Summary
全体膵臓の組織工学は、外分泌と内分泌機能のための挑戦です。そのままブタ膵臓と界面活性剤 Triton X-100 の灌流成功 decellularization のプロセス、デオキシ コール酸ナトリウム、デオキシリボヌクレアーゼの解剖のための手法を示す.
Abstract
全体膵臓のティッシュ エンジニア リングは、現在の糖尿病の治療法を向上できます。究極の目標は、組織エンジニア リング膵臓、ヒトの細胞と同種または異種ソースから効率的な郭清、decellularization、ブタの膵臓の recellularization に方法の例は、フィールドにメリットがあります。ブタ膵臓人間の膵臓に似ている 3 つの裂片のある解剖学的契約している (脾臓、十二指腸、および接続) 十二指腸や小腸で丸められます。膵十二指腸葉いくつかの小さな血管十二指腸に接続します。性質は、外分泌と内分泌膵臓の組織工学、複雑です。本稿では全くブタの膵臓を細かく分析し、その構造といくつかの細胞外マトリックス成分の保存中の洗剤とそれを decellularize 詳細なプロトコルを紹介します。完全な灌流を達成するために、大動脈は、入口と出口として門脈として選択されます。その他の血管 (肝動脈、脾静脈、脾動脈、上腸間膜動脈と静脈のツリー) と胆管を結紮します。豚のヘパリン血栓の形成を防ぐためには、そして、冷たいヘパリンと郭清後すぐに臓器がフラッシュされます。膵外分泌酵素の作用を抑制するには、膵臓の decellularization が 4 ° C で設定します。Decellularization は、トリトン X-100、デオキシ コール酸ナトリウム、デオキシリボヌクレアーゼ、断続的に最終的な広範な洗浄・灌流によって実行されます。成功した decellularization と膵臓が白、表示され、ヘマトキシリンとエオシンと組織学的評価は、保存された細胞外マトリックスの構造の核の不在を示しています。したがって、正常に decellularize 全体ブタ膵臓を解剖し, 提案手法を使用できます。
Introduction
糖尿病は、血液中のブドウ糖のレベルを増加の存在によって特徴付けられます。それはほとんどの国1の主要な公衆衛生課題として認識されます。血糖値の高レベル血管、目、心臓、腎臓、および虚血肢への損傷を引き起こし、神経系に影響を与えます。治療の従来の方法には、ライフ スタイルの変化、薬、外因性インスリンの注射が含まれます。いくつかのケースで、病気の治療法はともかく、利用可能な治療は、高血糖の結果、治療レベルでインスリンを維持するために失敗します。小島や膵臓全体の移植は、病気を回避できますそれは一般的行われないリスクと免疫抑制とカプセル化の2から困難さのため、適切なドナー臓器の不足のため。
組織工学および再生医学の分野で現在の改善は、これらの問題に対するソリューションを提供するための能力を有しています。Decellularization を用いた、人間または動物のドナー由来の細胞は、成長因子、細胞外マトリックス (ECM) 蛋白質に落とせるし、シグナル分子は足場で保持されます。受信者の非免疫原性幹細胞3,4recellularization 後器官の機能を復元するのには、免疫抑制療法を必要とせず、このような足場を移植可能性のあることができます。同種または異種ソースから組織設計の臓器は、主要な細胞外マトリックス蛋白質種の間で維持され、移植5後拒否されない場合があります、臨床移植で使用できます。
Decellularization は、物理的な力、化学洗剤、ティッシュまたは器官から細胞や核物質を削除する生理学的な設定での酵素の最適な使用を含む検索が上手くいった方法です。Recellularization は、無細胞性臓器に細胞を播種の手順です。それは、温度、圧力、およびガス6のような生理学的許容条件で臓器の培養細胞、細胞播種、最適の戦略、およびバイオリアクター システムの多数を必要とする、知的厳しい手順です。
膵臓はその外分泌と内分泌の容量のため組織工学のための挑戦的な組織を見なすことができます。一方、内分泌の部分は、インスリンなどのホルモンを分泌する外分泌組織はいくつかの消化酵素を分泌します。酵素 (トリプシン、デオキシリボヌクレアーゼ [DNase]) を使用して既に報告されてマウス7、8、人間9、および豚10からそのまま膵臓の decellularization (トリトン X-100) 非イオン性とイオン性洗剤 (デオキシ コール酸ナトリウム [SDC] と [SDS] ドデシル硫酸ナトリウム)。ただし、発行済みのプロトコルを次は正常解剖と完全な血流と ECM 構造を維持しながら decellularization を苦しんだ。我々 は、decellularization の中に応用の洗剤が細胞の換散を引き起こすそれにより器官に消化酵素を放出と推測。リリースされた酵素は ECM 足場に不可逆的な損傷を引き起こす、decellularization と recellularization の非効率的なこと。効果的に膵臓を消化酵素の作用を抑制する、decellularizes メソッドのデザインは、問題を解決可能性があります。我々 は彼らがなぜ低温が使用される9の報告されていないが何倍ら、冷たい温度で膵臓の decellularization の戦略を選んだ。同時に腹腔トランク (CT) と上腸間膜動脈 (SMA)11上の灌流の入口として大動脈の選択によってテイラーらから変更と郭清の戦略を考案しました。
最近発行された記事12、効果的な分離といくつかの ECM 成分を維持しながらブタ膵臓の decellularization のメソッドを紹介します。本稿では、脾臓、十二指腸を含む全体ブタ膵臓を解剖する方法および接続耳たぶの詳細な説明を見るし、成功した decellularization のための段階的なプロトコルを提示します。
Protocol
ブタ膵臓とここで紹介する decellularization プロシージャの郭清ヨーテボリ大学の倫理的なガイドラインに従ってください。
1. Decellularization セットアップの準備
- 3 × 5 mm のシリコン チューブを使用して、peristalic ポンプ洗剤入口コンテナー シリーズの接続商工会議所、器官で膵臓にを介して脱ガス装置 (図 1参照)。男性のルアーをオルガン室管内の自由端に接続します。
- 洗剤アウトレット コンテナーを介して灌流の洗剤を収集する蠕動性ポンプ別 3 × 5 mm のシリコン チューブを使用して、接続機関室。
- 2 ml ラベル ピペットを管洗剤入口コンテナーと洗剤コンセント cointainer の空いている端点に接続します。
- 4 ° C で全体の設定を維持します。
図 1: 潅流セッティングの準備です。蠕動性ポンプ、脱ガス装置、機関室洗剤入口コンテナーをシリーズに接続する設定に示すように 3 × 5 mm のシリコン チューブを使用して。黒い矢印は、機関室に洗剤入口コンテナーからフローの方向を示します。洗剤のアウトレットの別の 3 × 5 mm のシリコン チューブを使用し、臓器商工会議所経由で蠕動性ポンプに接続洗剤アウトレット コンテナー。赤い矢印は、洗剤アウトレット コンテナーに機関室からの流れの方向を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
2. Decellularization 溶液の調製
- 解決策 1 (リン酸緩衝生理食塩水 [PBS]): 純水 1 L に塩化ナトリウム (137 の mM) の 8 g、塩化カリウム (2.7 mM) の 0.2 g、リン酸ナトリウム (10 mM) の 1.44 g と 0.24 g リン酸カリウム (1.8 mM) を追加し、溶けるまでかき混ぜます。塩酸 (HCl) 7.4 に pH を調整します。合計では、このソリューションの 3.2 L は必要です。
- 解決策 2 (PBS + ヘパリン): 1 L ソリューション 1 にヘパリン (17 [IU] の国際単位/mL) の 3.4 mL を追加。このソリューションの新鮮なを準備し、寒くなるまで氷の上にそれを維持します。合計では、このソリューションの 1.2 L が必要です。
- 解決策 3 (純水 + アジ化ナトリウム ナトリウム エチレンジアミン四酢酸 [EDTA]): 1 L の純水には 1.86 g (5 mM) EDTA とアジ化ナトリウム (0.02%) 200 mg を追加。塩が溶けるまでかき混ぜます。使用前に 4 ° C への解決策を冷やして下さい。合計では、このソリューションの 22 L は必要です。
- ソリューション (PBS + アジ化ナトリウム EDTA) 4: 1 L ソリューション 1 に追加のアジ化ナトリウム (0.02%) および (5 mM) EDTA の 1.86 g 200 mg。塩が溶けるまでかき混ぜます。使用前に 4 ° C への解決策を冷やして下さい。合計では、このソリューションの 1 L が必要です。
- 解決策 (純水 + アジ化ナトリウム) 5: 1 L の純水に追加 (0.02%) アジ化ナトリウム 200 mg。塩が溶けるまでかき混ぜます。使用前に 4 ° C への解決策を冷やして下さい。合計では、このソリューションの 260 L が必要です。
注: EDTA, SDC を沈殿物を形作るし、すぐ洗濯 SDC 治療前後のそれに使用されるので、ソリューション 5 から除かれました。 - 解決策 (SDC + トリトン X-100) 6: 純水の 940 Ml (4%) の 40 g を追加します。SDC (6%) 60 mLトリトン X-100, (0.02%) アジの 200 mg, (0.4 mM) 特異フッ化物 (PMSF) 69.6 mg。溶解するまで攪拌します。使用前に 4 ° C への解決策を冷やして下さい。PMSF を使用する前に追加します。合計では、このソリューションの 9.6 L が必要です。
- 解決策 7 (DNase): DNase の 10,000 Kunitz の追加ユニット-CaCl2と MgCl2を含む (40 Kunitz ユニット/mL) ダルベッコ PBS の 250 mL の私。新鮮な準備し、すぐに使用します。使用する前に 37 ° C に解決を暖めます。
- 解決策 8 (PBS + ナトリウム アジ化): 1 L ソリューション 1 に追加 (0.02%) アジ化ナトリウム 200 mg。塩が溶けるまでかき混ぜます。使用前に 4 ° C への解決策を冷やして下さい。合計では、このソリューションの 1 L が必要です。
3 ブタの膵臓の解剖
注: この研究では、ブタの膵臓切除したから安楽死、ヘパリン (400 IU/kg) 雌豚農場から 45 kg.
- 仰臥位で解剖テーブルに豚を配置します。
- 正中切開 xiphoidal プロセスから恥骨の骨 (約 40 cm) にメス、腹部臓器のすべてを公開することを確認します。
- 脾を探します、十二指腸、および接続耳たぶ。
- 大十二指腸乳頭のレベルを見つけ、2 つの独立した縫合糸を使用してそのサイトから口頭で十二指腸を結紮します。
- 2 つの独立した縫合糸で下の食道を縛るし、胃を取り出してハサミで合字の間をカットします。
- 大腸小腸に到達するから結合組織を分離します。
- 膵脾葉にアタッチするコロンの結合組織を分離します。
- 小腸から動脈を縛ることの後、コロンを削除します。
- 下腸間膜静脈や下腸間膜動脈の木を見つけるし、膵臓の尾側の表示場所 1 つの縫合糸で縛る。
- 脾動脈を結紮し、一緒に 1 つの縫合糸、門で、脾臓に近い静脈遠位脾を削除するハサミでカットします。
- 従い、十二指腸十二指腸と接続の葉が消去され、2 つの独立した縫合糸端で十二指腸を縛る。
- 門脈の解剖、肝臓からの血液流出を防ぐ、合字に近位にカットする 1 つの縫合糸で縛る。門脈は、decellularization 中にコンセントとして機能します。
- 解剖し、胆管および 2 つの縫合糸で肝動脈を結紮します。縫合糸に遠位カットします。
- 腎静脈下大動脈を見つけるそして膵領域に達するまで、筋肉や結合組織から頭蓋の方向にそれを解剖します。
- 優しく膵臓を裏返すし、SMA と CT をそのまま維持する大動脈の解剖 CT よりも優れてとハサミで SMA に劣る大動脈をカットします。
- 残りのはさみで周囲の組織を切り取って膵臓を取り出します。
- 4 mm 切開カニューレに接続して 50 mL の注射器を使用して、それは全体の器官を perfuses まで、または全体の器官は寒くなるソリューション 2 大動脈を通じて器官のフラッシュします。
4. Decellularization のブタの膵臓の準備
- 4 ° c またはプロセス全体で氷の上は、膵臓を維持します。
- はさみを使って十二指腸の縫合糸をカット、純水 25 mL ピペットを使用しての 50-150 mL をフラッシュすることによって食糧のそれをきれいにし再び縫合糸とそれを縛る。
- 大動脈の一端と漏れを防ぐために縫合糸で SMA と CT のほかすべての枝を縛る。
- 大動脈のもう一方の端から 4 mm 切開のカニューレを挿入し、縫合糸で結紮します。
- Decellularization 設定を使用 20 mL/分で 1 時間のソリューション 3 膵灌流します。
注: は、気泡が入らない膵臓そのソリューション 3 ポンプのチューブを自動設定します。器官のすべての側面からの漏れを捜し、縫合糸で門脈内を除くすべての開いている血管枝を縛る。 - ソリューション 4-20 ° C で膵臓を凍結、decellularization の開始まで。
5 ブタの膵臓の decellularization
- 4 ° C で膵臓を解凍します。
- まで洗剤インレット チューブで気泡は見てない 20 mL/分でソリューション 3 decellularization 設定で蠕動ポンプを実行します。
- Decellularization コンテナーに膵臓を配置し、膵臓の大動脈に洗剤インレット チューブを接続します。4 ° C で 20 mL/分で一晩ソリューション 3 による血液灌流による臓器を洗う
- オルガンの部屋に残された解決策を注ぐ。
- ソリューション 5 ソリューション 3 に置き換えるし、20 mL/分 4 ° C で 30 分間膵臓を灌流機関室でソリューションを注ぐ。
- 解決策 6 を追加し、20 mL/分 4 ° C で 8 h の膵臓を灌流機関室でソリューションを注ぐ。
- 20 mL/分 4 ° C で 96 h のソリューション 5 による血液灌流による臓器を洗う機関室でソリューションを注ぐ。
- 膵臓 DNase 処理に備える CaCl2と 37 ° C で 30 分間 MgCl2を含むダルベッコ PBS の 500 mL を再循環によって機関室でソリューションを注ぐ。
- 解決策 7 の 250 mL を追加し、37 ° C で 20 mL/分 4 h の膵臓を灌流機関室でソリューションを注ぐ。
- 20 mL/分 4 ° C で 120 h のソリューション 5 による血液灌流による臓器を洗う
- 短い期間のための 4 ° c または-20 ° c 長時間ソリューション 8 に器官を格納します。
6. Decellularization の検証
- はさみを使用すると、膵臓のすべての葉から 3-10 mm 生検をカットし、室温で 48 時間ホルムアルデヒドでそれらを修正します。
- 15 分間超純水で部分を洗浄し、次の標準的なプロトコル、ティッシュ プロセッサで処理してパラフィンに埋め込みます。
- ミクロトームを使用して 5 μ m のセクションをカットし、マイヤーのヘマトキシリンと 0.2% アルコール エオシン (HE) 次の標準プロトコルによって、それらを染色します。
- 核の消失を確認する顕微鏡の下でスライドを表示します。
注: 同じ方法で処理された新鮮な組織から作品はコントロールとして核の有無の確認に使用できます。
Representative Results
図 2 aにツリー、門脈、肝動脈、胆管、大動脈 CT と SMA への分岐を静脈や下腸間膜動脈解離の検索とのに役立ちます、代表的なブタ膵臓解剖の写真が表示されます。2 b、および2 C (黄色の矢印)、それぞれ。ライトピンクし、脾、含まれています表示される図 3 a正常膵の形態を示しています接続、および十二指腸の葉。Decellularization 後、ピンク色が失われ、decellularized 膵臓の色で淡い白に見えます。脾を示す形態画像、接続、および decellularized 膵臓十二指腸の葉図 3 bに示します。図 3は、彼との汚損によって正常膵で多くの青い核の存在を示しています。Decellularized 膵臓、彼の核の損失青い核は見たない染色示した (図 3 D)。
図 2: ブタの膵臓の解剖の写真。(A) 下腸間膜動脈と静脈ツリー (黄色の矢印) の場所です。(B) 結紮術、門脈、肝動脈、胆管 (黄色の矢印)。(C) 大動脈腹腔トランクと上腸間膜動脈 (黄色の矢印) に分岐します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 総体の形態および彼通常と脱膵臓の染色します。(A) 通常の膵臓の形態。(B) decellularized 膵臓の形態。彼 (C) 染色正常膵で青い核の存在を示しています。彼 (D) 染色 decellularized 膵臓で青い核の欠如を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
4 ° c、SDC とトリトン X-100 の灌流を用いた提案方式は、全体ブタ膵臓を正常に decellularize されます。この手法では、課題は器官を灌流するために実質の供給の容器と試料の他の血管の枝の結紮を損なうことがなく、すべての 3 つの葉を含むそのまま膵臓の解剖ない漏れ。ブタの膵臓はひと膵臓と比較して異なる解剖学です。それは葉から成り、部分的囲ま小腸と密接な接触にとどまります。私たちは接続する腸と膵臓からいくつかの小血管、膵臓と十二指腸を解剖しました。最適化スタディの間にこれらの血管の鈍的切断は漏れとソリューションの不完全な灌流を示しています。
大動脈は、腹腔と優れた上腸間膜動脈を通って膵臓に接続するので、我々 は 1 つカニューレと、したがって、1 つの入口だけで灌流をできるだけ単純化する入口として大動脈を選んだ。経験から、大動脈 CT 上と下の SMA の結紮により郭清の時間を短縮、2 隻の船のいずれかの損傷のリスクを低減します。ヘパリン豚だけでなく我々 にも冷たいヘパリンを介して灌流剥離後すぐに大動脈は役立ちます臓器全体ソリューションの灌流を達成するために気づいた。これが血管の血栓の形成を防ぐことによって発生しますが推測された.郭清後純水と膵臓の初期の灌流は赤血球を溶解、器官で、血栓の形成を防ぐ血液の残骸を削除します。この期間は、血流を背景の上に簡単に気づくことができるよう、静脈と動脈の任意の unligated の小さな枝を見つけるため使用もできます。
これは膵臓の外分泌細胞から膵外分泌酵素の作用を妨げること、低温 (4 ° C) で全体の decellularization プロシージャを保つために選びました。膵外分泌酵素、抑制されないときは、彼らは、細胞膜やタンパク質12を消化すること、細胞と、ECM に悪影響を引き起こす可能性が。凍結・融解細胞をバーストすることができます効果的に、我々 含まれてフリーズ/フリーズ解除手順最初洗剤4,13の灌流前であってもに、。解凍後初期洗浄セルのバーストの残りが削除されます。我々 が使用される洗剤の治療は、SDC とトリトン X-100 高灌流の速度、異常に高い濃度でのミックスです。ECM を損傷外分泌腺の細胞を除去することによって高速な decellularization を達成するためにこの手法を選びました。我々 はより少ない時間が良い ECM 成分保持、ECM と対話する膵酵素の利用できるハードと高速のプロトコルが膵臓の decellularization のために有益されて推測します。ECM の部品を維持するためにもに追加しましたセリン プロテアーゼ阻害剤 (PMSF) 洗剤ソリューションには外分泌細胞14からリリースされた酵素の活性化を阻害すると。アジ化ナトリウムは、それ細菌汚染15のチャンスを阻害する静菌剤として機能するので、すべての decellularization ソリューションに追加されます。
膵臓は脱 ECM 構造と ECM タンパク質コラーゲンとエラスチンの保全を示したこのプロトコルに続きます。ただし、decellularized の膵臓におけるグリコサミノグリカンの大幅な損失がつきました。膵臓はまた 14 日12recellularized 個のひと胎児膵幹細胞の添付ファイルと外分泌と内分泌マーカーの発現のための約束を示したこのファッションで脱。ただし、そのままで機能的な膵臓を生成する正しい細胞源、細胞の種類、細胞播種戦略とバイオリアクター文化の評価にさらなる研究が必要です。
Disclosures
S.S.H. は、Verigraft、血管組織工学の技術のライセンスを取得している会社の株式を保持します。他の作家が何を開示するあります。
Acknowledgments
本研究は S.S.H. にアルフ LUA スウェーデン政府からの助成金によって融資されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4mm DLP arteriotomy cannula | Medtronic | 31104 | |
| 2ml Unlabelled pipette | vWR | 612-3720 | |
| Degasser | Biotech AB | 0001-6484 | |
| DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
| Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
| Heparin | Leo | 387107 | |
| Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Peristaltic pump | Oina | SP-1X4 | |
| PMSF | Roche | 10837091001 | Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion. |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
| SDC | Sigma Aldrich | 30970 | |
| Silicon tube 3X5mm | VWR | 2280706 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
| Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
| Suture | Vömel | 14817 | |
| Syrringe 50mL | Becton Dickinson | 300137 | |
| Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF |
References
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