Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

اختﻻق الكلي لحاء خارج الخلية المستمدة من مصفوفة المائية

Published: October 13, 2018 doi: 10.3791/58314
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Department of Bioengineering, Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington, 3Department of Medicine, Kidney Research Institute, University of Washington

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لاختلاق بها المائية المستمدة من المصفوفة خارج الخلية الكلي لحاء الاحتفاظ بتكوينها الهيكلي والبيوكيميائية المصفوفة خارج الخلية (ECM) الكلي الأصلي. ويرد وصف عملية التصنيع وتطبيقاتها. وأخيراً، تناقش منظورا بشأن استخدام هذه المائية لدعم تجديد الخلايا والأنسجة الخاصة بالكلى والهندسة الحيوية.

Abstract

المصفوفة خارج الخلية (ECM) توفر الرموز الفيزيائية والكيميائية الحيوية الهامة للحفاظ على التوازن الأنسجة. الهلاميات المائية الاصطناعية الحالية تقديم دعم قوي ميكانيكية في المختبر خلية ثقافة لكنها تفتقر إلى تكوين البروتين ويجند اللازمة للحصول على السلوك الفسيولوجية من الخلايا. هذه المخطوطة وصف أسلوب تصنيع للمائية المستمدة من إدارة المحتوى في المؤسسة قشرة الكلي مع المتانة الميكانيكية السليم وتكوين البيوكيميائية داعمة. المائية مختلق ميكانيكيا المجانسة وسولوبيليزينج قشرة الكلي البشرية ديسيلولاريزيد إدارة المحتوى في المؤسسة. المصفوفة يحافظ على نسب البروتين اللحاء المحتوى الكلي الأصلي بينما تمكن أيضا من جيليشن إلى ستيفنيسيس الميكانيكية الفسيولوجية. المائية بمثابة ركيزة عند الكلي التي يمكن الحفاظ على الخلايا المستمدة من اللحاء تحت الظروف الفسيولوجية. وعلاوة على ذلك، يمكن التلاعب بها تكوين المائية نموذج بيئة مريضة التي تمكن الدراسة المستقبلية لأمراض الكلي.

Introduction

المصفوفة خارج الخلية (ECM) توفر الرموز الفيزيائية والكيميائية الحيوية الهامة للحفاظ على التوازن الأنسجة. معقدة التركيب الجزيئي ينظم الخصائص الهيكلية والوظيفية على حد سواء من الأنسجة. تزويد الخلايا بالوعي المكاني البروتينات الهيكلية والسماح ل الالتصاق والهجرة1. يغاندس منضم تتفاعل مع مستقبلات سطح الخلية للتحكم في سلوك الخلية2. الكلي ECM يحتوي على عدد كبير جزيئات التي تكوينها وهيكلها يختلف اعتماداً على موقع التشريحية ومرحلة النمو والمرض الدولة3،4. أتصدى الطابع المعقد لإدارة المحتوى في المؤسسة أحد جوانب رئيسية في دراسة الخلايا المستمدة من الكلي في المختبر.

المحاولات السابقة لتكرار ميكرونفيرونمينتس إدارة المحتوى في المؤسسة ركزت على ديسيلولاريزينج الأنسجة كاملة لإنشاء السقالات قادرة على ريسيلولاريزيشن. وقد أجريت ديسيلولاريزيشن مع المنظفات الكيماوية مثل دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) أو المنظفات غير الأيونية، وأنه يستخدم أما الجهاز كله نضح أو الغمر والانفعالات أساليب5،6،7 ،،من89،10،11،،من1213. الحفاظ على السقالات المعروضة هنا العظة الهيكلية والبيوكيميائية الموجودة في الأنسجة الأصلية إدارة المحتوى في المؤسسة؛ وعلاوة على ذلك، قد ريسيلولاريزيشن مع الخلايا الخاصة بالجهات المانحة أهمية سريرية في جراحة14،،من1516،،من1718، 19. ومع ذلك، تفتقر إلى المرونة الهيكلية هذه السقالات وبالتالي فهي غير متوافقة مع العديد من الأجهزة الحالية المستخدمة للدراسات في المختبر . للتغلب على هذا التحديد، العديد من المجموعات قد كذلك تجهيز ECM ديسيلولاريزيد الهلاميات المائية20،،من2122،،من2324. هذه الهلاميات المائية متوافقة مع حقن صب وبيوينك والتحايل على القيود المكانية مقياس ميكرومتر التي ديسيلولاريزيد مكان السقالات في الخلايا. وعلاوة على ذلك، يتم الاحتفاظ بالتركيب الجزيئي والنسب الموجودة في المحتوى الأصلي3،25. هنا نظهر أسلوب لاختلاق المائية المستمدة من قشرة الكلي ECM (كيكم).

والغرض من هذا البروتوكول هو إنتاج المائية التي يتطابق المكروية المنطقة القشرية الكلي. أنسجة قشرة الكلي هو ديسيلولاريزيد في حل الحزب الديمقراطي الصربي 1% تحت التحريض المستمر لإزالة هذه المسألة الخلوية. الحزب الديمقراطي الصربي يستخدم عادة ديسيلولاريزي الأنسجة بسبب قدرته على إزالة المواد الخلوية المناعية6،،من79،26بسرعة. كيكم يخضع ثم التجانس الميكانيكية وليوفيليزيشن5،،من69،،من1126. سولوبيليزيشن في حمض قوي مع بيبسن النتائج في20،أسهم حل نهائي المائية27. دعم البروتينات كيكم الأصلية التي هامة للهيكلية وإشارة يتم الاحتفاظ بتوصيل3،25. يمكن أيضا أن تبلور المائية إلى داخل النظام واحدة من حيث الحجم الكلي البشرية الأصلية اللحاء28،،من2930. هذه المصفوفة يوفر بيئة فسيولوجية التي تم استخدامها للحفاظ على التتابع الخلايا الخاصة بالكلى مقارنة الهلاميات المائية من البروتينات مصفوفة أخرى. وعلاوة على ذلك، تكوين مصفوفة يمكن التلاعب بها، وعلى سبيل المثال، عن طريق إضافة الكولاجين-الأول، إلى بيئات المرض نموذج للدراسة من التليف الكلوي وغيرها31،أمراض الكلي32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم عزل الكلي البشرية بشمال غرب ليفيسينتير اتباع المبادئ التوجيهية الأخلاقية التي وضعتها "رابطة المنظمات شراء الجهاز". ويتبع هذا البروتوكول الحيوان التوجيهية ثقافة الرعاية وخلية المبينة بجامعة واشنطن.

1-إعداد الأنسجة البشرية الكلي

  1. إعداد حل ديسيلولاريزيشن
    1. تعقيم كوب مل 5000 وبار ضجة 70 × 10 مم.
    2. منزوع ميكس 1: 1000 (الوزن: حجم) دوديسيل كبريتات الصوديوم (الحزب الديمقراطي الصربي) في يعقم المياه في الكأس. اترك الحل على طبق ضجة في حوالي 200 في الدقيقة 24 ساعة أو حتى يذوب تماما الحزب الديمقراطي الصربي.
      ملاحظة: عادة، 2500 مل من محلول مخزونات النشر الاستراتيجي 1% غير كافية ديسيلولاريزي الكلي بشرية واحدة.
    3. نقل الحل إلى عامل تصفية 500 مل فراغ عقيمة وتصفيته في حاويات يمكن إغلاقها بشرط معقمة.
  2. التجهيز لانسجة الكلي
    1. المياه والصرف الصحي والاوتوكلاف زوج من الملقط، هما هيموستات المشابك، الخدمات العامة الصف مقص، اثنين من مقابض شفرة المبضع، 1000 مل كوب مغطاة برقائق الألومنيوم، وبار ضجة 36 × 9 ملم.
    2. خط غطاء زراعة الأنسجة مع أونديرباد. ضع الكأس وطبق استنبات الأنسجة معقمة (150 × 25 مم) والجهاز الكلوي كله إلى غطاء محرك السيارة. ملء الكأس مع 500 مل من محلول مخزونات النشر الاستراتيجي 1%.
      ملاحظة: وردت الكلي البشرية على الجليد من الشمال الغربي ليفيسينتير.
    3. وضع الكلي في طبق استنبات الأنسجة المعقمة (الشكل 1A). إزالة جميع بيريرينال الدهون باستخفاف حلق حول كبسولة الكلي مع مشرط (الشكل 1B).
    4. جعل شق ضحلة 8-10 سم بدون مشرط، العمق الكافي كسر فتح الكبسولة الكلوي دون إلحاق الضرر بالانسجة الكامنة وراء اللحاء، عبر نهاية متفوقة الكلي. إزالة الكبسولة الكلوي تقشير أنه بعيداً عن نسيج اللحاء مع اثنين هيموستات المشابك (الشكل 1).
    5. تقسم الكلي على طول الطائرة الاكليلية باستخدام المبضع على طول الجانب الأفقي الكلي (الشكل 1). عزل نسيج اللحاء من كلا نصفي بنحت خارج منطقة ميدلر مع مشرط (الشكل 1E) والنرد أنسجة اللحاء إلى 0.5 سم3 قطع (الشكل 1F). قم بإزالة أي سفن كبيرة مرئية.
  3. عزل مصفوفة خارج الخلية
    1. في غطاء زراعة الأنسجة، ملء كوب 1000 مل مع 500 مل من محلول مخزونات النشر الاستراتيجي 1%. وضع شريط قشرة مكعبات الأنسجة وآثاره في الكأس التي تحتوي على حل الحزب الديمقراطي الصربي. تغطية الكأس برقائق الألومنيوم يعقم ووضعه على لوحة ضجة حوالي 400 لفة في الدقيقة خارج هود زراعة الأنسجة.
    2. بعد أنسجة اللحاء على اللوحة إثارة ح 24، تحقيق الكأس غطاء زراعة الأنسجة وإضافة مصفاة خلية عقيمة 40 ميكرومتر المصنوعة من النايلون شبكة. ملء كوب مل 1000 منفصلة مع 200 مل التبييض ووضعه في هود زراعة الأنسجة.
    3. "الماصة؛" حل الحزب الديمقراطي الصربي من خلال مصفاة الخلية في كوب يحتوي على التبييض. "الماصة؛" جميع مخزونات النشر الاستراتيجي الحل حتى تبقى الأنسجة ديسيلولاريزيد ومصفاة الخلية فقط في الكأس.
      ملاحظة: مصفاة خلية ينبغي منع أي الأنسجة إزالة أثناء الشفط الحل.
    4. اترك مصفاة الخلية في الكأس والتعبئة مع 500 مل الطازجة إلى حل الحزب الديمقراطي الصربي. تغطية الكأس برقائق الألومنيوم نفسه ووضع على لوحة ضجة بنفس السرعة قبل.
    5. كرر الخطوات 1.3.1-1.3.3 كل 24 ساعة مع حل الحزب الديمقراطي الصربي الطازجة لمدة خمسة أيام.
    6. شطف ديسيلولاريزيد الأنسجة مع يعقم المياه دي كل 24 ساعة لمدة 3 أيام الكلية، عقب هذه التقنية المبينة في الخطوات 1.3.1-1.3.3.
    7. شطف الأنسجة ديسيلولاريزيد مع خلية ثقافة الصف المياه كل 24 ساعة لمجموع أيام 2، عقب هذه التقنية المبينة في الخطوات 1.3.1-1.3.3.
    8. كرر الخطوات 1.3.1-1.3.2. نقل الأنسجة ديسيلولاريزيد (يشار إلى كيكم من هذه النقطة على) في 30 مل بذاتها الأنبوبة المخروطية وملئه بخلية ثقافة الصف المياه حتى يتم غمر كل الأنسجة.

2-تلفيق الحل المخزونات المائية

  1. معالجة ميكانيكية للأنسجة ديسيلولاريزيد
    1. في غطاء زراعة الأنسجة، ميكانيكيا تجانسه كيكم داخل الأنبوبة المخروطية مع الخالطون أنسجة لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن يشابه كيكم المتجانس حلاً كامد مع لا قطعة مرئية لإدارة المحتوى في المؤسسة.
    2. غمر الأنبوبة المخروطية التي تحتوي على كيكم في النتروجين السائل حتى الغليان المحيطة بالانبوب لم يعد قائما. تخزين كيكم في ˚C-4 بين عشية وضحاها.
  2. ليوفيليزيشن أنسجة ديسيلولاريزيد المجمدة
    1. قليلاً قم بفك غطاء الأنبوبة المخروطية للسماح بتبادل الغازات ووضع الأنبوب في جهاز ليوفيليزيشن. ليوفيليزي كيكم لمدة ثلاثة أيام أو حتى أنه يشبه مسحوق أبيض ناعم. مخزن في ˚C-4.
  3. الهضم الكيميائي و solubilization هلام
    1. اﻷوتوكﻻف قنينة التﻷلؤ 20 مل وكاب وحانة ضجة 15.9 x 7.9 ملم، وزوج واحد من الملقط نصيحة الجميلة.
    2. تزن كيكم المجففة بالتبريد وحساب حجم HCl، وكتلة من بيبسن اللازمة لجعل كيكم لحل 3% (30 ملغ/مل) باستخدام المعادلات التالية، حيث mبيبسن هو كتلة بيبسن، مالأنسجة هو كتلة الأنسجة المجففة بالتبريد، و الخامسHCl هو حجم 0.01 N HCl:
      Equation 1
      Equation 2
    3. في غطاء زراعة الأنسجة، إضافة بيبسن المعدة الخنزير، 0.01 N HCl، وشريط إثارة إلى القنينة التﻷلؤ وترك الأمر على صفيحة ضجة في حوالي 500 دورة في الدقيقة حتى قد حلت جميع محيط. نقل كيكم المجففة بالتبريد إلى القنينة التﻷلؤ وترك الحل على طبق ضجة حوالي 500 لفة في الدقيقة لمدة ثلاثة أيام.

3-Hydrogel جيليشن

  1. إعداد هيدروجيل الكلي إدارة المحتوى في المؤسسة
    1. هلام المائية بخلط الحل المخزونات المائية كيكم مع هيدروكسيد الصوديوم N 1، 10 × الملحق الإعلامي (M199)، والخلية ثقافة وسائل الإعلام. الاحتفاظ بكافة الحلول على الجليد.
      ملاحظة: استخدمت تركيزات جل النهائي 7.5 ملغ/مل لثقافة الخلية. 1 مل جل كيكم كان كافياً لخلية ثقافة التجارب عرضت.
    2. تحديد حجم جل عملي كيكم المنتجة وحجم هيدروجيل كيكم الأسهم المطلوبة باستخدام المعادلة التالية، حيث الخامسالنهائي هو حجم جل إنشاء، Vكيكم الأسهم وحجم الأسهم كيكم المائية اللازمة، جكيكم الأسهم هو تركيز المائية كيكم الأسهم، و جالنهائي هو تركيز جل النهائي:
      Equation 3
    3. تحديد حجم لتحييد الكواشف اللازمة باستخدام المعادلات التالية، حيث Vهيدروكسيد الصوديوم هو حجم هيدروكسيد الصوديوم N 1، V10 X هو حجم M199 الملحق 10 X وسائط الإعلام، و الخامس1 X حجم الخلية ثقافة وسائل الإعلام:
      Equation 4
      Equation 5
      Equation 6
    4. في غطاء زراعة الأنسجة، "الماصة؛" الكواشف تحييد (هيدروكسيد الصوديوم، M199، وخلية ثقافة وسائل الإعلام) إلى عقيمة 30 مل الأنبوبة المخروطية قائمة بذاتها. مزيج الحل كاشف تحييد مع ميكروسباتولا.
    5. استخدام المحاقن معقمة 1 مل لنقل حجم الأسهم كيكم المائية المناسبة لتحييد الحل كاشف. استخدام ميكروسباتولا المزيج بلطف الحل حتى يتم الحصول على متجانسة في الألوان المائية الحل.
      ملاحظة: تجنب إدخال فقاعات الهواء عن طريق التحريك ببطء لطف.
    6. لدمج الخلايا في هيدروجيل كيكم، استقطاع 10 ميليلتر من خلية ثقافة وسائل الإعلام (V1 X) من تحييد الحل حجم الحسابات في خطوة 3.1.1.3.
      1. تعليق الخلايا إلى 10 ميليلتر من خلية ثقافة وسائل الإعلام. تحديد عدد الخلايا أن يوقف العمل باستخدام المعادلة التالية، حيث يعني #الخلايا عدد الخلايا بتعليق والخامسالنهائي هو حجم جل إنشاؤها:
        Equation 7
        ملاحظة: 300,000 خلايا/مل هو تركيز الخلايا المستخدمة في جل كيكم.
      2. "الماصة؛" 10 ميليلتر لحل تعليق خلية في جل كيكم النهائي بعد حل الأسهم كيكم مختلطاً مع تحييد الحل كاشف. يقلب الحل مع ميكروسباتولا حتى الخلايا وتوزع بالتساوي.
  2. استخدم حقنه 1 مل لملء جهاز ثقافة خلايا المطلوب مع hydrogel كيكم.
  3. السماح هلام لتعيين في ˚C 37 ح 1 قبل نقل أو طلاء الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوفر هيدروجيل كيكم مصفوفة لزراعة الخلايا الكلي مع التركيب الكيميائي مماثلة المكروية الكلي الأصلي. إلى افتعال المائية، نسيج قشرة الكلي معزولة ميكانيكيا من الجهاز كله الكلي ومكعبات (الشكل 1). ديسيلولاريزيشن مع منظفات كيميائية (الشكل 2A.1-ألف-3) تليها يشطف بالماء لإزالة جزيئات المنظفات (الشكل 2A.4-ألف-6) غلة ECM قشرة الكلي معزولة. يؤكد التقييم النسيجي نموذجي البروتينات الصفحي القاعدية مثل بروتينات الكولاجين-رابعا و laminin والهيكلية مثل الكولاجين-يتم الاحتفاظ، مع فيترونيكتين الوحيد ولاحظ الاستثناء (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، يبقى تكوين البروتين، بما في ذلك الحفاظ على إيسوفورمس، إدارة المحتوى في المؤسسة تمشيا مع القيم الملاحظة في الكلي الأصلي ECM (الشكل 3). ميكانيكيا هو تجانس ECM (الشكل 4A) والمجففة بالتبريد (الشكل 4) ثم سولوبيليزيد لإنتاج هيدروجيل كيكم النهائية (الشكل 4). المائية كيكم ظهرت معتمة مع كميات صغيرة من الأنسجة مرئية وليس لزج الكولاجين التقليدية--أنا المائية. كشفت انسيابية قياس كيكم تبلور بتركيز 15 مجم/ملليلتر من معامل معقدة (معامل مرونة ديناميكية) حوالي 800 السلطة الفلسطينية عبر النطاق الخطي من سلالة القيم، وأكبر كثيرا من الكولاجين 7.5 ملغ/مل-أنا (p = 1.602E-14). الكلي البشرية بيريتوبولار ميكروفاسكولار خلايا بطانية (هكميكس) المزروع في الكولاجين-الأول، كيكم وهلام خليط 1:1 تبين الاختلافات في النمط الظاهري، على وجه التحديد في التعبير CD31 حول سطوح الخلايا وتقاطعات (الشكل 5). هكميكس مثقف في الكولاجين--أنا عرض موحد CD31 التعبير بينما خفضت هكميكس المستزرعة في المواد الهلامية اثنين كيكم تحتوي على عرض التعبير CD31 في توزيع غير متساو. نوع المصفوفة لا يبدو تؤثر PV1 عالية ومنخفضة VWF التعبير في هكميكس.

Figure 1
رقم 1: عزل أنسجة قشرة الكلي. معالجة ميكانيكية جهاز الكلي كاملة لعزل نسيج اللحاء كمادة أساسية للمائية كيكم. يبدأ عزلة الميكانيكية مع (أ) إزالة الأنسجة الدهنية بيريرينال. يمكن أن تمزق أجزاء كبيرة من الأنسجة الدهنية بعيداً عن الكلي مع المشابك هيموستات. تبقى قطعة من الأنسجة الدهنية يمكن إزالتها عن طريق تشغيل مشرط ضد كبسولة الكلي بزاوية. (ب) كبسولة الكلي أفضل إزالة بجعل شق ضحلة على طول نهاية متفوقة الكلي و (ج) تقشير كبسولة الكلي بعيداً عن الأنسجة الكامنة مع المشابك هيموستات. (د) تتوسط الكلي على طول المحور الاكليلية يسمح لتصور منطقتي قشرة ولب. (ه) عزل نسيج اللحاء هو الأفضل القيام بنحت بها قطع أنسجة لب مع مشرط. لون المنطقة القشرية أغمق ملحوظ من المنطقة ميدلر ويمكن استخدام التفريق بين الأنسجة تشريحيا مميزة اثنين. تتضمن المعالجة النهائية لانسجة اللحاء (و) تقطيع الأنسجة إلى 0.5 سم3 قطع للمساعدة في ديسيلولاريزيشن اللاحقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: ديسيلولاريزيشن أنسجة اللحاء. توصيف المرئي والنسيجي للأنسجة ديسيلولاريزيد. (أ-1) سوبميرجينج مكعبات يسبب أنسجة اللحاء في حل الحزب الديمقراطي الصربي 1% ليسينج للخلايا وإزالة المواد الخلوية. بعد (ألف-2) ح 1 و (ألف-3) ح 24، تبدأ الأنسجة تفقد اللون، يتم إزالة هذه المسألة الخلوية التي تشير إلى. قبل (ألف-4) ح 120 هو المقشر الأنسجة ويبقى فقط إدارة المحتوى في المؤسسة. يشطف بالماء في (ألف-5) ح 24 و (ألف-6) ح 120 إظهار أية تغييرات مرئية للأنسجة. (ب) الفلورة تلطيخ الأنسجة القشرة غير المعالجة وديسيلولاريزيد يكشف عن قرب الإزالة الكاملة لهذه المسألة الخلوية والحفاظ عليها من البروتينات الهيكلية الرئيسية (الكولاجين-رابعا = Col-رابعا؛ لامينين = لام؛ فيبرونيكتين = الجبهة الوطنية؛ الهيبارين كبريتات بروتيوجليكانس = هسبج؛ وفيترونيكتين = VN). الحجم = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مطيافية الكتلة من الأنسجة ديسيلولاريزيد. تحليل أنسجة اللحاء ديسيلولاريزيد من الطيف الكتلي لتحديد تكوين بروتين ECM. يتم قياس نسب جميع كأسلحة في المئة. (أ) الهيكلية وغيرها من البروتينات المرتبطة بالصفيحة القاعدية كانت موجودة مع الكولاجين-رابعا-وأنا الأكثر شدة التي يتم تمثيلها. سلاسل (باء-1) الكولاجين-رابعا A1 و A2، في كل مكان في جميع أغشية الطابق السفلي، قد حفظت. كما تم الكشف عن سلاسل الكولاجين-رابعا A3 و A5، موجودة فقط في الأغشية الطابق السفلي من الكبيبة،. إيسوفورمس المشتركة (باء-2) لامينينس والكولاجين (باء-3)--وقد تم اكتشاف أيضا. واستنسخ هذا الرقم مع إذن12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تلفيق المائية كيكم. المعالجة الميكانيكية والكيميائية لانسجة اللحاء ديسيلولاريزيد غلة المائية كيكم عملي مع خصائص ميكانيكية كافية بعد جيليشن مع تحييد الكواشف. (A) ميكانيكيا هو تجانس أنسجة اللحاء ديسيلولاريزيد مع الخالطون أنسجة حتى تبقى لا قطعة مرئية لإدارة المحتوى في المؤسسة. (ب) مسحوق خشنة كان أسفرت عن بعد 3 أيام تحت ليوفيليزيشن. (ج) Solubilization في HCl والهضم الكيميائي مع بيبسن في قنينة التﻷلؤ أسفرت المائية كيكم عملي. المائية كانت مبهمة ولزوجته منخفضة. (د) المادية توصيف هيدروجيل كيكم عقب جيليشن مع تحييد الكواشف. وأجريت تجارب انسيابية مع نظام مواز لوحة قطرها 30 ملم. حماية حواف عينة مع الزيوت المعدنية ومنصة التحميل في 37 ˚C. المائية كيكم سمح لجل ح 1 قبل الاختبار. تم قياس خصائص الهلام لزج مطاطي مع اكتساح سلالة بين 0.01 إلى 20%. ثلاث عينات من كيكم والكولاجين-وقد اختبرت (n = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: خلية توصيف نمو. وصف الاختلافات المورفولوجية في هكميكس نمت على المصفوفات المختلفة. كانت مختلطة مع تحييد الكواشف والهلاميات المائية ˚C 37 لمدة 45 دقيقة في قوالب بولي دايمثيل سيلوكسان كسترد. هكميكس المصنفة على السطح من المواد الهلامية وأبقى في الثقافة من أجل ح 72 قبل ثابتة والملون. صور إيمونوفلوريسسينت من هكميكس المستزرعة في الكولاجين 7.5 ملغ/مل (A و D)--أنا جل؛ (ب) و (ه) 7.5 ملغ/مل كيكم هلام؛ وجل الخليط 1:1 7.5 ملغ/مل (C و F). (أ-ج): أحمر = CD31؛ أخضر = فوف؛ أزرق = النوى؛ شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (د-و): أحمر = F-أكتين؛ أخضر = PV1؛ أزرق = النوى؛ شريط المقياس = 50 ميكرومتر. واستنسخ هذا الرقم مع إذن12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مصفوفات توفير إشارات الميكانيكية والكيميائية الهامة التي تحكم سلوك الخلية. الهلاميات المائية الاصطناعية قادرة على دعم الزخرفة 3 الأبعاد المعقدة، لكنهم فشلوا في تقديم العظة خارج الخلية المتنوعة الموجودة في مصفوفة الفسيولوجية ميكرونفيرونمينتس. الهلاميات المائية المستمدة من إدارة المحتوى في المؤسسة الأصلية مواد مثالية للدراسات في الجسم الحي وفي المختبر . وقد استخدمت الدراسات السابقة الهلاميات المائية ECM ديسيلولاريزيد لمعطف الحيوية الاصطناعية لمنع المضيف الاستجابات المناعية33،34، التفريق بين الخلايا الجذعية البالغة35،،من3637 , 38، كركيزة للطباعة الحجرية في 2D ولينة خلية الثقافة39،40،،من4142، وفي إعداد بيوينكس ل الطباعة ثلاثية الأبعاد 3-43، 44 , 45 , 46-ECM الهلاميات المائية توفر الخلايا مع الإشارات الصحيحة الشروع في الالتصاق والتحكم في زيادة انتشار والتمايز2،47.

بالنسب وتكوين المكونات الرئيسية إدارة المحتوى في المؤسسة، مثل كولاجينس، لامينينس، إيلاستين، فيبرونيكتين والجليكوزامينوجليكان، تعتمد اعتماداً كبيرا على موقع التشريحية ووظيفة الأنسجة48،49، 50. ومن الثابت أن استخدام غير محددة أو أصلي الهلاميات المائية المستمدة من إدارة المحتوى في المؤسسة سيتم الحصول على ردود غير لائق من الخلايا21،،من5152،،من5354. في الكلي، يختلف تكوين إدارة المحتوى في المؤسسة على نطاق واسع بين المواقع التشريحية1،2. ولذلك، من المهم التفريق بين المناطق مثل اللحاء، ولب أو الحليمة قبل اختﻻق الهلاميات المائية للاستخدام التجريبي.

مصفوفة كيكم ملفقة هنا يحفظ الكلي الأصلي اللحاء ECM نسب البروتين عقب ديسيلولاريزيشن حين تمكن أيضا جيليشن إلى صلابة ميكانيكية ذات صلة فسيولوجيا3،25،، من28 ،من 2930. تم الكشف عن الزلال، بروتين بلازما الدم، في تتبع المبالغ داخل أنسجة اللحاء ديسيلولاريزيد، ربما بسبب الربط إلى الهيبارين الذي هرب ديسيلولاريزيشن والشطف55،56. على الرغم من بيبسن، مادة كيميائية غير أصلي إلى ECM قشرة الكلي، غير موجودة في الحل كيكم الأسهم، فإنه يمثل فقط 2.5% (w/v) تبلور المنتج النهائي. وعلاوة على ذلك، يصبح إلغاء تنشيط بيبسن بالإضافة إلى الحل كاشف تحييد57.

هيدروجيل كيكم بمثابة ركيزة التي يمكن الحفاظ على الخلايا الخاصة بقشرة الكلي في ظل الظروف الفسيولوجية. أظهرنا أن هذه المصفوفة يمكن أن تدعم النمو هكميك على سطح مستو. هكميكس هذه تحتفظ دولة فسيولوجية هادئة كما هي محددة من خلال الاختبارات الوظيفية، والتعبير المظهرية، والتعبير الجيني58. وفي المقابل، أصبح تنشيط هذه الخلايا عند الكولاجين-الأول، عنصر مصفوفة يرتبط بالتليف الكلوي، أضيفت إلى هيدروجيل كيكم في نسبة 1:159. وعلى سبيل المقارنة، عندما كانت مثقف الخلايا البطانية البشرية الوريد السري في الكولاجين-الأول، كانت هادئة، وعندما يختلط كيكم أصبحوا تنشيط12. وبناء على ذلك، الكولاجين-ومن المعروف أن تكون جزءا لا يتجزأ من تكوين الغشاء داخل الحبل السري، ويتناقص تحت الحالات المرضية مثل بريكلامبسيا38،60. وتبرز هذه النتائج أهمية تزويد الخلايا بالرموز الخاصة بالانسجة للحفاظ على الهدوء، وأيضا كيفية التلاعب بالوسط إدارة المحتوى في المؤسسة يمكن أن يؤثر على التوازن.

بينما كافة الخطوات في هذا الإجراء المبين هامة، عدة خطوات حاسمة في ضمان استمرارية المائية ملفقة. درجة تجانس النسيج اللحاء ديسيلولاريزيد يختلف استناداً إلى تقنية أو المعدات المستخدمة. من المهم العثور على أسلوب الذي سوف أفضل مجانسة الأنسجة. أثناء سولوبيليزيشن، ينبغي أن تظل درجة الحموضة في 3-4 للتأكد من بيبسن النشطة. عند خلط المائية مع تحييد الكواشف، يجب أن تكون مختلطة الهلام جيدا ودون الأخذ بفقاعات الهواء. إذا كان من الصعب الحصول على خليط موحد، التحقق من الرقم الهيدروجيني لحل جل للتأكد من أنها محايدة.

تدل نتائج تمثيلية عرضت في هذا الأسلوب وكيف يمكن تحقيق مصفوفة فسيولوجيا ذات صلة للدراسة في المختبر من خلايا الكلي. ويوفر ECM قشرة الكلي ديسيلولاريزيد مادة قاعدة مثالية لدعم نمو الخلايا المستمدة من الكلي بروتين ECM هي المحافظة على نسب في المائية النهائي المنتج3،25. يمكن أيضا تحقيق المنتج تبلور الخصائص الميكانيكية ذات الصلة فسيولوجيا28،،من2930. المائية كيكم يسمح للتفاعلات مصفوفة الخلايا السليمة، ولقد ثبت للحصول على السلوك الفسيولوجي أكبر من خلايا الكلي من الكولاجين--أنا عند مثقف على سطح مستو. وعلاوة على ذلك، يمكن المصنف المائية مع الخلايا الخاصة بالكلى قبل جيليشن نموذج بيئة ثلاثية الأبعاد ذات صلة أكثر فسيولوجيا. تكوين هيدروجيل كيكم يمكن أيضا بسهولة التلاعب بها. على سبيل المثال، خلط في المائية بمقادير متفاوتة من الكولاجين--يمكن أن تؤدي قبل جيليشن المصفوفات التي تحاكي الدول التقدمية التليف الكلوي31،32. ألواح من هذه المائية المستمدة من إدارة المحتوى في المؤسسة لتقليد معروفة التراكيب ECM المريضة يستحق مزيدا من التحقيق، وستمكن هذه الدراسة المستقبلية لأمراض الكلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ويود المؤلفون الاعتراف بلين ومختبر التصوير غارفي مايك في معهد للخلايا الجذعية والطب التجديدي، وشمال غرب ليفيسينتير. أنها أيضا تود أن تقر بالدعم المالي لمنح "المعاهد الوطنية للصحة"، TR000504 UH2/UH3 (إلى J.H.) و DP2DK102258 (إلى Y.Z.)، T32 المعاهد الوطنية للصحة التدريب منحة DK0007467 (R.J.N.) وهدية غير مقيد من مراكز الكلي الشمال الغربي معهد أبحاث الكلي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Preparation of Kidney Tissue
5000 mL Beaker Sigma-Aldrich Z740589
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 436143
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Stir Bar (70 x 10 mm) Fisher Science 14-512-128
500 mL Vacuum Filter VWR 97066-202
Stir Plate Sigma-Aldrich CLS6795420D
1000 mL Beaker Sigma-Aldrich CLS10031L
Forceps Sigma-Aldrich F4642 Any similar forceps may be used
Scissor-Handle Hemostat Clamp Sigma-Aldrich Z168866
Dissecting Scissors Sigma-Aldrich Z265977
Scalpel Handle, No. 4 VWR 25859-000 Any similar scalpel handle may be used
Scalpel Blade, No. 20 VWR 25860-020 Any similar scalpel blade may be used
Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) Fisher Science 14-513-52
Absorbent Underpad VWR 82020-845
Petri Dish (150 x 25 mm) Corning 430597
Autoclavable Biohazard Bag VWR 14220-026
Sterile Cell Strainer (40 um) Fisher Science 22-363-547
Cell Culture Grade Water HyClone SH30529.03
30 mL Freestanding Tube VWR 89012-778
Fabrication of ECM Gel
Tissue Homogenizer Machine Polytron PCU-20110
Freeze Dryer Labconco 7670520
20 mL Glass Scintillation Vials and Cap Sigma-Aldrich V7130
Stir Bar (15.9 x 8 mm) Fisher Science 14-513-62
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa Sigma-Aldrich P7012
0.01 N HCl Sigma-Aldrich 320331 Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water
Kidney ECM Gelation
1 N NaOH (Sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
Medium 199 Sigma-Aldrich M4530
15 mL Conical Tube ThermoFisher 339651
Cell Culture Media ThermoFisher 11330.032 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10082147
Antibiotic-Antimycotic 100X Life Technologies 15240-062
Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X Life Technologies 51300-044
1 mL Syringe Sigma-Aldrich Z192325
Microspatula Sigma-Aldrich Z193208

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lelongt, B., Ronco, P. Role of extracellular matrix in kidney development and repair. Pediatric Nephrology. 18 (8), 731-742 (2003).
  2. Yue, B. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. Journal of Glaucoma. 23, S20-S23 (2014).
  3. Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney International. 56 (6), 2016-2024 (1999).
  4. Petrosyan, A., et al. Decellularized Renal Matrix and Regenerative Medicine of the Kidney: A Different Point of View. Tissue Engineering Part B. 22 (3), 183-192 (2016).
  5. Caralt, M., et al. Optimization and Critical Evaluation of Decellularization Strategies to Develop Renal Extracellular Matrix Scaffolds as Biological Templates for Organ Engineering and Transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (1), 64-75 (2015).
  6. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
  7. Nakayama, K. H., Lee, C. C. I., Batchelder, C. A., Tarantal, A. F. Tissue Specificity of Decellularized Rhesus Monkey Kidney and Lung Scaffolds. Public Library of Science ONE. 8 (5), (2013).
  8. Orlando, G., et al. Production and implantation of renal extracellular matrix scaffolds from porcine kidneys as a platform for renal bioengineering investigations. Annals of Surgery. 256 (2), 363-370 (2012).
  9. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
  10. Choi, S. H., et al. Development of a porcine renal extracellular matrix scaffold as a platform for kidney regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1391-1403 (2015).
  11. Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
  12. Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
  13. Gupta, S. K., Mishra, N. C., Dhasmana, A. Decellularization Methods for Scaffold Fabrication. Methods in Molecular Biology. , 1-10 (2017).
  14. Hudson, T., et al. Optimized Acellular Nerve Graft is Immunologically Tolerated and Supports Regeneration. Tissue Engineering. 10 (11), 1641-1651 (2004).
  15. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
  16. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
  17. Uygun, B., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularied liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
  18. Nagao, R. J., et al. Preservation of Capillary-beds in Rat Lung Tissue Using Optimized Chemical Decellularization. Journal of Materials Chemistry B. 1 (37), 4801-4808 (2013).
  19. Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
  20. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  21. Wolf, M. T., et al. A hydrogel derived from decellularized dermal extracellular matrix. Biomaterials. 33 (29), 7028-7038 (2012).
  22. Fisher, M. B., et al. Potential of healing a transected anterior cruciate ligament with genetically modified extracellular matrix bioscaffolds in a goat model. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 20 (7), 1357-1365 (2012).
  23. Ghuman, H., et al. ECM hydrogel for the treatment of stroke: Characterization of the host cell infiltrate. Biomaterials. 91, 166-181 (2016).
  24. Rijal, G. The decellularized extracellular matrix in regenerative medicine. Regenerative Medicine. 12 (5), 475-477 (2017).
  25. Lennon, R., et al. Global Analysis Reveals the Complexity of the Human Glomerular Extracellular Matrix. Journal of the American Society of Nephrology. 25 (5), 939-951 (2014).
  26. Bonandrini, B., et al. Recellularization of Well-Preserved Acellular Kidney Scaffold Using Embryonic Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1486-1498 (2014).
  27. O'Neill, J. D., Freytes, D. O., Anandappa, A. J., Oliver, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. The regulation of growth and metabolism of kidney stem cells with regional specificity using extracellular matrix derived from kidney. Biomaterials. 34 (38), 9830-9841 (2013).
  28. Streitberger, K. -J., et al. High-resolution mechanical imaging of the kidney. Journal of Biomechanics. 47 (3), 639-644 (2014).
  29. Bensamoun, S. F., et al. Stiffness imaging of the kidney and adjacent abdominal tissues measured simultaneously using magnetic resonance elastography. Clinical Imaging. 35 (4), 284-287 (2011).
  30. Moon, S. K., et al. Quantification of Kidney Fibrosis Using Ultrasonic Shear Wave Elastography. Journal of Ultrasound in Medicine. 34, 869-877 (2015).
  31. Genovese, F., Manresa, A. A., Leeming, D. J., Karsdal, M. A., Boor, P. The extracellular matrix in the kidney: a source of novel non-invasive biomarkers of kidney fibrosis? Fibrogenesis & Tissue Repair. 7 (1), (2014).
  32. Hewitson, T. D. Fibrosis in the kidney: is a problem shared a problem halved? Fibrogenes & Tissue Repair. 5 (1), S14 (2012).
  33. Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
  34. Faulk, D. M., et al. ECM hydrogel coating mitigates the chronic inflammatory response to polypropylene mesh. Biomaterials. 35 (30), 8585-8595 (2014).
  35. Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels To Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
  36. Kim, M. -S., et al. Differential Expression of Extracellular Matrix and Adhesion Molecules in Fetal-Origin Amniotic Epithelial Cells of Preeclamptic Pregnancy. Public Library of Science ONE. 11 (5), e0156038 (2016).
  37. Paduano, F., Marrelli, M., White, L. J., Shakesheff, K. M., Tatullo, M. Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells on Hydrogel Scaffolds Derived from Decellularized Bone Extracellular Matrix and Collagen Type I. Public Library of Science ONE. 11 (2), e0148225 (2016).
  38. Viswanath, A., et al. Extracellular matrix-derived hydrogels for dental stem cell delivery. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (1), 319-328 (2017).
  39. Uriel, S., et al. Extraction and Assembly of Tissue-Derived Gels for Cell Culture and Tissue Engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 15 (3), 309-321 (2009).
  40. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  41. Faust, A., et al. Urinary bladder extracellular matrix hydrogels and matrix-bound vesicles differentially regulate central nervous system neuron viability and axon growth and branching. Journal of Biomaterials Applications. 31 (9), 1277-1295 (2017).
  42. Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
  43. Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
  44. Pati, F., et al. Biomimetic 3D tissue printing for soft tissue regeneration. Biomaterials. 62, 164-175 (2015).
  45. Wang, R. M., Christman, K. L. Decellularized myocardial matrix hydrogels: In basic research and preclinical studies. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 77-82 (2016).
  46. Jang, J., et al. 3D printed complex tissue construct using stem cell-laden decellularized extracellular matrix bioinks for cardiac repair. Biomaterials. 112, 264-274 (2017).
  47. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
  48. Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 771-785 (2014).
  49. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
  50. Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials - Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
  51. Uriel, S., et al. The role of adipose protein derived hydrogels in adipogenesis. Biomaterials. 29 (27), 3712-3719 (2008).
  52. Singelyn, J. M., et al. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
  53. Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
  54. Loneker, A. E., Faulk, D. M., Hussey, G. S., D'Amore, A., Badylak, S. F. Solubilized liver extracellular matrix maintains primary rat hepatocyte phenotype in-vitro. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (4), 957-965 (2016).
  55. Hill, R. C., Calle, E. A., Dzieciatkowska, M., Niklason, L. E., Hansen, K. C. Quantification of extracellular matrix proteins from a rat lung scaffold to provide a molecular readout for tissue engineering. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 961-973 (2015).
  56. Li, Q., et al. Proteomic analysis of naturally-sourced biological scaffolds. Biomaterials. 75, 37-46 (2016).
  57. Tanaka, T., Yada, R. Y. N-terminal portion acts as an initiator of the inactivation of pepsin at neutral pH. Protein Engineering. 14 (9), 669-674 (2001).
  58. Ligresti, G., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (8), 2370-2381 (2016).
  59. Mozes, M. M., Böttinger, E. P., Jacot, T. A., Kopp, J. B. Renal expression of fibrotic matrix proteins and of transforming growth factor-beta (TGF-beta) isoforms in TGF-beta transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (2), 271-280 (1999).
  60. Romanowicz, L., Galewska, Z. Extracellular matrix remodeling of the umbilical cord in pre-eclampsia as a risk factor for fetal hypertension. Journal of Pregnancy. 2011, 542695 (2011).

Tags

الهندسة الحيوية، 140 قضية، الهندسة الحيوية، المصفوفة خارج الخلية، وهندسة الأنسجة، والمائية، والكلى، وخلايا بطانية
اختﻻق الكلي لحاء خارج الخلية المستمدة من مصفوفة المائية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hiraki, H. L., Nagao, R. J.,… More

Hiraki, H. L., Nagao, R. J., Himmelfarb, J., Zheng, Y. Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel. J. Vis. Exp. (140), e58314, doi:10.3791/58314 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter