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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Modellierung von Tuberkulose Mycobacterium Marinum infizierten Erwachsenen Zebrafisch

Published: October 8, 2018 doi: 10.3791/58299
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Oral and Maxillofacial Unit, Tampere University Hospital

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Modell menschlichen Tuberkulose in einem Erwachsenen Zebrafisch mit seiner natürlichen Erreger Mycobacterium Marinum. Extrahierte DNA und RNA aus den inneren Organen der infizierten Zebrafisch lässt sich zeigen, dass die Summe mykobakteriellen in die Fische und Immunantwort des Wirtes mit qPCR lädt.

Abstract

Mycobacterium Tuberculosis ist derzeit die tödlichsten menschlicher Erreger 1,7 Millionen Tote und 10,4 Millionen Infektionen jährlich. Belastung durch dieses Bakterium verursacht eine große Krankheit Spektrum beim Menschen von einer sterilisierten Infektion bis hin zu einer aktiv fortschreitenden tödlichen Krankheit. Die häufigste Form ist die latente Tuberkulose, die asymptomatisch, aber hat das Potential, in eine fulminante Krankheit zu reaktivieren. Erwachsenen Zebrafisch und seine natürliche Erreger Mycobacterium Marinum vor kurzem erwiesen sich ein anwendbaren Modell, das große Krankheit Spektrum der Tuberkulose zu studieren. Wichtig ist, können spontane Latenz sowie Reaktivierung und adaptive Immunantworten im Rahmen der mykobakteriellen Infektion in diesem Modell untersucht werden. In diesem Artikel beschreiben wir Methoden für die experimentelle Infektion von Erwachsenen Zebrafisch, der Sammlung der inneren Organe für die Extraktion von Nukleinsäuren für die Messung der mykobakteriellen Lasten und Host Immunantwort durch quantitative PCR. Die in-house entwickelten, M. Marinum -spezifische qPCR-Assay ist empfindlicher als die traditionellen Beschichtung-Methoden, da es auch DNA aus nicht teilt, ruhend oder kürzlich verstorbener Mykobakterien erkennt. Wie DNA und RNA aus der gleichen Person gewonnen werden, ist es möglich, die Beziehungen zwischen den krankhaften Zustand, und der Wirt und Erreger Genexpression zu studieren. Die Erwachsenen Zebrafisch-Modell für Tuberkulose präsentiert sich somit als sehr zutreffend, nicht-Säugetier in Vivo System zu Wirt-Pathogen Interaktionen zu untersuchen.

Introduction

Zebrafisch (Danio Rerio) ist eine weit verbreitete Tiermodell in der biomedizinischen Forschung, und es ist eine akzeptierte Modell für gemeinsame vertebrate Biologie. Der Zebrabärbling adaptiert wurde zu vielen Bereichen der Forschung Modellierung menschliche Krankheiten und Störungen, Krebs1 und Herzerkrankungen2 bis hin zu Infektionen und immunologische Studien aus mehreren bakteriellen 3 und Virusinfektionen4 , 5. Darüber hinaus die Entwicklung ex Utero Zebrafisch-Embryonen erzielt der Zebrabärbling ein beliebtes Modell in Entwicklungsbiologie6 und Toxikologie7,8.

In vielen Bereichen der Forschung, einschließlich der Infektionsbiologie sind die optisch transparenten zebrafischlarven gebräuchlich. Die ersten Immunzellen erscheinen innerhalb von 24 h Post Düngung (hpf), wenn primitive Makrophagen erkannten9sind. Neutrophile sind die nächsten Immunzellen rund 33 hpf10angezeigt werden. Zebrafisch-Larven sind somit für die Untersuchung der frühen Stadien der Infektion und die Rolle der angeborenen Immunität bei fehlender adaptive Immunzellen11möglich. Die Erwachsenen Zebrafisch mit seinem voll funktionsfähige adaptive Immunsystem bietet jedoch eine zusätzliche Schicht der Komplexität für Infektions-Experimente. T-Zellen können um durch erkannt werden 3 Tage nach Befruchtung12und B-Zellen sind in der Lage, funktionale Antikörper produzieren 4 Wochen Post Befruchtung13. Die Erwachsenen Zebrafisch hat die wichtigsten Gegenstücke des Säugetier-angeborenen und der adaptiven Immunsystems. Die wichtigsten Unterschiede zwischen den Immune systems von Fischen und Menschen werden in Antikörper-Klassen ebenso wie in der Anatomie des lymphatischen Geweben gefunden. Der Zebrabärbling hat nur drei Antikörper Klassen14, während Menschen fünf15haben. In Ermangelung von Knochenmark und Lymphknoten der primären lymphatischen Organe in den Fischen sind die Niere und die Thymus-16 und die Milz, die Nieren und den Darm als sekundären lymphatischen Organe17dienen. Trotz dieser Unterschiede, mit seiner vollen immun Arsenal der angeborenen und der adaptiven Zellen ist der Erwachsenen Zebrabärbling ein hoch anwendbar, einfach zu bedienende, nicht Mammalian Modell für Wirt-Pathogen-Wechselwirkungsstudien.

Der Zebrabärbling hat in letzter Zeit als eine praktikable Modell zur Tuberkulose18,19,20,21,22etabliert. Tuberkulose ist eine in der Luft Krankheit verursacht durch Mycobacterium Tuberculosis. Nach der World Health Organization Tuberkulose1,7 Millionen Todesopfer im Jahr 2016 und ist die führende Ursache des Todes von einem einzigen Erreger weltweit23. Mäuse24,25, Kaninchen26 und nicht-menschlichen Primaten27 sind die bekanntesten in der Tuberkuloseforschung aber jedes Gesicht ihre Grenzen Tiermodelle. Die nichtmenschlichen Primaten-Modell von M. Tuberkulose -Infektion ähnelt am ehesten der menschlichen Krankheit, aber mit Hilfe dieses Modells wird durch ernsthafte ethische Überlegungen. Anderen Tiermodellen sind durch die Wirtsspezifität von M. Tuberculosis behindert, die die Pathologie der Krankheit betrifft. Wahrscheinlich das größte Problem bei der Modellierung von Tuberkulose ist das breite Spektrum von Infektion und Krankheit folgen bei der menschlichen Krankheit: Tuberkulose ist eine sehr heterogene Erkrankung Immunität gegen latente, aktive und reaktivierten Infektion28 Sterilisation bis hin , das ist schwer zu reproduzieren und experimentell zu modellieren.

Mycobacterium Marinum ist ein enger Verwandter des M. Tuberculosis mit ~ 3.000 ortholog Proteine mit 85 % Aminosäure Identität29. M. Marinum infiziert natürlich Zebrafisch produziert Granulome, die Markenzeichen der Tuberkulose, in seiner inneren Organe19,30. Im Gegensatz zu anderen Tiermodellen in der Tuberkuloseforschung Zebrafisch produziert viele Nachkommen, es erfordert nur einen begrenzten Raum und wichtiger ist, es ist neurophysiologisch wenigsten entwickelten Wirbeltiere Tuberkulose-Modell zur Verfügung. Darüber hinaus verursacht die M. Marinum Infektion latente Infektion, aktiver Erkrankung oder auch Sterilisation von mykobakteriellen Infektion im Erwachsenen Zebrafisch eng imitiert das Spektrum der Krankheitsverläufe der menschlichen Tuberkulose19, 31 , 32. hier, wir beschreiben Methoden für das experimentelle Tuberkulose-Modell der Erwachsenen Zebrafisch durch M. Marinum in die Bauchhöhle injiziert und mittels quantitativen PCR zur Messung der mykobakteriellen Lasten und Immunreaktionen vom Zebrafisch Gewebeproben.

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Protocol

Alle Zebrafisch-Experimente sind vom Tier Experiment Board in Finnland (ESAVI/8245/04.10.07/2015) genehmigt worden. Methoden sind nach dem Gesetz (497/2013) und der Regierungsverordnung (564/2013) zum Schutz der Versuchstiere zu wissenschaftlichen oder erzieherischen Zwecken in Finnland durchgeführt.

1. Anzucht von Mycobacterium Marinum

Hinweis: Da Mycobacterium Marinum ein Erreger verursacht oberflächliche Infektionen beim Menschen fähig ist, erfahren Sie die lokalen Richtlinien für die persönliche Sicherheit und Biohazard Abfallentsorgung vor Arbeitsbeginn mit diesem Bakterium.

  1. Kultur M. Marinum auf einem 7 H 10 Platte ergänzt mit 10 % OADC (Ölsäure, Albumin, Traubenzucker, Katalase) Bereicherung und 0,5 % V/V des Glycerins bei 29 ° C für mindestens 5 Tage. Pflegen Sie M. Marinum Kulturen, indem man frische Bakterien aus dem Gefrierfach alle zwei Wochen und jede zweite Woche auf eine neue Platte zu übertragen.
    Hinweis: M. Marinum ist eine natürliche Fisch Erreger infizieren nichtheimischer Arten und es ist wichtig, keine Vorkehrungen zu treffen, Zebrafisch Aktien mit Bakterien verunreinigt. Infizierten Zebrafisch und Elemente mit Bakterien kontaminiert müssen getrennt von den Zuchtanlagen.
  2. Mithilfe einer sterilen 1 µL Impfschlinge aseptisch eine IMPFÖSE M. Marinum bakterienmasse übertragen in eine Zelle-Kultur-Flasche mit 10 mL 7 H 9 mittlere mit 10 % ADC (Albumin, Traubenzucker, Katalase) Bereicherung, 0,2 % V/V Polysorbat 80 und 0,2 % V/V Glycerin. Kultur für 3 – 4 Tage auf etwa ein OD600 (Extinktion) von 0,7 bei 29 ° C im Dunkeln ohne schütteln. Lassen Sie die Kappe lose, oder verwenden Sie eine Filterkappe, um den ausreichenden Gasaustausch zu ermöglichen.
    Hinweis: Polysorbat 80 ergänzt das Medium, die Aggregation von Bakterien zu verhindern. Darüber hinaus führt Lichteinwirkung zu phänotypischen Veränderungen in bakterielle Kolonien (z.B. die Farbwechsel von weiß bis gelb). Um dies zu vermeiden, halten Sie die Kulturen im Dunkeln.
  3. Messen Sie OD600Wert mit einem Spektralphotometer. Die Flüssigkultur auf einem OD-600 von 0,07 – 0,09 verdünnen und weiter züchten für 2 Tage bei 29 ° C im Dunkeln ohne schütteln. Lassen Sie die Kappe lose.
    Hinweis: In diesen zwei Tagen werden die Bakteriensuspension eines OD600von etwa 0,5 entspricht einer frühen Log-Phase erreichen.

2. Vorbereitung des bakteriellen Lösung für Erwachsene Zebrafisch infizieren

  1. Übertragen Sie die Bakteriensuspension in einem großen sterilen Küvette oder eine 15 mL Tube und legen Sie sie im Dunkeln bei Raumtemperatur 15 Minuten erlauben die größten Klumpen zu begleichen.
  2. Übertragen Sie die Top 5 – 7 mL der Suspension in ein sauberes Röhrchen oder eine Küvette und Messen Sie die OD600. Verwenden Sie diese obere Phase der Suspension für die Infektionen.
  3. Sammeln Sie 1 mL M. Marinum Kultur in ein frisches Tubus und Zentrifuge für 3 min bei 10.000 X g. Den überstand zu entfernen und das Pellet in 1 mL sterilen 1 X PBS Aufschwemmen.
  4. Verdünnen, um die gewünschte bakterielle Konzentration erreichen mithilfe von sterilen 1 x PBS mit 0,3 mg/mL Phenol rot als Tracer. Teilen Sie die verdünnte Suspension in drei Aliquote.
    Hinweis: Verwenden Sie einen vorgegebenen OD600 vs. KBE (Kolonie bildende Einheiten) / µL Kurve, die Verdünnung zu schätzen benötigt, um die gewünschte Anzahl der Bakterien in die 5 µL Injektion Volumen34. Die Korrelation zwischen OD600 und Konzentration von der Bakteriensuspension muss überprüft werden, bevor Sie beginnen die eigentlichen Infektions-Experimente. Reservieren Sie zwei Wochen für die Erhebung dieser Daten.
  5. Mit einer 1 mL Spritze, langsam ziehen die Aussetzung durch eine 27 G Nadel 3 X. Führen Sie für jedes aliquoten diesen Schritt kurz vor dem Einsatz.
    Hinweis: Verwenden Sie nicht die gleiche bakterielle Lösung für mehr als 2 h.

3. experimentelle M. Marinum Infektion mit intraperitonealer Injektion

  1. Pipette einen 5 µL Tropfen der verdünnten bakterielle Lösung auf ein Stück Parafilm Film und das Tröpfchen in einer 30 G-Insulin-Nadel ziehen.
  2. Verwenden Sie 5 – 8 Monat-alten Wildtyp und rag1−/−hu1999 mutierte Fische für das Experiment. Erwachsenen Zebrafisch in den Wassertank mit 0,02 % 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (pH 7,0) zu betäuben. Positionieren Sie den Fisch Bauchseite bis in einen Schlitz auf einem feuchten geschäumten Kunststoff.
    Hinweis: Rag-/- mutierte Fische sind nicht in der Lage, somatische Rekombination zu unterziehen und funktionale T- und B-Zellen zu produzieren.
  3. Injizieren die Nadel zwischen die Bauchflossen an einen Winkel von etwa 45°. Halten Sie die Nadel Öffnung nach oben, um zu beobachten, dass die gesamte Öffnung innerhalb der Bauchhöhle. Injizieren Sie die Bakteriensuspension langsam und entfernen Sie vorsichtig die Nadel.
    Anmerkung: für den Fall, dass die rote Tracer aus den Fisch nach Einspritzung undicht ist, ohne den Fisch aus dem Experiment.
  4. Sofort nach der Injektion übertragen Sie die Fische in einen Auffangbehälter mit frischen Tank Wasser.
  5. Nehmen Sie Proben von der Bakteriensuspension auf 7H 10 Platten alle 15 min von der bakteriellen aliquoten gebräuchlich und 5 Tage die Bakterien bei 29 ° C inkubieren und überprüfen Sie die Infektion Dosis durch zählen der Kolonien auf den Platten.
  6. Überprüfen Sie regelmäßig das Wohlbefinden der Fische und einschläfern keine Fische mit den Symptomen einer Infektion mit mehr als 0,02 % Konzentration von 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (pH 7,0).
    Hinweis: Ungefähr 7 % der Erwachsenen Zebrafisch infiziert mit 34 ± 15 KBE und 30 % der Zebrafisch infiziert mit 2029 ± 709 KBE werden Symptome von 8 Wochen19gehabt haben. Die Symptome können abnorme Schwimmen, mangelnde Reaktion auf Berührung, keuchend, Ödeme oder beobachtbaren verschwenden.
  7. Pflegen Sie der Zebrabärbling nach gemeinsamen Standards35.

4. Erhebung der inneren Organe

  1. Einschläfern der Zebrabärbling mit einer Überdosis von 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (mehr als 0,02 % Konzentration, pH 7.0) in den Wassertank.
  2. Setzen Sie einen Stift posterior Branchiostegal Strahlen und die andere durch den Schweif zu Heften Sie den Fisch auf die Plattform.
  3. Öffnen Sie den gesamten Bauchraum mit einem Skalpell und sammeln Sie die inneren Organe mit einem kleinen Löffel und scharfe endete Pinzette. Aus dem Herzen beginnen Sie und arbeiten Sie entlang der Wirbelsäule nach hinten, alle inneren Organe in einem Block zu lösen.
    Hinweis: Achten Sie darauf, alle nierengewebe zu sammeln, indem Sie entlang der Wirbelsäule mit dem Löffel abkratzen.
  4. Schließlich benutzen Sie eine Pinzette zu trennen den Darm neben der Kloake, die Organe zu einem 1,5 mL Homogenisierung Schlauch mit sechs 2,8 mm Keramik Perlen zu übertragen. Legen Sie sofort auf Trockeneis, die Probe einzufrieren. Die Probe kann bei-80 ° C bis homogenisiert gelagert werden.
  5. Spülen Sie die Instrumente mit 70 % Ethanol zwischen Individuen.

5. Homogenisierung und RNA-Extraktion aus einem Organ.

Hinweis: Die Methode ist von der Stanford University Protokolle36geändert.

  1. Hinzufügen ein Gesamtvolumen von 1.500 µL. Guanidin-Thiocyanat-Phenol-Lösung für die Nukleinsäure-Extraktion (Table of Materials) verwendet oben auf die Probe stellen sicher, dass die Stichprobe maximal 10 % des Gesamtvolumens umfasst.
    Achtung: Die erwartete Menge des geernteten Gewebes ist 100 µL. Guanidin Thiocyanat-Phenol-Lösung enthält giftige und reizende Verbindungen und erfordert Schutzbekleidung, Nitril-Handschuhe und arbeiten in einer Dampfhaube. Kombinieren Sie als Bildung von giftigen Gasen dadurch nicht mit Bleichmittel. Sicherheitsdatenblatt (MSDS) vor Gebrauch zu lesen.
  2. Homogenisieren von Proben mit einer Perle-Prügel-Homogenisator 3 Mal für 40 s bei 3.200 u/min. Cool auf dem Eis für 30 s zwischen den Zyklen. Beschallen Sie die homogenisierten Proben in einem Wasserbad für 9 min.
  3. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 X g für 10 min bei 4 ° C und bewegen Sie 1.000 µL der gerodeten Homogenat zu einem frischen Microcentrifuge Schlauch.
  4. Fügen Sie 200 µL Chloroform, mischen Sie sofort durch Vortexen für 15 s und 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    Vorsicht: Chloroform ist ein giftiges und reizend Verbindung Falls eingeatmet, verschluckt oder Kontakt mit Haut oder Augen. Verwenden Sie notwendige Sicherheitsausrüstung für den Personenschutz und arbeiten unter einem Abzug. Sicherheitsdatenblatt (MSDS) vor Gebrauch zu lesen.
  5. Zentrifugieren Sie bei 12.000 X g für 15 min bei 4 ° C, wässrigen und organische Phasen zu trennen.
  6. Übertragen Sie sorgfältig, 500 µL der oberen Phase auf ein frisches Tubus zur Vermeidung einer Kontamination der RNS. Entfernen Sie und entsorgen Sie den Rest der wässrigen Phase (~ 100 µL) und speichern Sie die Interphase und die organische Phase bei 4 ° C für DNA-Extraktion.
    Hinweis: Die obere Phase enthält die RNA.
  7. Fügen Sie 500 µL 2-Propanol und sofort mischen durch Vortexen für 15 S. Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur, die RNA auszufällen.
  8. Zentrifugieren Sie bei 12.000 X g für 10 min bei 4 ° C, die RNA pellet. Entfernen Sie den Überstand durch pipettieren.
  9. Fügen Sie 1 mL 75 % Ethanol und Wirbel für 10 s.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten, und die Proben über Nacht bei 4 ° c gehalten
  10. Zentrifuge bei 7.500 X g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand durch pipettieren.
  11. Wiederholen Sie den Waschen 5,9 – 5.10. Den Überstand durch pipettieren vorsichtig entfernen und an der Luft trocknen lassen das Pellet in einer Dampfhaube.
  12. Lösen Sie die RNA-Pellet in 500 µL Nuklease-freies Wasser auf und halten Sie die Proben auf Eis. Messen Sie die Konzentrationen mit einem Microvolume Spektralphotometer oder mit gleichwertigen Geräten. Speichern der RNS bei-80 ° C.

6. Reinigung von Co extrahierten Zebrafisch und Mykobakteriellen DNA

  1. Bereiten Sie eine Rücken-Extraktionspuffer (BEB) durch Auflösen 118,2 g Guanidin Thiocyanat (Endkonzentration 4 M), 3,68 g Natriumcitrat (Endkonzentration 50 mM) und 30,29 g Tris freie Base (Endkonzentration 1 M) in 120 mL Nuklease-freies Wasser (Mai dieses Jahres erfordern Sie, unter ständigem Rühren über Nacht). Eine endgültige Gesamtvolumen von 250 mL und Filter, um die Lösung zu sterilisieren fügen Sie Nuklease-freies Wasser hinzu.
    Hinweis: Dieses Puffers kann für bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden. Kombinieren Sie BEB nicht mit Bleichmittel, wie sie reagieren, um giftige Gase wie Blausäure und Chlorwasserstoff zu produzieren.
  2. Verwenden Sie die Interphase und die organische Phase der Probe um mykobakteriellen DNA extrahieren. Jedes Rohr 500 μL der BEB hinzufügen. Mischen Sie ausgiebig für 10 min durch Inversion bei Raumtemperatur.
  3. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 12.000 X g für 30 min bei Raumtemperatur und übertragen Sie 500 µL der oberen wässrigen Phase mit der DNA zu einem neuen Schlauch sorgfältig zu.
  4. 400 μl 2-Propanol hinzufügen. Durch umdrehen mischen und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  5. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 X g für 15 min bei 4 ° C. Ein Pellet, enthält die DNA sollte an dieser Stelle sichtbar sein. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch pipettieren.
  6. Fügen Sie 800 μl 70 % Ethanol. Waschen Sie die Pellets durch Umkehrung. Tun nicht Wirbel die Proben zu diesem Zeitpunkt genomischer DNA leicht bricht.
  7. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 X g für 15 min bei 4 ° C und entfernen Sie den Überstand durch pipettieren. Wiederholen Sie das Ethanol waschen (Schritte 6.6 und 6.7).
  8. Entfernen Sie das Ethanol durch sorgfältig pipettieren. Lassen Sie die Proben an der Luft trocknen für 5 – 10 min. Auflösen das Pellet in 200 μL der Nuklease-freies Wasser.
  9. Messen Sie DNA-Konzentrationen mit einem Microvolume Spektralphotometer oder mit gleichwertigen Geräten. DNA kann bei 4 ° C oder bei-20 ° C für die Langzeitspeicherung gespeichert werden.

(7) quantitative PCR zur Messung der Mykobakteriellen Lasten

  1. Bereiten Sie qPCR Reaktionsmischungen mit keine-ROX (Carboxy-X-Rhodamin) gegen M. Marinum interne transkribierten Abstandhalter (ITS) zwischen 16-23 s ITS gemäß den Anweisungen des Herstellers mit MMITS1 Primer (Tabelle 1). Pipette die Reaktion Mischung und Verdünnungen als Duplikate auf einer 96-Well-Platte geeignet für qPCR probieren. Enthalten Sie ein DNA-standard Verdünnungsreihen einer bekannten Menge an Bakterien in jedem Lauf.
    Hinweis: Die zu erwartende M. Marinum Last pro Fisch kann zwischen 0 KBE und 1.000.000 KBE auf 4 Wpi. QPCR-Assay kann auch mit anderen qPCR-Kits durchgeführt werden, aber die Anlasstemperatur für die Primer muss neu optimiert werden.
  2. Die Dichtplatte mit einem optisch transparenten Film und Zentrifugieren der Platte bei 2.000 X g für 2 min bei 4 ° C.
  3. Führen Sie das qPCR-Programm in der Tabelle 2dargestellt.
  4. Anhand der Standardkurve, berechnen Sie die Anzahl der Bakterien in der ganzen Fisch-Probe.

8. DNase-Behandlung von der RNA-Proben

  1. Um möglichen verbliebenen Spuren von genomischer DNA aus der RNA zu entfernen, führen Sie ich DNase Behandlung. Die RNA-Proben auf Eis Auftauen.
    Hinweis: Achten Sie darauf, nur RNase-freie Geräte und Lösungen verwenden und wischen die Arbeitsfläche und Pipetten mit einem Dekontamination-Reagenz, Beseitigung von RNases (Table of Materials) vor Arbeitsbeginn. Tragen Sie einen langärmeligen Kittel und Handschuhe zum Schutz Ihrer Proben.
  2. Vorbereitung 10 μL DNase ich Reaktionsmischungen auf Eis nach den Anweisungen des Herstellers. Mix 1 μL der DNase I, 1 μl 10 x DNase-Puffer und 8 μl RNA Probe einschließlich maximal 1 μg RNA.
  3. Vorsichtig mischen Sie die Reaktionen (keine Heizungsjobstep) und 30 min bei 37 ° c inkubieren
  4. Fügen Sie vor Hitze-Inaktivierung 1 µL 50 mM EDTA zu jeder 10 µL Probe hinzu. Wenn EDTA nicht hinzugefügt wird, wird die RNA chemischen Abbau bei Erhitzung unterzogen.
  5. 10 min bei 65 ° C Hitze-inaktivieren DNase I. weiter direkt an cDNA Synthese oder speichern die DNase-behandelten RNA bei-80 ° c inkubieren

9. cDNA Synthese

  1. Bewahren Sie alle Reagenzien und Proben auf Eis und bereiten Sie die Reaktionsmischungen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für eine 5 μL Reaktion Mischung, enthalten 1 μl Reverse Transkription Master Mix, 3 μL der Nuklease-freies Wasser und 1 μL der DNase behandelt RNA.
  2. Mischen Sie die reverse Transkription Reaktionen vorsichtig und kurz drehen Sie das Rohr bei Bedarf.
  3. Proben in einer PCR-Maschine und verwenden Sie das Programm in Tabelle 3dargestellt.
  4. Verdünnen Sie die cDNA in Nuklease-freies Wasser für qPCR zu einer maximalen Konzentration von 2,5 ng/μl, wenn nötig. cDNA kann bei-20 ° c gelagert werden

10. Messen Zebrafish Genexpression durch Quantitative PCR

  1. Bereiten Sie einen qPCR-master-Mix auf dem Eis nach den Anweisungen des Herstellers und vor Licht schützen. Verwenden Sie die Primer in Tabelle 1vorgestellt.
    Hinweis: Um die Falte der Induktion für jedes Gen berechnen, Messen des Ausdrucks auch von einer gepoolten Grundlinie Probe 6 gesunde Zebrafisch entnommen.
  2. Bereiten Sie Wiederholungen jeder Probe und pipette Reaktionsmischungen auf einen qPCR-Teller. Die Dichtplatte mit einem optisch transparenten Film und Zentrifugieren der Platte bei 2.000 X g für 2 min bei 4 ° C vor dem Start des Laufs.
  3. Führen Sie die qPCR Programm gezeigt in der Tabelle 4 mit der Anlasstemperatur abhängig von dem Primerpaar verwendet (Tabelle 1).
  4. Analysieren Sie das Gen Ausdruck-Verhältnis im Vergleich zu einem Haus-halten-gen (loopern437) mit der ΔCt-Methode unter Verwendung der Gleichung:
    Equation

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Representative Results

Die natürliche Fisch-Erregers Mycobacterium Marinum infiziert die inneren Organe der Zebrafisch und produziert eine systemische Infektion mit histologisch sichtbare Granulome19. Erwachsenen Zebrafisch durch eine intraperitoneale Injektion mit M. Marinum infiziert sind. DNA und RNA extrahiert und die mykobakteriellen Last bemisst sich quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) mithilfe von DNA als Vorlage. Die Gliederung der Methode ist in Abbildung 1dargestellt.

Die anfängliche Anzahl von Mykobakterien verwendet für die Fische zu infizieren ist ein kritischer Faktor für den Ausgang der Infektion. Eine hohe Infektion Dosis von M. Marinum (~ 2.000 CFU) führt zu eine fortschreitende Erkrankung, die in der mykobakteriellen Lasten erhöhen weiterhin, bis die durchschnittliche bakterielle Belastung rund 5 Millionen Bakterien (Abbildung 2A) letztlich töten der Fische erreicht. Eine niedrige Dosis (~ 20 – 90 KBE) von M. Marinum führt zur Entwicklung einer Krankheit Spektrum ähnlich gesehen im menschlichen Tuberkulose (Abbildung 2 b). Die bakterielle Belastung steigt bis etwa 4 – 7 Wochen (Abbildung 2A und Abbildung 3A), nach denen in der Mehrzahl der Fische die Krankheit einen stabilen Zustand erreicht. Abbildung 2 b zeigt ein Beispiel für die Verteilung der Krankheitsverläufe mit einer niedrigen Dosis-Infektion: etwa 7 % der infizierten Zebrafisch konnten das Bakterienwachstum einschränken. Diese Einzelpersonen entwickelt eine primäre progrediente Erkrankung und starben innerhalb von zwei Monaten nach der Infektion. Rund 10 % der Personen gelöscht die mykobakteriellen Infektion von 4 Wochen. Die restliche 65 % des Fischbestandes entwickelte eine latente mykobakteriellen Infektion mit stetigen bakterielle Belastungen. Jedoch erneut aktiviert zwischen 8 und 32 Wochen nach der Infektion, in 18 %, die latente Infektion spontan zu dem Fortschreiten der Krankheit führt.

Durch die Verwendung Rag-/- mutierte Fische, es ist möglich, die Rolle der adaptiven Immunantwort in den Erwachsenen Fischen zu studieren. Rag-/- mutierte Fische können nicht ausreichend begrenzen das Wachstum von Mykobakterien führt zu höheren bakterielle Belastungen (Abbildung 3A) und erhöhter Morbidität (Abb. 3 b), eindeutig belegen die Bedeutung der adaptiven Immunität in mykobakteriellen Infektion zu kontrollieren. Darüber hinaus kann die Bedeutung der adaptiven Reaktionen in bestimmten Zytokin-Antworten in mykobakteriellen Infektion hervorzurufen in diesem Modell untersucht werden. Hier zeigen wir, dass die adaptive Reaktion für die effiziente Induktion von Interleukin 4 (IL4) benötigt (Abbildung 3), ist aber entbehrlich für die Induktion von Interferon-γ (IFNγ) bei 4 Wpi (Abbildung 3D). Interferon-γ ist ein Zytokin fahren die Reaktion gegen intrazelluläre Erreger Interleukin 4 gemeinsame Vermittler in der adaptiven Immunantwort gegen extrazelluläre Krankheitserreger ist. Deutlich höheren Ausdruck von il4 in der Wildtyp Gruppe im Vergleich zu Rag-/- mutierte Fische bezieht sich auf wichtige adaptive humorale Reaktionen in der mykobakteriellen Infektion (Abbildung 3).

Figure 1
Abbildung 1: Workflow für die Entwicklung von mykobakteriellen Lasten in der Erwachsenen Zebrabärbling. Erwachsenen Zebrafisch mit eine intraperitoneale Injektion von M. Marinuminfiziert sind. DNA und RNA sind die inneren Organe des Fisches entzogen, und M. Marinum Last und Host Immunantworten quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) analysiert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Injektion von M. Marinum in Erwachsenen Zebrafisch verursacht ein Spektrum von Krankheitszuständen. (A) Zebrafisch wurden mit einem niedrigen (34 ±15 CFU) oder eine hohe Dosis (2029 ±709 KBE) von M. Marinuminjiziert. Durchschnittliche Belastung für 5 Fische (außer 32 Wochen hochdosierte, n = 2) werden mit SD. Low-Dose-Statistiken angezeigt: * p < 0,05 verglichen mit 1 Woche ** p < 0,05 im Vergleich zu 1 und 2 Wochen. Hochdosis-Statistik: *** p < 0,05 verglichen mit 1, 2, 8, 11 und 20 @daveplugers ¤ niedrigdosierte vs. hochdosierte p < 0,05. Geändert von Parikka Et al. 2012-19. (B) typische Verteilung der Krankheitsverläufe innerhalb einer Wildtyp Zebrafisch-Population mit einer niedrigen Dosis von M. Marinuminfiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Adaptive Immunität beeinflusst den Verlauf der mykobakteriellen Infektion in den Erwachsenen Zebrafisch. Erwachsenen Wildtyp (wt) und rag1 (−/−) Zebrafisch waren infiziert mit einer niedrigen Dosis (n = 30) von M. Marinum. (A) die durchschnittliche mykobakteriellen Lasten qPCR bei 2, 4 und 7 Wochen Post-Infektion (Wpi) gemessen wurden (n = 10) * P < 0,05. (B) die Fische wurden bei der Entwicklung von Symptomen der Krankheit eingeschläfert und Überleben Grundstücke entstanden. (C). der Ausdruck il4 waren gemessen an 4 Wpi. (D) der Ausdruck wurden IFNγ an 4 Wpi gemessen. (A und B) von Parikka Et Al. 201219geändert. (C und D) Von Hammarén Et Al. 201438geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Gen Primer Sequenz Anlasstemperatur
MMITS1 F: CACCACGAGAAACACTCCAA 65
16 s-23SITS Locus AB548718 M. Marinum Quantifizierung R: ACATCCCGAAACCAACAGAG
loopern4 F: TGAGCTGAAACTTTACAGACACAT 61
Äußerte sich wiederholende Elemente R: AGACTTTGGTGTCTCCAGAATG
IL4 GCAGGAATGGCTTTGAAGGG 59,5
ZDB-GEN-100204-1 GCAGTTTCCAGTCCCGGTAT
ifnγ1-2 F: GGGCGATCAAGGAAAACGACCC 61
ZDB-GEN-040629-1 R: TAGCCTGCCGTCTCTTGCGT

Tabelle 1: Primer-Sequenzen und annealing Temperaturen. Die Sequenzen der Primer verwendet und ihre optimierte annealing Temperaturen. Die Primer für den M. Marinum 16-23 s rRNA Transcript wurden für ein No-ROX-qPCR-Kit und die anderen Primer für einen unter anderem qPCR Kit ROX optimiert.

Schritt Zeit Temperatur
1 3 min 95 ° C
2 5 s 95 ° C
3 10 s 65 ° C
4 5 s 72 ° C (Fluoreszenz-Detektion)
5 Gehen Sie zu Schritt 2. 39 mal
6 Kurvenanalyse 55-95° C schmelzen mit Abständen von 0,5 ° C
7 Für immer 4 ° C

Tabelle 2: qPCR-Programm zur Messung von M. Marinum DNA. Ein qPCR-Protokoll entsprechend den Anweisungen des Herstellers entworfen und optimiert für M. Marinum DNA von Zebrafisch Proben messen.

Zeit Temperatur
5 min 25 ° C
30 min 42 ° C
5 min 85 ° C
für immer 4 ° C

Tabelle 3: cDNA Synthese Programm. Protokoll zur Synthese der cDNA von der extrahierten RNA eine infizierte Zebrafisch gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Schritt Zeit Temperatur
1 30 s 95 ° C
2 12 s 95 ° C
3 30 s Glühen ° C
4 Gehen Sie zu Schritt 2. für 39 mal
5 Kurvenanalyse 65 – 95 ° C schmelzen mit Abständen von 0,5 ° C
6 Für immer 4 ° C

Tabelle 4: qPCR-Programm zur Messung des Gastgebers Genexpression. Ein qPCR-Protokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers entworfen und optimiert für die Messung der Expression von Genen verschiedener Zebrafisch.

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Discussion

Hier beschreiben wir eine qPCR-basierte Anwendung mykobakteriellen Lasten aus DNA extrahiert von experimentell infizierten Erwachsenen Zebrafisch Gewebe messen. Diese Anwendung basiert auf Primer entwickelt, um die 16-23 s rRNA internen übertragenen Distanzscheibe Sequenz40. Mykobakteriellen Gesamtlast in einer Fisch-Probe wird geschätzt mit Hilfe einer Standardkurve aus DNA extrahiert aus einer bekannten Anzahl von kultivierten Mykobakterien und vorausgesetzt, dass ein Bakterium hat eine Kopie seines Genoms zu einem gegebenen Zeitpunkt vorbereitet. Die Nachweisgrenze von M. Marinum -qPCR ist ungefähr 100 koloniebildenden Einheiten18. Ein klarer Vorteil der Methode im Vergleich zu traditionellen Beschichtung ist, dass sowohl aktive als auch nicht teilenden ruhende Erreger nachgewiesen werden können. Darüber hinaus ist ein häufiges Problem von kontaminierenden Wachstum auf Kultur-Platten aus dem Zebrafisch Gewebe durch diese Vorgehensweise umgangen. DNA als Vorlage verwendet wird, ist es jedoch möglich, dass einige der Kopien gemessen die DNA von Bakterien können abgeleitet werden, die vor kurzem gestorben sind. Ein wesentlicher Vorteil der Nukleinsäure-basiertes Protokoll ist, dass da sowohl DNA und RNA (als auch Proteine, die hier nicht beschrieben) von der gleichen Person extrahiert werden können, die mykobakteriellen Last des einzelnen Genexpressionsdaten beider kombinierbar mit den Gastgeber und die Bakterien.

Die Dosierung von M. Marinum ist ein kritischer Faktor für das Ergebnis einer Infektion. Die niedrige M. Marinum (~ 20 – 90 KBE) Infektion Dosis produziert ein Spektrum von Krankheitszuständen mit Latenz als die häufigste Form. Wenn die Infektion Dosis in der Größenordnung von Tausenden, entwickelt eine progressive Krankheit in den meisten Individuen. Wie die natürliche infektiöse Dosis niedrig in menschlichen Tuberkulose41bekannt ist, dürfte mit einer niedrigen Dosis von M. Marinum im Zebrafisch-Modell eine natürliche Infektion zu produzieren. Um die richtige Dosis zu erreichen, achten Sie darauf, das Verhältnis zwischen der OD600 und koloniebildenden Einheiten vor dem Start keine Experimente zu überprüfen. Die normale Variante der vergoldeten Infektion Dosen beträgt ca. 30 % und ist kein Problem angesehen. Es ist jedoch wichtig, um sicherzustellen, dass das gesamte 5 µL Volumen von der Bakteriensuspension im Fisch bleibt. Austritt von der Injektionslösung wird zusätzliche Variation in der Dosis der Infektion verursachen. Neben der Infektion Dosis kann der Bakterienstamm das Fortschreiten der Erkrankung beeinflussen. Es wurde gezeigt, dass die Virulenz der verschiedenen M. Marinum Stämme zwischen den Stämmen verändern können. Die beiden am häufigsten verwendeten Stämme sind ATCC927 (Fisch isoliert in diesen Experimenten verwendete Stamm) und der M-Stamm. Diese Sorten unterscheiden sich jedoch stark in ihrer Virulenz. Die Menschen isoliert M Belastung entwickelt eine progressive Krankheit, während der Fisch isoliert eine mildere Krankheit gut geeignet für das Studium der latenten Form der mykobakteriellen Infektion33produziert. Die Virulenz der Bakterien innerhalb einer Sorte kann auch verändern, wenn die Bakterien wird seriell übertragen, von einer Kultur zur anderen, die verhindert werden kann, indem man frische Mykobakterien aus einer Tiefkühltruhe oft genug auf Lager.

In-vitro- Kultivierung der langsam Aufteilung M. Marinum ohne Antibiotika ist anfällig für Verunreinigungen. Die Handhabung der Bakterien erfordert daher, streng aseptischen Ansatz in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt. Kontaminationen in der Kultur erkannt werden, als zu hoch OD600 Wert, seltsam aussehende Bakteriensuspension oder Kolonien. M. Marinum Kolonien sind normalerweise unscharfe Kanten, flach und matt weiß in der Farbe. M. Marinum Kulturen sind empfindlich gegen Licht und sie produzieren gelbes Pigment bei Lichteinfall. Dieses gelbe Pigment kann verwendet werden, um M. Marinum Kolonien von anderen Bakterien nach Infektionen zu unterscheiden. Verunreinigungen können dazu führen, dass die Fische sterben bald nach der Infektion. In der Regel erscheinen die ersten Symptome einer Niedrigdosis-Infektion nicht vor 3 Wochen nach Infektion und Todesfälle vor diesem Zeitpunkt wegen der Verschmutzung in der Bakteriensuspension oder Trauma induziert beim Einspritzen dürften.

Erwachsenen Zebrafisch sind sehr empfindlich gegen 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester und nicht überleben, wenn die Belichtungszeit zu lang oder die Konzentration des Betäubungsmittels zu hoch ist. Daher bei Infizierung der Zebrabärbling ausgesetzt werden sollte der Narkose nur für die minimale Zeit, gute Anästhesie zu erreichen (~ 1 – 2 min.). Nach der Infektion sind Erwachsene Zebrafisch in Gruppen gehalten, bei Wassertemperatur von 26 – 28 ° C. Wenn die Temperatur höher oder niedriger ist, kann es der M. Marinum Wachstumsrate und die Kinetik der Infektion auswirken. Darüber hinaus ist die Tank-Wasserqualität (mikrobiologische Qualität, Salzkonzentration, pH-Wert, Sauerstoff-Sättigung) ein wichtiger Teil gewährleisten ein gelungenes Experiment. Gesundheitsberichterstattung des Fisches muss täglich und Fische, die zeigen, dass Symptome einer Infektion aus der Gruppe entfernt und eingeschläfert werden müssen durchgeführt werden. Wenn die Fische in den Tank sterben, können die anderen Fische neu infizierten durch den Darm werden die Auswirkungen auf das Fortschreiten der Infektion.

Das häufig verwendete Zebrafisch Larven Modell der Tuberkulose gilt für angeborene Immunität Studie, die die Experimente auf eine begrenzte Teilmenge der Host-Mikroben-Interaktionen lenkt. Die Verwendung von Erwachsenen Zebrafisch ermöglicht es, angeborene und adaptive Immunantworten in ein vielseitiges Modell18,32,39zu studieren. Erwachsenen Zebrafisch präsentiert sich als ein praktisches vertebrate Modell, das gesamte Spektrum der Tuberkulose zu studieren. Mit einer Niedrigdosis-Ausstellung von M. Marinum7 % des Fischbestandes primäre progressive Krankheit entwickeln, 10 % sind in der Lage, die Infektion zu sterilisieren, 65 % latente Krankheit entwickeln und spontanen Reaktivierung tritt in 18 % (Abbildung 2). Das Spektrum der Krankheit ähnelt, die in menschlichen Tuberkulose, in dem die überwiegende Mehrheit eine latente Krankheit, etwa 4 – 14 % entwickeln gesehen innerhalb der ersten fünf Jahre nach der Infektion42, 10 – 20 % der aktiven Primärinfektion stark produzieren exponierte Personen scheinen in der Lage, die Infektion43 sterilisieren und 5 – 10 % der latenten Infektion reaktivieren44. Unterschiede in der Gastgeber Genetik beeinflusst die Anfälligkeit gegen Tuberkulose und die Krankheit Fortschreiten45. Dies wird auch in der Zebrafisch-Bevölkerung gesehen, die im Gegensatz zu vielen anderen Labor Tiere46,47genetisch sehr heterogen ist. Die natürliche genetische Variation macht es ein höchst anwendbaren Modell bei der Suche nach optimalen Immunantworten in diese multifaktorielle Erkrankung.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die finnische kulturelle Stiftung (H.L.), Tampere Tuberculosis Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), Gründung des finnischen Anti-Tuberkulose-Vereins (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius Stiftung (M.P.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane und Aatos Erkko Stiftung (M.P.) und Academy of Finland (M.P.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo und Jenna Ilomäki sind für ihre technische Unterstützung anerkannt. Die Autoren erkennen die Tampere Zebrafisch-Labor für ihren Dienst.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mycobacterium marinum American Type Culture Collection ATCC 927
Middlebrock 7H10 agar BD, Thermo Fisher Scientific 11799042
Middlebrock OADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Middlebrock 7H9 medium BD, Thermo Fisher Scientific 11753473
Middlebrock ADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ML
GENESYS20 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Sigma-Aldrich P4417-50TAB
Phenol red Sigma-Aldrich P3532
27 G needle Henke Sass Wolf 4710004020
1 mL syringe Henke Sass Wolf 4010.200V0
Omnican 100 30 G insulin needle Braun 9151133
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) Sigma-Aldrich A5040
1.5 mL homogenization tube Qiagen 13119-1000
2.8 mm ceramic beads Qiagen 13114-325
Ethanol, ETAX Aa Altia
2-propanol Sigma-Aldrich 278475
Chloroform VWR 22711.290
Guanidine thiocyanate Sigma-Aldrich G9277 FW 118.2 g/mol
Sodium citrate Sigma-Aldrich 1613859 FW 294.1 g/mol
Tris (free base) Sigma-Aldrich TRIS-RO FW 121.14 g/mol
TRI reagent Molecular Research Center TR118 Guanidine thiocyanate-phenol solution
PowerLyzer24 homogenizator Qiagen
Sonicator m08 Finnsonic
Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix Bioline BIO-98005
qPCR 96-well plate BioRad HSP9601
Optically transparent film BioRad MSB1001
C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system BioRad
RNase AWAY Thermo Fisher Scientific 10666421 decontamination reagent eliminating RNases
DNase I Thermo Fisher Scientific EN0525
Reverse Transcription Master Mix Fluidigm 100-6298
SsoFast Eva Green master mix BioRad 172-5211

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Immunologie und Infektion Ausgabe 140 Zebrafisch Tuberkulose Mycobacterium Marinum Mycobacterium Tuberculosis mykobakteriellen Infektion qPCR Immunsystem
Modellierung von Tuberkulose <em>Mycobacterium Marinum</em> infizierten Erwachsenen Zebrafisch
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Luukinen, H., Hammarén, M. M., Vanha-aho, L. M., Parikka, M. Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (140), e58299, doi:10.3791/58299 (2018).

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