Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Label-gratis identifikation af lymfocyt undertyper ved hjælp af tre-dimensionelle kvantitative fase Imaging og Machine Learning

doi: 10.3791/58305 Published: November 19, 2018

Summary

Vi beskriver en protokol for etiket-fri identifikation af lymfocyt undertyper ved hjælp af kvantitative fase billeddiagnostik og en maskine læring algoritme. Målinger af 3D brydningsindeks Tomogrammer af lymfocytter præsenterer 3D morfologiske og biokemiske oplysninger for individuelle celler, som er derefter analyseret med en maskine-læring algoritme for identifikation af celletyper.

Abstract

Vi beskriver her en protokol for etiket-fri identifikation af lymfocyt undertyper ved hjælp af kvantitative fase imaging og machine learning. Identifikation af lymfocyt undertyper er vigtige for studiet af immunologi samt diagnose og behandling af forskellige sygdomme. I øjeblikket, stole ensartede metoder til klassificering af lymfocyt typer på mærkning specifikke Membranproteiner via antigen-antistof reaktioner. Men disse mærkning teknikker medfører de potentielle risici ved at ændre cellulære funktioner. Protokollen beskrevet her overvinder disse udfordringer ved at udnytte iboende optisk kontraster målt ved 3D kvantitative fase billeddiagnostik og en maskine læring algoritme. Måling af 3D brydningsindeks (RI) Tomogrammer af lymfocytter giver kvantitative oplysninger om 3D morfologi og fænotyper af individuelle celler. De biofysiske parametre udvundet fra den målte 3D RI Tomogrammer analyseres derefter kvantitativt med en maskine læring algoritme, aktivering af label-fri identifikation af lymfocyt typer på en enkelt celle niveau. Vi måler den 3D RI Tomogrammer af B, CD4 + T og CD8 + T-lymfocytter og identificeret deres celletyper med over 80% nøjagtighed. I denne protokol beskriver vi detaljerede trin til lymfocyt isolation, 3D kvantitative fase imaging og machine learning til at identificere lymfocyt typer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lymfocytter kan inddeles i forskellige undertyper herunder B, helper (CD4 +) T cytotoksisk (CD8 +) T og regulerende T celler. Hver lymfocyt har en anden rolle i det adaptive immunsystem; for eksempel, producerer B-lymfocytter antistoffer, der henviser til, at T-lymfocytter opdage specifikke antigener, fjerne unormale celler og regulere B-lymfocytter. Lymfocyt funktion og regulering er stramt kontrolleret af og relateret til forskellige sygdomme herunder kræft1, autoimmune sygdomme2og virusinfektioner3. Identifikation af lymfocyt typer er således vigtigt at forstå deres patofysiologiske roller i sådanne sygdomme og for immunterapi i klinikker.

I øjeblikket, afhængige metoder til klassificering af lymfocyt typer antigen-antistof reaktioner ved at målrette specifikke overflade Membranproteiner eller celleoverflademarkører4. Målretning celleoverflademarkører er en præcis og nøjagtig metode til at bestemme lymfocyt typer. Det kræver dog dyrt reagenser og tidskrævende procedurer. Desuden, det bærer risikoen for ændring af membran proteinstrukturer og ændring af cellulære funktioner.

For at overvinde disse udfordringer, introducerer protokollen beskrevet her den etiket-fri identifikation af lymfocyt typer ved hjælp af 3D kvantitative fase imaging (QPI) og machine learning5. Denne metode gør det muligt for klassifikation af lymfocyt på en enkelt celle niveau baseret på morfologiske oplysninger fra etiket-gratis 3D billeddannelse af enkelte lymfocytter. I modsætning til konventionelle Fluorescens mikroskopi-teknikker udnytter QPI brydningsindeks (RI) distributioner (iboende optiske egenskaber af levende celler og væv) som optisk kontrast6,7. RI Tomogrammer af individuelle lymfocytter repræsenterer fænotypiske oplysninger specifikt for undertyper af lymfocytter. I dette tilfælde for at systemisk udnytte 3D RI Tomogrammer af individuelle lymfocytter, blev en overvåget maskinen læring algoritme udnyttet.

Bruger forskellige QPI teknikker, de 3D RI Tomogrammer af celler er blevet aktivt brugt til studie af celle Patofysiologi fordi de giver en etiket-fri, kvantitative imaging kapacitet8,9,10, 11,12,13. Også, de 3D RI distributioner af individuelle celler kan give morfologiske, biokemiske og Biomekanisk information om celler. 3D RI Tomogrammer tidligere har udnyttet inden for hæmatologi14,15,16,17, infektionssygdomme18,19, 20, immunologi21, celle biologi22,23, betændelse24, kræft25, neurovidenskab26,27, udviklingsmæssige biologi28, toksikologi 29og Mikrobiologi12,30,31,32.

Selv om 3D RI Tomogrammer give detaljerede oplysninger om morfologiske og biokemiske af celler, er klassificering af lymfocyt undertyper vanskeligt at opnå ved simpelthen imaging 3D RI Tomogrammer5. Systematisk og kvantitativt udnytte den målte 3D RI Tomogrammer for celle type klassificering, udnyttet vi en maskine læring algoritme. For nylig, flere værker er blevet rapporteret i hvilke kvantitative fase billeder af celler blev analyseret med forskellige machine learning algoritmer33, herunder påvisning af mikroorganismer34, klassificering af bakteriel slægten35 , 36, hurtig og etiket-fri påvisning af miltbrand sporer37, automatiseret analyse af sædceller38, analyse af kræft celler39,40, og påvisning af makrofag aktivering41.

Denne protokol giver detaljerede trin for at udføre etiket-fri identifikation af lymfocyt typer på den enkelte celle niveau ved hjælp af 3D QPI og machine learning. Dette omfatter: 1) lymfocyt isolation fra mus blod, 2) lymfocyt sortering via flow flowcytometri, 3) 3D QPI, 4) kvantitative funktion udvinding fra 3D RI Tomogrammer og 5) overvåget læring til at identificere lymfocyt typer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dyrs pleje og eksperimentelle procedurer blev udført under godkendelse af institutionelle dyrs pleje og brug Udvalget af KAIST (KA2010-21, KA2014-01 og KA2015-03). Alle eksperimenter i denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer.

1. lymfocytter Isolation fra mus blod

  1. Når en C57BL/6J mus er euthanized via CO2 indånding, indsætte en 26 G kanyle ind i musen hjertet og indsamle 0,3 mL blod. Direkte sætte blod ind i et rør med 100 U/mL heparin opløsning fortyndes med 1 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
    Bemærk: Alternativt lymfocytter fra milten kan være isoleret.
  2. Centrifugeres rør ved 400 x g i 5 min. ved 4 ° C.
  3. Tilsæt 0,5 mL af ammonium-chlorid-kalium lysing buffer til røret og forsigtigt vendes det et par gange for at blande opløsningen.
  4. Inkuber rør ved stuetemperatur (RT) i 5 min.
  5. Cellerne vaskes ved at tilføje 4,5 mL PBS og centrifugering ved 400 x g i 5 min. ved 4 ° C, to gange.
  6. Fjern supernatanten og celle resuspenderes i 100 µL af friske RPMI-1640 medium med 10% føtal bovint serum (FBS).
  7. Tilføje 0,1 µg CD16/32 (2.4G2) antistof til røret for at blokere.
  8. Hold røret på is.

2. flyde flowcytometri og sortering af lymfocyt undertyper

Bemærk: Sortering lymfocytter afhængigt af celletype er afgørende for oprettelse af cellen jorden-sandhed (dvs. korrekt) Skriv etiketter til at træne og teste en celle type klassificering i overvåget læring. Flowcytometri, en guld-standard metode, der bruges til at identificere og adskille lymfocytter42.

  1. Gøre en blanding af overflade markør farvning antistoffer i 100 µL af friske RPMI-1640 medium [med 10% FBS, 0,1 µg for CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D 3), CD45R (B220, RA3-6B2) og NK1.1 (PK136)] og 0,25 µg CD4 (GK1.5) antistoffer mod mål B, CD4 + T og CD8 + T lymfocytter.
  2. Tilføj 100 µL antistof blandingen til cellesuspension (fremstillet i trin 1,8).
  3. Inkuber i 25 min på is.
  4. Cellerne vaskes ved at tilføje 5 mL PBS og centrifugering ved 400 x g i 5 min. ved 4 ° C, to gange.
  5. Resuspenderes celle i 5 mL frisk RPMI-1640 medium med 10% FBS og 2,5 µg for DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole).
  6. Indsamle hver lymfocyt type separat med flowcytometri ved hjælp af fluorescens niveauer af mærkerne beskrevet ovenfor. Samtidig udelukke døde celler ved hjælp af DAPI signaler.
    Bemærk: Detaljerede protokoller vedrørende flow flowcytometri-baserede celle sortering er blevet beskrevet tidligere42.

3. 3D kvantitative fase Imaging

  1. Holde de sorterede lymfocytter på is i hele de billeddiagnostiske procedurer, der skal være gennemført inden for 5 h (siden lymfocyt isolation fra mus) for at undgå celleskader og biokemiske ændringer.
  2. Vælg en sorteret celletype (blandt B, CD4 + T og CD8 + T-lymfocytter) og fortyndes prøven (fremstillet i trin 2.6) 180 celler/mikroliter med RPMI medium for optimal tænkelig tilstand (dvs. én celle pr. enkelt synsfelt).
  3. Indlæse 120 μl af de fortyndede prøve i en billeddannelse kammer ved langsom injektion. Grundigt tjek på tilstedeværelsen af bobler i den billeddiagnostiske afdeling med prøven. Hvis der er bobler, forsigtigt fjerne dem, som de vil forringe kvaliteten af målingerne.
  4. Erhverve 3D RI Tomogrammer ved hjælp af en kommerciel 3D kvantitative fase mikroskop, eller holotomography og dens billedbehandlingsprogrammer.
    Bemærk: Detaljerede oplysninger om opsætningen af eksperimenterende kan findes i det oprindelige manuskript5.
    1. Anbring en dråbe destilleret vand oven på objektive linse af mikroskopet.
    2. Placer den billeddiagnostiske afdeling med prøven på stadiet oversættelse af mikroskopet og justere dets placering, så prøven flugter med den objektive linse.
    3. Justere mål og kondensatoren linser aksial holdninger ved at klikke på fokus og overflade, henholdsvis, under fanen "Kalibrering" i "Mikroskop" perspektiv af imaging-software.
    4. Juster mål og kondensatoren linserne ved at klikke på Auto-Mode. Alternativt, bruger Scanning Mode og manuelt justere linser, så belysningsstyrke mønstre er lokaliseret på den centrale region af field-of-view.
    5. Vende tilbage til Normaltilstand og justere oversættelse scenen for at finde en celle i field-of-view.
    6. Find brændplanet ved at justere mål linse aksial position. Perfekt fokus gør prøve grænsen visualiseret i skærmen næsten usynlige.
    7. Justere oversættelse scenen for at finde en placering uden en celle.
    8. Klik på Kalibrer for at måle flere 2D hologrammer med varierende belysning vinkler.
    9. Justere oversættelse scenen for at finde en celle i midten af field-of-view.
    10. Gå til fanen "Tilegnelse" og klik på 3D Snapshot for at måle hologrammer af celle med identiske belysning vinkler som gjort i trin 3.4.8.
    11. Når de indsamlede data præsenteres på panelet "Data Management", Højreklik på de indsamlede data, og klik på proces for at rekonstruere en 3D RI tomogram fra hologrammer målt i trin 3.4.8 og 3.4.10, ved hjælp af diffraktion tomografi algoritme 9 , 10 implementeret i den billedbehandlingsprogrammer.
    12. Gentag trin 3.4.5-3.4.11 for at måle mere end 100 celler for at sikre statistiske strøm til maskinen læring.
    13. Alle billeder, der behandles via trin 3.4.11. kan visualiseres. Højreklik dataene på panelet "Data Management" og klik på Åbn for at visualisere dataene. Klik på RI Tomogram på panelet "Data Manager". Under fanen "Preset", klik på Indlæs og dobbeltklik på "lymphocyte.xml", som er en foruddefineret overførselsfunktionen leveres af billedbehandlingsprogrammer at visualisere tomogram ifølge de 3D RI distributioner.
  5. Gentag trin 3.2-3.4 til at måle 3D RI Tomogrammer af alle lymfocyt undertyper.

4. kvantitative morfologiske og biokemiske funktion udvinding fra 3D RI Tomogrammer

  1. Placere alle tomografisk data målt over i en enkelt mappe. Split celletyper i undermapperne i denne mappe. Forbered hvert tomogram skal være en enkelt .mat fil.
  2. Åbn supplerende fil 1 - funktion udvinding (skrevet for en billedbehandling software).
  3. Rediger linje 14 at udpege mappen tomogram udarbejdet i trin 4.1.
  4. Rediger linje 15 til at udpege en mappe til at gemme de udpakkede funktion data.
  5. Valgfrit, redigere linje 17 til at justere parametrene RI tærskel for funktionen udvinding. Standardindstillingen er 20 RI tærskler fra 1.340-1.378, med en forøgelse af 0,002 som tidligere beskrevet5.
  6. Udføre koden. For hver tomogram i datasættet, koden beregner fem funktioner: overflade område (SA), cellulære volumen (CV), kugleform (SI), protein tæthed (PD) og tør masse (DM), per RI tærskel. De detaljerede algoritmer for funktionen udvinding er beskrevet andetsteds5.
  7. For at overvåge funktionen udvinding, under udførelsen check på skærmbilledet visualisere RI tærskel-baserede celle segmentering.
  8. Tjek på de udpakkede funktion data, som .mat fil pr. tomogram, gemmes i mappe udpeget i trin 4.4.

5. overvåget læring og identifikation

  1. Tilfældigt delt funktion oplysninger indhentet i trin 4.8 til uddannelse (70%) og test (30%) sæt med separate mapper.
  2. Åben supplerende fil 2 - toget (skrevet for en billedbehandling software).
  3. Rediger linje 14 til at udpege den uddannelse sæt forberedt i trin 5.1.
  4. Rediger linje 16 at udpege en mappe til at gemme uddannet klassificeringen.
  5. Rediger linje 17 til at angive et filnavn for klassificeringen.
  6. Valgfrit, redigere linje 19 til at vælge funktioner for uddannelse. Standardindstillingen blev som angivet tidligere5, brugt til at opnå repræsentative resultater nedenfor.
  7. Udføre koden. Ved hjælp af de valgte funktioner af uddannelse sæt koden tog en klassificering med k-nærmeste nabo algoritme (k -NN; k = 4) og derefter gemmer klassificeringen (som nævnt i trin 5.5) i den mappe i trin 5.4.
  8. Tjek på skærmbilledet visualisere klassificeringen ydeevne og cross-validering nøjagtighed.
  9. Valgfrit, tog flere klassificeringer med kombinationer af forskellige funktion ved at gentage trin 5.5-5.7. Derefter vælge klassificeringen med den højeste cross-validering nøjagtighed.
  10. Åbn supplerende fil 3 - Test (skrevet for en billedbehandling software).
  11. Rediger linjer 14-15 at udpege uddannet klassificeringen skal testes.
  12. Rediger linje 17 til at udpege den test sæt forberedt i trin 5.1.
  13. Udføre koden. Klassificeringen beskrevet ovenfor identificerer celletyper i de enkelte lymfocytter i test sæt.
  14. Tjek på skærmbilledet visualisere identifikation performance og test nøjagtighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 1 viser skematisk processen med den hele protokol. Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her, vi isoleret B (n = 149), CD4 + T (n = 95), og CD8 + T (n = 112) lymfocytter. For at få oplysninger om hovedaktivitet og amplitude på forskellige vinkler af belysning, blev flere 2D hologrammer af hver lymfocyt målt ved at ændre vinklen af belysning (fra-60 ° til 60 °). Typisk 50 hologrammer kan bruges til at rekonstruere en 3D RI tomogram, men antallet af 2D hologrammer kan justeres overvejer imaging hastighed og kvalitet. Amplitude og fase oplysninger af de målte hologrammer hentes ved hjælp af en felt hentning algoritme baseret på Fourier transform43,44. Den 3D RI tomogram af hver lymfocyt blev rekonstrueret fra flere 2D hentet fase og amplitude oplysninger i forskellige vinkler af belysning ved hjælp af optisk diffraktion tomografi algoritme. Oplysninger om image-processen og 3D RI tomogram genopbygning metode kan findes andetsteds21,45.

Figur 2 A-2_C viser repræsentative 3D afsmeltet RI Tomogrammer af B, CD4 + T og CD8 + T-lymfocytter ved at tildele forskellige farveskemaer ifølge RI værdier via den billedbehandlingsprogrammer. Fra RI værdier, kvantitative morfologiske (SA, CV og SI) og biokemiske (PD og DM) funktioner blev beregnet (figur 2A-2_C). Dette resultat viser klart, at 3D RI distribution giver mulighed for kvantitativ analyse af morfologiske samt biokemiske oplysninger af lymfocytter.

Overvåget maskinen læring blev udnyttet til at identificere lymfocyt typer på en enkelt celle niveau. De målte 3D RI Tomogrammer blev tilfældigt delt i 70% og 30% af uddannelse (B: 104, T: 66 CD4 + og CD8 + T: 77) og test (B: 45, T: 29 CD4 + og CD8 + T: 35) datasæt, henholdsvis. Vi optimeret klassificeringer for at inddæmme udnytte celle-type-specifikke fingeraftryk kodet i funktion rum. Den samlede nøjagtighed sensitivitet (sandt positivt) og specificitet (sandt negativ) blev beregnet ved at sammenligne klassificering-forudsagt resultater og jorden-sandheden celletyper.

For at demonstrere proof-of-concept af den foreslåede protokol, vi udførte overvåget maskinen læring på tre forskellige tilfælde: binære klassificering af (i) B og T lymfocytter og (ii) to T-lymfocytter undertyper (CD4 + og CD8 +) og (iii) multiclass klassifikation af alle lymfocytter.

Figur 3 viser identifikation performance optimeret klassificeringer for træning, og test faser. Nøjagtigheden af T og B-lymfocytter klassificering var 93.15% og 89.81% for uddannelse og prøvesager, henholdsvis. CD4 + og CD8 + T-lymfocytter var statistisk klassificeret, og nøjagtigheden var 87.41% og 84,38% for uddannelse og test sæt, henholdsvis. Endelig, nøjagtigheden af multiclass celle type klassificering var 80.65% og 75.93% for træning, og test faser, henholdsvis.

Figure 1
Figur 1 : Skematiske diagrammer af label-fri identifikation af lymfocyt typer at udnytte 3 D kvantitative fase imaging og machine learning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentative 3 D afsagt RI Tomogrammer hver lymfocytter celle type med kvantitative morfologiske og biokemiske funktioner. (A) B celle, b CD4 + T-celle, og (C) CD8 + T-celle. Skalalinjen = 2 µm. SA, areal; CV, cellulære volumen; SI, kugleform; PD, protein tæthed; DM, tør masse. Dette tal er ændret med tilladelse5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Identifikation af individuelle lymfocyt typer via overvåget maskinen læring (A) binære nomenklatur for B og T-celler, b binære klassificering af CD4 + og CD8 + T celler og (C) multiclass klassificering af alle tre lymfocyt celletyper; for både træning og test sæt. Bemærk den lille forskel mellem uddannelse og prøvesager, tyder på pæn generalisering af de etablerede klassificeringer. Tallene under navnene af hver celletype angiver antallet af celler, der bruges. Dette tal er ændret med tilladelse5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary File 1
Supplerende fil 1: indslag udvinding kode. Udvinding funktioner (SA, CV, SI, PD og DM) efter RI tærskel-baserede segmentering af hver tomogram. Implementeret i et billedbehandlingsprogram. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplementary File 2
Supplerende fil 2: uddannelse kode. Uddannelse en k -NN klassificeringen træning baseret på valgte funktioner. Implementeret i et billedbehandlingsprogram. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplementary File 3
Supplerende fil 3: testning kode. Test en uddannet k- NN klassificering for et nyt datasæt (dvs., test sæt). Implementeret i et billedbehandlingsprogram. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi præsenterer en protokol, der gør det muligt for etiket-fri identifikation af lymfocyt typer at udnytte 3D kvantitative fase imaging og machine learning. Kritiske trin i denne protokol er kvantitative fase imaging og funktion udvalg. For den optimale holografisk imaging, bør tætheden af celler kontrolleres som beskrevet ovenfor. Mekanisk stabilitet af cellerne er også vigtigt at få en præcis 3D RI distribution, fordi flydende eller vibrationelle cellulære beslutningsforslag vil forstyrre hologram målinger på belysning vinkel ændringer. Vi ventede derfor flere minutter, indtil prøven blev stabil og statisk i imaging salen før måling hologrammer. Endelig er bobler inde den billeddiagnostiske afdeling problematisk når måling hologrammer på grund af RI forskelle mellem luft og prøve; således bør prøven omhyggeligt indlæses den billeddiagnostiske afdeling.

Funktionen udvinding og udvalg hjælpe med at bestemme identifikation performance af klassificeringen. Vi beregnet 5 kvantitative morfologiske (CV, SA, SI) og biokemiske (PD, DM) funktioner fra 3D RI distribution på 20 forskellige RI tærskelværdier; dermed, vi udtrak ialt 100 funktioner. Vi søgte udtømmende optimal funktion og klassificeringen kombinationer, som viser, at de bedste cross-validering nøjagtighed blev valgt. Vi har testet 6 forskellige machine learning algoritmer, herunder k -NN (k = 4 og k = 6), lineære forskelsbehandling analyse, kvadratiske forskelsbehandling analyse, naive Bayes, og beslutningstræ, og vi fandt at k -NN (k = 4 ) viste de bedste identifikation performance. Men der er en chance for at forbedre identifikationen nøjagtighed ved hjælp af andre maskine læringsmetoder, herunder støtte vektor maskine og neuronal netværk.

Denne protokol måler iboende optiske egenskaber via 3D kvantitative fase imaging for at identificere lymfocyt typer; således er kræver det ikke en mærkning proces baseret på antigen-antistof reaktioner anvendes i fluorescens eller magnetisk bead-baserede celle-sortering teknikker, som har risiko for at ændre cellefunktion ved at ændre membran proteinstrukturer. Desuden, den nuværende metode måler 3D RI distribution og indeholder 3D morfologiske og biokemiske oplysninger om den celle, der ikke kan opnås af en single-shot holografi metode46; Derfor er identifikation performance i protokollen mere præcis på grund af høj-dimensionelle oplysninger.

En mindre begrænsning i denne protokol er manuel regulering af prøven scenen og kræves mærkning proces for overvåget maskinen læring. Vi søgte en lymfocyt ved at justere den manuelle translationel fase og målte hologrammer, som er de mest tidskrævende trin. Denne begrænsning vil blive forbedret ved at ansætte et automatiseret motoriserede Stadium eller mikrofluid kanal enheder. Vedrørende overvåget læring er de kendte lymfocyt typer forpligtet til at fastslå den optimale klassificering; således, vi havde til første isolere og identificere lymfocyt celletyper baseret på de antigen-antistof-baseret sortering teknik. Ikke desto mindre, denne protokol bruger stadig den iboende optisk kontrast af lymfocytter, og de mærkning agenter bruges til at angive antistoffer har ubetydelig indvirkning på de målte 3D RI signal. Derfor kan etablerede klassificeringen bruges til at identificere lymfocytter i en etiket-fri måde.

Selv om denne protokol hovedsagelig udnytter fænotyper af lymfocytter ved at måle 3D RI Tomogrammer af individuelle celler, i disse 3D RI data kan også bruges i kombination med andre modaliteter adressering genotyper eller proteom oplysninger for bedre klassificering af undertyper. For nylig har korrelationsmaalinger mikroskopi-teknikker kombinerer fluorescens imaging og QPI været indført47,48,49. Metoden fremlægges i denne protokol kan også udvides til disse korrelationsmaalinger Billeddannende metoder.

Label-fri identifikation af lymfocyt typer kan anvendes til at studere Patofysiologi eller diagnosticere sygdommen ved at opdage unormale lymfocytter eller nøgletal blandt lymfocyt typer. Desuden kan denne protokol anvendes til fuldblod analyse ved at identificere forskellige celler herunder røde blodlegemer, blodplader og hvide blodlegemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Prof. Y. Park, Y. Jo, Y. S. Kim og S. Lee har økonomiske interesser i Tomocube, Inc., en virksomhed, der commercializes optisk diffraktion tomografi og kvantitative fase imaging instrumenter og er en af sponsorerne af arbejdet.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af KAIST BK21 + Program, Tomocube, Inc., og National Research Foundation Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo anerkender støtte fra KAIST Presidential Fellowship og Asan Foundation biomedicinsk videnskab legat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403, (6769), 503 (2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11, (1), 14 (2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105, (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7, (1), 6654 (2017).
  6. Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. McGraw Hill Professional. (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13, (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. 106328 (2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2, (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1, (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19, (4), 046009 (2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8, (3), 256 (2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4, (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6, (6), 20869 (2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6, (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson's disease. Cytometry Part A. 91, (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7, (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8, (1), 210 (2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9, (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. arXiv:1806.03982 (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13, (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23, (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3, (8), 1700606 (2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91, (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91, (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72, (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36, (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19, (1), 011005 (2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15, (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8, (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. arXiv:1801.00854 (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8, (5), 2496-2518 (2017).
Label-gratis identifikation af lymfocyt undertyper ved hjælp af tre-dimensionelle kvantitative fase Imaging og Machine Learning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).More

Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter