Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

בידוד, Decellularization פוג'אלאדוצ'נוי זהאלאזי כל חזירי

Published: October 10, 2018 doi: 10.3791/58302
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Department of Surgery, Institute of Clinical Sciences, Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg, 2The Transplant Institute, Sahlgrenska University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

הנדסת רקמות הלבלב כל היא אתגר פונקציות האנדוקרינית אקסוקרינית שלה. אנו מראים שיטת ניתוח הלבלב חזירי שלם של תהליך של decellularization מוצלחת מאת זלוף של דטרגנטים טריטון X-100, סודיום deoxycholate, ואת deoxyribonuclease.

Abstract

הנדסת רקמות הלבלב כל יכול לשפר טיפולים שוטפים עבור סוכרת. המטרה הסופית היא רקמת הלבלב מהנדס ממקור allogeneic או xenogeneic עם תאים אנושיים. הפגנה של שיטות עבור ניתוח יעיל, decellularization, recellularization של הלבלב חזירי יכול להפיק תועלת השדה. דומה הלבלב אנושי, חזירי הלבלב יש הסכם אנטומי מיוחד עם שלוש אונות (הטחול, תריסריון, וחיבור) מעוגל על ידי התריסריון והמעי הדק. האונה תריסריון הלבלב מתחבר התריסריון על ידי מספר כלי דם קטנים. הנדסת רקמות הלבלב הוא מסובך בשל טבעה, האנדוקרינית אקסוקרינית. בנייר זה, אנו מראים פרוטוקול מפורט לנתח הלבלב כל חזירי, decellularize אותו עם חומרי ניקוי בעת שמירת מבנהו ורכיבים מסוימים מטריצה חוץ-תאית. כדי להשיג זלוף מלאה, אבי העורקים נבחר כניסת ו וריד שער הכבד כמו שקע. כלי הדם (עורק הכבד, הטחול וריד, עורק הטחול, עץ עורק, וריד מצע המעי העליון) ואת צינור המרה אחרים מאתרים. כדי למנוע היווצרות של כגון, החזיר heparinized ו, מיד לאחר ניתוח, האיבר התרוקן עם הפרין קר. כדי לעכב את הפעולה של אנזימים אקסוקרינית, מוגדר decellularization הלבלב-4 מעלות צלזיוס. Decellularization מתבצע על ידי זלוף של טריטון X-100, סודיום deoxycholate, deoxyribonuclease, עם כביסה נרחב לסירוגין והאחרון. עם decellularization מוצלח, הלבלב מופיעה לבן ומראה הערכה היסטולוגית ועם hematoxylin אאוזין היעדרות של גרעינים עם מבנה מטריצה חוץ-תאית משומר. לכן, השיטה המוצעת יכול לשמש בהצלחה לנתח, decellularize הלבלב כל חזירי.

Introduction

סוכרת מאופיין על ידי הנוכחות של רמות גבוהות של גלוקוז בדם. היא מוכרת בתור אתגר מרכזי בריאות הציבור המדינות רוב1. רמות גבוהות של גלוקוז בדם משפיע על כלי הדם, מערכת העצבים, גרימת נזק בעיניים, בלב, בכליות, ואת הגפיים איסכמיה. השיטות המסורתיות של הטיפול כוללים זריקות של אינסולין אקסוגני, תרופות, שינויים באורח החיים. שמה בצד תרופה למחלה, במקרים מסוימים, הטיפולים להיכשל לשמור על האינסולין ברמות טיפולית, וכתוצאה מכך היפרגליקמיה. למרות השתלת של איים קטנים או הלבלב כל מבטלת את המחלה, זה לא נפוץ נעשה בשל מחסור האיברים תורם מתאים ובשל הסיכונים והקשיים מעורב החיסוני, כימוס2.

שיפורים הנוכחי בתחום של הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית בעלי היכולת למתן פתרון לבעיות אלה. עם הטכניקה של decellularization, ניתן להסיר את החומר הסלולר מתורם אדם או בעלי חיים תוך החלבונים החשובים מטריצה חוץ-תאית (ECM), גורמי גדילה, ואת מולקולות איתות יישמרו בלגרדום. פיגומים כזה יכול פוטנציאלית להיות מושתלים ללא צורך החיסוני, כדי לשחזר את תפקוד האיבר לאחר recellularization עם3,-immunogenic בתאי גזע של המטופל4. האברים רקמות מהונדסים ממקורות allogeneic או xenogeneic יכול לשמש השתלת קלינית, החלבונים העיקריים מטריצה חוץ-תאית נשמרים בין המינים, לא יכול להיות דחתה לאחר השתלת5.

Decellularization היא שיטה מוכר הכרוכות אופטימלית של הכוחות הפיזיקליים, חומרי ניקוי כימיים, אנזימים בסביבה הפיזיולוגית כדי להסיר תאים וחומרים גרעיניים רקמה או איבר. Recellularization הוא הליך של זריעת תאי בחזרה לתוך האיבר acellular. . זה הליך קשה מבחינה אינטלקטואלית, הדורשות מספר גדול של תאים, אסטרטגיית אופטימום זורעות תא, ומערכת ביוריאקטור לתרבות של האיבר-תנאים מקובלים מבחינה פיזיולוגית כמו טמפרטורה, לחץ, גזים6

הלבלב יכול להיחשב טישו מאתגרת עבור הנדסת רקמות בגלל שלה אקסוקרינית ויכולות האנדוקרינית. הרקמה האקסוקרינית מפריש אנזימי עיכול מספר, בעוד החלק האנדוקרינית מפרישה הורמונים, כולל אינסולין. Decellularization של הלבלב ללא פגע מן העכבר7,8, אנושי9ו חזיר10 כבר דווח באמצעות אנזימים (טריפסין, deoxyribonuclease [DNase]) ללא יונית (טריטון X-100) ו (דטרגנטים יוניים נתרן deoxycholate [SDC], נתרן גופרתי dodecyl [מרחביות]). עם זאת, בעקבות הפרוטוקולים שפורסמו, נאבקנו עם לנתיחה מוצלחת, מלאה זלוף, decellularization תוך שמירה על מבנה ה-ECM אנחנו משערים כי חומרי ניקוי יישומית במהלך decellularization גורם פירוק של התאים, ובכך משחרר אנזימי עיכול לתוך איבר המין. אנזימים שפורסמו לגרום לנזק בלתי הפיך של לגרדום ECM ולהפוך אותו יעיל עבור decellularization ו- recellularization. עיצוב של השיטה שבה ביעילות decellularizes הלבלב בזמן מעכב את הפעולה של אנזימי העיכול עשויה לפתור את הבעיה. בחרנו את האסטרטגיה של Peloso. et al., של decellularization של הלבלב בטמפרטורה קרה, למרות שהם לא דיווח על הסיבה וקרות מהטמפ בשימוש9. במקביל, תיכננו אסטרטגיה הקרע עם שינויים של טיילור et al. על-ידי בחירת אבי העורקים כמו כניסת זלוף מעל המטען הצליאק (CT), עורק מצע המעי העליון סופריור (SMA)11.

מאמר שפורסם לאחרונה12, נדגים שיטה עבור בידוד יעיל ו decellularization של הלבלב חזירי תוך שמירה על רכיבים מסוימים ECM. בנייר זה, אנו להציג תיאור מפורט של איך לנתח כל חזירי לבלב המכיל הטחול, תריסריון, חיבור אונות, ולהציג פרוטוקול stepwise עבור decellularization מוצלח.

Protocol

ניתוח לבלב חזירי וההליך decellularization המובאת כאן את ההנחיות האתית של אוניברסיטת גטבורג.

1. הכנת קביעת Decellularization

  1. באמצעות צינורות סיליקון 3 x 5 מ מ, התחברות בסדרת המכולה כניסת דטרגנט המשאבה peristalic ועל ואז על הלבלב באיבר קאמרית ויה degasser (ראה איור 1). להתחבר עם סכינים סטריליים זכר לסוף צינור בחדר איברים ללא תשלום.
  2. באמצעות צינור סיליקון אחר של 3 x 5 מ מ, להתחבר לחדר עוגב אאוטלט דטרגנט מיכל דרך משאבת סחרור לאיסוף הנוזל perfused.
  3. להתחבר פיפטה ללא תווית של 2 ml הפנויות של צינורות כניסת דטרגנט המכיל ולא דטרגנט שקע cointainer.
  4. לשמור את כל התרמית ב 4 º C.

Figure 1
איור 1: הכנת הסידור זלוף. באמצעות צינור סיליקון 3 x 5 מ מ, כפי שמוצג בקביעת, להתחבר בסדרת המכולה כניסת דטרגנט את משאבת סחרור, את degasser ואת תא איברים. החצים השחורים מראה לכם את הכיוון זרימה של כניסת דטרגנט מכיל לתא איברים עבור השקע דטרגנט, להשתמש עוד 3 x 5 מ מ סיליקון שפופרת וחבר את איבר קאמרית באמצעות משאבת סחרור המכולה עודפים דטרגנט. החיצים האדומים מראה לכם את הכיוון זרימה של איברים קאמרית לגורם עודפים דטרגנט אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. הכנת Decellularization פתרונות

  1. פתרון 1 (באגירה פוספט תמיסת מלח [PBS]): להוסיף 8 גרם של נתרן כלורי (137 מ מ), g 0.2 (2.7 מ"מ) אשלגן כלורי, 1.44 גר' (10 מ מ) סודיום פוספט ו- 0.24 גר' (1.8 מ"מ) אשלגן פוספט 1 ליטר של מים הנדסה גנטית ומערבבים עד התפרקה. להתאים את ה-pH ל 7.4 עם חומצת מלח (HCl). בסך הכל, 3.2 L של פתרון זה נדרש.
  2. פתרון 2 (PBS + הפארין): עד 1 L של פתרון 1, להוסיף 3.4 מיליליטר הפרין (17 יחידות הבינלאומי [IU] /mL). להכין טרי הפתרון הזה ולשמור אותו בקרח עד שיהפוך קר. בסך הכל, 1.2 L של פתרון זה נדרש.
  3. פתרון 3 (הנדסה גנטית מים + אזיד הנתרן + ניתרן ethylenediaminetetraacetic חומצה [EDTA]): עד 1 L של הנדסה גנטית מים, להוסיף 1.86 g של EDTA (5 מ מ), 200 מ ג של אזיד הנתרן (0.02%). מערבבים עד המלחים הם התפרקה. מגניב הפתרון עד 4 ° C לפני השימוש. בסך הכל, L 22 של פתרון זה נדרש.
  4. פתרון 4 (PBS + אזיד הנתרן + EDTA): עד 1 L של פתרון 1, להוסיף 200 מ ג של אזיד הנתרן (0.02%) ו- g 1.86 של (5 מ"מ) EDTA. מערבבים עד המלחים הם התפרקה. מגניב הפתרון עד 4 ° C לפני השימוש. בסך הכל, 1 ליטר של פתרון זה נדרש.
  5. פתרון 5 (הנדסה גנטית מים + אזיד הנתרן): עד 1 L של הנדסה גנטית מים, להוסיף 200 מ ג של אזיד הנתרן (0.02%). מערבבים עד המלחים הם התפרקה. מגניב הפתרון עד 4 ° C לפני השימוש. בסך הכל, 260 L של פתרון זה נדרש.
    הערה: EDTA טפסים של התמיסה עם SDC, נכללו 5 פתרון מאז זה ישמש לרחצה מיידית לפני ואחרי הטיפול SDC.
  6. פתרון 6 (SDC + טריטון X-100): 940 מ של מים הנדסה גנטית, להוסיף 40 גרם (4%) SDC, 60 מ ל (6%) טריטון X-100 200 מ ג של אזיד הנתרן (0.02%), 69.6 מ"ג של פלואוריד (0.4 מ מ) phenylmethylsulfonyl (PMSF). מערבבים עד התפרקה. מגניב הפתרון עד 4 ° C לפני השימוש. הוסף PMSF לפני השימוש. בסך הכל, 9.6 L של פתרון זה נדרש.
  7. פתרון 7 (DNase): להוסיף קוניץ 10,000 יחידות DNase-אני ב- 250 מ של PBS של Dulbecco (40 קוניץ יחידות/mL) המכיל CaCl2 ו- MgCl2. להכין טרי ולהשתמש מיד. חממו את הפתרון 37 ° C לפני השימוש.
  8. פתרון 8 (PBS + נתרן אזיד): עד 1 L של פתרון 1, להוסיף 200 מ ג של אזיד הנתרן (0.02%). מערבבים עד המלחים הם התפרקה. מגניב הפתרון עד 4 ° C לפני השימוש. בסך הכל, 1 ליטר של פתרון זה נדרש.

3. ניתוח של הלבלב חזירי

הערה: במחקר זה, הלבלב חזירי היו גזור מן מורדמים, heparinized (400 IU/kg) חזירות במשקל של 45 ק ג של חווה.

  1. מקם את החזיר על השולחן לנתיחה במצב פרקדן.
  2. עושים קו האמצע חתך מתהליך xiphoidal לעצם החיק (כ 40 ס מ) בעזרת אזמל, חשיפת כל אברי הבטן.
  3. לאתר את הטחול, תריסריון, ואת החיבור אונות.
  4. אתר רמת papilla תריסריון העיקריים ולחץ מאתרים ומפסיקים התריסריון אורלית מאתר זה בעזרת שני תפרים נפרדים.
  5. מאתרים ומפסיקים את הוושט נחות עם שני תפרים נפרד וחותכים בין ליגטורות עם מספריים כדי להוציא את הבטן.
  6. להפריד את רקמת המעי הגס כדי להגיע אל המעי הדק.
  7. להפריד את רקמת החיבור של המעי הגס שמתחבר האונה הטחול של הלבלב.
  8. הסר את המעי הגס המעי הדק לאחר נבדק העורקים.
  9. למצוא את וריד מצע המעי העליון נחות והעץ עורק מצע המעי העליון נחות, מאתרים ומפסיקים בתפר אחד שבו יופיעו הקליפה של הלבלב.
  10. מאתרים ומפסיקים את עורק הטחול ואת הווריד יחד עם תפר אחד, קרוב הטחול, ב hilum, וחותכים רחוק עם מספריים כדי להסיר את הטחול.
  11. בצע את התריסריון עד האונות תריסריון וחיבור נמחקים, מאתרים ומפסיקים התריסריון בסוף עם שני תפרים נפרדים.
  12. לנתח את וריד שער הכבד, מאתרים ומפסיקים אותו בתפר אחד כדי למנוע דליפה כלשהי הדם מן הכבד, לחתוך הציר הקרוב קשירה. וריד שער הכבד משמש לפורקן במהלך decellularization.
  13. לנתח, מאתרים ומפסיקים את צינור המרה ואת עורק הכבד עם שני תפרים. לחתוך יש תפרים.
  14. למצוא העורקים תחת וריד הכליה, לנתח את זה לכיוון הגולגולת של שרירים ורקמות. עד שהוא מגיע לאזור הלבלב.
  15. להתהפך הלבלב בעדינות, לנתח את העורקים, שמירה SMA ו- CT תקין, וחותכים העורקים ל CT לכוחו של SMA עם מספריים.
  16. לחתוך את הנותרים הרקמות הסובבות עם מספריים, להוציא את הלבלב.
  17. באמצעות מזרק 50-mL מחובר arteriotomy 4-מ מ בצינורית, לרוקן את האיבר דרך העורקים עם פתרון 2 עד זה perfuses את כל האיבר או עד האיבר כולו הופך קר.

4. הכנה של הלבלב חזירי Decellularization

  1. לשמור על הלבלב ב 4 ° C או על קרח לאורך כל התהליך.
  2. לחתוך את התפרים של התריסריון באמצעות מספריים, לנקות את זה של מזון על ידי שטיפה 50-150 מ ל מים הנדסה גנטית בעזרת פיפטה 25-mL ו מאתרים ומפסיקים אותו שוב עם תפרים.
  3. מאתרים ומפסיקים את קצה אחד של אבי העורקים ואת כל ענפי חוץ SMA ו- CT עם תפרים למניעת דליפה.
  4. הוספת מהקצה השני של אבי העורקים בצינורית 4-מ מ arteriotomy, מאתרים ומפסיקים את זה עם תפרים.
  5. Perfuse הלבלב עם פתרון 3 בשביל 1 h ב- 20 מ ל/דקה באמצעות את קביעת decellularization.
    הערה: Prefill הצינורות של משאבת עם פתרון 3 כזה כי אין בועות הזן הלבלב. לחפש כל leakages מכל הכיוונים של האיבר, מאתרים ומפסיקים סניפים כלי הדם הכל פתוח עם התפרים, למעט וריד שער הכבד.
  6. להקפיא הלבלב ב-20 ° C ב- 4 פתרון עד תחילת decellularization.

5. decellularization של הלבלב חזירי

  1. הפשרת הלבלב ב 4 º C.
  2. הפעל את משאבת סחרור בקביעת decellularization עם פתרון 3 ב- 20 מ ל/דקה עד אין בועות אוויר נראים בצינור כניסת דטרגנט.
  3. למקם את הלבלב המכולה decellularization וחבר את צינור כניסת דטרגנט העורקים של הלבלב. לשטוף את איבר המין על ידי זלוף עם פתרון 3 בן לילה-20 mL/min ב 4 º C.
  4. יוצקים את הפתרון השאיר בבית הבליעה איברים.
  5. להחליף 3 פתרון פתרון 5 ו perfuse הלבלב למשך 30 דקות ב- 20 mL/min ב 4 º C. יוצקים את הפתרון בבית הבליעה איברים.
  6. להוסיף פתרון 6, perfuse הלבלב עבור 8 שעות-20 mL/min ב 4 º C. יוצקים את הפתרון בבית הבליעה איברים.
  7. לשטוף את איבר המין על ידי זלוף עם 5 פתרון עבור 96 h ב- 20 mL/min ב 4 º C. יוצקים את הפתרון בבית הבליעה איברים.
  8. הכן הלבלב לטיפול DNase באמצעות צואה 500 מ ל- PBS של Dulbecco המכילה CaCl2 ו- MgCl2 למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. יוצקים את הפתרון בבית הבליעה איברים.
  9. להוסיף 250 מ של פתרון 7, perfuse הלבלב במשך 4 שעות ב- 20 mL/min ב- 37 מעלות צלזיוס. יוצקים את הפתרון בבית הבליעה איברים.
  10. לשטוף את איבר המין על ידי זלוף עם 5 פתרון עבור h 120 20 mL/min ב 4 º C.
  11. אחסן את האיבר פתרון 8 ב 4 ° C לפרקי זמן קצרים או ב-20 ° C לתקופות ארוכות.

6. אימות של Decellularization

  1. בעזרת מספריים, לחתוך ביופסיות 3 עד 10-מ מ מ כל האונות של הלבלב ותקן אותן בפורמלין במשך 48 שעות בטמפרטורת החדר.
  2. לשטוף את החלקים במים הנדסה גנטית למשך 15 דקות, לעבד אותם במעבד רקמות בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים, להטביע אותם בפרפין.
  3. סעיפים 5-מיקרומטר באמצעות מיקרוטום גזורה תכתים אותם על ידי hematoxylin ו- 0.2% אלכוהוליים אאוזין של מאייר (הוא) בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים.
  4. הצגת השקופיות תחת מיקרוסקופ אור כדי לבדוק על האובדן של גרעין האטום.
    הערה: קטע רקמה טריים מעובדים באופן זהה יכול לשמש פקד כדי לבדוק נוכחות של גרעין האטום.

Representative Results

נציג הלבלב חזירי חיתוך תמונות, אשר יכול לעזור לאתר, לנתח את עורק מצע המעי העליון נחות הווריד עץ, וריד שער הכבד, עורק הכבד, המרה, העורקים המסתעפת CT ו- SMA, מוצגות באיור איור 2A, 2Bו- 2 C (צהוב חצים), בהתאמה. איור 3A מראה המורפולוגיה ברוטו של לבלב נורמלי, אשר מופיע אור ורוד והוא מכיל הטחול, חיבור, ואונות תריסריון. לאחר decellularization, צבע ורוד אובד, הלבלב decellularized נראה לבן חיוור בצבע. מורפולוגיה דוחה תמונה המציגה את הטחול, חיבור, ואונות תריסריון לבלב decellularized מוצג באיור 3B. איור 3C מציגה הנוכחות של גרעינים רבים כחול הלבלב נורמלי על ידי צביעת עם הוא. ב לבלב decellularized, שהוא מכתים הראה לאובדן של גרעינים, כמו גרעינים כחול לא נראים (דמות תלת-ממד).

Figure 2
איור 2: תמונות של הלבלב חזירי. הקרע. (א) מיקום של נחות מצע המעי העליון רואה העץ (חץ צהוב). (B) מצדו של וריד שער הכבד, עורק הכבד המרה (חץ צהוב). אבי העורקים (C) מ. המטען הצליאק, עורק מצע המעי העליון סופריור (חץ צהוב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ברוטו מורפולוגיה והוא מכתים של הלבלב נורמלי, decellularized. (א) מורפולוגיה ברוטו פוג'אלאדוצ'נוי זהאלאזי נורמלי. (B) דוחה המורפולוגיה של לבלב decellularized. (ג) הוא מכתים מציגה הנוכחות של גרעינים כחול הלבלב נורמלי. (ד) הוא מכתים מציג להעדר הגרעינים כחול לבלב decellularized. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

הפרוטוקול המוצע, באמצעות זלוף SDC, טריטון X-100 ב 4 ° C, decellularize הלבלב כל חזירי בהצלחה. האתגר בטכניקה זו הוא ניתוח הלבלב שלם המכיל כל האונות שלוש ללא פגיעה parenchyma ו. הקערות המספקת, וכן את מצדו של הסניפים כלי הדם של הדגימה כדי perfuse את האיבר בלי דליפה. הלבלב חזירי יש של האנטומיה שונה בהשוואה בלבלב האנושי. הוא מורכב משלוש אונות, נשאר בקשר הדוק עם המעי הדק על ידי חלקית המקיפים אותו. פרקנו התריסריון יחד עם הלבלב, כמו מספר כלי דם קטנים מן הלבלב מתחבר המעי. במהלך הלימודים אופטימיזציה, חיתוך בוטה של כלי דם אלה הראו זליגת זלוף לא שלם של פתרונות.

מאז העורקים מתחבר הלבלב דרך העורקים מצע המעי העליון הצליאק והסופריור, בחרנו העורקים כמו מעין שקע בחופו לשמור את זלוף פשוטה באמצעות רק בצינורית אחד ו, לכן, כניסה אחת. מניסיוננו, מצדו של אבי העורקים מעל ה-CT ומתחת של SMA יקטן הזמן של דיסקציה ומפחיתה את הסיכון של פגיעה כלשהי שתי הספינות. בנוסף חזיר heparinized, שמנו לב גם כי זלוף של הפארין קר ויה מיד לאחר דיסקציה אבי העורקים מסייעת בהשגת זלוף של פתרונות לכל אורך איבר המין. אנחנו משערים אם מצב זה מתרחש על-ידי מניעת היווצרות של קרישי דם בכלי הדם. זלוף הראשונית של לבלב עם הנדסה גנטית מים לאחר ניתוח lyse כדוריות דם אדומות ולהסיר שאריות הדם באיבר, ובכך מונע היווצרות של קרישי דם. בתקופה זו גם ניתן למצוא בכל סניפי קטן unligated של ורידים, עורקים, כמו זרימת הדם ניתן להבחין בקלות מעל הרקע.

בחרנו להשאיר את ההליך כולו decellularization בטמפרטורות קרות (4 ° C), כמו זה לעכב את הפעולה של אנזימים אקסוקרינית לשחרר מתאי אקסוקרינית של הלבלב. אנזימים אקסוקרינית, כאשר לא עכבות, יכול לגרום חד משמעית את ECM, והתאים כפי שהם מסוגלים לעכל קרום התא וב -חלבונים12. כפי הקפאה והפשרה של יכולות להתפוצץ ביעילות את התאים, כללנו צעד ההקפאה/ההפשרה, בתחילה עוד לפני זלוף של דטרגנטים4,13. לשטוף את הראשונית לאחר מפשיר יסיר את שרידי התא מתפרץ. הטיפול דטרגנט השתמשנו הוא שילוב של SDC טריטון X-100 בריכוזים גבוהים מהרגיל, במהירות גבוהה זלוף. בחרנו בגישה זו כדי להשיג decellularization מהר יותר על-ידי הסרת התאים אקסוקרינית נזק של ECM. אנו משערים כי פרוטוקול חזק ומהר הוא מועיל עבור הלבלב decellularization, כפי פחות זמן יהיה זמין עבור אנזימי לבלב לקיים אינטראקציה עם ה-ECM, וכך לשמר את רכיבי ה-ECM טוב. כדי לשמר את רכיבי ה-ECM, גם הוספנו סרין מעכב פרוטאז (PMSF) הפתרונות דטרגנט, כמו זה ימנע את ההפעלה של אנזימים שוחרר מן התאים אקסוקרינית14. אזיד הנתרן נוסף כל הפתרונות decellularization, כאשר היא פועלת כסוכן bacteriostatic, ובכך מעכבים את הסיכוי לזיהום חיידקי15.

הלבלב decellularized בעקבות פרוטוקול זה הראה על שימור מבנים ECM, ה-ECM חלבונים קולגן ואלסטין. עם זאת, לאובדן משמעותי של glycosaminoglycans היה לב בלבלב decellularized. הלבלב decellularized באופנה זה הראה גם ההבטחה עבור ההחזקה של האדם תאי גזע עובריים הלבלב ואת הביטוי של סמנים, האנדוקרינית אקסוקרינית חתיכות recellularized 14 ימים12. עם זאת, כדי ליצור של הלבלב שלמים ולא פונקציונלי, מחקר נוסף נדרש בהערכת מקורות התא הנכון, סוגי תאים, תא אסטרטגיות זריעה והתרבות ביוריאקטור.

Disclosures

S.S.H. מחזיקה החברה במניות Verigraft, חברה יש רישיון הטכנולוגיה של הנדסת רקמות כלי דם. המחברים האחרים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי מענק מאלף LUA הממשלה השוודי S.S.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4mm DLP arteriotomy cannula Medtronic 31104
2ml Unlabelled pipette vWR 612-3720
Degasser Biotech AB 0001-6484
DNase-I Worthington LS0020007
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 Sigma Aldrich D8662
EDTA disodium salt dihydrate AlfaAesar A15161.OB
Heparin Leo 387107
Luer Male with 1/8" ID Barb Oina LM-2PP-QC For 3X5mm silicon tube
Peristaltic pump Oina SP-1X4
PMSF Roche 10837091001 Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion.
Potassium chloride Sigma Aldrich P5405
Potassium hydrogen phosphate Sigma Aldrich P9791
SDC Sigma Aldrich 30970
Silicon tube 3X5mm VWR 2280706
Sodium Azide Sigma Aldrich 71290
Sodium chloride Sigma Aldrich 13423
Sodium hydrogen phosphate Merck 71640-M
Suture Vömel 14817
Syrringe 50mL Becton Dickinson 300137
Triton-X-100 AlfaAesar A16046.OF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Federation, I. D. IDF Diabetes Atlas. , Available from: http://www.diabetesatlas.org (2016).
  2. Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. Journal of Diabetes and its Complications. 29 (5), 737-743 (2015).
  3. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
  4. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  5. Hynes, R. O. The evolution of metazoan extracellular matrix. Journal of Cell Biology. 196 (6), 671-679 (2012).
  6. Scarritt, M. E., Pashos, N. C., Bunnell, B. A. A review of cellularization strategies for tissue engineering of whole organs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnol. 3, 43 (2015).
  7. Goh, S. K., et al. Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering. Biomaterials. 34 (28), 6760-6772 (2013).
  8. Wu, D., et al. 3D Culture of MIN-6 Cells on Decellularized Pancreatic Scaffold. In Vitro and In Vivo Study. Biomed Research International. 2015, 432645 (2015).
  9. Peloso, A., et al. The Human Pancreas as a Source of Protolerogenic Extracellular Matrix Scaffold for a New-generation Bioartificial Endocrine Pancreas. Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).
  10. Mirmalek-Sani, S. H., et al. Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering. Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).
  11. Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation. Cell Transplantation. 19 (5), 613-628 (2010).
  12. Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).
  13. Gilpin, A., Yang, Y. Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications. Biomed Research International. 2017, 9831534 (2017).
  14. James, G. T. Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers. Analytical Biochemistry. 86 (2), 574-579 (1978).
  15. Lichstein, H. C., Soule, M. H. Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: I. The Action of Sodium Azide on Microbic Growth. Journal of Bacteriology. 47 (3), 221-230 (1944).

Tags

בביו-הנדסה בעיה 140 לבלב הלבלב חזירי לנתיחה הנדסת רקמות decellularization רפואה רגנרטיבית מטריצה חוץ-תאית
בידוד, Decellularization פוג'אלאדוצ'נוי זהאלאזי כל חזירי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuna, V. K., Kvarnström, N.,… More

Kuna, V. K., Kvarnström, N., Elebring, E., Holgersson, S. S. Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas. J. Vis. Exp. (140), e58302, doi:10.3791/58302 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter