Summary
조직 공학 전체 췌 장의 외 분 비 및 내 분 비 기능 때문에 도전 이다. 우리는 그대로 돼지 췌 세제 Triton X-100의 관류에 의해 성공적인 decellularization의 프로세스, 나트륨 deoxycholate, 및 deoxyribonuclease의 해 부에 대 한 방법을 보여줍니다.
Abstract
전체 췌 장의 조직 공학 당뇨병 mellitus에 대 한 현재의 치료를 개선할 수 있습니다. 궁극적인 목표는 인간 세포와 수용자 또는 xenogeneic 소스에서 조직 엔지니어 췌 하는. 효율적인 해 부, decellularization, 및 recellularization 돼지 췌의 방법의 데모는 분야를 유익할 수 있습니다. 인간의 췌 유사 돼지 췌는 3 개의 돌출부와 특별 한 해부학 적 합의 (비장, 십이지 장, 및 연결) 십이지 장 및 소장에 의해 반올림. 췌 십이지 장 엽 여러 작은 혈관에 의해 십이지 장 연결합니다. 조직 공학 췌 장의 외 분 비 및 내 분 비의 특성으로 인해 복잡 하다. 이 문서에서 우리는 전체 돼지 췌 장 해 부 구조와 일부 세포 외 매트릭스 구성 요소를 저장 하는 동안 그것을 세제와 함께 decellularize를 자세한 프로토콜을 보여줍니다. 완전 한 관류를 위해 대동맥 입구와 콘센트로 문맥으로 선택 됩니다. 다른 혈관 (간 동맥, 비장 정 맥, 비장 동맥, mesenteric 동맥 및 정 맥)과 담 즙 덕트 출혈 됩니다. 돼지 heparinized는 혈전의 형성을 방지 하 고, 해 부, 후 즉시 기관 찬 헤 파 린으로 플러시됩니다. 외 분 비 효소의 활동을 억제 하기 위해 췌 장 decellularization는 4 ° c.에 설정 되어 decellularization Triton X-100, 나트륨 deoxycholate, 및 deoxyribonuclease, 간헐적이 고 최종 광범위 한 세척의 관류에 의해 수행 됩니다. 성공적인 decellularization와 췌 흰색, 나타나고 hematoxylin와 오신 조직학 평가 보존 된 세포 외 매트릭스 구조와 핵의 부재를 보여준다. 따라서, 제안된 방법 성공적으로 해 부 전체 돼지 췌 장 decellularize을 사용할 수 있습니다.
Introduction
당뇨병은 혈액에 포도 당의 수준 향상된의 존재에 의해 특징입니다. 대부분 국가1에 있는 중요 한 공중 위생 도전으로 인식 된다. 높은 혈액 포도 당 수준의 혈관 및 신 경계, 눈, 심장, 신장, 및 말단 허 혈 손상에 영향을 줍니다. 치료의 전통적인 방법 exogenous 인슐린, 마약, 그리고 생활 습관의 변화를의 주사를 포함합니다. 어떤 경우에는 질병에 대 한 치료법을 치우고, 가능한 치료 치료 수준으로 혈당 결과 인슐린을 유지 하기 위해 실패 합니다. 비록 독도 또는 전체 췌 장 이식 질병을 제거, 그것은 수행 되지 않습니다 일반적으로 적합 한 공여 장기의 부족으로 인해 고 위험 및 면역 억제 및 캡슐화2에서 포함 된 어려움 때문에.
조직 공학 및 재생 의학의 분야에서 현재 개선 이러한 문제에 대 한 솔루션을 제공 하기 위한 능력을가지고 있다. Decellularization의 기술, 인간 또는 동물 기증자 로부터 세포 물자는 중요 한 세포 외 기질 (ECM) 단백질, 성장 요인, 동안 제거 될 수 있다와 신호 분자는 비 계에 유지 됩니다. 이러한 건설 기계 면역 억제, 받는 사람의 비 면역성 줄기 세포3,4recellularization 후 장기의 기능을 복원 하려면 필요 없이 잠재적으로 이식 수 있습니다. 주요 세포 외 기질 단백질 종 가운데 보존 하 고 이식5후 거부 되지 수 수용자 또는 xenogeneic 소스에서 조직 공학 장기 임상 이식에 사용할 수 있습니다.
Decellularization 물리적 힘, 화학 세제 및 조직이 나 장기에서 세포와 핵 물질을 제거 하는 생리 적인 설정에 효소의 최적 사용을 포함 하는 잘 탐험 방법입니다. Recellularization 셀 acellular 기관에 다시 뿌리기의 절차입니다. 그것은 온도, 압력, 가스6같은 순수 허용 가능한 조건에서 오르간의 문화에 대 한 셀, 최적의 셀 시드 전략 및 생물 시스템의 많은 수를 요구 한 지적 힘든 절차.
췌 장 외 분 비 및 내 분 비 용량 때문에 조직 공학에 대 한 도전적인 조직을 여겨질 수 있다. 외 분 비 조직 내 분 비 부분 인슐린 등 호르몬을 분 비 하는 동안 여러 가지 소화 효소를 은닉 한다. 마우스7,8, 인간의9, 돼지10 에서 그대로 췌의 decellularization은 이미 알려졌다 효소 (트립 신, deoxyribonuclease [DNase])를 사용 하 여 비 이온 (Triton X-100)와 이온 세제 ( 나트륨 deoxycholate [SDC] 고 나트륨 라우릴 황산 [SDS]). 그러나, 게시 된 프로토콜에 따라 우리는 성공적인 절 개 및 완전 한 관류와 ECM 구조를 유지 하면서 decellularization 싸 워. 우리는 decellularization 동안 적용된 세제 세포 세포의 용 해 발생 기관으로 소화 효소를 방출 함으로써 추측. 출시 된 효소 ECM 발판에 돌이킬 수 없는 손상을 하 고 decellularization 및 recellularization에 대 한 비효율적인 확인. 효과적으로 췌 장 소화 효소의 작용을 억제 하는 동안 decellularizes 방법의 디자인 문제를 해결할 수 있습니다. 비록 그들은 왜 찬 온도 사용된9에 보고 하지 않았다 Peloso 그 외 여러분, 추운 온도에서 췌의 decellularization의 전략을 선택 했습니다. 같은 시간에 우리는 coeliac 트렁크 (CT) 및 우수한 mesenteric 동맥 (SMA)11관류 유입으로 대동맥을 선택 하 여 테일러 외 에서 수정 해 부 전략을 설계 되었습니다.
최근에 출판 된 기사12, 효과적인 격리와 일부 ECM 구성 요소를 유지 하면서 돼지 췌의 decellularization 하는 방법을 보여 줍니다. 이 문서에 우리는 비장, 십이지 장를 포함 하는 전체 돼지 췌 장 해 부 하는 방법과 연결 돌출부에 대 한 자세한 설명을 표시 하 고 성공적인 decellularization에 대 한 단계적 프로토콜을 제시.
Protocol
돼지 췌 장 및 여기에 제시 된 decellularization 절차의 해 부 고 덴 부르 크 대학교의 윤리 지침을 따르십시오.
1입니다. Decellularization 설정의 준비
- Peristalic 펌프 세제 입구 컨테이너 시리즈에 연결 하 고 다음 기관에 췌를 통해 는 degasser 챔버 3 x 5 m m 실리콘 튜브를 사용 하 여 ( 그림 1참조). 기관 실에서 튜브의 무료 끝에 남성 루어를 연결 합니다.
- 다른 3 x 5 m m 실리콘 튜브를 사용 하 여 연결할 기관 챔버는 세제 콘센트 컨테이너를 통해 perfused 세제를 수집 하는 연동 펌프.
- 2 ml 레이블이 없는 피 펫 세제 입구 컨테이너와 세제 콘센트 cointainer에서 튜브의 무료 끝에 연결 합니다.
- 4 ° c.에서 전체 설정 유지
그림 1: 관류 설정 준비. 설정에 표시 된 대로 3 x 5 m m 실리콘 튜브를 사용 하 여, 시리즈에서 세제 유입 컨테이너에 연결 연동 펌프는 degasser, 기관 실. 검은 화살표 기관 실로 세제 입구 컨테이너에서 흐름 방향을 표시합니다. 세제 콘센트에 대 한 또 다른 3 x 5 m m 실리콘 튜브를 사용 하 고 세제 콘센트 컨테이너에는 기관 실 통해 연동 펌프 연결. 빨간색 화살표 세제 콘센트 컨테이너에 기관 실에서 흐름 방향을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
2입니다. Decellularization 솔루션의 준비
- 해결 방법 1 (인산 염 버퍼 염 [PBS]): 염화 나트륨 (137 밀리미터)의 8 g, 0.2 g 염화 칼륨 (2.7 m m)의 (10mm) 나트륨 인산 염, 1.44 g 및 0.24 g (1.8 m m) 칼륨 인산 염의 초순 물 1 L에 추가 하 고 해산 때까지 휘저어. 7.4 염 산 (HCl)에 pH를 조정 합니다. 전체 있음,이 솔루션의 3.2 L가 필요 합니다.
- 해결 방법 2 (PBS + 헤 파 린): 1 L의 솔루션 1, 헤 파 린 (17 국제 단위 [IU] /mL) 3.4 mL을 추가. 이 솔루션 신선한 준비 하 고 감기 될 때까지 얼음에 그것을 유지. 전체 있음,이 솔루션의 1.2 L가 필요 합니다.
- 해결 방법 3 (초순 나트륨 아 지 드 + disodium ethylenediaminetetraacetic 산 [EDTA]): 1 L의 초순, 1.86 g (5mm) EDTA와 200mg (0.02%) 나트륨 아 지 드의 추가. 소금은 녹아 때까지 휘저어. 멋진 솔루션을 사용 하기 전에 4 ° C. 전체 있음,이 솔루션의 22 L가 필요 합니다.
- 해결 방법 4 (PBS 나트륨 아 지 드 + EDTA): 1 L의 솔루션 1, 200 밀리 그램 (0.02%) 나트륨 아 지 드와 1.86 g (5mm) EDTA의 추가. 소금은 녹아 때까지 휘저어. 멋진 솔루션을 사용 하기 전에 4 ° C. 전체 있음,이 솔루션의 1 리터는 필요 합니다.
- 해결 방법 5 (초순 + 나트륨 아 지 드): 1 L의 초순, 추가 (0.02%) 나트륨 아 지 드의 200 밀리 그램. 소금은 녹아 때까지 휘저어. 멋진 솔루션을 사용 하기 전에 4 ° C. 전체 있음,이 솔루션의 260 L가 필요 합니다.
참고: EDTA SDC와 침전을 형성 하 고 이후 SDC 처리 전후 즉시 세척을 위해 사용 될 것입니다 솔루션 5에서 제외 됐다. - 해결 방법 6 (SDC + 트라이 톤 X-100): 초순의 940 mL을 추가 (4%)의 40 g SDC, 60 mL (6%) 트라이 톤 X-100, 200 밀리 그램 (0.02%) 나트륨 아 지 드의 고 (0.4 m m) phenylmethylsulfonyl 불 소 (PMSF)의 69.6 mg. 해산 때까지 휘저어. 멋진 솔루션을 사용 하기 전에 4 ° C. 사용 전에 PMSF를 추가 합니다. 전체 있음,이 솔루션의 9.6 L가 필요 합니다.
- 7 (DNase) 솔루션: 추가 10000 Kunitz 단위의 DNase-CaCl2 및 MgCl2(40 Kunitz 단위/mL) Dulbecco의 PBS의 250 mL에 나. 신선 하 게 준비 하 고 즉시 사용 합니다. 따뜻한 솔루션을 사용 하기 전에 37 ° C.
- 솔루션 8 (PBS + 나트륨 아 지 드): 1 L의 솔루션 1, 200mg (0.02%) 나트륨 아 지 드의 추가. 소금은 녹아 때까지 휘저어. 멋진 솔루션을 사용 하기 전에 4 ° C. 전체 있음,이 솔루션의 1 리터는 필요 합니다.
3입니다. 돼지 췌 장 해 부
참고:이 연구에서 돼지 췌 했다 해 부에서 안락사, heparinized (400 IU/kg) 여성 돼지는 농장에서 45 k g.
- 부정사 위치에 해 부 테이블에 돼지를 놓습니다.
- 중간 절 개를 xiphoidal 프로세스에서 치 골 (약 40cm)에 모든 복 부 장기를 노출 하는 메스를 사용 하 여 확인 합니다.
- 위치는 비장, 십이지 장, 및 연결 돌출부.
- 주요 십이지 장 시의 레벨을 찾아서 두 개의 별도 봉합을 사용 하 여 해당 사이트에서 구두로 십이지 장 선.
- 두 개의 별도 봉합 열 등 한 식도 선 그리고 위장을 꺼내가 위로 합자 사이.
- 소장에 도달 콜론에서 연결 조직 구분 합니다.
- 췌 장 비장 엽에 콜론의 결합 조직 구분 합니다.
- 동맥을 ligating 후 소장에서 콜론을 제거 합니다.
- 열 등 한 mesenteric 정 맥 및 열 등 한 mesenteric 동맥 나무를 찾아서 어디 췌의 caudally 표시 한 봉합 사로 선.
- 비장 동맥 선 하 고 hilum에서 비장을 가까이 한 봉합 함께 정 맥 distally 비장 제거를 위로 잘라.
- 십이지 장 및 연결 돌출부는 두 개의 별도 봉합 후에 십이지 장 선까지 십이지 장을 따릅니다.
- 해 부 포털 정 맥, 간에서 어떤 혈액 누출을 방지 하 여 합자 proximally 잘라 한 봉합으로 선. 문맥에서 decellularization 동안 콘센트로 제공합니다.
- 해 부 및 담 즙 덕트와 두 봉합 간 동맥 선. 봉합을 distally 컷.
- 신장 정 맥에서 대동맥을 찾아서 췌 장 영역에 도달할 때까지 근육과 결합 조직에서 두개골 방향에서 그것을 해 부.
- 뒤집어 췌 부드럽게 및 SMA와 CT를 그대로 유지 하는 대동맥 해 부와 대동맥 CT에 우수한 SMA를 열 등 한가 위를 잘라.
- 가 위로 조직을 둘러싼 나머지 잘라내어 췌를 꺼내.
- 4 m m arteriotomy 정에 연결 50 mL 주사기를 사용 하 여, 전체 기관 perfuses 때까지 또는 전체 기관 감기 될 때까지 솔루션 2 대동맥을 통해 장기를 플러시.
4. 돼지 췌 장 Decellularization에 대 한 준비
- 4 ° C에 또는 과정 전반에 걸쳐 얼음에 췌를 유지.
- 잘라가 위를 사용 하 여 십이지의 봉합, 초순 물 25 mL 피 펫을 사용 하 여 50-150 mL를 홍 조에 의해 식품의 그것을 청소 하 고 다시 봉합 선.
- 대동맥의 한쪽 끝 및 누설을 방지 하기 위해 봉합 SMA 및 CT 외 모든 분기를 선.
- 대동맥의 다른 쪽 끝에서 4 mm arteriotomy 정을 삽입 하 고 봉합 선.
- Decellularization 설치를 사용 하 여 20 mL/min에서 1 시간에 대 한 솔루션 3 췌 장 perfuse
참고: 아무 거품 췌 입력 되도록 솔루션 3 펌프의 튜브를 프리 필. 장기의 모든 측면에서 어떤 누설에 대 한 모양과 봉합, 포털 정 맥 제외 하 고 열려 있는 모든 혈관 분 지 선. - 솔루션 4에서-20 ° C에서 췌는 decellularization의 시작까지 동결.
5입니다. 돼지 췌 장 decellularization
- 4 ° c.에 췌 해 동
- 없음 기포 세제 입구 관에서 볼 수 있습니다 때까지 20 mL/min에서 솔루션 3 decellularization 설정에서 연동 펌프를 실행 합니다.
- Decellularization 컨테이너에서 췌를 놓고 췌의 대동맥에 세제 유입 튜브를 연결 합니다. 4 ° c.에 20 mL/min에서 하룻밤 솔루션 3 관류에 의해 장기를 씻어
- 기관 상공에 솔루션을 붓는 다.
- 솔루션 5 솔루션 3를 대체 하 고 4 ° c.에 20 mL/min에서 30 분 동안 췌 장 perfuse 기관 실에 솔루션을 붓는 다.
- 솔루션 6을 추가 하 고 perfuse 4 ° c.에 20 mL/min에서 8 h에 대 한 췌 장 기관 실에 솔루션을 붓는 다.
- 4 ° c.에 20 mL/min에서 96 h에 대 한 솔루션 5 관류에 의해 장기를 씻어 기관 실에 솔루션을 붓는 다.
- CaCl2 와 37 ° c.에 30 분 동안 MgCl2 를 포함 하는 Dulbecco의 PBS의 500 mL를 재순환 하 여 췌 DNase 치료에 대 한 준비 기관 실에 솔루션을 붓는 다.
- 솔루션 7의 250 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 20 mL/min에서 4 h에 대 한 췌 장 perfuse 기관 실에 솔루션을 붓는 다.
- 4 ° c.에 20 mL/min에서 120 h에 대 한 솔루션 5 관류에 의해 장기를 씻어
- 짧은 기간에 4 ° C에서 또는 오랜 기간 동안-20 ° C에서 솔루션 8에서 장기를 저장 합니다.
6입니다. Decellularization의 확인
- 가 위를 사용 하 여, 3-10 mm biopsies 췌의 모든 돌출부에서 잘라내어 실 온에서 48 h에 대 한 포름알데히드에 그들을 수정.
- 15 분 초순에 조각을 세척 하 고 표준 프로토콜에 따라 조직 프로세서에서 처리 한 파라핀에 그들을 포함.
- 톰을 사용 하 여 5 µ m 섹션을 잘라내어 메이어의 hematoxylin 및 0.2% 알콜 오신 (그는) 표준 프로토콜을 다음에 의해 그들을 얼룩.
- 핵의 손실에 대 한 확인을 가벼운 현미경 슬라이드 보기
참고: 동일한 방법으로 처리 신선한 조직에서 조각을 사용할 수 있습니다 제어로 핵의 존재에 대 한 확인.
Representative Results
수 있는 찾기 및 열 등 한 mesenteric 동맥 해 부 도와 트리, 포털 정 맥, 간 동맥, 담 관 및 CT와 SMA 분기 대동맥 정 맥, 대표 돼지 췌 장 해 부 사진 그림 2A에 표시 됩니다. 2B및 2 C (노란색 화살표), 각각. 그림 3A 정상 췌의 심한 형태를 보여주는 핑크 빛 고 비장, 포함 연결, 그리고 십이지 장 돌출부. Decellularization, 후 핑크 색상 및 분실 decellularized 췌 보이는 창백한 백색 색깔에 있다. 비장 보여주는 총 형태 그림, 연결, 및 decellularized 췌 장의 십이지 장 엽 그림 3B에 표시 됩니다. 그림 3C 그 얼룩에 의해 정상적인 췌에 많은 블루 핵의 존재를 보여줍니다. decellularized 췌 장, 그 얼룩이 보였다 핵의 손실 없음 블루 핵 본 (그림 3D).
그림 2: 돼지 췌 장 해 부의 사진. (A) 열 등 한 mesenteric 동맥 및 정 맥 나무 (노란색 화살표)의 위치입니다. (B)는 문맥, 간 동맥 및 담 즙 덕트 (노란색 화살표)의 결 찰. (C) 대동맥 coeliac 트렁크와 우수한 mesenteric 동맥 (노란색 화살표) 분기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 형태와 그 총 정상 및 decellularized 췌의 얼룩. (A) 정상적인 췌의 심한 형태. (B) decellularized 췌의 심한 형태. (C) 그 얼룩 블루 핵의 존재는 정상적인 췌 보여줍니다. (D) 그 얼룩 decellularized 췌에 파란색 핵의 부재를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
4 ° C에서 SDC와 트라이 톤 X-100의 관류를 사용 하 여 제안 된 프로토콜은 성공적으로 전체 돼지 췌 장을 decellularize 것입니다. 이 기술은 과제는 기관 perfuse 순서는 다른 혈관의 분 지의 표본 결 찰 뿐만 아니라는 실질 및 그것의 공급 혈관 손상 없이 모든 3 개의 돌출부를 포함 하는 그대로 췌의 해 부 없이 누설. 돼지 췌 장 인간의 췌에 비해 다른 해부학이 있다. 그것은 3 개의 돌출부의 구성 하 고 부분적으로 그것을 둘러싼 여 소장과 가까운 접촉에서 유지 됩니다. 소장을 연결 하는 췌 장에서 여러 개의 작은 혈관으로 우리 해 함께 췌 장, 십이지 장 부. 최적화 연구 기간 동안 이러한 혈관의 무딘 절단 누설 및 솔루션의 불완전 재 관류를 보이고 있다.
때문에 대동맥 coeliac 및 우수한 mesenteric 동맥을 통해 췌에 연결, 우리는 관류 한 정 고, 따라서, 1 개의 입구만 사용 하 여 간단 하 게 입구로 대동맥을 선택 했다. 우리의 경험에서 대동맥 CT 위와 아래는 SMA의 결 찰 해 부의 시간을 줄일 것 이다 고 두 혈관의 손상의 위험을 감소 시킨다. Heparinized 돼지 뿐만 아니라 우리는 또한을 통해 차가운 덤플링의을 관류 대동맥 해 부의 직후 기관 전체 솔루션의 관류를 달성에 도움이 나타났습니다. 우리는이 혈관에 혈전의 형성을 방지 하 여 발생 하는 경우 추측. 절 개 후 초순와 췌의 초기 관류 붉은 혈액 세포를 lyse 하 고 혈전 형성 방지 기관에 혈액 잔재를 제거 것입니다. 혈 배경 위에 쉽게 발견 될 수 있습니다이 기간 또한 정 맥과 동맥의 어떤 unligated 작은 가지를 찾는 데 사용할 수 있습니다.
우리는 찬 온도 (4 ° C)에서 전체 decellularization 절차를 유지 하이 췌 장의 외 분 비 세포에서 풀어 exocrine 효소의 행동을 방해 것으로 선택 했습니다. 외 분 비 효소, 저해 하지 때 그들은 세포 막과 단백질12소화할 수 있다 세포와 ECM에 해로운 효과 발생할 수 있습니다. 중지 및 재개 셀 버스트 효과적으로 수 있습니다, 우리가 포함 동결/동결 해제 단계 처음 세제4,13의 관류 전에. 녹고 후 초기 세척 세포 파열의 잔해를 제거 합니다. 우리가 사용 하는 세제 치료 SDC와 트라이 톤 X-100 비정상적으로 높은 농도 높은 관류 속도의 혼합 이다. ECM 손상 외 분 비 세포를 제거 하 여 빠른 decellularization를 달성 하기 위해이 방법을 선택 했습니다. 우리는 하드 및 빠른 프로토콜은 췌 장 decellularization에 대 한 유익한 시간이 ECM, 따라서 보존 좋은 ECM 구성 요소와 상호 작용 하는 췌 장 효소에 사용할 수 있을 것입니다 추측. ECM 구성 요소를 유지 하려면 우리 또한 떠들고 protease 억제제 (PMSF)에 추가 세제 솔루션으로 그 외 분 비 세포14에서 릴리스 하는 효소의 활성화를 억제 합니다. 세균성 오염15의 기회를 억제 함으로써 bacteriostatic 대리인으로 작동 하는 때 나트륨 아 지 드 모든 decellularization 솔루션에 추가 됩니다.
췌 보였다 ECM 구조와 ECM 단백질 콜라겐과 엘라 스 틴의 보전이이 프로토콜에 따라 decellularized. 그러나, 있다의 상당한 손실 decellularized 췌에서 발견 되었다. 췌 장 decellularized이 방식 또한 14 일12recellularized 조각에 인간 태아의 췌 장 줄기 세포의 부착 및 외 분 비 및 내 분 비 마커의 표현에 대 한 약속을 보여주었다. 그러나, 손상과 기능 췌를 생성 하려면 추가 연구 올바른 셀 소스, 셀 형식, 셀 시드 전략, 및 생물 문화 평가에 필요 합니다.
Disclosures
S.S.H.는 Verigraft, 혈관 조직 공학의 기술 라이센스는 회사에서에서 주식을 보유 하고있다. 다른 저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 S.S.H.에 스웨덴 정부 LUA ALF에서 교부 금에 의해 융자 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4mm DLP arteriotomy cannula | Medtronic | 31104 | |
| 2ml Unlabelled pipette | vWR | 612-3720 | |
| Degasser | Biotech AB | 0001-6484 | |
| DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
| Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
| Heparin | Leo | 387107 | |
| Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Peristaltic pump | Oina | SP-1X4 | |
| PMSF | Roche | 10837091001 | Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion. |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
| SDC | Sigma Aldrich | 30970 | |
| Silicon tube 3X5mm | VWR | 2280706 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
| Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
| Suture | Vömel | 14817 | |
| Syrringe 50mL | Becton Dickinson | 300137 | |
| Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF |
References
- Federation, I. D. IDF Diabetes Atlas. , Available from: http://www.diabetesatlas.org (2016).
- Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. Journal of Diabetes and its Complications. 29 (5), 737-743 (2015).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Hynes, R. O. The evolution of metazoan extracellular matrix. Journal of Cell Biology. 196 (6), 671-679 (2012).
- Scarritt, M. E., Pashos, N. C., Bunnell, B. A. A review of cellularization strategies for tissue engineering of whole organs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnol. 3, 43 (2015).
- Goh, S. K., et al. Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering. Biomaterials. 34 (28), 6760-6772 (2013).
- Wu, D., et al. 3D Culture of MIN-6 Cells on Decellularized Pancreatic Scaffold. In Vitro and In Vivo Study. Biomed Research International. 2015, 432645 (2015).
- Peloso, A., et al. The Human Pancreas as a Source of Protolerogenic Extracellular Matrix Scaffold for a New-generation Bioartificial Endocrine Pancreas. Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).
- Mirmalek-Sani, S. H., et al. Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering. Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).
- Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation. Cell Transplantation. 19 (5), 613-628 (2010).
- Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).
- Gilpin, A., Yang, Y. Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications. Biomed Research International. 2017, 9831534 (2017).
- James, G. T. Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers. Analytical Biochemistry. 86 (2), 574-579 (1978).
- Lichstein, H. C., Soule, M. H. Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: I. The Action of Sodium Azide on Microbic Growth. Journal of Bacteriology. 47 (3), 221-230 (1944).
