Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Этикетка свободной идентификации лимфоцитов подтипы, с использованием трехмерных количественных этап визуализации и машинного обучения

doi: 10.3791/58305 Published: November 19, 2018

Summary

Мы описываем протокол для лейбл свободной идентификации подтипы лимфоцитов с помощью количественных этап визуализации и алгоритм машинного обучения. Измерение 3D преломления томограмм лимфоцитов представляют 3D Морфологические и биохимические информации для отдельных ячеек, который затем анализируется с помощью алгоритмов машинного обучения для идентификации типов клеток.

Abstract

Здесь мы описываем протокол для лейбл свободной идентификации подтипы лимфоцитов с помощью количественных фазы создания образов и машинного обучения. Определение подтипы лимфоцит имеет важное значение для исследования иммунологии, а также диагностики и лечения различных заболеваний. В настоящее время стандартные методы для классификации типов лимфоцитов полагаются на маркировке конкретных мембранных белков через реакции антиген антитело. Однако эти методы маркировки несут потенциальные риски изменения клеточных функций. Протокол, описанные здесь преодолевает эти проблемы, используя встроенный оптический контрастов, измеряется изображений 3D количественную фазу и алгоритм машинного обучения. Измерение 3D преломления (RI) томограмм лимфоцитов обеспечивает количественную информацию о 3D морфологии и фенотипы отдельных клеток. Биофизических параметров, извлеченных из измеренных 3D ри томограмм затем количественно проанализированы с алгоритм обучения машины, позволяя лейбл свободной идентификации типов лимфоцитов на уровне одной ячейки. Мы измерить 3D ри томограмм B, T CD4 + и CD8 + T-лимфоцитов и определили их типы клеток с более чем 80% точность. В этом протоколе мы описывают подробные шаги для лимфоцитов изоляции, 3D количественных этап визуализации и машинного обучения для выявления типов лимфоцитов.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Лимфоциты могут быть разделены на различные подтипы, включая B, помощник (CD4 +) T, цитотоксических T (CD8 +) и регулирования T клетки. Каждый тип лимфоцит имеет другую роль в адаптивной иммунной системы; например лимфоциты вырабатывают антитела, тогда как Т-лимфоцитов обнаружения специфических антигенов, устранить аномальные клетки и регулировать лимфоцитов. Функцию лимфоцитов и регулирование плотно управляется и относящиеся к различным заболеваниям, включая рак1, аутоиммунных заболеваний2и3вирусных инфекций. Таким образом идентификация типов лимфоцитов имеет важное значение для понимания их патофизиологические ролей в таких заболеваний и для иммунотерапии в клиниках.

В настоящее время методы для классификации типов лимфоцитов полагаются на реакции антиген антитело, нацеленных на конкретные поверхности мембранных белков или поверхностных маркеров4. Ориентация поверхности маркеров является точное и точный метод определения типов лимфоцитов. Однако это требует дорогостоящих реагентов и длительных процедур. Кроме того он несет риски модификация белков мембранных структур и изменения клеточных функций.

Для преодоления этих проблем, описанных здесь протокол вводит лейбл свободный идентификация типов лимфоцитов с помощью 3D количественных этап визуализации (QPI) и машинного обучения5. Этот метод позволяет классификация типов лимфоцитов на уровне одной ячейки на основе морфологических сведений, извлеченных из метки Бесплатные 3D визуализации отдельных лимфоцитов. В отличие от обычных флуоресцентной микроскопии методы QPI использует индекс преломления (RI) дистрибутивов (внутренние оптические свойства живых клеток и тканей) оптических контраст6,7. РИ томограмм отдельных лимфоцитов представляют фенотипические информацию, относящуюся к подтипам лимфоцитов. В этом случае системно использовать 3D ри томограмм отдельных лимфоцитов, использовался алгоритм обучения под наблюдением машины.

Используя различные методы QPI, 3D ри томограмм клеток активно использовались для изучения патофизиологии клеток потому, что они предоставляют метку бесплатно, количественные визуализации возможность8,9,10, 11,12,13. Кроме того 3D ри распределения отдельных ячеек может предоставить морфологических, биохимических и биомеханических информацию о клетки. 3D ри томограмм, ранее использовались в области гематологии14,,1516,17, инфекционные заболевания18,19, 20, иммунологии21, ячейки биологии22,23, воспаление24, рак25, нейронауки26,27, биологии развития28, токсикологии 29и микробиологии12,30,,3132.

Хотя 3D ри томограмм подробно Морфологические и биохимические клеток, классификация лимфоцитов подтипы трудно достичь, просто визуализации 3D ри томограмм5. Воспользоваться систематически и количественно измеряемых 3D ри томограмм для классификации типа клеток, мы использовали алгоритм обучения машины. Недавно несколько работ были зарегистрированы в котором количественных фазе изображения клеток были проанализированы с различных машинного обучения алгоритмов33, включая обнаружение микроорганизмов34, классификация бактериальных род35 , 36, быстрый и бесплатный этикетки обнаружения спор сибирской язвы37, автоматизированный анализ клеток спермы38, анализ рака клеток39,40и выявления активации макрофагов41.

Этот протокол обеспечивает подробные шаги для выполнения лейбл свободной идентификации типов лимфоцитов на уровне отдельных клеток с использованием 3D QPI и машинного обучения. Это включает в себя: 1) лимфоцитов изоляции от мыши крови, 2) лимфоцитов сортировки через поток цитометрии, 3) 3D QPI, 4) количественные функция извлечения из 3D ри томограмм и 5) под наблюдением обучения для выявления типов лимфоцитов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Уход за животными и экспериментальной процедуры выполнялись под номером официального утверждения институциональный уход за животными и использование Комитета KAIST (KA2010-21, KA2014-01 и KA2015-03). Все эксперименты в рамках этого исследования были проведены в соответствии с утвержденными руководящими принципами.

1. лимфоцитов изоляции от мыши крови

  1. После того, как мышь C57BL/6J умерщвлены через CO2 ингаляции, вставьте иголку 26-G в сердце мыши и собирать 0,3 мл крови. Прямо положил крови в трубку с 100 ед/мл Гепарин раствор разбавляют с 1 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS).
    Примечание: в качестве альтернативы, лимфоцитов из селезенки может быть изолирован.
  2. Центрифуга для трубки на 400 g x 5 мин при 4 ° C.
  3. Добавить 0,5 мл аммония хлорид калия лизировать буфер трубки и осторожно перевернуть его несколько раз перемешать раствор.
  4. Инкубируйте трубки при комнатной температуре (RT) за 5 мин.
  5. Вымойте клетки путем добавления 4,5 мл PBS и центрифугирование в 400 g x 5 минут при температуре 4 ° C, дважды.
  6. Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 100 мкл свежих RPMI 1640 среды с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС).
  7. Добавьте 0,1 мкг антитела CD16/32 (2.4G2) трубка для блокировки.
  8. Держите трубку на льду.

2. поток цитометрии и сортировка лимфоцитов подтипы

Примечание: Сортировка лимфоцитов в зависимости от типа ячейки имеет важное значение для создания земли истина (т.е. правильный) клетки типа этикетки для обучения и тестирования классификатор типа клеток в поднадзорных обучения. Проточной цитометрии, золотой стандарт методом, используется для идентификации и отдельные лимфоцитов42.

  1. Сделать смесь поверхности маркера, Пятнать антитела в 100 мкл свежих RPMI 1640 среды [с 10% FBS, 0,1 мкг CD3e (17A2), CD8a (53-6.7), CD19 (1D, 3), CD45R (B220, RA3-6B2) и NK1.1 (PK136)] и 0,25 мкг CD4 (GK1.5) антител к целевой B, CD4 + T и CD8 + T лимфоцитов.
  2. Добавьте 100 мкл антител смеси в суспензию клеток (полученные на шаге 1.8).
  3. Инкубируйте 25 мин на льду.
  4. Вымойте клетки, добавив 5 мл PBS и центрифугирование в 400 g x 5 минут при температуре 4 ° C, дважды.
  5. Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл свежего RPMI 1640 среды с 10% FBS и 2,5 мкг DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole).
  6. Собирают отдельно каждого типа лимфоцитов с проточной цитометрии, используя уровни флюоресценции маркеров, описанных выше. Одновременно исключить мертвые клетки, с использованием сигналов DAPI.
    Примечание: Подробные протоколы относительно потока, сортировки на основе цитометрии клеток были описаны ранее42.

3. 3D количественную фазу изображений

  1. Держите отсортированный лимфоцитов на льду на всей изображений процедуры, которым должна быть завершена в течение 5 ч (с лимфоцитов изоляции от мыши) чтобы избежать повреждения клеток и биохимические изменения.
  2. Выберите тип сортировки ячейки (среди B, T CD4 + и CD8 + T лимфоциты) и разбавления образца (полученные на шаге 2.6) 180 клеток/мкл с RPMI средой для оптимальной визуализации состояния (то есть, одна ячейка за одного поля зрения).
  3. Загрузите 120 мкл разбавленного образца в тепловизионной камеры, медленной инъекции. Тщательно проверьте на наличие пузырьков в тепловизионной камере с образцом. Если есть пузырьки, тщательно удалите их, как они будут компромисс качества измерений.
  4. Приобрести 3D ри томограмм, с использованием коммерческих 3D количественных Этап микроскопа, или holotomography и изображений программное обеспечение.
    Примечание: Подробная информация о экспериментальной установки можно найти в оригинальной рукописи5.
    1. Место падения дистиллированной воды на вершине объектива микроскопа.
    2. Поместите тепловизионные камеры с образцом на стадии перевода микроскопа и скорректировать его расположение, так что образец выравнивает с объектива.
    3. Отрегулируйте осевой позиции объективных и конденсатор линзы, нажав фокус и поверхности, соответственно, на вкладке «Калибровка» «Микроскоп» перспективы визуализации программного обеспечения.
    4. Согласовать цели и конденсатор линзы, нажав кнопку Режим Auto. Можно также использовать Режим сканирования и вручную настроить линзы так, что модели освещенности локализованы в центральной части поля зрения.
    5. Вернуться в Обычный режим и настройте стадии перевода найти ячейку в поле зрения.
    6. Найти фокальной плоскости, регулируя осевое положение объектива. Совершенный упор делает границы образца, визуализируется на экране почти невидимым.
    7. Настройте перевод этапе найти место без клетки.
    8. Нажмите кнопку калибровки для измерения несколько 2D голограмм с различной освещенности углами.
    9. Настройте перевод этапе найти ячейку в центре поля зрения.
    10. Перейдите на вкладку «Приобретения» и нажмите кнопку 3D снимок для измерения голограммы ячейки с углы идентичным освещения, как это сделано в шаге 3.4.8.
    11. Когда полученные данные представлены на панели «Управление данными», щелкните правой кнопкой мыши на полученных данных и нажмите кнопку процесса восстановить 3D томограммы ри от голограмм, измеряется в шагах 3.4.8 и 3.4.10, с использованием алгоритма томография дифракции 9 , 10 в визуализации программного обеспечения.
    12. Повторите шаги 3.4.5-3.4.11 для измерения более чем 100 клеток для обеспечения статистической мощности для машинного обучения.
    13. Все изображения, которые обрабатываются через шаг 3.4.11. могут быть визуализированы. На панели «Управление данными» щелкните правой кнопкой мыши данные и нажмите кнопку Открыть для визуализации данных. Нажмите ри томограммы на панели «Данные менеджер». На вкладке «Настройки» нажмите кнопку загрузить и дважды щелкните «lymphocyte.xml», который представляет предопределенный передаточной функции, предоставляемые изображений программное обеспечение для визуализации томограммы по 3D ри дистрибутивов.
  5. Повторите шаги 3.2-3.4 измерения 3D ри томограмм всех подтипов лимфоцитов.

4. количественные Морфологические и биохимические функции извлечения из 3D ри томограмм

  1. Поместите все томографических данных, измеренных выше в одной папке. Разделение типов клеток в подпапках этой папки. Подготовка каждого томограммы быть один .mat файл.
  2. Откройте дополнительный файл 1 - функция извлечения (написано для обработки изображений программное обеспечение).
  3. Измените линия 14 назначить папке томограммы, подготовленную на этапе 4.1.
  4. Измените линия 15 назначить папку для сохранения извлеченных данных.
  5. При необходимости измените строку 17 регулировать параметры порога ри для извлечения компонентов. Параметром по умолчанию является 20 ри порогов от 1.340-1.378, с добавкой 0,002, как описано ранее5.
  6. Выполнение кода. Для каждого томограммы в наборе данных, код вычисляет пять функций: поверхности области (SA), сотовой тома (CV), сферичность (SI), плотность белка (PD) и сухой массы (DM), за порог ри. Подробные алгоритмов для извлечения компонентов описанных в других5.
  7. Для того чтобы контролировать функцию извлечения, во время выполнения проверки на экране визуализации ри на основе порогового значения ячейки сегментации.
  8. Проверить на извлеченных данных, как .mat файл томограммы, сохраняются в папке, в шаге 4.4.

5. надзор за обучение и идентификации

  1. Случайным образом Разбейте функции данные, полученные в наборы шаг 4,8 профессиональной подготовки (70%) и тест (30%) с отдельные папки.
  2. Открыть дополнительный файл 2 - поезд (написано для обработки изображений программное обеспечение).
  3. Измените линия 14 для обозначения набора профессиональной подготовки, подготовленный в шаге 5.1.
  4. Отредактируйте строку 16 назначить папку для сохранения подготовленных классификатора.
  5. Отредактируйте строку 17 чтобы задать имя файла для классификатора.
  6. При необходимости измените строку 19 для выбора возможностей для профессиональной подготовки. Параметр по умолчанию, как указано ранее5, был использован для получения представительной результаты ниже.
  7. Выполнение кода. Использование отдельных функций обучающего набора, код поезда классификатора с k-ближайшего соседа алгоритм (k -NN; k = 4), а затем сохраняет в папке, в шаге 5.4 классификатора (как назвал в шаге 5.5).
  8. Проверить на экране визуализации классификатор производительности и точности перекрестной проверки.
  9. При необходимости поезд несколько классификаторов с комбинациями различных функций, повторив шаги 5.5-5,7. Затем выберите классификатор с высокой точностью перекрестной проверки.
  10. Открыть дополнительный файл 3 - тест (написано для обработки изображений программное обеспечение).
  11. Редактирование линий 14-15 назначить подготовленных классификатор для проверки.
  12. Отредактируйте строку 17 для обозначения набора тест, подготовленную на этапе 5.1.
  13. Выполнение кода. Классификатор, описанные выше идентифицирует типы клеток отдельных лимфоцитов в наборе тестов.
  14. Проверить на экране визуализации идентификации производительность и точность теста.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Рисунок 1 показана схема процесса всего протокола. С помощью процедуры, представленные здесь, мы изолированы B (n = 149), CD4 + T (n = 95) и CD8 + T (n = 112) лимфоцитов. Для получения амплитуды и фазы при различных углах освещения, несколько 2D голограммы каждого лимфоцитов были измерены, изменив угол освещения (от-60 ° c до 60 °). Как правило 50 голограмм может использоваться для воссоздания 3D ри томограммы, но может регулироваться количество 2D голограмм, учитывая скорость и качество. Амплитуда и фаза информации измеренных голограмм извлекаются с помощью поля поиска алгоритм, основанный на43,преобразование Фурье44. 3D томограммы ри каждом лимфоцитов был реконструирован из нескольких 2D проверено амплитуды и фазы информации при различных углах освещения с использованием алгоритма томография дифракции. Подробности процесса изображения и 3D ри томограммы метод восстановления можно найти в других21,45.

Рисунок 2 A-2_C показывает представитель 3D оказанные ри томограмм, B, T CD4 + и CD8 + T-лимфоцитов, выделяя различные цветовые схемы по ри значений через изображений программное обеспечение. От значения ри, количественные морфологические (СА, CV и SI) и биохимических особенностей (PD и DM) были рассчитаны (рисA-2_C). Этот результат ясно демонстрирует, что 3D ри распределения позволяет количественный анализ как морфологические, так и биохимических информации лимфоцитов.

Под наблюдением машинного обучения была использована для определения лимфоцита типы на уровне одной ячейки. Измеренной 3D томограмм ри были случайным образом разделены на 70% и 30% обучения (B: 104, CD4 + T: 66 и CD8 + T: 77) и тест (B: 45, CD4 + T: 29 и CD8 + T: 35) наборы данных, соответственно. Мы оптимизировали классификаторы максимально использовать отпечатки пальцев определенного типа клеток, закодированные в пространстве. Общая точность, чувствительность (истинный положительный) и специфичность (истинный отрицательный результат) были рассчитаны путем сопоставления классификатор предсказать результаты и типы клеток земли правда.

Для того чтобы продемонстрировать доказательства в концепция предлагаемого протокола, мы провели под наблюдением машинного обучения на трех различных случаях: двоичной классификации лимфоцитов T и B (i) и (ii) двух подтипов Т-лимфоцитов (CD4 + и CD8 +) и (iii) нескольких классов Классификация видов лимфоцитов.

Рисунок 3 показывает идентификации производительность оптимизированных классификаторов для этапов подготовки и тестирования. Точность классификации T и B лимфоцитов был 93.15% и 89,81% для обучения и тестовых случаев, соответственно. CD4 + и CD8 + T лимфоциты статистически были классифицированы, и точность была 87.41% и 84,38% для обучения и тестирования наборов, соответственно. Наконец точность классификатор типа многофункциональность ячейки составила 80.65% и 75.93% для этапов подготовки и тестирования, соответственно.

Figure 1
Рисунок 1 : Схематические лейбл свободной идентификации лимфоцитов типов использования 3 D количественные фазы создания образов и машинного обучения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Представитель 3 D оказываемых ри томограмм каждого типа клеток лимфоцитов с количественным Морфологические и биохимические особенности. (A) клетки B, (B) CD4 + Т-клеток и (C) CD8 + Т-клеток. Шкалы бар = 2 мкм. SA, площадь поверхности; CV, сотовой тома; SI, сферичность; PD, плотность белка; DM, сухой массы. Этот показатель изменяется с разрешением5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Типы идентификации отдельных лимфоцитов через руководил машинного обучения (A) двоичной классификации B и T-клеток, (B) двоичной классификации клеток CD4 + и CD8 + T и (C) многофункциональность классификации всех трех типов клеток лимфоцитов; для обучения и проверочный наборы. Обратите внимание на небольшой разницу между профессиональной подготовкой и тестовых случаев, предлагая хороший обобщение установленных классификаторов. Цифры ниже имена каждого типа ячейки указывают количество ячеек, которые используются. Этот показатель изменяется с разрешением5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Supplementary File 1
Дополнительный файл 1: есть код извлечения. Извлечение функций (СА, CV, SI, PD и DM) после сегментации каждой томограммы ри на основе порога. Реализовано обработки изображений программное обеспечение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Supplementary File 2
Дополнительный файл 2: подготовка код. Обучение k -NN классификатор обучения на основе выбранных функций. Реализовано обработки изображений программное обеспечение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Supplementary File 3
Дополнительный файл 3: тестирование кода. Тестирование подготовленных k- NN классификатора для нового набора данных (т.е., проверить набор). Реализовано обработки изображений программное обеспечение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Мы представляем протокол, который позволяет идентифицировать метку бесплатно лимфоцитов типов использования 3D количественных фазы создания образов и машинного обучения. Важнейшие шаги этого протокола являются количественную фазу изображений и возможность выбора. Для оптимального голографических изображений, плотность клеток должны контролироваться как описано выше. Механическая стабильность клеток также имеет важное значение для получения точных 3D ри распределения, потому что плавающей или колебательных движений сотовой будет беспокоить голограмма измерений при изменении угла освещения. Поэтому мы, ждал несколько минут, пока образец стала стабильной и статические в тепловизионной камере перед измерением голограммы. И наконец пузыри внутри тепловизионные камеры являются проблематичными, при измерении голограмм ввиду ри различия между воздухом и образца; Таким образом образец должен быть тщательно загружен тепловизионной камере.

Функция извлечения и отбора помогают определить идентификацию производительности классификатора. Мы рассчитали 5 количественных морфологические (CV, SA, SI) и биохимические (PD, DM) функций от 3D ри распределения в 20 различных пороговых значений ри; Таким образом мы извлекли в общей сложности 100 функций. Мы исчерпывающе Поиск оптимальной функции и классификатор комбинаций, которые показывают, что был выбран лучший точности перекрестной проверки. Мы протестировали 6 алгоритмы обучения различных машин, в том числе k -NN (k = 4 и k = 6), анализ линейной дискриминации, квадратичных дискриминации анализ, наивно Байеса и дерево принятия решений и мы обнаружили, что k -NN (k = 4 ) показал лучшее исполнение идентификации. Однако есть шанс улучшить точность идентификации с помощью других методов, включая поддержку векторной машины и нейрональных сетей обучения машины.

Этот протокол меры внутренние оптические свойства через 3D количественную фазу обработки изображений для выявления типов лимфоцитов; Таким образом он не требует маркировки процесс, основанный на реакции антиген антитела, используемые в флуоресценции или магнитные шарик сортировки клеток методов, которые имеют риски изменения клеточную функцию путем изменения структуры белков мембранных. Кроме того нынешний метод измеряет 3D ри распределение и обеспечивает 3D Морфологические и биохимические сведения о ячейке, которая не может быть получено голографии single shot метод46; Таким образом производительность идентификации протокола является более точным из-за высокой мерной информацией.

Незначительные ограничения настоящего Протокола является ручной регулировки на стадии образца и необходимые маркировки процесс для поднадзорных машинного обучения. Мы искали лимфоцитов, регулируя руководство трансляционная стадии и измеренных голограмм, которые являются наиболее трудоемкими шаги. Это ограничение будет улучшена путем использования автоматизированных моторизованного столика или microfluidic канала устройства. Что касается контролируемой обучения, известных лимфоцитов типы необходимы для установления оптимального классификатора; Таким образом мы должны были первой изолировать и определить типы клеток лимфоцитов, на основе метода сортировки на основе антиген антитело. Тем не менее этот протокол по-прежнему использует встроенный оптический контраст лимфоцитов, и используется для указания антитела обозначая агенты имеют незначительное влияние на измеряемый сигнал 3D ри. Таким образом установленным классификатор может использоваться для идентификации лимфоцитов образом ярлык бесплатно.

Хотя этот протокол использует главным образом фенотипов лимфоцитов путем измерения 3D ри томограмм отдельных ячеек, эти 3D ри данные также могут использоваться в сочетании с другими методами решения генотипов или proteomic информацию для лучшего классификации подтипы. Недавно корреляционного микроскопии методы комбинирования изображений флуоресценции и QPI были введены47,48,49. Представленный в настоящем протоколе подход может также распространяться на эти корреляционные методы визуализации.

Этикетка свободной идентификации типов лимфоцитов может применяться для изучения патофизиологии или диагностика болезни путем обнаружения ненормальных лимфоциты или соотношения между типами лимфоцитов. Кроме того этот протокол может применяться к цельной крови анализ путем выявления различных клеток, включая красные кровяные клетки, тромбоциты и белые кровяные клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Профессор ю. парк, Y. Jo, S. Ким ю. и с. ли имеют финансовые интересы в Tomocube, Inc., компании, которая коммерциализирует дифракции томография и количественных фазы обработки изображений инструменты и является одним из авторов работы.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана KAIST BK21 + программа, Tomocube, Inc. и Национальный исследовательский фонд Кореи (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Ю. Джо выражает поддержку от KAIST президентских стипендий и Асан фонд биомедицинской науки стипендию.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403, (6769), 503 (2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11, (1), 14 (2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105, (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7, (1), 6654 (2017).
  6. Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. McGraw Hill Professional. (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13, (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. 106328 (2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2, (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1, (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19, (4), 046009 (2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8, (3), 256 (2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4, (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6, (6), 20869 (2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6, (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson's disease. Cytometry Part A. 91, (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7, (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8, (1), 210 (2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9, (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. arXiv:1806.03982 (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13, (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23, (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3, (8), 1700606 (2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91, (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91, (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72, (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36, (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19, (1), 011005 (2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15, (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8, (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. arXiv:1801.00854 (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8, (5), 2496-2518 (2017).
Этикетка свободной идентификации лимфоцитов подтипы, с использованием трехмерных количественных этап визуализации и машинного обучения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).More

Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter