet i forhold til et hus-holder gen (loopern437) med den ΔCt metode ved hjælp af ligningen:
    Equation

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Naturlige fisk patogen Mycobacterium marinum inficerer de indre organer hos zebrafisk og producerer en systemisk infektion med histologisk synlige granulomer19. Voksen zebrafisk er inficeret med M. marinum ved en intraperitoneal injektion. DNA og RNA er udvundet, og mykobakterielle belastningen måles ved kvantitative polymerase kæde reaktion (qPCR) ved hjælp af DNA som skabelon. Omridset af metoden, der er vist i figur 1.

Startantallet af mykobakterier bruges til at inficere fisken er en kritisk faktor for resultatet af infektion. En høj infektion dosis af M. marinum (~ 2.000 CFU) fører til en progressiv sygdom, hvor de mykobakterielle belastninger fortsætter med at stige indtil den gennemsnitlige bakteriemængde når omkring fem millioner bakterier (figur 2A) i sidste ende dræbe fisken. En lav dosis (~ 20-90 CFU) M. marinum fører til udvikling af en sygdom spektrum svarende til den, set i menneskelige tuberkulose (figur 2B). Den bakteriemængde fortsætter med at stige indtil ca 4-7 uger (figur 2A og figur 3A), efter som i fleste af fiskene sygdommen når et steady-state. Figur 2B viser et eksempel på fordelingen af sygdommen resultater med en lav dosis infektion: ca. 7% af de inficerede zebrafisk var ude af stand til at begrænse den bakterievækst. Disse personer udviklet en primær progressiv sygdom og de døde to måneder efter infektionen. Omkring ryddet 10% af personerne den mykobakterielle infektion af 4 uger. De resterende 65% af befolkningens fisk udviklet en latent mykobakterielle infektion med stabil bakteriel byrder. Mellem 8 og 32 uger efter infektion, i 18%, genaktiveres de latent infektion spontant fører til progression af sygdommen.

Ved hjælp af rag-/- mutant fisk, det er muligt at studere rollen af adaptive immunrespons i den voksne fisk. Rag-/- mutant fisk ikke tilstrækkeligt begrænse væksten af mykobakterier fører til højere bakteriel belastninger (figur 3A) og øget sygelighed (figur 3B), klart viser betydningen af adaptive immunitet i kontrollerende mykobakterielle infektion. Også, vigtigheden af adaptive responser i fremmane visse cytokin respons i mykobakterielle infektion kan studeres i denne model. Her viser vi, at den adaptive respons er nødvendig for effektiv induktion af interleukin 4 (IL4) (figur 3 c), men er undværes til induktion af interferon-γ (IFNγ) på 4 wpi (figur 3D). Interferon-γ er en cytokin kørsel respons mod intracellulære patogener interleukin 4 er en fælles mægler i den adaptive immunrespons mod ekstracellulære patogener. De betydeligt højere udtryk niveauer af il4 i gruppen wild-type i forhold til rag-/- mutant fisk refererer til vigtige adaptive humorale respons i mykobakterielle infektionen (figur 3 c).

Figure 1
Figur 1: arbejdsgang for at studere udviklingen af mykobakterielle belastninger i den voksne zebrafisk. Voksen zebrafisk er inficeret med en intraperitoneal injektion af M. marinum. DNA og RNA er udvundet fra de indre organer hos fisk og M. marinum belastning og værtens immunrespons analyseres med kvantitative Polymerasekædereaktionen (qPCR). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Injektion af M. marinum i voksen zebrafisk forårsager et spektrum af sygdomstilstande. (A) zebrafisk blev sprøjtet med en lav (34 ±15 CFU) eller en høj dosis (2029 ±709 CFU) af M. marinum. Gennemsnitlig belastninger for 5 fisk (undtagen 32 uger høj dosis, n = 2) er vist med SD. lav-dosis statistik: * p < 0,05 sammenlignet med 1 uge, ** p < 0,05 sammenlignet med 1 og 2 uge. Højdosis statistik: *** p < 0,05 sammenlignet med 1, 2, 8, 11 og 20 uge ¤ lavdosis vs. høj dosis p < 0,05. Ændret fra Parikka et al. 201219. (B) typisk fordeling af sygdom resultater inden for en vildtype zebrafisk befolkning inficeret med en lav-dosis af M. marinum. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Adaptive immunitet påvirker forløbet af mykobakterielle infektion i den voksne zebrafisk. Voksen vildtype (wt) og rag1 (−/−) zebrafisk var smittet med en lav dosis (n = 30) af M. marinum. (A) den gennemsnitlige mykobakterielle belastninger blev målt ved qPCR på 2, 4 og 7 uger efter infektion (wpi) (n = 10) * P < 0,05. (B) fisken var aflivet ved udvikling af symptomer på sygdommen og overlevelse parceller blev oprettet. (C). udtryk niveauerne af il4 blev målt ved 4 wpi. (D) udtrykket niveauer af IFNγ blev målt ved 4 wpi. (A og B) ændret fra Parikka et al. 201219. (C og D) Modificeret fra Hammarén et al. 201438. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Gen Primer sekvens Udglødning temperatur
MMITS1 F: CACCACGAGAAACACTCCAA 65
16s-23SITS Locus AB548718 for M. marinum kvantificering R: ACATCCCGAAACCAACAGAG
loopern4 F: TGAGCTGAAACTTTACAGACACAT 61
Udtrykt gentagne elementer R: AGACTTTGGTGTCTCCAGAATG
il4 GCAGGAATGGCTTTGAAGGG 59,5
ZDB-GEN-100204-1 GCAGTTTCCAGTCCCGGTAT
ifnγ1-2 F: GGGCGATCAAGGAAAACGACCC, 61
ZDB-GEN-040629-1 R: TAGCCTGCCGTCTCTTGCGT

Tabel 1: Primer sekvenser og udgloedning temperaturer. Sekvenser af primere bruges og deres optimeret udgloedning temperaturer. Primere for M. marinum 16S-23S rRNA udskrift er blevet optimeret til en No-ROX qPCR kit og de andre primere for en ROX, herunder qPCR kit.

Trin Tid Temperatur
1 3 min 95 ° C
2 5 s 95 ° C
3 10 s 65 ° C
4 5 s 72 ° C (Fluorescens påvisning)
5 Gå til trin 2. 39 gange
6 Smeltende kurve analyse 55-95° C med 0,5 ° C intervaller
7 For evigt 4 ° C

Tabel 2: qPCR program til måling af M. marinum DNA. En qPCR protokol designet efter producentens anvisninger og optimeret til at måle M. marinum DNA fra zebrafisk prøver.

Tid Temperatur
5 min 25 ° C
30 min 42 ° C
5 min 85 ° C
for evigt 4 ° C

Tabel 3: cDNA syntese program. Protokol for syntese cDNA fra den udpakkede RNA af en inficeret zebrafisk ifølge producentens anvisninger.

Trin Tid Temperatur
1 30 s 95 ° C
2 12 s 95 ° C
3 30 s Udglødning ° C
4 Gå til trin 2. for 39 gange
5 Smeltende kurve analyse 65-95 ° C med 0,5 ° C intervaller
6 For evigt 4 ° C

Tabel 4: qPCR program til måling af værtens genekspression. En qPCR protokol designet efter fabrikantens anvisninger og optimeret til at måle udtryk for forskellige zebrafisk gener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en qPCR-baseret program til at måle mykobakterielle belastninger fra DNA ekstraheret fra eksperimentelt inficerede voksne zebrafisk væv. Dette program er baseret på primere designet omkring 16S-23S rRNA interne transskriberede spacer sekvens40. Den totale mykobakterielle belastning i en fisk prøve anslås ved hjælp af en standardkurve, der er fremstillet af DNA ekstraheret fra et kendt antal kulturperler mykobakterier og under forudsætning af at en bakterie har en kopi af dens genom på et givet tidspunkt. Detektionsgraensen for M. marinum -qPCR er ca 100 kolonidannende enheder18. En klar fordel af metoden i forhold til traditionelle plating er, at både aktive og ikke-dividere hvilende bakterier kan påvises. Derudover er et fælles problem for kontaminerende vækst på kultur plader fra zebrafisk væv omgået ved denne tilgang. Men som DNA bruges som skabelon, det er muligt, at nogle af kopierne målt kan være afledt af DNA fra bakterier, der er døde for nylig. En væsentlig fordel af nukleinsyre-baseret protokol er, som både DNA og RNA (såvel som proteiner, ikke beskrevet her) kan udtrækkes fra den samme person, mykobakterielle belastningen af enkelt kan kombineres med genekspression data for både den vært og bakterier.

Dosering af M. marinum er en kritisk faktor for resultatet af infektion. Den lave M. marinum (~ 20-90 CFU) infektion dosis producerer et spektrum af sygdom stater med ventetid som den mest almindelige form. Hvis infektionen dosis er i størrelsesordenen tusindvis, udvikler en mere progressiv sygdom i hovedparten af personer. Som den naturlige infektiøse dosis er kendt for at være lav i menneskelige tuberkulose41, er ved hjælp af en lav dosis af M. marinum i zebrafisk model tilbøjelige til at producere en mere naturlig infektion. For at nå den korrekte dosis, Sørg for at validere forholdet mellem OD600 og kolonidannende før du starter enhver eksperimenter. Den normale variation af forgyldt infektion doser er ca 30% og betragtes ikke som et problem. Det er dog vigtigt at kontrollere, at hele 5 µL volumen af den bakterielle suspension forbliver inde i fisken. Utætte af injektion løsning vil forårsage ekstra variation i infektion dosis. Ud over infektion dosis, kan stamme af bakterier påvirke sygdomsprogression. Det har været vist som virulence af de forskellige M. marinum stammer kan ændre mellem stammer. De to mest almindeligt anvendte stammer er ATCC927 (fisk isolerede stamme disse forsøgsdyr) og M-stamme. Men disse stammer er meget forskellige i deres virulens. Den menneskelige-isoleret M stamme udvikler en mere progressiv sygdom der henviser til, at den fisk-isolerede stamme producerer en mildere sygdom godt egnet til at studere den latente form af mykobakterielle infektion33. Virulens af bakterier i en stamme kan også ændre hvis bakterierne seriefremstillede overføres fra én kultur til en anden, som kan forebygges ved at tage friske mykobakterier fra en fryser lager ofte nok.

In vitro dyrkning af langsomt dividere M. marinum uden antibiotika er tilbøjelige til forureninger. Derfor, håndtering af bakterier kræver strenge aseptisk tilgang gennemført i en laminar flow hætte. Eventuel kontamination i kultur kan påvises som for høj en OD600 værdi, mærkeligt udseende bakteriel suspension eller kolonier. M. marinum kolonier er normalt fuzzy-kantet, flad og mat hvid farve. M. marinum kulturer er følsomme over for lys og de begynder at producere gult pigment når de udsættes for lys. Denne gule pigment kan bruges til at skelne M. marinum kolonier fra andre bakterier efter infektioner. Forurenende stoffer kan forårsage fisk at dø snart efter infektion. De første symptomer på en lav-dosis infektion vises normalt, ikke inden 3 uger efter infektion og enhver MORTALITET før dette tidspunkt er sandsynligvis på grund af forurening i den bakterielle suspension eller trauma induceret under injektion.

Voksen zebrafisk er meget følsomme over for 3-aminobenzoic syre ethylester og overleve ikke hvis eksponeringstiden er for lang eller koncentrationen af narkose er for høj. Derfor, når inficere, zebrafisk skal udsættes for narkose kun for et minimum af tid til at opnå god anæstesi (~ 1-2 min). Efter infektion, voksen zebrafisk holdes i flokke på vandtemperatur på 26-28 ° C. Hvis temperaturen er højere eller lavere end dette, kan det påvirke M. marinum vækstrate og kinetik af infektionen. Tank vandkvalitet (mikrobiologiske kvalitet, saltkoncentration, pH, iltmætning) er også en vigtig del at sikre en vellykket eksperiment. Sundhedsovervågning af fisk skal foretages dagligt og fisk, der viser symptomer på infektion bør fjernes fra gruppen og aflivet. Hvis fiskene dør i tanken, kan de andre fisk blive re inficerede gennem tarmen, som vil påvirke progression af infektion.

Almindeligt anvendte zebrafisk larve model af tuberkulose er relevant til undersøgelse medfødt immunitet, som dirigerer eksperimenter til en begrænset delmængde af host-mikrobe interaktioner. Brug af voksen zebrafisk gør det muligt at studere både medfødte og adaptive immunrespons i en alsidig model18,32,39. Voksen zebrafisk præsenterer sig selv som en bekvem hvirveldyr model til at studere hele spektret af tuberkulose. Med en lav-dosis eksponering af M. marinum, 7% af befolkningens fisk udvikle primær progressiv sygdom, 10% er i stand til at sterilisere infektionen, 65% udvikler latent sygdom og i 18% spontan reaktivering opstår (figur 2). Sygdom spektrum ligner, set i menneskelige tuberkulose, hvor langt de fleste udvikle en latent sygdom, ca. 4-14% producerer primære aktiv infektion inden for de første fem år efter infektion42, 10 – 20% af stærkt udsatte personer synes at være i stand til at sterilisere infektion43 og 5-10% af de latente infektioner genaktivere44. Forskelle i værters genetik påvirker modtagelighed for tuberkulose og sygdom progression45. Dette ses også i zebrafisk befolkningen, der er genetisk meget heterogene i modsætning til mange andre laboratorium dyr46,47. Den naturlige genetiske variationer gør det en yderst relevant model i søgen efter optimal immunrespons i denne multifaktoriel sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde er blevet støttet af den finske kulturelle fundament (HL), Tampere tuberkulose Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), grundlaget for den finske Anti-tuberkulose Association (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius Foundation (M.P.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane og Aatos Erkko Foundation (M.P.) og Finlands Akademi (M.P.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo og Jenna Ilomäki er anerkendt for deres tekniske bistand. Forfatterne anerkender Tampere zebrafisk laboratorium for deres service.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mycobacterium marinum American Type Culture Collection ATCC 927
Middlebrock 7H10 agar BD, Thermo Fisher Scientific 11799042
Middlebrock OADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Middlebrock 7H9 medium BD, Thermo Fisher Scientific 11753473
Middlebrock ADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ML
GENESYS20 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Sigma-Aldrich P4417-50TAB
Phenol red Sigma-Aldrich P3532
27 G needle Henke Sass Wolf 4710004020
1 mL syringe Henke Sass Wolf 4010.200V0
Omnican 100 30 G insulin needle Braun 9151133
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) Sigma-Aldrich A5040
1.5 mL homogenization tube Qiagen 13119-1000
2.8 mm ceramic beads Qiagen 13114-325
Ethanol, ETAX Aa Altia
2-propanol Sigma-Aldrich 278475
Chloroform VWR 22711.290
Guanidine thiocyanate Sigma-Aldrich G9277 FW 118.2 g/mol
Sodium citrate Sigma-Aldrich 1613859 FW 294.1 g/mol
Tris (free base) Sigma-Aldrich TRIS-RO FW 121.14 g/mol
TRI reagent Molecular Research Center TR118 Guanidine thiocyanate-phenol solution
PowerLyzer24 homogenizator Qiagen
Sonicator m08 Finnsonic
Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix Bioline BIO-98005
qPCR 96-well plate BioRad HSP9601
Optically transparent film BioRad MSB1001
C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system BioRad
RNase AWAY Thermo Fisher Scientific 10666421 decontamination reagent eliminating RNases
DNase I Thermo Fisher Scientific EN0525
Reverse Transcription Master Mix Fluidigm 100-6298
SsoFast Eva Green master mix BioRad 172-5211

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
  2. Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
  3. Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
  4. Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
  5. Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
  6. Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis--heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
  7. Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
  8. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  9. Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
  10. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
  11. Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
  12. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
  13. Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
  14. Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
  15. Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
  16. Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
  17. Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  18. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
  19. Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
  20. Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
  21. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
  22. Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
  23. World Health Organization. WHO Global tuberculosis report 2017. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
  24. Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
  25. Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
  26. Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
  27. Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
  28. Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
  29. Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
  30. Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
  31. Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
  32. Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
  33. Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
  34. Madigan, M., Martinko, J. Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
  35. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish:a practical approach. , Oxford University Press. Oxford. (2002).
  36. Anonymous Stanford University Protocols. , Available from: http://med.stanford.edu/labs/vanderijn-west/Protocols.html (2018).
  37. Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
  38. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
  39. Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
  40. Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
  41. Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
  42. Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
  43. Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
  44. Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
  45. Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
  46. Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
  47. Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmål 140 zebrafisk tuberkulose Mycobacterium marinum Mycobacterium tuberculosis mykobakterielle infektioner qPCR immunsystemet
Modellering tuberkulose i <em>Mycobacterium marinum</em> inficeret voksen zebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luukinen, H., Hammarén, M. M.,… More

Luukinen, H., Hammarén, M. M., Vanha-aho, L. M., Parikka, M. Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (140), e58299, doi:10.3791/58299 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter