Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

अलगाव और एक पूरे सुअर का अग्ंयाशय के Decellularization

Published: October 10, 2018 doi: 10.3791/58302
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Department of Surgery, Institute of Clinical Sciences, Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg, 2The Transplant Institute, Sahlgrenska University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

पूरे अग्ंयाशय के ऊतक इंजीनियरिंग अपनी exocrine और अंत में स्रावी कार्यों की वजह से एक चुनौती है । हम एक बरकरार सुअर का अग्ंयाशय के विच्छेदन और डिटर्जेंट ट्राइटन एक्स-१००, सोडियम deoxycholate, और deoxyribonuclease के छिड़काव द्वारा सफल decellularization की प्रक्रिया के लिए एक विधि दिखाते हैं ।

Abstract

पूरे अग्ंयाशय के ऊतक इंजीनियरिंग मधुमेह के लिए वर्तमान उपचार में सुधार कर सकते हैं । अंतिम लक्ष्य मानव कोशिकाओं के साथ एक allogeneic या xenogeneic स्रोत से ऊतक इंजीनियर अग्ंयाशय के लिए है । कुशल विच्छेदन, decellularization, और सुअर का अग्ंयाशय के recellularization के लिए विधियों का एक प्रदर्शन क्षेत्र को लाभ हो सकता है । मानव अग्ंयाशय के समान, सुअर का अग्ंयाशय तीन पालियों (प्लीहा, ग्रहणी, और कनेक्शन) ग्रहणी और छोटी आंत द्वारा गोल के साथ एक विशेष संरचनात्मक व्यवस्था है । अग्ंयाशय के ग्रहणी पालि कई छोटे रक्त वाहिकाओं द्वारा ग्रहणी को जोड़ता है । अग्न्याशय के टिशू इंजीनियरिंग इसकी exocrine और अंत में स्रावी प्रकृति की वजह से जटिल है । इस पत्र में, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल दिखाने के लिए पूरे सुअर का अग्ंयाशय काटना और यह डिटर्जेंट के साथ decellularize जबकि इसकी संरचना और कुछ extracellular मैट्रिक्स घटकों को बचाने । पूरा छिड़काव प्राप्त करने के लिए, महाधमनी प्रवेश और आउटलेट के रूप में पोर्टल नस के रूप में चुना जाता है । अन्य रक्त वाहिकाओं (यकृत धमनी, प्लीहा नस, प्लीहा धमनी, mesenteric धमनी और शिरा पेड़) और पित्त नली ligated हैं । थक्का के गठन को रोकने के लिए, सुअर heparinized है और, विच्छेदन के तुरंत बाद, अंग ठंडे हेपरिन के साथ फ्लश है । exocrine एंजाइमों की कार्रवाई को बाधित करने के लिए, अग्ंयाशय decellularization 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया गया है । decellularization ट्राइटन एक्स के छिड़काव द्वारा किया जाता है-१००, सोडियम deoxycholate, और deoxyribonuclease, एक आंतरायिक और अंतिम व्यापक धुलाई के साथ । एक सफल decellularization के साथ, अग्ंयाशय सफेद दिखाई देता है, और hematoxylin और eosin के साथ एक ऊतकवैज्ञानिक मूल्यांकन एक संरक्षित नाभिक मैट्रिक्स संरचना के साथ extracellular की अनुपस्थिति से पता चलता है । इस प्रकार, प्रस्तावित विधि सफलतापूर्वक काटना और decellularize पूरे सुअर का अग्ंयाशय के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

मधुमेह रक्त में ग्लूकोज के स्तर में वृद्धि की उपस्थिति की विशेषता है । यह अधिकांश देशों में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य चुनौती के रूप में पहचाना जाता है1. रक्त ग्लूकोज के उच्च स्तर रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंत्र को प्रभावित, आंखों को नुकसान के कारण, दिल, और गुर्दे, और उग्रवाद के ischemia. उपचार के पारंपरिक तरीकों exogenous इंसुलिन, दवाओं, और जीवन शैली में परिवर्तन के इंजेक्शन शामिल हैं । एक तरफ रोग के लिए एक इलाज लाना, कुछ मामलों में, उपलब्ध उपचार चिकित्सकीय स्तर पर इंसुलिन बनाए रखने में विफल, hyperglycemia में जिसके परिणामस्वरूप. हालांकि टाप या पूरे अग्ंयाशय के प्रत्यारोपण रोग समाप्त, यह आमतौर पर उपयुक्त दाता अंगों की कमी की वजह से नहीं किया है और जोखिम और प्रतिरक्षादमन और encapsulation2से जुड़े कठिनाइयों की वजह से ।

ऊतक इंजीनियरिंग और regenerative चिकित्सा के क्षेत्र में वर्तमान सुधार इन मुद्दों के लिए एक समाधान प्रदान करने के लिए क्षमता के अधिकारी । decellularization की तकनीक के साथ, एक मानव या पशु दाता से सेलुलर सामग्री हटाया जा सकता है, जबकि महत्वपूर्ण extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन, विकास कारकों, और संकेत अणुओं पाड़ में संरक्षित कर रहे हैं । इस तरह के पाड़ों संभावित प्रतिरक्षादमन के लिए आवश्यकता के बिना प्रत्यारोपण किया जा सकता है, प्राप्तकर्ता के अपने गैर immunogenic स्टेम सेल3,4के साथ recellularization के बाद अंग समारोह बहाल करने के लिए । allogeneic या xenogeneic स्रोतों से ऊतक इंजीनियर अंगों नैदानिक प्रत्यारोपण में इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रमुख extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन प्रजातियों के बीच संरक्षित कर रहे हैं और5प्रत्यारोपण के बाद अस्वीकार नहीं किया जा सकता है के रूप में.

Decellularization एक अच्छी तरह से पता लगाया है शारीरिक बलों, रासायनिक डिटर्जेंट, और एक शारीरिक सेटिंग में एंजाइमों के इष्टतम उपयोग को शामिल विधि एक ऊतक या अंग से कोशिकाओं और परमाणु सामग्री को दूर करने के लिए । Recellularization कोशिकाओं acellular अंग में वापस बोने की एक प्रक्रिया है । यह एक बौद्धिक कठिन प्रक्रिया है, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है, एक इष्टतम कोशिका बोने की रणनीति, और तापमान, दबाव की तरह शारीरिक रूप से स्वीकार्य शर्तों पर अंग की संस्कृति के लिए एक प्रतिक्रियात्मक प्रणाली, और6गैसों ।

अग्ंयाशय अपने exocrine और अंत में स्रावी क्षमता की वजह से ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक चुनौतीपूर्ण ऊतक माना जा सकता है । exocrine ऊतक कई पाचन एंजाइमों स्रावित करती है, जबकि अंत में स्रावी हिस्सा हार्मोन, इंसुलिन सहित स्रावित करती है । माउस से बरकरार अग्न्याशय की decellularization7,8, मानव9, और सुअर10 पहले से ही एंजाइमों का उपयोग रिपोर्ट किया गया है (trypsin, deoxyribonuclease [DNase]) और गैर ईओण (ट्राइटन एक्स-१००) और ईओण डिटर्जेंट ( सोडियम deoxycholate [एसडीसी] और सोडियम dodecyl सल्फेट [एसडीएस]) । हालांकि, प्रकाशित प्रोटोकॉल के बाद, हम एक सफल विच्छेदन और पूरा छिड़काव और decellularization के साथ संघर्ष करते हुए एक ECM संरचना को बनाए रखने । हम अटकलें लगाई कि कोशिकाओं के decellularization कारण lysis के दौरान लागू डिटर्जेंट, जिससे अंग में पाचन एंजाइमों को रिहा । जारी एंजाइमों ECM पाड़ के लिए एक अपरिवर्तनीय क्षति का कारण है और यह decellularization और recellularization के लिए अक्षम कर देगा । विधि का एक डिजाइन है कि प्रभावी ढंग से decellularizes अग्ंयाशय जबकि पाचन एंजाइमों की कार्रवाई बाधा समस्या का समाधान हो सकता है । हम Peloso एट अलकी रणनीति का फैसला किया, अग्ंयाशय के decellularization के एक ठंडे तापमान पर, हालांकि वे रिपोर्ट क्यों ठंड तापमान9इस्तेमाल किया जाता है पर नहीं था । एक ही समय में, हम टेलर एट अल से संशोधनों के साथ एक विच्छेदन रणनीति तैयार की coeliac ट्रंक (सीटी) और बेहतर mesenteric धमनी (SMA)11पर एक छिड़काव प्रवेश के रूप में महाधमनी का चयन करके ।

हाल ही में प्रकाशित एक लेख12में, हम प्रभावी अलगाव और सुअर का अग्ंयाशय के decellularization के लिए एक विधि का प्रदर्शन करते हुए कुछ ECM घटकों के संरक्षण । इस पत्र में, हम प्लीहा, ग्रहणी, और कनेक्शन पालियों युक्त एक पूरे सुअर का अग्ंयाशय काटना करने के लिए कैसे का एक विस्तृत वर्णन दिखाने के लिए, और सफल decellularization के लिए एक stepwise प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Protocol

एक सुअर का अग्ंयाशय के विच्छेदन और decellularization प्रक्रिया यहां प्रस्तुत गोथनबर्ग विश्वविद्यालय के नैतिक दिशा निर्देशों का पालन करें ।

1. Decellularization सेट अप की तैयारी

  1. 3 x 5 मिमी सिलिकॉन ट्यूबों का उपयोग करना, श्रृंखला में peristalic पंप करने के लिए डिटर्जेंट प्रवेश कंटेनर और फिर degasser के माध्यम से अंग कक्ष में अग्ंयाशय के लिए कनेक्ट ( 1 चित्रादेखें) । अंग कक्ष में ट्यूब के मुक्त अंत करने के लिए एक पुरुष luer कनेक्ट ।
  2. एक और 3 x 5 मिमी सिलिकॉन ट्यूब का उपयोग कर, सिकुड़नेवाला पंप के माध्यम से डिटर्जेंट आउटलेट कंटेनर के लिए अंग कक्ष कनेक्ट करने के लिए perfused डिटर्जेंट इकट्ठा ।
  3. एक 2 मिलीलीटर पिपेट डिटर्जेंट प्रवेश कंटेनर और डिटर्जेंट आउटलेट cointainer में ट्यूबों के मुक्त सिरों को unlabel्ड कनेक्ट ।
  4. 4 ° c पर पूरे सेट-अप रखें ।

Figure 1
चित्रा 1: छिड़काव सेट अप की तैयारी । एक 3 x 5 मिमी सिलिकॉन ट्यूब का उपयोग करना, के रूप में सेट अप में दिखाया गया है, सिकुड़नेवाला पंप, degasser और अंग चैंबर के लिए श्रृंखला डिटर्जेंट प्रवेश कंटेनर में कनेक्ट । काले तीर डिटर्जेंट प्रवेश कंटेनर से अंग कक्ष के प्रवाह की दिशा दिखाने के लिए । डिटर्जेंट आउटलेट के लिए, एक और 3 x 5 मिमी सिलिकॉन ट्यूब का उपयोग करें और डिटर्जेंट आउटलेट कंटेनर के लिए सिकुड़नेवाला पंप के माध्यम से अंग चैंबर कनेक्ट । लाल तीर अंग कक्ष से डिटर्जेंट आउटलेट कंटेनर के प्रवाह की दिशा दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

2. Decellularization समाधानों की तैयारी

  1. समाधान 1 (फॉस्फेट-बफर खारा [पंजाब]): 8 ग्राम (१३७ मिमी) के सोडियम क्लोराइड, ०.२ जी के (२.७ मिमी) पोटेशियम क्लोराइड, १.४४ जी के (10 मिमी) सोडियम फॉस्फेट, और ०.२४ जी के (१.८ मिमी) पोटेशियम फॉस्फेट ultrapure पानी की 1 L को जोड़ें और हलचल जब तक भंग । ७.४ को हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCl) के साथ पीएच समायोजित करें । इस समाधान के कुल, ३.२ एल में आवश्यक है ।
  2. समाधान 2 (पंजाब + हेपरिन): 1 एल के समाधान 1 के लिए, जोड़ें ३.४ मिलीलीटर की हेपरिन (17 अंतर्राष्ट्रीय इकाइयों [IU]/mL) । इस घोल को ताजा तैयार करें और इसे ठंडा होने तक बर्फ पर रखें । इस समाधान के कुल, १.२ एल में आवश्यक है ।
  3. समाधान 3 (ultrapure water + सोडियम azide + disodium ethylenediaminetetraacetic एसिड [EDTA]): ultrapure पानी के 1 एल के लिए, जोड़ें १.८६ जी के (5 मिमी) EDTA और २०० मिलीग्राम की (०.०२%) सोडियम azide । हलचल जब तक नमक भंग कर रहे हैं । प्रयोग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान ठंडा । कुल में, इस समाधान के 22 एल की आवश्यकता है ।
  4. समाधान 4 (पंजाबियों + सोडियम azide + EDTA): 1 एल के समाधान 1, जोड़ें २०० मिलीग्राम की (०.०२%) सोडियम azide और १.८६ जी के (5 मिमी) EDTA. हलचल जब तक नमक भंग कर रहे हैं । प्रयोग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान ठंडा । कुल में, इस समाधान के 1 एल की आवश्यकता है ।
  5. समाधान 5 (ultrapure water + सोडियम azide): ultrapure पानी के 1 एल के लिए, जोड़ें २०० मिलीग्राम (०.०२%) सोडियम azide । हलचल जब तक नमक भंग कर रहे हैं । प्रयोग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान ठंडा । इस समाधान के कुल, २६० एल में आवश्यक है ।
    नोट: EDTA रूपों एसडीसी के साथ एक हाला और समाधान 5 से बाहर रखा गया था क्योंकि यह तत्काल धोने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा से पहले और एसडीसी उपचार के बाद ।
  6. हल 6 (एसडीसी + ट्राइटन X-१००): ultrapure पानी की ९४० मिलीलीटर, के लिए ४० g जोड़ें (4%) एसडीसी, ६० मिलीलीटर की (6%) ट्राइटन एक्स-१००, २०० मिलीग्राम (०.०२%) सोडियम azide, और ६९.६ मिलीग्राम (०.४ मिमी) phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) । हलचल जब तक भंग । प्रयोग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान ठंडा । उपयोग करने से पहले PMSF जोड़ें । इस समाधान के कुल, ९.६ एल में आवश्यक है ।
  7. समाधान 7 (DNase): जोड़ें १०,००० Kunitz इकाइयों में DNase-I की २५० मिलीलीटर (४० Kunitz इकाइयों/Dulbecco के पंजाबियों युक्त CaCl2 और MgCl2। ताजा तैयार है और तुरंत उपयोग करें । उपयोग करने से पहले ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान गर्म ।
  8. 8 समाधान (पंजाबियों + सोडियम azide): समाधान 1 के 1 एल, जोड़ें २०० मिलीग्राम (०.०२%) सोडियम azide । हलचल जब तक नमक भंग कर रहे हैं । प्रयोग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान ठंडा । कुल में, इस समाधान के 1 एल की आवश्यकता है ।

3. सुअर का अग्ंयाशय का विच्छेदन

नोट: इस अध्ययन में, सुअर का अग्न्याशय euthanized से विच्छेदित किया गया, heparinized (४०० IU/महिला सूअरों एक खेत से ४५ किलो वजनी ।

  1. लापरवाह स्थिति में सुअर को विच्छेदन टेबुल पर रखें ।
  2. xiphoidal प्रक्रिया से जघन हड्डी (लगभग ४० सेमी) एक स्केलपेल का उपयोग कर, सभी उदर अंगों को उजागर करने के लिए एक midline चीरा बनाओ ।
  3. प्लीहा, ग्रहणी, और कनेक्शन पालियों की स्थिति जानें ।
  4. प्रमुख ग्रहणी papilla के स्तर का पता लगाने और दो अलग टांके का उपयोग कर उस साइट से मौखिक रूप से ग्रहणी ligate ।
  5. दो अलग टांके के साथ अवर घेघा Ligate और पेट बाहर ले जाने के लिए कैंची के साथ लिगेचर्स के बीच कटौती ।
  6. छोटी आंत तक पहुंचने के लिए बृहदांत्र से संयोजी ऊतक अलग ।
  7. अग्ंयाशय के प्लीहा पालि के लिए देता है कि बृहदांत्र के संयोजी ऊतक अलग ।
  8. धमनियों को ligating के बाद छोटी आंत से कोलन को निकाल लें ।
  9. अवर mesenteric नस और अवर mesenteric धमनी के पेड़ और ligate एक सीवन जहां वे अग्ंयाशय के caudally दिखाई के साथ खोजें ।
  10. प्लीहा धमनी और नस को एक साथ एक सीवन के साथ Ligate, तिल्ली के करीब, hilum में, और तिल्ली को हटाने के लिए कैंची के साथ लंबी कटौती ।
  11. ग्रहणी और कनेक्शन पालियों को मंजूरी दे दी है जब तक ग्रहणी का पालन करें और दो अलग टांके के साथ अंत में ग्रहणी ligate ।
  12. पोर्टल नस काटना, यह एक सीवन के साथ ligate जिगर से किसी भी रक्त रिसाव को रोकने के लिए और संयुक्ताक्षर को समीपस्थ काट । पोर्टल शिरा decellularization के दौरान एक आउटलेट के रूप में कार्य करता है ।
  13. काटना और दो टांके के साथ पित्त नलिका और यकृत धमनी ligate । टांके के लिए लंबी कटौती ।
  14. गुर्दे की नस के तहत महाधमनी का पता लगाएं और मांसपेशियों और संयोजी ऊतक से कपाल दिशा में यह काटना जब तक यह अग्नाशय के क्षेत्र तक पहुंचता है ।
  15. अग्न्याशय को धीरे से ऊपर पलटें और महाधमनी को काटना, sma और सीटी को बरकरार रखते हुए, और महाधमनी को सीटी से बेहतर और कैंची से sma करने के लिए काट लें ।
  16. शेष आसपास के ऊतकों को कैंची से काटें और अग्न्याशय को बाहर निकाल लें ।
  17. 4-mm arteriotomy प्रवेशनी से जुड़े एक ५०-एमएल सिरिंज का प्रयोग, महाधमनी के माध्यम से अंग फ्लश 2 जब तक यह पूरे अंग perfuses या जब तक पूरे अंग ठंडा हो जाता है ।

4. Decellularization के लिए सुअर का अग्न्याशय की तैयारी

  1. अग्ंयाशय में 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर प्रक्रिया भर में रखो ।
  2. काट-छाँट का उपयोग कर ग्रहणी की टांके, यह एक 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर ultrapure पानी की ५०-१५० मिलीलीटर फ्लश द्वारा भोजन की साफ है, और यह फिर से टांके के साथ ligate ।
  3. रिसाव को रोकने के लिए महाधमनी के एक छोर और Ligate के अलावा सभी शाखाओं में टांके के साथ और सीटी के साथ ।
  4. महाधमनी एक 4 मिमी arteriotomy प्रवेशनी के दूसरे छोर से डालें और यह टांके के साथ ligate ।
  5. Perfuse समाधान 3 के साथ अग्ंयाशय के लिए 1 ज 20 मिलीलीटर/decellularization सेट-अप का उपयोग कर ।
    नोट: समाधान 3 के साथ पंप की नलियों को भरने ऐसी है कि कोई बुलबुले अग्ंयाशय में प्रवेश । अंग के सभी पक्षों से किसी भी रिसाव के लिए देखो और टांके के साथ सभी खुले संवहनी शाखाओं ligate, पोर्टल नस को छोड़कर ।
  6. अग्ंयाशय पर-20 ° c समाधान 4 में decellularization के प्रारंभ तक फ़्रीज़ करें ।

5. सुअर का अग्ंयाशय का Decellularization

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर अग्ंयाशय गल ।
  2. decellularization सेट में सिकुड़नेवाला पंप भागो 20 मिलीलीटर/मिनट में समाधान 3 के साथ जब तक कोई हवा बुलबुले डिटर्जेंट प्रवेश ट्यूब में देखा जाता है ।
  3. decellularization कंटेनर में अग्ंयाशय प्लेस और अग्ंयाशय के महाधमनी के लिए डिटर्जेंट प्रवेश ट्यूब कनेक्ट । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात के 20 मिलीलीटर/मिनट में समाधान 3 के साथ छिड़काव द्वारा अंग धो लो ।
  4. बाहर समाधान डालो अंग कक्ष में छोड़ दिया ।
  5. समाधान 3 को समाधान 5 से बदलें और 4 ° c पर 20 मिलीलीटर/मिनट में 30 मिनट के लिए अग्ंयाशय perfuse । बाहर अंग चैंबर में समाधान डालो ।
  6. समाधान 6 जोड़ें और 4 ° c पर 20 एमएल/मिनट में 8 घंटे के लिए अग्ंयाशय perfuse । बाहर अंग चैंबर में समाधान डालो ।
  7. 4 ° c पर 20 एमएल/मिनट में ९६ ज के लिए समाधान 5 के साथ छिड़काव द्वारा अंग धो लो । बाहर अंग चैंबर में समाधान डालो ।
  8. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए CaCl2 और MgCl2 युक्त Dulbecco के पंजाबियों के ५०० मिलीलीटर recirculat उपचार के लिए अग्ंयाशय तैयार करते हैं । बाहर अंग चैंबर में समाधान डालो ।
  9. 7 समाधान के २५० मिलीलीटर जोड़ें और perfuse के लिए अग्ंयाशय 4 ज पर 20 एमएल/ बाहर अंग चैंबर में समाधान डालो ।
  10. 4 ° c पर 20 एमएल/मिनट में १२० ज के लिए समाधान 5 के साथ छिड़काव द्वारा अंग धो लो ।
  11. छोटी अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर या लंबी अवधि के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान 8 में अंग स्टोर ।

6. Decellularization का सत्यापन

  1. कैंची का प्रयोग, 3-से 10 मिमी बायोप्सी अग्ंयाशय के सभी पालियों से काट और उंहें formaldehyde में कमरे के तापमान पर ४८ घंटे के लिए ठीक ।
  2. 15 मिनट के लिए ultrapure पानी में टुकड़े धो, उंहें मानक प्रोटोकॉल के बाद एक ऊतक प्रोसेसर में प्रक्रिया है, और उंहें तेल में एंबेड ।
  3. कट 5-µm वर्गों microtome का उपयोग कर और उंहें मेयेर hematoxylin और ०.२% शराबी eosin (वह) मानक प्रोटोकॉल निंनलिखित द्वारा दाग ।
  4. नाभिक के नुकसान के लिए जांच करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड देखें ।
    नोट: एक ताजा एक ही रास्ते में संसाधित ऊतक से एक टुकड़ा नाभिक की उपस्थिति के लिए जांच करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Representative Results

प्रतिनिधि सुअर का अग्न्याशय विच्छेदन चित्रों, जो पता लगाने और अवर mesenteric धमनी और नस पेड़ विदारक में मदद कर सकते हैं, पोर्टल नस, यकृत धमनी, पित्त नलिका, और सीटी और SMA के लिए बंटी महाधमनी, चित्रा 2aमें दिखाया गया है, 2 बी, और 2c (पीले तीर) क्रमशः । 3 ए एक सामांय अग्ंयाशय, जो प्रकाश गुलाबी प्रकट होता है और प्लीहा, कनेक्शन, और ग्रहणी पालियों में शामिल की सकल आकृति विज्ञान दिखाता है । decellularization के बाद, गुलाबी रंग खो दिया है और सेलुलर अग्ंयाशय रंग में पीला सफेद लग रहा है । प्लीहा, कनेक्शन दिखा सकल आकृति विज्ञान चित्र, और एक विरूपण अग्ंयाशय के ग्रहणी पालियों चित्र बीमें दिखाया गया है । चित्रा 3 सी एक सामांय अग्ंयाशय में कई नीले नाभिक की उपस्थिति के साथ दाग से पता चलता है । एक विसेलुलर अग्ंयाशय में, वह धुंधला नाभिक का नुकसान दिखाया, के रूप में कोई नीला नाभिक (चित्रा 3 डी) देखा जाता है ।

Figure 2
चित्रा 2: एक सुअर का अग्ंयाशय विच्छेदन के चित्र । (क) अवर mesenteric धमनी और शिरा वृक्ष का स्थान (पीला तीर). (ख) पोर्टल नस के बंधाव, यकृत धमनी और पित्त नली (पीला तीर) । (ग) coeliac ट्रंक और बेहतर mesenteric धमनी (पीला तीर) को शाखाओं में महाधमनी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सकल आकृति विज्ञान और वह सामांय और सेलुलर अग्ंयाशय के दाग । (क) एक सामांय अग्ंयाशय की सकल आकृति विज्ञान । (ख) एक सेलुलर अग्ंयाशय की सकल आकृति विज्ञान । (ग) वह दाग एक सामांय अग्ंयाशय में नीले नाभिक की उपस्थिति से पता चलता है । (घ) वह दाग एक सेलुलर अग्ंयाशय में नीले नाभिक के अभाव से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

प्रस्तावित प्रोटोकॉल, एसडीसी और ट्राइटन X-१०० के 4 डिग्री सेल्सियस पर छिड़काव का उपयोग कर, पूरे सुअर का अग्ंयाशय सफलतापूर्वक decellularize जाएगा । इस तकनीक में चुनौती पैरेन्काइमा और इसकी आपूर्ति वाहिकाओं को नुकसान पहुंचाए बिना सभी तीन पालियों से युक्त बरकरार अग्न्याशय के विच्छेदन है, साथ ही नमूना के अन्य संवहनी शाखाओं के बंधाव के क्रम में अंग perfuse करने के लिए बिना रिसाव के । सुअर का अग्ंयाशय मानव अग्ंयाशय की तुलना में एक अलग शरीर रचना विज्ञान है । यह तीन पालियों के होते है और आंशिक रूप से यह आसपास के द्वारा छोटी आंत के साथ निकट संपर्क में रहता है । हम अग्ंयाशय के साथ ग्रहणी विदारक, कई छोटे रक्त वाहिकाओं के रूप में अग्ंयाशय से आंत कनेक्ट । अनुकूलन अध्ययन के दौरान, इन रक्त वाहिकाओं के कुंद काटने रिसाव और समाधान का एक अधूरा छिड़काव दिखाया गया है ।

महाधमनी coeliac और बेहतर mesenteric धमनियों के माध्यम से अग्न्याशय को जोड़ता है के बाद से, हम केवल एक छिड़काव का उपयोग करके सरल प्रवेशनी रखने के लिए एक प्रवेश के रूप में महाधमनी चुना है और, इसलिए, एक प्रवेश. हमारे अनुभव में, सीटी के ऊपर महाधमनी के बंधाव और SMA के नीचे विच्छेदन के समय में कमी होगी और दो जहाजों के किसी भी नुकसान का खतरा कम कर देता है । एक heparinized सुअर के अलावा, हम यह भी ध्यान दिया है कि महाधमनी के तुरंत बाद विच्छेदन के माध्यम से ठंड हेपरिन की एक छिड़काव अंग भर में समाधान के छिड़काव को प्राप्त करने में मदद करता है । हम अटकलें अगर यह रक्त वाहिकाओं में रक्त के थक्के के गठन को रोकने के द्वारा होता है । विच्छेदन के बाद ultrapure पानी के साथ एक अग्ंयाशय के प्रारंभिक छिड़काव लाल रक्त कोशिकाओं को लाइसे और अंग में रक्त के अवशेष को दूर करेगा, जिससे रक्त के थक्के के गठन को रोकने । इस अवधि में भी नसों और धमनियों की किसी भी unligated छोटी शाखाओं को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में रक्त प्रवाह आसानी से पृष्ठभूमि के ऊपर देखा जा सकता है ।

हम ठंड तापमान (4 डिग्री सेल्सियस) पर पूरे decellularization प्रक्रिया रखने का फैसला, के रूप में यह exocrine एंजाइमों की कार्रवाई में बाधा होगी कि अग्ंयाशय के exocrine कोशिकाओं से जारी है । exocrine एंजाइमों, जब बाधा नहीं है, कोशिकाओं और ECM पर एक बचके प्रभाव पैदा कर सकता है, के रूप में वे कोशिका झिल्ली और प्रोटीन12पचा सकता है । के रूप में ठंड और गल प्रभावी ढंग से कोशिकाओं को फट सकता है, हम एक फ्रीज/गल कदम, शुरू में भी डिटर्जेंट4,13के छिड़काव से पहले शामिल थे । शुरुआती धुल के बाद गल जाने से कोशिका के फटने के अवशेष निकल जाएंगे. हम इस्तेमाल किया डिटर्जेंट उपचार असामांय रूप से उच्च सांद्रता पर और एक उच्च छिड़काव गति पर एसडीसी और ट्राइटन एक्स-१०० का मिश्रण है । ECM को नुकसान पहुंचाने वाली exocrine कोशिकाओं को हटाकर तेजी से decellularization हासिल करने के लिए हमने यह तरीका चुना । हम सोचते है कि एक कठिन और तेजी से प्रोटोकॉल अग्ंयाशय decellularization के लिए फायदेमंद है, के रूप में कम समय अग्नाशय एंजाइमों के लिए उपलब्ध हो जाएगा ECM के साथ बातचीत, इस प्रकार अच्छा ECM घटकों के संरक्षण । ECM घटकों को बनाए रखने के लिए, हम भी serine चिढ़ा अवरोध करनेवाला (PMSF) डिटर्जेंट समाधान के लिए कहा, के रूप में है कि exocrine कोशिकाओं14से जारी एंजाइमों के सक्रियकरण को बाधित करेगा । सोडियम azide सभी decellularization समाधान के लिए जोड़ा गया है, के रूप में यह एक बैक्टीरियोस्टेटिक एजेंट के रूप में कार्य करता है, जिससे जीवाणु संदूषण15की संभावना बाधा ।

इस प्रोटोकॉल निंनलिखित अग्ंयाशय ECM संरचनाओं और ECM प्रोटीन कोलेजन और elastin का संरक्षण दिखाया । हालांकि, glycosaminoglycans का एक महत्वपूर्ण नुकसान में देखा गया था विसेलुलर अग्ंयाशय । इस फैशन में इस अग्न्याशय में भी मानव भ्रूण अग्नाशय स्टेम कोशिकाओं के लगाव के लिए वादा दिखाया और 14 दिनों12के लिए recellular टुकड़ों में exocrine और अंत-स्रावी मार्करों की अभिव्यक्ति. हालांकि, एक बरकरार और कार्यात्मक अग्ंयाशय उत्पंन करने के लिए, और अनुसंधान सही सेल सूत्रों का मूल्यांकन करने में आवश्यक है, सेल प्रकार, सेल सीडिंग रणनीतियों, और प्रतिक्रियात्मक संस्कृति ।

Disclosures

S.S.H. Verigraft, एक कंपनी है कि रक्त वाहिका ऊतक इंजीनियरिंग की तकनीक लाइसेंस प्राप्त में शेयर रखती है । दूसरे लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन स्वीडिश सरकार LUA ALF से S.S.H. को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4mm DLP arteriotomy cannula Medtronic 31104
2ml Unlabelled pipette vWR 612-3720
Degasser Biotech AB 0001-6484
DNase-I Worthington LS0020007
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 Sigma Aldrich D8662
EDTA disodium salt dihydrate AlfaAesar A15161.OB
Heparin Leo 387107
Luer Male with 1/8" ID Barb Oina LM-2PP-QC For 3X5mm silicon tube
Peristaltic pump Oina SP-1X4
PMSF Roche 10837091001 Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion.
Potassium chloride Sigma Aldrich P5405
Potassium hydrogen phosphate Sigma Aldrich P9791
SDC Sigma Aldrich 30970
Silicon tube 3X5mm VWR 2280706
Sodium Azide Sigma Aldrich 71290
Sodium chloride Sigma Aldrich 13423
Sodium hydrogen phosphate Merck 71640-M
Suture Vömel 14817
Syrringe 50mL Becton Dickinson 300137
Triton-X-100 AlfaAesar A16046.OF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Federation, I. D. IDF Diabetes Atlas. , Available from: http://www.diabetesatlas.org (2016).
  2. Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. Journal of Diabetes and its Complications. 29 (5), 737-743 (2015).
  3. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
  4. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  5. Hynes, R. O. The evolution of metazoan extracellular matrix. Journal of Cell Biology. 196 (6), 671-679 (2012).
  6. Scarritt, M. E., Pashos, N. C., Bunnell, B. A. A review of cellularization strategies for tissue engineering of whole organs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnol. 3, 43 (2015).
  7. Goh, S. K., et al. Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering. Biomaterials. 34 (28), 6760-6772 (2013).
  8. Wu, D., et al. 3D Culture of MIN-6 Cells on Decellularized Pancreatic Scaffold. In Vitro and In Vivo Study. Biomed Research International. 2015, 432645 (2015).
  9. Peloso, A., et al. The Human Pancreas as a Source of Protolerogenic Extracellular Matrix Scaffold for a New-generation Bioartificial Endocrine Pancreas. Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).
  10. Mirmalek-Sani, S. H., et al. Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering. Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).
  11. Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation. Cell Transplantation. 19 (5), 613-628 (2010).
  12. Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).
  13. Gilpin, A., Yang, Y. Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications. Biomed Research International. 2017, 9831534 (2017).
  14. James, G. T. Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers. Analytical Biochemistry. 86 (2), 574-579 (1978).
  15. Lichstein, H. C., Soule, M. H. Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: I. The Action of Sodium Azide on Microbic Growth. Journal of Bacteriology. 47 (3), 221-230 (1944).

Tags

इंजीनियरिंग १४० अंक अग्ंयाशय सुअर का अग्न्याशय विच्छेदन ऊतक इंजीनियरिंग decellularization अपक्षयी चिकित्सा extracellular मैट्रिक्स
अलगाव और एक पूरे सुअर का अग्ंयाशय के Decellularization
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuna, V. K., Kvarnström, N.,… More

Kuna, V. K., Kvarnström, N., Elebring, E., Holgersson, S. S. Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas. J. Vis. Exp. (140), e58302, doi:10.3791/58302 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter