Summary
Descriviamo un protocollo per l'identificazione di sottotipi del linfocita usando formazione immagine fase quantitativa e un algoritmo di apprendimento automatico privo di etichetta. Misurazioni dell'indice di rifrazione 3D tomogrammi dei linfociti presentano 3D informazioni morfologiche e biochimiche per le singole celle, che viene quindi analizzati con un algoritmo di apprendimento automatico per l'identificazione di tipi delle cellule.
Abstract
Descriviamo qui un protocollo per l'identificazione di sottotipi del linfocita usando formazione immagine fase quantitativa e apprendimento automatico privo di etichetta. L'identificazione di sottotipi del linfocita è importante per lo studio di immunologia, come pure la diagnosi ed il trattamento di varie malattie. Attualmente, metodi standard per la classificazione dei tipi di linfocita si basano sull'etichettatura di proteine di membrana specifici tramite reazioni antigene-anticorpo. Tuttavia, queste tecniche d'etichettatura trasportano i potenziali rischi di alterare le funzioni cellulari. Il protocollo descritto qui supera queste sfide sfruttando intrinseci contrasti ottici misurati da formazione immagine 3D fase quantitativa e un algoritmo di apprendimento automatico. Misurazione dell'indice di rifrazione 3D (RI) tomogrammi dei linfociti fornisce informazioni quantitative sulla morfologia 3D e fenotipi di singole celle. I parametri biofisici estratti dal misura 3D RI tomogrammi vengono poi analizzati quantitativamente con un algoritmo di apprendimento della macchina, che consente di identificare tipi di linfocita a livello di singola cellula privo di etichetta. Misuriamo i tomogrammi RI 3D dei linfociti B, T CD4 + e CD8 + T e identificati i tipi di cellule con oltre l'80% precisione. In questo protocollo, descriviamo la procedura dettagliata per l'isolamento, imaging 3D fase quantitativa e apprendimento automatico per l'identificazione dei tipi del linfocita.
Introduction
I linfociti possono essere classificati in diversi sottotipi, tra cui B, helper (CD4 +) T, linfociti T citotossici (CD8 +) e T regolatorie cellule. Ogni tipo di linfocita ha un ruolo diverso nel sistema immunitario adattivo; ad esempio, i linfociti B producono anticorpi, mentre i linfociti T rilevare antigeni specifici, eliminano le cellule anormali e regolano i linfociti B. Regolamento e funzione del linfocita è strettamente controllato da e relative alle varie malattie tra cui tumori1, malattie autoimmuni2e infezioni virali3. Così, l'identificazione dei tipi del linfocita è importante comprendere i loro ruoli fisiopatologici in tali malattie e per l'immunoterapia nelle cliniche.
Attualmente, metodi per la classificazione dei tipi di linfocita si basano sulle reazioni antigene-anticorpo targeting proteine specifiche della membrana superficiale o marcatori di superficie4. Targeting per gli indicatori di superficie è un metodo preciso e accurato per determinare i tipi di linfociti. Tuttavia, esso richiede costosi reagenti e lunghe procedure. Inoltre, trasporta i rischi della modificazione della struttura delle proteine di membrana e l'alterazione delle funzioni cellulari.
Per superare queste sfide, il protocollo descritto qui introduce l'identificazione privo di etichetta dei tipi del linfocita usando fase quantitativa 3D imaging (QPI) e machine learning5. Questo metodo consente la classificazione dei tipi di linfocita a livello di singola cellula basato su informazioni morfologiche estratte da imaging 3D privo di etichetta dei singoli linfociti. A differenza delle tecniche di microscopia di fluorescenza convenzionali, QPI utilizza l'indice di rifrazione (RI) distribuzioni (intrinseche proprietà ottiche di tessuti e cellule vive) come contrasto ottico6,7. I tomogrammi RI dei singoli linfociti rappresentano informazioni fenotipiche specifiche ai sottotipi di linfociti. In questo caso, per via sistemica utilizzare 3D RI tomogrammi dei linfociti individuali, è stato utilizzato un algoritmo di apprendimento supervisionato macchina.
Varie tecniche di QPI, i 3D tomogrammi RI delle cellule sono stati attivamente utilizzati per lo studio della fisiopatologia delle cellule perché forniscono un privo di etichetta, quantitativa imaging capacità8,9,10, 11,12,13. Le distribuzioni di RI 3D delle singole celle è anche, in grado di fornire informazioni morfologiche, biochimiche e biomeccaniche sulle celle. 3D RI tomogrammi sono stati precedentemente utilizzati nei settori dell'ematologia14,15,16,17, malattie infettive18,19, 20, immunologia21, cellula biologia22,23, infiammazione24, cancro25, neuroscienze26,27, biologia dello sviluppo28, tossicologia 29e microbiologia12,30,31,32.
Anche se 3D RI tomogrammi forniscono dettagliate informazioni morfologiche e biochimiche delle cellule, la classificazione dei sottotipi del linfocita è difficile da raggiungere da semplicemente imaging 3D RI tomogrammi5. Sfruttare sistematicamente e quantitativamente i misurato tomogrammi RI 3D per la classificazione del tipo di cellula, abbiamo utilizzato un algoritmo di apprendimento della macchina. Recentemente, diverse opere sono stati segnalati in quale fase quantitativa immagini delle cellule sono stati analizzati con vari di machine learning algoritmi33, compresa l'individuazione di microrganismi34, classificazione del genere di batteri35 , 36, rilevazione rapida e privo di etichetta di spore di antrace37, automatizzato di analisi delle cellule dello sperma38, analisi di cancro cellule39,40e la rilevazione di macrofago attivazione41.
Questo protocollo fornisce una procedura dettagliata per eseguire privo di etichetta di identificazione dei tipi del linfocita a livello di singola cella usando 3D QPI e il machine learning. Questo include: 1) l'isolamento dal sangue del topo, 2) dei linfociti l'ordinamento tramite flusso cytometry, 3) 3D QPI, 4) quantitativa funzione di estrazione da 3D RI tomogrammi e apprendimento 5) supervisionato per l'identificazione dei tipi del linfocita.
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Protocol
Cura degli animali e procedure sperimentali sono state effettuate sotto l'approvazione del istituzionale Animal Care e uso Comitato del KAIST (KA2010-21, KA2014-01 e KA2015-03). Tutti gli esperimenti in questo studio sono stati effettuati conformemente agli orientamenti approvati.
1. l'isolamento dal sangue del topo
- Una volta che un mouse C57BL/6J è eutanasia tramite inalazione di CO2 , inserire un ago 26G il cuore del topo e raccogliere 0,3 mL di sangue. Direttamente mettere il sangue in una provetta con 100 U/mL di soluzione di eparina diluita con 1 mL di tampone fosfato salino (PBS).
Nota: In alternativa, i linfociti dalla milza possono essere isolati. - Centrifugare la provetta a 400 x g per 5 min a 4 ° C.
- Aggiungere 0,5 mL di tampone lisante ammonio-cloruro-potassio al tubo e capovolgere delicatamente e alcune volte per miscelare la soluzione.
- Incubare la provetta a temperatura ambiente (TA) per 5 min.
- Lavare le cellule aggiungendo 4,5 mL di PBS e centrifugazione a 400 x g per 5 min a 4 ° C, due volte.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 100 µ l di terreno RPMI-1640 nuovo con 10% siero bovino fetale (FBS).
- Aggiungere 0,1 µ g di anticorpo CD16/32 (2.4G2) nella provetta per il blocco.
- Tenere il tubo sul ghiaccio.
2. citometria a flusso e l'ordinamento dei sottotipi del linfocita
Nota: L'ordinamento di linfociti a seconda del tipo di cella è essenziale per stabilire la cella di terra-verità (cioè, corretto) digitare le etichette per addestrare e testare un classificatore di tipo cellulare in apprendimento supervisionato. Citometria a flusso, un metodo gold standard, viene utilizzato per identificare e separare i linfociti42.
- Fare un miscuglio di macchiatura anticorpi in 100 µ l di terreno RPMI-1640 nuovo marcatore di superficie [con 10% FBS, 0.1 µ g di CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D 3), CD45R (B220, RA3-6B2) e NK1.1 (PK136)] e 0,25 µ g di anticorpi anti-CD4 (GK1.5) destinazione B, T CD4 + e CD8 + T linfociti.
- Aggiungere 100 µ l della miscela dell'anticorpo alla sospensione di cellule (ottenuta al passaggio 1.8).
- Incubare per 25 min sul ghiaccio.
- Lavare le cellule aggiungendo 5 mL di PBS e centrifugazione a 400 x g per 5 min a 4 ° C, due volte.
- Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di terreno RPMI-1640 fresco con 10% FBS e 2,5 µ g di DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole).
- Raccogliere separatamente ogni tipo di linfociti con citometria a flusso utilizzando i livelli di fluorescenza degli indicatori sopra descritti. Contemporaneamente escludere le cellule morte utilizzando i segnali DAPI.
Nota: Protocolli dettagliati per quanto riguarda il flusso cytometry-base cella ordinamento sono stati descritti precedentemente42.
3. 3D fase quantitativa Imaging
- Mantenere i linfociti ordinati su ghiaccio durante le procedure di imaging, che dovrebbe essere completato entro 5h (dall'isolamento dal mouse) per evitare il danno delle cellule e le alterazioni biochimiche.
- Selezionare un tipo di cellula ordinato (tra i linfociti B, T CD4 + e CD8 + T) e diluire il campione (ottenuto al passaggio 2.6) a 180 cellule / µ l con terreno RPMI per condizioni ottimali di formazione immagine (cioè, una cella al singolo campo di vista).
- Caricare 120 μL del campione diluito in una camera di imaging mediante iniezione lenta. Controllare accuratamente la presenza di bolle nella camera di imaging con l'esempio. Se ci sono bolle, rimuovere con attenzione loro, come essi comprometterà la qualità delle misurazioni.
- Acquisire i tomogrammi RI 3D utilizzando un microscopio quantitativo 3D di fase, commerciale, o holotomography e relativo software di imaging.
Nota: Informazioni dettagliate circa la messa a punto sperimentale possono essere trovati nel manoscritto originale5.- Mettere una goccia di acqua distillata in cima la lente dell'obiettivo del microscopio.
- Posizionare la camera di imaging con il campione sul palco traduzione del microscopio e regolare la sua posizione, in modo che il campione si allinea con la lente dell'obiettivo.
- Regolare la posizione assiale delle lenti obiettivo e condensatore facendo fuoco e superficie, rispettivamente, nella scheda "Taratura" della prospettiva "Microscopio" del software di imaging.
- Allineare le lenti obiettive e condensatore cliccando la Modalità Auto. In alternativa, utilizzare la Modalità di scansione e regolare manualmente le lenti in modo che i modelli di illuminazione sono localizzati alla regione centrale del campo di vista.
- Tornare alla Modalità normale e regolare la fase di traduzione per individuare una cella nel campo-di-vista.
- Trovare il piano focale regolando la posizione assiale della lente dell'obiettivo. Perfetta messa a fuoco rende quasi invisibile il confine di esempio visualizzato nella schermata.
- Regolare la fase di traduzione per trovare una posizione senza una cella.
- Fare clic su Calibra per misurare più ologrammi 2D con diversi angoli di illuminazione.
- Regolare la fase di traduzione per individuare una cella al centro del campo di vista.
- Passare alla scheda "Acquisizione" e fare clic su Snapshot 3D per misurare gli ologrammi della cella con gli angoli di illuminazione identiche come fatto nel passaggio 3.4.8.
- Quando i dati acquisiti sono presentati sul pannello "Gestione dati", fare clic destro sui dati acquisiti e fare clic su processo per ricostruire un tomogramma RI 3D da ologrammi misurata in passi 3.4.8 e 3.4.10, utilizzando l'algoritmo di tomografia di diffrazione 9 , 10 implementato in software di imaging.
- Ripetere i passaggi 3.4.5-3.4.11 per misurare più di 100 cellule per garantire potenza statistica per apprendimento automatico.
- Tutte le immagini che vengono processate attraverso il passo 3.4.11. possono essere visualizzati. Il riquadro "Gestione dati", pulsante destro del mouse i dati e fare clic su Apri per visualizzare i dati. Fare clic su RI tomogramma sul pannello "gestione dati". Nella scheda "Preset", fare clic su carica e fare doppio clic su "lymphocyte.xml", che è una funzione di trasferimento predefinito fornita dal software di imaging per visualizzare il tomogramma secondo le distribuzioni RI 3D.
- Ripetere i passaggi da 3.2-3.4 su misura 3D RI tomogrammi di tutti i sottotipi del linfocita.
4. quantitativi morfologici e biochimici Feature Extraction da 3D RI tomogrammi
- Inserire tutti i dati tomografici misurati di sopra in una singola cartella. Dividere i tipi di cellule presenti nelle sottocartelle della cartella. Preparare ogni tomogramma è un file singolo . Mat .
- Aprire File supplementari 1 - Feature Extraction (scritto per una software di elaborazione di immagini).
- Modificare la riga 14 per designare la cartella tomogramma preparata al punto 4.1.
- Modificare la linea 15 per designare una cartella per salvare i dati estratti caratteristica.
- Facoltativamente, modificare linea 17 per regolare i parametri di soglia RI per funzione di estrazione. L'opzione predefinita è 20 soglie RI da 1.340-1.378, con un incremento pari a 0,002 come descritto in precedenza5.
- Eseguire il codice. Per ogni tomogramma nel set di dati, il codice calcola cinque caratteristiche: superficie di zona (SA), volume cellulare (CV), sfericità (SI), densità di proteina (PD) e massa secca (DM), soglia di RI. Gli algoritmi di dettagliate per estrazione di feature sono descritti altrove5.
- Al fine di monitorare la funzione di estrazione, durante l'esecuzione verifica sullo schermo visualizzazione segmentazione basata su soglia cella RI.
- Controllare i dati estratti caratteristica, come il file . Mat a tomogramma, salvato nella cartella indicata al punto 4.4.
5. sotto la supervisione apprendimento e identificazione
- In modo casuale dividere i dati di funzionalità ottenuti in set passo 4.8 per formazione (70%) e test (30%) con cartelle separate.
- Open File supplementari 2 - treno (scritto per una software di elaborazione di immagini).
- Modificare la riga 14 per designare l'insieme di formazione preparata al punto 5.1.
- Modificare la riga 16 per designare una cartella per salvare il classificatore addestrato.
- Modificare la linea 17 per impostare un nome di file per il classificatore.
- Facoltativamente, modificare la linea 19 per selezionare le funzioni per l'allenamento. L'opzione predefinita, come specificato in precedenza5, utilizzato per ottenere i risultati rappresentativi di seguito.
- Eseguire il codice. Utilizzando le funzionalità selezionate di set di training, il codice addestra un classificatore con il k-più vicina neighbors (k -NN; k = 4) e quindi Salva il classificatore (come denominato nel passaggio 5.5) nella cartella indicata al punto 5.4.
- Verificare sullo schermo visualizzando le prestazioni del classificatore e la precisione di cross-validazione.
- Facoltativamente, i treni più classificatori con combinazioni di diverse funzionalità ripetendo i passaggi 5.5-5.7. Scegli il classificatore con la massima precisione di cross-validazione.
- Aprire File supplementari 3 - Test (scritto per una software di elaborazione di immagini).
- Modificare le righe 14-15 per designare il classificatore addestrato per essere testato.
- Modificare la riga 17 per designare l'insieme di test preparata al punto 5.1.
- Eseguire il codice. Il classificatore descritto sopra identifica i tipi di cellule dei linfociti individuali nel set di test.
- Verificare sullo schermo visualizzando le prestazioni di identificazione e l'esattezza della prova.
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Representative Results
Figura 1 Mostra il processo schematico dell'intero protocollo. Utilizzando la procedura qui presentata, abbiamo isolato B (n = 149), CD4 + T (n = 95) e T CD8 + (n = 112) linfociti. Per ottenere informazioni di fase e ampiezza a vari angoli di illuminazione, sono stati misurati più ologrammi 2D di ogni linfocita modificando l'angolo di illuminazione (da-60 ° a 60 °). In genere, 50 ologrammi possono essere utilizzati per ricostruire un tomogramma RI 3D, ma il numero degli ologrammi 2D può essere registrato considerando la velocità e la qualità di imaging. Informazioni di ampiezza e fase di ologrammi misurati vengono recuperati utilizzando un algoritmo di recupero campo basato sulla trasformata di Fourier transform43,44. Il tomogramma RI 3D di ogni linfocita è stato ricostruito da 2D Estratto fase e ampiezza informazioni multiple a vari angoli di illuminazione mediante diffrazione ottica tomografia algoritmo. Dettagli del processo di immagine e 3D metodo di ricostruzione del tomogramma RI possono essere trovati altrove21,45.
Figura 2 A-2_C Mostra rappresentativi tomogrammi RI rendering 3D dei linfociti B, T CD4 + e CD8 + T allocando combinazioni di colori diversi in base ai valori di RI tramite il software di imaging. Dai valori RI, quantitativi morfologiche (SA, CV e SI) e caratteristiche biochimiche (PD e DM) sono state calcolate (Figura 2A-2_C). Questo risultato dimostra chiaramente che il 3D RI distribuzione permette analisi quantitativa di informazioni morfologiche nonché biochimiche dei linfociti.
Apprendimento automatico di supervisione è stata sfruttata per identificare i tipi del linfocita a livello di singola cellula. I misurato tomogrammi RI 3D sono stati casualmente suddivisi in 70% e 30% di prova (b: 45, t: 29 di CD4 + e CD8 + t: 35) e di addestramento (b: 104, t: 66 di CD4 + e CD8 + t: 77) set di dati, rispettivamente. Abbiamo ottimizzato i classificatori per sfruttare al massimo le impronte di cellula-tipo-specifico codificate nello spazio caratteristica. La totale accuratezza, sensibilità (vero positivo) e la specificità (vero negativo) sono stati calcolati confrontando il classificatore-predetto risultati e tipi di cellule di terra-verità.
Al fine di dimostrare il proof-of-concept del protocollo proposto, abbiamo effettuato apprendimento supervisionato macchina su tre diversi casi: classificazione binaria di linfociti di T e B (i) e (ii) due sottotipi di linfociti T (CD4 + e CD8 +) e (iii) multiclass classificazione di tutti i tipi di linfociti.
Figura 3 Mostra le prestazioni di identificazione di classificatori ottimizzate per le fasi di prova e di addestramento. L'accuratezza della classificazione T e dei linfociti B era 93.15% e 89,81% per la formazione e il test case, rispettivamente. I linfociti T CD4 + e CD8 + statisticamente sono stati classificati, e la precisione era 87.41% e 84.38% per la formazione e il set di prova, rispettivamente. Infine, la precisione del classificatore tipo multiclass cella era 80,65% e % 75,93 per le fasi di prova e di addestramento, rispettivamente.
Figura 1 : Diagrammi schematici dell'identificazione dei tipi di linfocita sfruttando privo di etichetta 3 D fase quantitativa imaging e apprendimento automatico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Rappresentante 3 D ha reso tomogrammi RI di ogni tipo di cellula del linfocita con caratteristiche morfologiche e biochimiche quantitative. (A) delle cellule di B, (B) CD4 + T cell e (C) CD8 + T cell. Barra della scala = 2 µm. SA, superficie; CV, volume cellulare; SI, sfericità; PD, densità di proteine; DM, massa secca. Questa figura è modificata con autorizzazione5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Identificazione del linfocita singolo tipi tramite apprendimento supervisionato automatico (A) binario classificazione delle cellule B e T, (B) binario classificazione delle cellule T CD4 + e CD8 + e (C) multiclass classificazione di tutti i tre tipi di cellule del linfocita; per i set di prova e di addestramento. Notare la piccola differenza tra la formazione e il test case, suggerendo bella generalizzazione dei classificatori stabiliti. I numeri sotto i nomi di ogni tipo di cellula indicano il numero di celle utilizzate. Questa figura è modificata con autorizzazione5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare File 1: riportano estrazione codice. Estrazione di caratteristiche (SA, CV, SI, PD e DM) dopo RI soglia-segmentazione basata su regioni di ogni tomogramma. Implementato in una software di elaborazione di immagini. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Complementare File 2: codice formazione. Addestramento di un k -NN classificatore addestramento basato su funzionalità selezionate. Implementato in una software di elaborazione di immagini. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Complementare File 3: test del codice. Un classificatore di addestrato k- NN per un nuovo set di dati di test (cioè., set per il test). Implementato in una software di elaborazione di immagini. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Vi presentiamo un protocollo che consente l'identificazione privo di etichetta dei tipi di linfocita sfruttando la fase quantitativa 3D imaging e apprendimento automatico. Fasi critiche del presente protocollo sono fase quantitativa imaging e funzionalità di selezione. Per l'imaging olografico ottima, la densità delle cellule dovrebbe essere controllata come descritto sopra. Stabilità meccanica delle cellule è anche importante per ottenere una precisa distribuzione RI 3D perché movimenti cellulari galleggianti o vibrazionali disturberà misure ologramma su modifiche di angolo di illuminazione. Abbiamo, quindi aspettato alcuni minuti fino a quando il campione è diventato stabile e statico nella camera di formazione immagine prima della misurazione ologrammi. Infine, le bolle all'interno della camera di formazione immagine sono problematiche quando si misurano gli ologrammi a causa delle differenze di RI fra aria ed il campione; così, il campione deve essere caricato con attenzione alla camera di imaging.
Funzione di estrazione e selezione consentono di determinare le prestazioni di identificazione del classificatore. Abbiamo calcolato 5 quantitative morfologiche (CV, SA, SI) e biochimici (PD, DM) caratteristiche da distribuzione RI 3D 20 valori di soglia RI diversi; così, abbiamo estratto un totale di 100 funzioni. Abbiamo perquisito esaustivamente combinazioni ottimali di funzionalità e classificatore, che mostrano che è stata selezionata la migliore precisione di cross-validazione. Abbiamo testato 6 algoritmi di apprendimento macchina diversa, tra cui k -NN (k = 4 e k = 6), discriminazione lineare analisi, analisi di discriminazione quadratica, naïve Bayes e albero di decisione e abbiamo trovato quel k -NN (k = 4 ) ha mostrato le migliori prestazioni di identificazione. Tuttavia, c'è una possibilità per migliorare l'accuratezza di identificazione utilizzando altre metodi, compreso la macchina di vettore di sostegno e reti neuronali di apprendimento della macchina.
Questo protocollo misure intrinseche proprietà ottiche tramite imaging 3D fase quantitativa al fine di identificare i tipi di linfociti; Pertanto, non richiede un processo di etichettatura basato sulle reazioni antigene-anticorpo utilizzate in fluorescenza o magnetici perlina tecniche basate sulla ordinamento delle cellule, che hanno rischi di alterare la funzione cellulare modificando la struttura delle proteine di membrana. Inoltre, il presente metodo misura 3D RI distribuzione e fornisce informazioni morfologiche e biochimiche 3D circa la cella, che non può essere ottenuta da un colpo singolo olografia metodo46; di conseguenza, le prestazioni di identificazione del protocollo sono più accurate informazioni alto-dimensionali.
Una limitazione minore del presente protocollo è la regolazione manuale della fase del campione e richiesto il processo di apprendimento supervisionato macchina di etichettatura. Abbiamo cercato un linfocita regolando la fase manuale di traslazionale e ologrammi misurati, che sono i passaggi che richiede più tempo. Questa limitazione sarà migliorata impiegando un tavolino motorizzato automatico o dispositivi microfluidici canale. Per quanto riguarda l'apprendimento supervisionato, i tipi noti dei linfociti sono necessari per stabilire il classificatore ottimo; così, abbiamo avuto al primo isolato e identificare i tipi di cellule del linfocita basati sulla tecnica di ordinamento basati su antigene-anticorpo. Tuttavia, questo protocollo utilizza ancora il contrasto ottico intrinseco dei linfociti, e gli agenti d'etichettatura utilizzati per specificare gli anticorpi hanno effetti trascurabili sul segnale misurato 3D RI. Pertanto, il classificatore stabilito può essere utilizzato per l'identificazione dei linfociti in un modo privo di etichetta.
Anche se questo protocollo utilizza principalmente fenotipi dei linfociti misurando 3D RI tomogrammi delle singole celle, questi dati RI 3D possono essere anche usati in combinazione con altre modalità di indirizzamento genotipi o informazioni di proteomica per la migliore classificazione di sottotipi. Recentemente, tecniche di microscopia correlativa combinando fluorescenza e QPI sono stati introdotti47,48,49. L'approccio presentato in questo protocollo può estendersi anche a questi metodi di imaging correlativi.
Privo di etichetta di identificazione dei tipi dei linfociti può essere applicato per studiare la fisiopatologia o diagnosi di malattia rilevando i linfociti anormali o rapporti tra tipi del linfocita. Inoltre, questo protocollo può essere applicato all'analisi di sangue intero mediante l'identificazione di varie cellule compreso i globuli rossi, piastrine e globuli bianchi.
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Disclosures
Prof. ssa Y. Park, Y. Jo, Y. S. Kim e S. Lee avere interessi finanziari in Tomocube, Inc., un'azienda che commercializza diffrazione ottica tomografia e fase quantitativa strumenti di imaging ed è uno degli sponsor del lavoro.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da KAIST BK21 + programma, Tomocube, Inc e National Foundation Research of Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo riconosce sostegno dal KAIST Presidential Fellowship e Asan Foundation Scholarship scienza biomedica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse | Daehan Biolink | C57BL/6J mice | gender and age-matched, 6 – 8 weeks |
| Falcon conical centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | 15 mL |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | 806544-500ML | |
| Ammonium-chloride-potassium lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10438018 | |
| Antibody | BD Biosciences | 553140 (RRID:AB_394655) | CD16/32 (clone 2.4G2) |
| Antibody | BD Biosciences | 555275 (RRID:AB_395699) | CD3ε (clone 17A2) |
| Antibody | Biolegnd | 100734 (RRID:AB_2075238) | CD8α (clone 53-6.7) |
| Antibody | BD Biosciences | 557655 (RRID:AB_396770) | CD19 (clone 1D3) |
| Antibody | BD Biosciences | 557683 (RRID:AB_396793) | CD45R/B220 (clone RA3-6B2) |
| Antibody | BD Biosciences | 552878 (RRID:AB_394507) | NK1.1 (clone PK136) |
| Antibody | eBioscience | 11-0041-85 (RRID:AB_464893) | CD4 (clone GK1.5) |
| DAPI | Roche | 10236276001 | 4,6-diamidino-2-phenylindole |
| Flow cytometry | BD Biosciences | Aria II or III | |
| Imaging chamber | Tomocube, Inc. | TomoDish | |
| Holotomography | Tomocube, Inc. | HT-1H | |
| Holotomography imaging software | Tomocube, Inc. | TomoStudio | |
| Image professing software | MathWorks | Matlab R2017b |
References
- Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503 (2000).
- Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14 (2010).
- Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (16), 6776-6781 (2007).
- Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105 (7), 2828-2835 (2005).
- Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
- Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. , McGraw Hill Professional. (2011).
- Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
- Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. , 106328 (2017).
- Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2 (2), (2016).
- Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1 (4), 153-156 (1969).
- Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046009 (2014).
- Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8 (3), 256 (2014).
- Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4 (4), 460-463 (2017).
- Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
- Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
- Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
- Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
- Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
- Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
- Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6 (6), 20869 (2011).
- Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3865-3875 (2015).
- Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
- Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. , (2017).
- Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson's disease. Cytometry Part A. 91 (5), 510-518 (2017).
- Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
- Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8 (1), 210 (2017).
- Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
- Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. , (2016).
- Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (9), 7908-7917 (2017).
- Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
- Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. , arXiv:1806.03982 (2018).
- Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13 (12), 4492-4506 (2005).
- Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23 (12), 15792-15805 (2015).
- Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
- Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3 (8), 1700606 (2017).
- Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91 (9), 893-900 (2017).
- Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91 (5), 482-493 (2017).
- Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. , (2017).
- Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72 (1), 156-160 (1982).
- Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36 (23), 4677-4679 (2011).
- Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011005 (2013).
- Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15 (4), 1123-1132 (2015).
- Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8 (12), 5688-5697 (2017).
- Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. , arXiv:1801.00854 (2018).
- Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (5), 2496-2518 (2017).
