Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para fabricar um rim córtex extracelulares matriz-derivado hidrogel para manter a composição de estruturais e bioquímicos de matriz extracelular (ECM) do rim nativo. O processo de fabricação e suas aplicações são descritas. Finalmente, uma perspectiva sobre como usar este hidrogel para apoiar a bioengenharia e a regeneração celular e tecido de rim-específicas é discutida.
Abstract
Matriz extracelular (ECM) fornece importantes pistas biofísicas e bioquímicas para manter a homeostase do tecido. Hidrogel sintético atual oferece suporte mecânico robusto em vitro cultura de células, mas falta a composição de proteínas e ligante necessária para eliciar comportamentos fisiológicos das células. Este manuscrito descreve um método de fabricação para um hidrogel de ECM-derivado de córtex renal com robustez mecânica adequada e apoia composição bioquímica. O hidrogel é fabricada por mecanicamente, homogeneizando e solubilizing córtex renal humana decellularized ECM. A matriz preserva rácios de proteína nativa renal córtex ECM, permitindo também a criação de gelificação para stiffnesses mecânicas fisiológicas. O hidrogel serve como substrato ao qual nos rins córtex-derivado de células podem ser mantidas sob condições fisiológicas. Além disso, a composição de hidrogel pode ser manipulada para modelar um ambiente de doente que permite o estudo futuro das doenças renais.
Introduction
Matriz extracelular (ECM) fornece importantes pistas biofísicas e bioquímicas para manter a homeostase do tecido. A composição molecular complexa regula propriedades estruturais e funcionais do tecido. Proteínas estruturais fornecem células com consciência espacial e permitam a migração e adesão1. Ligantes acoplados interagem com receptores de superfície celular para controlar o comportamento de célula2. Rim ECM contém uma infinidade de moléculas cuja composição e estrutura varia dependendo da localização anatômica, grau de desenvolvimento e doença estado3,4. Recapitulando a complexidade do ECM é um aspecto fundamental no estudo de células de rim-derivado em vitro.
Tentativas anteriores de replicar o microambiente ECM focaram-se decellularizing todo tecido para criar andaimes capaz de recellularization. Decellularization tem sido realizado com detergentes químicos tais como sulfato dodecyl de sódio (SDS) ou detergentes não-iônicos, e utiliza qualquer órgão inteiro perfusão ou imersão e agitação métodos5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. Os andaimes aqui apresentados preservar as pistas estruturais e bioquímicas encontradas no tecido nativo ECM; Além disso, recellularization com células específicas do doador tem relevância clínica em cirurgia reconstrutiva14,15,16,17,18, 19. no entanto, estes andaimes falta flexibilidade estrutural e, portanto, são incompatíveis com muitos dispositivos atuais usados para estudos em vitro . Para contornar essa limitação, muitos grupos têm ulteriormente decellularized ECM em hidrogel20,21,22,23,24. Estes hidrogel é compatíveis com bioink e moldagem por injeção e contornar micrômetro escala espacial restrições que decellularized lugar de andaimes nas células. Além disso, a composição molecular e rácios encontrados em ECM nativo são preservados3,25. Aqui vamos demonstrar um método para fabricar um hidrogel derivado de córtex renal ECM (kECM).
O propósito do presente protocolo é produzir um hidrogel que Replica o microambiente da região cortical do rim. Tecido de córtex renal é decellularized em uma solução de SDS 1% sob agitação constante para remover a matéria celular. SDS é comumente usado para decellularize de tecido devido à sua capacidade de remover rapidamente o material celular imunológica6,7,9,26. O kECM é então sujeito a homogeneização mecânica e liofilização5,6,9,11,26. Solubilização de um ácido forte com pepsina resulta em uma solução de hidrogel final20,27. KECM nativo de proteínas que são importantes para estrutural suportam e sinal de transdução estão preservados3,25. O hidrogel pode também ser gelificada para dentro de uma ordem de magnitude de rim humano nativo córtex28,29,30. Esta matriz fornece um ambiente fisiológico que tem sido usado para manter a quiescência de células específicas do rim em comparação com hidrogel de outras proteínas da matriz. Além disso, composição da matriz pode ser manipulada, por exemplo, através da adição de colágeno-I, ambientes de doença de modelo para o estudo de fibrose renal e outras doenças de rim31,32.
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Protocol
Rins humanos foram isolados por LifeCenter noroeste seguindo as diretrizes éticas, definidas pela Associação de organizações de contratos órgão. Este protocolo segue animais cuidados e célula cultura diretrizes delineadas pela Universidade de Washington.
1. preparação do tecido do rim humano
- Preparação da solução de decellularization
- Esterilize um copo de 5000 mL e uma barra de agitação de 70 x 10mm.
- Misture 1: 1000 (peso: volume) Dodecil sulfato de sódio (SDS) em água desionizada esterilizada no copo. Deixe a solução em uma placa de agitação em aproximadamente 200 rpm para 24h ou até o SDS é completamente dissolvido.
Nota: Normalmente, 2500 mL de solução de SDS 1% é suficiente para decellularize um único rim humano. - Transferir a solução para um filtro de vácuo estéril 500 mL e filtrar em recipientes sealable esterilizados.
- Processamento de tecido renal
- Lavagem e da autoclave um par de pinças, pinça hemostática dois grampos, um par de tesouras de serviço geral série, duas alças de lâmina de bisturi, uma proveta de 1000 mL coberta com folha de alumínio e uma barra de agitação de 36 x 9 mm.
- Linha um capuz de cultura de tecidos com underpad. Coloque o copo, um prato de cultura de tecido estéril (150 x 25 mm) e o órgão de rim no capô. Encha o pote com 500 mL de solução de SDS 1%.
Nota: Os rins humanos foram recebidos no gelo do LifeCenter noroeste. - Coloque o rim a placa de cultura de tecido estéril (figura 1A). Retire toda a gordura perirrenal cortando levemente ao redor da cápsula renal com um bisturi (figura 1B).
- Faça uma incisão superficial 8-10 cm com o bisturi, fundo o suficiente para abrir a cápsula renal sem danificar o tecido do córtex subjacente, em toda a extremidade superior do rim. Remova a cápsula renal por peeling-lo longe do tecido do córtex com duas pinças pinça hemostática (Figura 1).
- Bissetriz do rim ao longo do plano coronal, usando o bisturi ao longo do lado lateral do rim (Figura 1). Isolar o tecido do córtex de ambas as partes por esculpir a região medular com o bisturi (Figura 1E) e cortar o tecido do córtex em pedaços de 0,5 cm3 (Figura 1F). Remova qualquer grandes vasos visíveis.
- Isolamento de matriz extracelular
- Em uma capa de cultura de tecidos, encha uma proveta de 1000 mL com 500 mL de solução de SDS 1%. Coloque a barra de tecido e mexa de córtex em cubos no copo contendo solução de SDS. Cubra o copo com folha de alumínio esterilizado e coloque-o em um prato misture a aproximadamente 400 rpm fora a capa de cultura de tecidos.
- Depois que o tecido do córtex tem sido na placa de agitação por 24 h, trazer o copo em uma capa de cultura de tecidos e adicionar um filtro de célula estéril de 40 µm feito com malha de nylon. Encha um copo separado 1000 mL com 200 mL de água sanitária e coloque dentro do capô de cultura de tecidos.
- Pipetar a solução de SDS através do filtro de célula para o béquer contendo água sanitária. Pipetar toda solução de SDS até apenas tecido decellularized e o filtro célula permanecem no copo.
Nota: O filtro célula deve evitar qualquer tecido removido durante a aspiração da solução. - Deixe o filtro célula copo e encha com 500 mL de solução de SDS fresca. Cubra o copo com a mesma folha de alumínio e coloque em uma placa de agitação na mesma velocidade que antes.
- Repita etapas 1.3.1-1.3.3 cada 24 horas com solução de SDS fresca para um total de cinco dias.
- Lave o tecido decellularized com água esterilizada cada 24h para total de 3 dias, seguindo a técnica descrita em etapas 1.3.1-1.3.3.
- Lave o tecido decellularized com água de grau de cultura de célula cada 24h para total de 2 dias, seguindo a técnica descrita em etapas 1.3.1-1.3.3.
- Repita as etapas 1.3.1-1.3.2. Transferir o tecido decellularized (referido como kECM deste ponto na) em um 30ml self permanente tubo cônico e preenchê-lo com água de grau de cultura de célula até que todo o tecido está submersa.
2. fabricação da solução estoque de hidrogel
- Processamento mecânico do tecido decellularized
- Em uma capa de cultura de tecidos, homogeneizar mecanicamente o kECM no interior do tubo cônico com um homogeneizador por 2 min.
Nota: KECM homogeneizado deve assemelhar-se uma solução opaca com nenhum fragmentos visíveis de ECM. - Mergulhe o tubo cônico contendo a kECM em nitrogênio líquido até ebulição em torno do tubo não mais persiste. Armazene o kECM em-4 ˚ c durante a noite.
- Em uma capa de cultura de tecidos, homogeneizar mecanicamente o kECM no interior do tubo cônico com um homogeneizador por 2 min.
- Liofilização de tecidos decellularized congelados
- Ligeiramente Afrouxe a tampa do tubo cônico para permitir a troca gasosa e colocar o tubo em uma máquina de liofilização. Lyophilize o kECM por três dias ou até que se assemelha a um pó branco fino. Loja-4 ˚ c.
- Digestão química e solubilização de gel
- Autoclave, um frasco de cintilação de 20 mL e cap, uma barra de agitação de 15,9 x 7,9 mm e um par de pinças de ponta fina.
- Pesar o liofilizado kECM e calcular o volume de HCl e massa de pepsina necessária para solubilizar o kECM para uma solução de 3% (30 mg/mL), usando as seguintes equações, onde mpepsina é a massa de pepsina, mtecido é a massa do tecido liofilizado e VHCl é o volume de 0,01 N HCl:
- Em uma capa de cultura de tecidos, adicionar barra de agitação, 0,01 N HCl e pepsina gástrica suínos para o frasco de cintilação e deixá-lo em um prato misture a aproximadamente 500 rpm até dissolver toda a pepsina. Transferir o kECM liofilizado para o frasco de cintilação e deixar a solução em uma placa de agitação em aproximadamente 500 rpm durante três dias.
3. hidrogel gelificação
- Preparação do hidrogel rim ECM
- O hidrogel do gel misturando a solução-mãe de hidrogel kECM com 1 N NaOH, 10 x mídia suplemento (M199) e meios de cultura de células. Mantenha todas as soluções no gelo.
Nota: Concentrações de gel de Final de 7,5 mg/mL foram usadas para cultura de células. 1 mL de gel de kECM era suficiente para experimentos de cultura celular apresentados. - Determinar o volume do gel de kECM funcional produzido e volume de estoque kECM hydrogel necessário usando a seguinte equação, onde final V é o volume do gel criado, VkECM estoque é o volume de hidrogel de kECM das ações necessária, CkECM de estoque é a concentração de hidrogel o estoque kECM, e Cfinal é a concentração do gel final:
- Determinar o volume de neutralizar os reagentes necessários usando as seguintes equações, onde VNaOH é o volume de 1 N de NaOH, V10 X é o volume de M199 completar 10 mídia X e V1 X é o volume de meios de cultura de células:
- Em uma capa de cultura de tecidos, pipete os reagentes neutralizantes (NaOH, M199 e meios de cultura de células) para um estéril 30ml self permanente tubo cônico. Misture a solução de reagente a neutralização com um microspatula.
- Use uma seringa de 1ml estéril para transferir o volume apropriado de hidrogel de kECM ações para a solução neutralizante do reagente. Use um microspatula para misturar delicadamente a solução até obter uma homogênea em solução de hidrogel de cor.
Nota: Evite a introdução de bolhas de ar agitando lentamente e suavemente. - Para incorporar o hidrogel de kECM células, subtrai os cálculos de volume de solução neutralizante na etapa 3.1.1.3 em 10 µ l de meios de cultura celular (V1. X).
- Suspenda as células em 10 µ l de meios de cultura de células. Determine o número de células a ser suspenso usando a seguinte equação, onde #células implica o número de células para suspender efinal V é o volume do gel criado:
Nota: 300.000 células/mL é a concentração de células utilizadas no gel kECM. - Pipete a 10 µ l de solução de célula suspensa para o gel de kECM final após a solução estoque de kECM foi misturada com solução de reagente de neutralização. Mexa a solução com um microspatula até as células são distribuídas uniformemente.
- Suspenda as células em 10 µ l de meios de cultura de células. Determine o número de células a ser suspenso usando a seguinte equação, onde #células implica o número de células para suspender efinal V é o volume do gel criado:
- O hidrogel do gel misturando a solução-mãe de hidrogel kECM com 1 N NaOH, 10 x mídia suplemento (M199) e meios de cultura de células. Mantenha todas as soluções no gelo.
- Use uma seringa de 1 mL para preencher um dispositivo de cultura de célula desejado com o hidrogel de kECM.
- Permitir que o gel definir em 37 ˚ c por 1h antes de transferir ou chapear pilhas.
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Representative Results
O hidrogel de kECM fornece uma matriz para cultura de células de rim com composição química similar como o microambiente de rim nativo. Para fabricar o hidrogel, tecido de córtex renal é mecanicamente isolado de um órgão de rim e cubos (Figura 1). Decellularization com um detergente químico (Figura 2AA..1-3), seguido de lavagens com água para remover partículas de detergente (Figura 2A.4-6) rende ECM de córtex renal isolado. Avaliação histológica confirma típicas basais laminar as proteínas tais como colágeno-IV e laminina e estrutural de proteínas como colágeno-são preservados, com vitronectina como a única notável exceção (Figura 2B). Além disso, a composição de proteínas, incluindo a preservação das isoformas, em ECM continua consistente com valores observados em rim nativo ECM (Figura 3). O ECM (Figura 4A) mecanicamente é homogeneizado e liofilizado (Figura 4B) então solubilizado para produzir o hidrogel de kECM final (Figura 4). O hidrogel de kECM apareceu opaca com pequenas quantidades de tecido visível e não era tão viscoso como colágeno tradicional-eu hidrogel. Medição reológica de gelificada kECM numa concentração de 15 mg/mL revelou um complexo módulo de elasticidade (elasticidade dinâmico) de cerca de 800 Pa na faixa linear de tensão valores, significativamente maior que a do colágeno de 7,5 mg/mL-eu (p = 1.602E-14). Rim humano peritubular microvascular células endoteliais (HKMECs) cultivadas em colágeno-I, kECM e um gel de mistura 1:1 mostrou diferenças no fenótipo, especificamente na expressão CD31 próximo de superfícies de célula e as junções (Figura 5). HKMECs cultivadas em colágeno-exibido uniforme CD31 expressão enquanto HKMECs cultivadas sobre os dois géis contendo kECM exibido reduziram expressão CD31 em distribuições desiguais. Tipo de matriz não pareceu afetar o PV1 de alta e baixa expressão de VWF nos HKMECs.
Figura 1: isolamento do tecido do córtex renal. Processamento mecânico de um órgão de rim para isolar o tecido do córtex como material de base para o hidrogel de kECM. Isolamento mecânico começa com (A) a remoção do tecido adiposo perirrenal. Grandes peças de tecido adiposo podem ser arrancadas do rim com braçadeiras de pinça hemostática. Restantes peças do tecido adiposo podem ser removidos, executando um bisturi contra a cápsula renal em um ângulo. (B) a cápsula renal é melhor removida por fazendo uma incisão superficial ao longo da extremidade superior do rim e (C) peeling a cápsula renal longe do tecido subjacente com braçadeiras de pinça hemostática. (D) dividindo o rim ao longo do eixo coronal permite a visualização das regiões de córtex e medula. (E) o isolamento do tecido córtex é o melhor feito por esculpir peças de tecido medula com um bisturi. A cor da região cortical é visivelmente mais escura do que a da região medular e pode ser usada diferenciar os dois tecidos anatomicamente distintos. Processamento final do tecido córtex envolve (F) cortar o tecido em pedaços de 0,5 cm3 para ajudar na decellularization subsequente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Decellularization do tecido do córtex. Caracterização visual e histológica do tecido decellularized. Submerging (a. 1) em cubos tecido do córtex em solução a 1% SDS provoca a Lise das células e a remoção de material celular. Depois (a. 2) 1 h e 24 h (a. 3), o tecido começa a perder a cor, indica matéria celular está sendo removida. Por 120 h. (4) o tecido é descascado e permanece apenas o ECM. Enxágue com água em 24h (a. 5) e (6) 120h não mostra nenhuma alteração visível no tecido. (B) imunofluorescência a coloração do tecido do córtex não tratada e decellularized revela perto de remoção completa da matéria celular e preservação das principais proteínas estruturais (colágeno-IV = Col-IV; laminina = LAM; fibronectina = FN; proteoglicanos de sulfato de heparina = HSPG; e vitronectina = VN). Escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: espectroscopia de massa de tecido decellularized. Análise do tecido do córtex decellularized por espectrometria de massa para determinar a composição de proteína de ECM. Todos os rácios são medidos como % em massa. (A) estavam presentes com colágeno-IV e - o mais altamente ser representado estrutural e outras proteínas associadas com a lâmina basal. Correntes (b. 1) colágeno-IV A1 e A2, onipresentes em todas as membranas do porão, foram conservadas. Cadeias de colágeno-IV A3 e A5, presentes apenas em membranas de porão do glomérulo, também foram detectadas. (B. 2) comum isoformas de laminins e colágeno (b. 3)-eu também foram detectados. Esta figura foi reproduzida com permissão de12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: fabricação de hidrogel de kECM. Transformação mecânica e química do tecido do córtex decellularized produz um hidrogel de kECM funcional com propriedades mecânicas suficientes gelificação com neutralizando reagentes a seguir. (A) decellularized córtex tecido mecanicamente é homogeneizado com um homogeneizador de até permanecem sem fragmentos visíveis de ECM. (B) um pó grosseiro foi rendido após 3 dias sob liofilização. (C) solubilização em HCl e químico digestão com pepsina em um frasco de cintilação resultou em um hidrogel de kECM viável. O hidrogel era opaco e baixa viscosidade. (D) física caracterização do hidrogel de kECM sequência de gelificação com reagentes de neutralização. Reológicos experimentos foram realizados com um sistema de placa paralela de diâmetro de 30mm. As bordas de amostra foram protegidas com óleo mineral e a plataforma de carga foi fixada em 37 ˚ c. O hidrogel de kECM foi permitido ao gel para 1 h antes do teste. Nas propriedades viscoelásticas do gel foram medidas com uma varredura de tensão entre 0,01 a 20%. Três amostras de colágeno e de kECM-foram testados (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: caracterização do crescimento de células. Caracterização das diferenças morfológicas em HKMECs cultivadas em diferentes matrizes. Hidrogel foram misturados com neutralizando reagentes e fixado em 37 ˚ c por 45 min em moldes de polidimetilsiloxano open-faced. HKMECs foram semeadas na superfície dos géis e mantidos em cultura para 72 h antes de ser fixadas e coradas. Imunofluorescência imagens de HKMECs cultivadas em colágeno de 7,5 mg/mL (A e D)-eu do gel; Gel de kECM de 7,5 mg/mL (B e E); e (C e F) 7,5 mg/mL gel de mistura 1:1. (A-C): vermelho = CD31; verde = VWF; azul = núcleos; barra de escala = 50 µm. (D-F): vermelho = F-Actina; verde = PV1; azul = núcleos; barra de escala = 50 µm. Esta figura foi reproduzida com permissão de12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Matrizes fornecem importantes dicas mecânicas e químicas que regem o comportamento da célula. Hidrogel sintético é capazes de apoiar a padronização 3-dimensional complexa mas não apresentar as diversas pistas extracelulares encontradas no microambiente matriz fisiológica. Hidrogel derivado de ECM nativo é materiais ideais para estudos tanto in vivo e in vitro . Estudos anteriores usaram decellularized ECM hidrogel para revestir biomateriais sintéticos para evitar33,host respostas imunológicas34, para diferenciar as células-tronco35,36,37 , 38, como um substrato para litografia 2D e macio celular cultura39,40,41,,42e na preparação de bioinks para impressão 3-dimensional43, 44 , 45 , 46. ECM hidrogel fornece células com sinalização adequada para iniciar a aderência e controlar ainda mais a proliferação e diferenciação de2,47.
As proporções e composição dos principais componentes da ECM, tais como colágenos, laminins, elastina, fibronectina e glicosaminoglicanos, são altamente dependentes da localização anatômica e a funcionalidade do tecido48,49, 50. Está bem estabelecido que usar inespecíficos ou relvados ECM-derivado de hidrogel eliciará impróprias respostas de células21,,51,52,53,54. No rim, composição de ECM varia amplamente entre localizações anatômicas1,2. Portanto, é importante diferenciar entre regiões como o córtex, medula ou papila antes de fabricar o hidrogel para uso experimental.
A matriz de kECM fabricada aqui preserva rácios proteína ECM do córtex renal nativo decellularization, permitindo também a criação de gelificação de uma rigidez mecânica fisiologicamente relevantes3,25,28, a seguir 29,30. Albumina, uma proteína do plasma sanguíneo, foi detectada em quantidades de traço dentro do tecido do córtex decellularized, possivelmente devido à ligação a heparina que escaparam decellularization e enxaguar55,56. Embora a pepsina, uma substância química não-nativas de ECM do córtex renal, está presente na solução das ações kECM, é apenas responsável por 2,5% (p/v) do produto final gelificado. Além disso, a pepsina torna-se desativado com a adição da neutralização de solução reagente57.
O hidrogel de kECM serve como substrato sobre o qual células de rim de córtex específico podem ser mantidas sob condições fisiológicas. Temos demonstrado que essa matriz pode suportar o crescimento de HKMEC sobre uma superfície plana. Estes HKMECs mantiveram um estado quiescente fisiológico conforme determinado através de ensaios funcionais, expressão fenotípica e genética expressão58. Em contraste, estas células se tornou ativadas quando colágeno-eu, um componente da matriz correlacionado com fibrose renal, foi adicionado para o hidrogel de kECM em uma proporção 1:1,59. Em comparação, quando as células endoteliais da veia umbilical humana foram cultivadas em colágeno-eu, eles estavam em descanso, e quando misturado com o kECM eles se tornaram ativado12. Por conseguinte, colágeno-é conhecido por ser um componente integral da composição da membrana basal dentro do cordão umbilical e é diminuída em estados patológicos tais como pré-eclâmpsia38,60. Estes resultados destacam a importância de fornecer células com sugestões de tecido-específica para manter quiescência e também como manipulação de meio de ECM pode afetar a homeostase.
Considerando que todas as etapas no procedimento descrito são importantes, várias etapas são fundamentais para assegurar a viabilidade do hidrogel fabricado. O grau de homogeneização do tecido decellularized córtex irá variar com base na técnica ou equipamento utilizado. É importante encontrar uma técnica que irá melhor homogeneizar o tecido. Durante a solubilização, o pH deve ser mantido em 3-4 para assegurar que a pepsina está ativa. Ao misturar o hidrogel com reagentes de neutralização, o gel deve ser misturado completamente e sem a introdução de bolhas de ar. Se difícil obter uma mistura uniforme, verificar o pH da solução de gel para garantir que é neutro.
Os resultados representativos apresentados neste método demonstram como uma matriz de fisiologicamente relevante para o estudo em vitro de células de rim pode ser alcançado. Decellularized renal córtex ECM fornece um material de base ideal para apoiar o crescimento de células de rim-derivado como proteína de ECM rácios são conservados no final hidrogel produto3,25. O produto gelificado também pode atingir fisiologicamente relevantes propriedades mecânicas28,29,30. O hidrogel de kECM permite interações célula-matriz adequada e tem sido mostrado para eliciar maior comportamento fisiológico de células de rim de colágeno-I quando cultivadas em uma superfície plana. Além disso, o hidrogel pode ser inoculado com células de rim específicos antes da gelificação para modelar um ambiente 3-dimensional mais fisiologicamente relevante. A composição do hidrogel de kECM também pode ser facilmente manipulada. Por exemplo, misturando o hidrogel com quantidades variadas de colágeno-eu antes da gelificação pode produzir matrizes que imitam progressivos estados de fibrose renal31,32. O pré-definido deste hidrogel ECM-derivado para imitar o conhecido doentes composições de ECM garante ainda mais a investigação e permitirá o estudo futuro das doenças renais.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de reconhecer a Lynn e Mike Garvey Imaging laboratório do Instituto de células-tronco e medicina regenerativa e LifeCenter noroeste. Eles também gostaria de agradecer o apoio financeiro da National Institutes of Health subvenções, UH2/UH3 TR000504 (de J.H.) e DP2DK102258 (para Y.Z.), NIH T32 formação grant DK0007467 (R.J.N.) e um presente sem restrições os centros de rim do noroeste para o Instituto de pesquisa do rim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
References
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