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Immunology and Infection

用三维定量相位成像和机器学习技术对淋巴细胞亚型进行无标签鉴定

doi: 10.3791/58305 Published: November 19, 2018

Summary

我们描述了一种使用定量相位成像和机器学习算法对淋巴细胞亚型进行无标签识别的协议。对淋巴细胞三维折射率图的测量为单个细胞提供了三维形态和生化信息, 然后用机器学习算法进行分析, 以识别细胞类型。

Abstract

我们在这里描述了一个协议的无标签识别淋巴细胞亚型使用定量相位成像和机器学习。淋巴细胞亚型的鉴定对免疫学的研究以及各种疾病的诊断和治疗都很重要。目前, 对淋巴细胞类型进行分类的标准方法依赖于通过抗原抗体反应标记特定的膜蛋白。然而, 这些标记技术具有改变细胞功能的潜在风险。通过利用三维定量相位成像和机器学习算法测量的内在光学对比来克服这些挑战。测量淋巴细胞的三维折射率 (ri) 断层扫描物提供了有关单个细胞的三维形态学和表型的定量信息。然后, 使用机器学习算法对从测量到的 3d ri 断层扫描图中提取的生物物理参数进行定量分析, 从而能够在单细胞水平上对淋巴细胞类型进行无标签识别。我们测量 b、cd4+ t 和 cd8+ t 淋巴细胞的 3d ri 断层扫描, 并以80% 以上的准确率确定它们的细胞类型。在本协议中, 我们描述了淋巴细胞分离、三维定量相位成像和机器学习的详细步骤, 以识别淋巴细胞类型。

Introduction

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淋巴细胞可分为多种亚型, 包括 b、辅助 (cd4 +) t、细胞毒性 (cd8 +) t 和调节 t 细胞。每种淋巴细胞类型在适应性免疫系统中都有不同的作用;例如, b 淋巴细胞产生抗体, 而 t 淋巴细胞检测到特定的抗原, 消除异常细胞, 并调节 b 淋巴细胞。淋巴细胞功能和调节受到各种疾病的严格控制, 并与之相关, 包括癌症1、自身免疫性疾病2和病毒感染 3。因此, 确定淋巴细胞类型对于了解其在此类疾病中的病理生理作用以及在临床上进行免疫治疗具有重要意义。

目前, 淋巴细胞类型的分类方法依靠抗原抗体反应, 靶向特定的表面膜蛋白或表面标记4。靶向表面标记是确定淋巴细胞类型的一种精确和准确的方法。但是, 它需要昂贵的试剂和耗时的程序。此外, 它还具有改变膜蛋白结构和改变细胞功能的风险。

为了克服这些挑战, 这里描述的协议介绍了使用三维定量相位成像 (qpi) 和机器学习5的淋巴细胞类型的无标签识别.这种方法可以根据从单个淋巴细胞的无标签三维成像中提取的形态信息, 在单细胞水平上对淋巴细胞类型进行分类。与传统的荧光显微镜技术不同, qpi 利用折射率 (ri) 分布 (活细胞和组织的固有光学特性) 作为光学对比度6,7。单个淋巴细胞的 ri 图是特定于淋巴细胞亚型的表型信息。在这种情况下, 为了系统地利用单个淋巴细胞的三维 ri 断层扫描, 采用了一种有监督的机器学习算法。

利用各种 qpi 技术, 细胞的三维 ri 图像已被积极用于细胞病理生理学的研究, 因为它们提供了一个无标签, 定量成像能力8,9,10, 11,12,13。此外, 单个细胞的三维 ri 分布可以提供有关细胞的形态、生化和生物力学信息。3d ri 断层扫描术以前曾被用于血液学领域 14,15,16, 17, 传染病18,19, 20、免疫学21、细胞生物学22、23、炎症24、癌症25、神经科学2627、发育生物学 28、毒理学29, 微生物学12,30,31,32

尽管 3d ri 断层扫描物提供了细胞的详细形态和生化信息, 但通过简单地成像 3d ri 图5很难实现淋巴细胞亚型的分类.为了系统、定量地利用测量到的三维 ri 图进行细胞类型分类, 我们采用了机器学习算法。最近, 有几项工作是用各种机器学习算法33分析细胞的定量相位图像, 包括微生物的检测34、细菌属的分类 35,36、炭疽孢子的快速无标签检测 37, 精子细胞自动分析 38, 癌细胞 39,40 的分析, 巨噬细胞活化41 的检测.

该协议提供了详细的步骤, 使用 3d qpi 和机器学习在单个细胞级别执行无标签的淋巴细胞类型识别。这包括: 1) 从小鼠血液中分离淋巴细胞, 2) 通过流式细胞仪进行淋巴细胞分选, 3) 3d qpi, 4) 从 3d ri 肿瘤中提取定量特征, 5) 有监督的学习, 以识别淋巴细胞类型。

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Protocol

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动物护理和实验程序是在 kaist 机构动物照料和使用委员会 (ka2010-21、kaa160001 和 ka2015-03) 的批准下进行的。本研究中的所有实验都是按照批准的准则进行的。

1. 小鼠血液淋巴细胞分离

  1. 一旦 c57bl/6j 小鼠通过吸入二氧化碳实现安乐死 , 将26-g 针插入小鼠心脏并收集0.3 毫升的血液。直接将血液放入用1毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 稀释的 100 u/ml 肝素溶液管中。
    注: 或者, 可以分离脾脏的淋巴细胞。
  2. 在4°c 条件下, 以 400 x g 离心管5分钟。
  3. 在试管中加入0.5 毫升的氯化铵-钾裂解缓冲液, 轻轻倒置几次, 混合溶液。
  4. 在室温 (rt) 下将试管孵化5分钟。
  5. 在4°c 下, 加入4.5 毫升的 pbs 和 400 x g 的离心 5分钟, 清洗细胞, 两次。
  6. 去除上清液, 在100微米的新鲜 rpmi-1640 培养基中重新悬浮细胞颗粒, 并使用10% 的胎牛血清 (fbs)。
  7. 在管中加入0.1 微克的 ccma/32 (2.4 g2) 抗体进行阻滞。
  8. 把管子放在冰上。

2. 淋巴细胞亚型的流式细胞术和分选

注: 根据细胞类型对淋巴细胞进行分类对于建立地面真相 (正确) 细胞类型标签以训练和测试在监督学习中的细胞类型分类器至关重要。流式细胞术是一种金标准方法, 用于识别和分离淋巴细胞42

  1. 在100微米的新鲜 rpmi-1640 培养基中混合表面标记染色抗体 [用 10% fbs, 0.1μg cd3e (17a2), cd8a (53-6.7)、cd19 (1d3)、cd45r (b220、ra3-6b2)、nk1.1 (pk136)] 和0.25 微克 cd4 (gk1.5) 抗体对目标 b、cd4 + t 和 cd8 + t淋巴细胞。
  2. 在细胞悬浮液中加入100μl 抗体混合物 (在步骤1.8 中获得)。
  3. 在冰上孵化25分钟。
  4. 在4°c 下, 加入5毫升的 pbs 和 400 x g 的离心 5分钟, 清洗细胞, 两次。
  5. 用10% 的 fbs 和2.5μg 的 dapi (4 ', 6-二胺-2-苯丁胺) 在新鲜的 rpmi-1640 培养基5毫升中重新注入细胞颗粒。
  6. 使用上述标记的荧光水平, 用流式细胞仪分别收集每种淋巴细胞类型。同时使用 dapi 信号排除死细胞。
    注: 以前已经描述了有关基于流式细胞检查的细胞排序的详细协议42。

3. 三维定量相位成像

  1. 在整个成像过程中, 应将分类的淋巴细胞放在冰上, 这些过程应在5小时内完成 (因为淋巴细胞与小鼠分离), 以避免细胞损伤和生化改变。
  2. 选择分类细胞类型 (b、cd4 + t 和 cd8 + t 淋巴细胞之间), 用 rpmi 培养基将样本 (在步骤2.6 中获得) 稀释到180细胞μμμl, 以获得最佳成像条件 (, 每个单一视场一个细胞)。
  3. 通过缓慢注射将稀释后的样品的120μl 加载到成像室中。用样品彻底检查成像室内是否存在气泡。如果有气泡, 请小心去除它们, 因为它们会影响测量的质量。
  4. 使用商业3d 定量相位显微镜 (或全息扫描) 及其成像软件获取 3d ri 断层扫描。
    注: 有关实验设置的详细信息可在原稿5中找到。
    1. 在显微镜的物镜上放一滴蒸馏水。
    2. 将与样品一起放置在显微镜的翻译阶段, 并调整其位置, 使样品与物镜对齐。
    3. 在成像软件的 "显微镜" 透视 "选项卡上, 分别单击" 焦点"和" 表面", 调整目标镜头和冷凝器镜头的轴向位置。
    4. 通过单击"自动模式"来对齐目标镜头和冷凝器镜头。或者, 使用扫描模式并手动调整镜头, 以便将照明模式本地化到视场的中心区域。
    5. 返回到"正常模式"并调整转换阶段, 以便在视场中定位单元格。
    6. 通过调整物镜的轴向位置来查找焦平面。完美的对焦使样品边界在屏幕上的可视化几乎是不可见的。
    7. 调整翻译阶段以查找没有单元格的位置。
    8. 单击 "校准"可测量具有不同照明角度的多个2d 全息图。
    9. 调整翻译阶段以定位视场中心的单元格。
    10. 移动到 "采集" 选项卡, 然后单击3d 快照以测量单元格的全息图, 其照明角度与步骤3.4.8 相同。
    11. 当采集的数据显示在 "数据管理" 面板上时, 右键单击采集到的数据, 然后单击"处理", 使用衍射层析成像算法, 从3.4.8 和3.4.10 的步骤测量的全息图中重建三维 ri 层析成像9,10在成像软件中实现。
    12. 重复步骤 3.4.5-3.4.11 测量100多个单元, 以确保机器学习的统计能力。
    13. 通过步骤处理的所有图像3.4.11。可以可视化。在 "数据管理" 面板上, 右键单击数据, 然后单击 "打开" 以可视化数据。单击 "数据管理器" 面板上的 ri tom图。在 "预设" 选项卡上, 单击 "加载" 并双击 "淋巴细胞. xml", 这是成像软件提供的预定义的传递函数, 用于根据 3d ri 分布可视化断层扫描图。
  5. 重复步骤 3.2-3.4 测量所有淋巴细胞亚型的三维 ri 断层扫描。

4. 三维 ri 形图中定量形态和生化特征提取

  1. 将上面测量的所有断层扫描数据放在一个文件夹中。拆分此文件夹的子文件夹中的单元格类型。准备每个断层扫描图成为一个单一的. mat 文件。
  2. 打开补充文件 1 -功能提取 (为图像处理软件编写)。
  3. 编辑第14行以指定步骤4.1 中准备的 "断层扫描图" 文件夹。
  4. 编辑第15行以指定一个文件夹以保存提取的要素数据。
  5. (可选) 编辑第17行以调整特征提取的 ri 阈值参数。默认选项为1.340-1.378个的 20个 ri 阈值, 如前面述, 增量为0.002。
  6. 执行代码。对于数据集中的每个断层扫描图, 该代码计算每个 ri 阈值的五个特征: 表面积 (sa)、细胞体积 (cv)、球度 (si)、蛋白质密度 (pd) 和干质量 (dm)。详细的特征提取算法在其他地方描述了 5
  7. 为了监控特征提取, 在执行过程中检查屏幕上可视化基于 ri 阈值的细胞分割。
  8. 检查提取的要素数据, 作为每个断层扫描图的. mat 文件, 保存在步骤4.4 中指定的文件夹中。

5. 监督学习和识别

  1. 将步骤4.8 中获得的要素数据随机拆分为训练 (70%) 和使用单独文件夹测试 (30%) 集。
  2. 打开补充文件 2 -训练 (为图像处理软件编写)。
  3. 编辑第14行以指定步骤5.1 中准备的培训集。
  4. 编辑第16行以指定一个文件夹来保存训练过的分类器。
  5. 编辑第17行以设置分类器的文件名。
  6. (可选) 编辑第19行以选择培训功能。默认选项 (如前面指定的 5) 用于获取以下具有代表性的结果。
  7. 执行代码。使用训练集的选定功能, 代码使用k最近邻居算法 (k-nn; k = 4) 训练分类器, 然后将分类器 (在步骤5.5 中命名) 保存在步骤5.4 中指定的文件夹中。
  8. 检查屏幕上显示分类器的性能和交叉验证的准确性。
  9. (可选) 通过重复步骤 5.5-5.7 训练具有不同功能组合的多个分类器。然后选择具有最高交叉验证精度的分类器。
  10. 打开补充文件 3 -测试 (为图像处理软件编写)。
  11. 编辑行14-15 以指定要测试的训练有素的分类器。
  12. 编辑第17行以指定步骤5.1 中准备的测试集。
  13. 执行代码。上面描述的分类器识别测试集中单个淋巴细胞的细胞类型。
  14. 检查屏幕上的识别性能和测试精度。

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Representative Results

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图 11显示整个协议的原理图过程。使用这里介绍的程序, 我们分离 b (n = 149)、cd4+ t (n = 95) 和 cd8 + t (n = 112) 淋巴细胞。为了在不同的光照角度获得相位和振幅信息, 通过改变光照角度 (从-60°到 60°) 测量了每个淋巴细胞的多个二维全息图。通常情况下, 50个全息图可用于重建三维 ri 断层扫描图, 但2d 全息图的数量可以根据成像速度和质量进行调整。利用基于傅里叶变换4344的现场检索算法, 检索测量全息图的振幅和相位信息。利用光学衍射层析成像算法, 利用多个二维恢复相位和振幅信息, 在不同的照明角度, 对每个淋巴细胞进行三维 ri 层析。图像处理和三维 ri 层析成像重建方法的细节可在其他地方找到21,45

图 2a-2c 显示具有代表性的三维渲染 ri x 目 b, cd4+ t 和 cd8 + t t 淋巴细胞通过通过成像软件分配不同的配色方案。从 ri 值、定量形态学 (sa、cv 和 si) 和生化 (pd 和 dm) 特征计算 (图 2a-2c)。这一结果清楚地表明, 3d ri 分布可以对淋巴细胞的形态和生化信息进行定量分析。

在单细胞水平上, 利用监督机器学习来识别淋巴细胞类型。测量的三维 ri 断层扫描分别随机分为70% 和30% 的训练 (b:104、cd4+ t:66 和 cd8 + t:77) 和测试 (b:45, cd4 + t:29 和 cd8 + t:35) 数据集。我们对分类器进行了优化, 以最大限度地利用在特征空间中编码的细胞类型特异性指纹。通过对分类器预测结果和地面真相细胞类型的比较, 计算了总精度、灵敏度 (真正阳性) 和特异性 (真阴性)。

为了证明拟议协议的概念, 我们在三种不同的情况下进行了监督机器学习: (i) b 和 t 淋巴细胞的二元分类和 (ii) 两个 t 淋巴细胞亚型 (cd4 + 和 cd8 +) 和 (iii) 多类所有淋巴细胞类型的分类。

图 13显示了优化分类器在训练和测试阶段的识别性能。训练和试验病例 t 淋巴细胞和 b 淋巴细胞分类的准确率分别为23.15% 和89.81。对 cd4 + 和 cd8 + t 淋巴细胞进行了统计分类, 训练和检测组的准确率分别为87.41% 和84.38%。最后, 在训练和测试阶段, 多类细胞类型分类器的准确率分别为80.65 和7593%。

Figure 1
图 1: 开发淋巴细胞类型无标签鉴定示意图3 个d 定量相位成像和机器学习.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 代表3 个d 呈现了每个淋巴细胞类型的 ri 图, 具有定量的形态学和生化特征.(a) b 细胞, (b) cd4 + t 细胞, 和 (c) cd8 + t 细胞。刻度杆 = 2μm. sa, 表面积;cv, 细胞体积;si, 球度;pd, 蛋白质密度;dm, 干质量。此图使用权限5进行修改。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 通过监督机器学习识别单个淋巴细胞类型(a) b 和 t 细胞的二元分类, cd4 + 和 cd8 + t 细胞的二元分类, 以及三种淋巴细胞类型的 (c) 多类分类;用于培训和测试集。请注意训练和测试用例之间的微小差异, 这表明已建立的分类器很好的泛化。每个单元格类型名称下方的数字表示所使用的单元格数。此图使用权限5进行修改。请点击这里查看此图的较大版本.

Supplementary File 1
补充文件 1: 功能提取代码.在基于 ri 阈值的每个断层扫描图分割后提取特征 (sa、cv、si、pd 和 dm)。在图像处理软件中实现。请点击此处下载此文件.

Supplementary File 2
补充文件 2: 培训代码.根据选定的功能培训k-n分类器培训。在图像处理软件中实现。请点击此处下载此文件.

Supplementary File 3
补充文件 3: 测试代码.测试新数据集 (测试集) 的训练的 k-nn 分类器。在图像处理软件中实现。请点击此处下载此文件.

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Discussion

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我们提出了一个协议, 使标签免费识别淋巴细胞类型结合3d 定量相位成像和机器学习。该协议的关键步骤是定量相位成像和特征选择。为了获得最佳的全息成像, 应按上述方式控制细胞的密度。细胞的机械稳定性对于获得精确的 3d ri 分布也很重要, 因为浮动或振动细胞运动会干扰全息图测量时, 照明角度的变化。因此, 我们等待了几分钟, 直到样品在成像室变得稳定和静态, 然后再测量全息图。最后, 由于空气和样品之间的 ri 差异, 成像室内气泡在测量全息图时存在问题;因此, 样品应小心地加载到成像室。

特征提取和选择有助于确定分类器的识别性能。我们计算了20个不同 ri 阈值下三维 ri 分布的5个定量形态 (cv, sa, si) 和生化 (pd, dm) 特征;因此, 我们提取了总共100个要素。我们对最优特征和分类器组合进行了详尽的搜索, 结果表明选择了最佳的交叉验证精度。我们测试了6种不同的机器学习算法, 包括k-nn(k = 4 和k = 6)、线性判别分析、二次判别分析、天真的 bayes 和决策树, 我们发现k-nn(k = 4)) 显示出最佳的识别性能。然而, 有机会提高识别精度使用其他机器学习方法, 包括支持向量机和神经元网络。

该协议通过三维定量相位成像测量内在光学特性, 以识别淋巴细胞类型;因此, 它不需要基于荧光或磁珠细胞分选技术中使用的抗原抗体反应的标记过程, 这就有可能通过改变膜蛋白结构来改变细胞功能。此外, 该方法还测量了三维 ri 分布, 提供了细胞的三维形态和生化信息, 单射全息法46无法获得;因此, 由于具有高维信息, 协议的识别性能更加准确。

该协议的一个小限制是手动调整样本阶段和监督机器学习所需的标签过程。我们通过调整手动平移阶段和测量全息图来搜索淋巴细胞, 这是最耗时的步骤。这一限制将通过采用自动机动级或微流体通道装置得到改善。在监督学习中, 需要已知的淋巴细胞类型来建立最佳的分类器;因此, 我们必须首先根据抗原抗体的分选技术来分离和识别淋巴细胞类型。尽管如此, 该协议仍然使用淋巴细胞的固有光学对比度, 用于指定抗体的标记剂对测量到的 3d ri 信号的影响可以忽略不计。因此, 所建立的分类器可用于识别淋巴细胞在无标签的方式。

虽然该协议主要利用表型的淋巴细胞通过测量单个细胞的三维 ri 断层扫描图, 这些 3d ri 数据也可以与其他方式结合处理基因型或蛋白质组学信息, 以更好地分类亚。近年来, 荧光成像与 qpi 相结合的相关显微技术被引入了474849。该协议中提出的方法也可以推广到这些相关的成像方法。

淋巴细胞类型的无标签鉴定可通过检测淋巴细胞类型异常或淋巴细胞之间的比率, 用于病理生理学或诊断疾病的研究。此外, 该方案可通过识别包括红血球、血小板和白细胞在内的各种细胞, 应用于全血分析。

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Disclosures

朴泰桓教授、y. jo. y. kim 和 s. lee 在 tomocube 公司拥有财务利益, 该公司将光学衍射层析成像和定量相位成像仪器商业化, 是这项工作的赞助商之一。

Acknowledgments

这项工作得到了 kaist bk21+ 计划、tomocube 公司和韩国国家研究基金会的支持 (2015ra3a2066, 2017m3c1a3013923, 2018k0003996)。y. jo 感谢 kaist 总统研究金和阿桑基金会生物医学科学奖学金的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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用三维定量相位成像和机器学习技术对淋巴细胞亚型进行无标签鉴定
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Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).More

Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).

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