Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Niere Kortex extrazelluläre Matrix abgeleitet Hydrogel um die native Niere extrazelluläre Matrix (ECM) strukturelle und biochemische Zusammensetzung behalten zu fabrizieren. Den Fertigungsprozess und ihre Anwendungen werden beschrieben. Schließlich ist eine Perspektive auf die Verwendung dieses Hydrogel zur Niere-spezifische zelluläre und Geweberegeneration und Bioingenieurwissenschaften Unterstützung diskutiert.
Abstract
Extrazellulärer Matrix (ECM) bietet wichtige biophysikalische und biochemische Hinweise um Gewebe Homöostase. Aktuelle synthetischen Hydrogelen bieten robuste mechanische Unterstützung für in-Vitro Zellkultur aber fehlen die notwendigen Protein und Liganden Zusammensetzung physiologischen Verhalten von Zellen zu entlocken. Dieses Manuskript beschreibt ein Herstellungsverfahren für eine Niere Kortex ECM-abgeleitete Hydrogel mit richtige mechanische Robustheit und unterstützende biochemischen Zusammensetzung. Das Hydrogel ist von mechanisch Homogenisieren und Gefäss-decellularized menschliche Niere Kortex ECM hergestellt. Die Matrix bewahrt native Niere Kortex ECM Protein Verhältnisse Gelierung zu physiologischen mechanische Steifigkeit ermöglicht. Das Hydrogel dient als Substrat auf die Nieren Rinde gewonnenen Zellen unter physiologischen Bedingungen aufrechterhalten werden können. Darüber hinaus kann die Hydrogel-Zusammensetzung manipuliert werden, um eine kranke Umwelt-Modell ermöglicht die Zukunftsstudie von Nierenerkrankungen.
Introduction
Extrazellulärer Matrix (ECM) bietet wichtige biophysikalische und biochemische Hinweise um Gewebe Homöostase. Die komplexen molekularen Zusammensetzung regelt die strukturelle und funktionelle Eigenschaften des Gewebes. Strukturproteine Zellen mit räumliches Vorstellungsvermögen und Adhäsion und Migration1. Gebundene Liganden interagieren mit Oberfläche Zellrezeptoren, Zelle Verhalten2zu kontrollieren. Niere ECM enthält eine Fülle von Molekülen, deren Zusammensetzung und Struktur variiert je nach anatomischen Lage, Entwicklungsstufe und Krankheit Staat3,4. Rekapitulation der Komplexität von ECM ist ein wichtiger Aspekt bei der Untersuchung der Nieren-abgeleitete Zellen in Vitro.
Frühere Versuche zur Replikation von ECM Mikroumgebungen konzentrierten sich auf einem ganzen Gewebe, Gerüste Recellularization zusammenzustellen. Decellularization mit chemischen Reinigungsmitteln wie Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) oder nichtionischen Reinigungsmitteln durchgeführt wurde, und es nutzt entweder ganze Organ Perfusion oder Eintauchen und Agitation Methoden5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. Die hier vorgestellten Gerüste bewahren die strukturelle und biochemische Signale in nativen Gewebe ECM gefunden; Darüber hinaus Recellularization mit Spender-spezifischen Zellen hat klinischen Relevanz in der rekonstruktiven Chirurgie14,15,16,17,18, 19. allerdings diese Gerüste fehlen strukturelle Flexibilität und sind daher nicht kompatibel mit vielen aktuellen Geräten für in-vitro- Studien verwendet. Um diese Einschränkung zu umgehen, haben viele Gruppen decellularized ECM zu Hydrogele20,21,22,23,24weiterverarbeitet. Diese Hydrogele sind kompatibel mit Spritzguss und Bioink und Mikrometer Skala räumliche Einschränkungen, die Gerüste auf Zellen statt decellularized umgehen. Darüber hinaus sind Molekulare Zusammensetzung und Verhältnisse in native ECM gefunden3,25erhalten. Hier zeigen wir eine Methode, um ein Hydrogel, abgeleitet von Niere Kortex ECM (kECM) herzustellen.
Dieses Protokoll soll ein Hydrogel zu produzieren, die die Mikroumgebung der Niere kortikalen Region repliziert werden. Nierengewebe Kortex ist in einer 1 % SDS-Lösung unter ständiger Bewegung, zelluläre Materie zu entfernen decellularized. SDS ist häufig verwendet, um Gewebe wegen seiner Fähigkeit, schnell zu entfernen, immunologische zellulären Material6,7,9,26decellularize. Dann unterliegt die kECM mechanische Homogenisierung und Lyophilisation5,6,9,11,26. Solubilisierung in einer starken Säure mit Pepsin führt zu einer endgültigen Hydrogel-Stammlösung20,27. Native kECM Proteine, die wichtig sind für strukturelle Unterstützung und signal-Transduktion sind3,25erhalten. Das Hydrogel kann auch in einer Größenordnung von nativen menschlichen Niere Kortex28,29,30, geliert werden. Diese Matrix bietet eine physiologische Umgebung, die verwendet wurde, um die Ruhe der Niere-spezifischen Zellen im Vergleich zu Hydrogele aus anderen matrixproteine pflegen. Darüber hinaus Matrix Zusammensetzung manipuliert werden kann, zum Beispiel durch die Zugabe von Kollagen-I Modell Krankheit Umgebungen für die Studie der renalen Fibrose und andere Niere Krankheiten31,32.
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Protocol
Menschliche Nieren wurden durch LifeCenter Nordwesten nach ethischen Leitlinien durch die Association of Organ Procurement Organizations lokalisiert. Dieses Protokoll folgt Tiere Pflege und Zelle Kultur genannten Richtlinien von der University of Washington.
1. Vorbereitung des menschlichen Nierengewebe
- Vorbereitung der Decellularization Lösung
- Ein 5000 mL-Becherglas und eine 70 x 10 mm Stir Bar zu sterilisieren.
- Mix 1: 1000 (Gewicht: Volumen) Natrium Dodecyl-Sulfat (SDS) in autoklaviert deionisiertes Wasser in den Becher geben. Lassen Sie die Lösung auf einem Teller rühren ca. 200 u/min für 24 h oder bis die SDS vollständig gelöst ist.
Anmerkung: In der Regel reicht 2500 mL 1 % SDS-Lösung zu eine einzige menschlichen Niere decellularize. - Die Lösung auf eine 500 mL sterile Vakuumfilter übertragen und in sterilisierte verschließbaren Behälter zu filtern.
- Verarbeitung von nierengewebe
- Wasch- und Autoklaven ein paar Zangen, zwei Gefäßklemme Klemmen, der allgemeine Service Klasse Schere, Skalpell Klinge Tragegriffen, einen 1000-mL-Becherglas abgedeckt mit Alufolie und 36 x 9 mm Stir Bar.
- Linie eine Gewebekultur Kapuze mit Unterlage. Legen Sie die Becher, ein steriles Gewebe Kulturschale (150 x 25 mm) und die ganze Niere-Orgel in der Haube. Füllen Sie den Becher mit 500 mL 1 % SDS-Lösung.
Hinweis: Die menschliche Nieren gingen am Eis aus LifeCenter Nordwesten. - Legen Sie die Niere in der sterilen Gewebe Kulturschale (Abbildung 1A). Entfernen Sie alle Tubulussystem Fett durch das Rasieren leicht um die renale Kapsel mit einem Skalpell (Abbildung 1 b).
- Machen Sie einen flachen 8-10 cm Schnitt mit dem Skalpell, nur tief genug, um die renale Kapsel aufzubrechen ohne die zugrunde liegenden Kortex Gewebe, über das bessere Ende der Niere. Entfernen Sie die renale Kapsel durch Schälen es weg von der Rinde Gewebe mit zwei Gefäßklemme Klemmen (Abbildung 1).
- Halbieren Sie die Niere entlang der koronalen Ebene mit dem Skalpell entlang der lateralen Seite der Niere (Abbildung 1). Kortex Gewebe aus beiden Hälften durch Ausgliederung der medullären Region mit dem Skalpell (Abbildung 1E) zu isolieren und die Rinde Gewebe in 0,5 cm3 Stücke (Abb. 1F) Würfeln. Entfernen Sie alle sichtbaren Großschiffe.
- Isolierung der extrazellulären matrix
- Füllen Sie in einer Gewebekultur-Haube einen 1000-mL-Becherglas mit 500 mL 1 % SDS-Lösung. Legen Sie die gewürfelte Kortex Gewebe und rühren Bar in das Becherglas mit SDS-Lösung. Decken Sie das Becherglas mit autoklaviert Alufolie ab und legen Sie sie auf einem Teller rühren ca. 400 u/min außerhalb der Gewebekultur-Haube.
- Nach das Kortex Gewebe auf dem Teller rühren für 24 h wurde, bringen Sie das Becherglas in einer Gewebekultur Kapuze und fügen Sie ein 40 µm sterile Zelle Sieb mit Nylon-Mesh gemacht. Füllen Sie einen separaten 1000 mL Becher mit 200 mL Bleichmittel und legen Sie sie in der Gewebekultur-Haube.
- Pipette, die SDS-Lösung durch das Sieb der Zelle in das Becherglas mit Bleichmittel. Pipette, alle SDS-Lösung bis nur decellularized Gewebe und Zelle Sieb im Becherglas bleiben.
Hinweis: Die Zelle Sieb sollte jedem Gewebe verhindern entfernt während Lösung streben. - Lassen Sie die Zelle Sieb in den Becher und füllt mit 500 mL frischem SDS-Lösung. Das Becherglas mit dem gleichen Alu-Folie abdecken und auf einen Teller rühren mit der gleichen Geschwindigkeit wie vor Ort.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.3 alle 24 Stunden mit frischem SDS-Lösung für insgesamt fünf Tage.
- Spülen Sie decellularized Gewebe mit autoklaviert DI Wasser alle 24 h für 3 Tage insgesamt, nach der Technik beschriebenen in Schritten 1.3.1-1.3.3.
- Spülen decellularized Gewebe mit Zellwasser Kultur Grade alle 24 h für 2 Tage, nach der Technik gemäß Schritte 1.3.1-1.3.3.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.2. Übertragen Sie das decellularized Gewebe (bezeichnet als kECM ab diesem Zeitpunkt auf) in eine 30 mL Selbststehend konischem Rohr zu und mit Kultur Grade Zellwasser füllen Sie, bis das Gewebe untergetaucht ist.
2. Herstellung von Hydrogel-Lager-Lösung
- Mechanische Bearbeitung von decellularized Gewebe
- In einer Gewebekultur Haube mechanisch Homogenisieren Sie kECM innerhalb der konischen Röhre mit einem Gewebe-Homogenisator für 2 min.
Hinweis: Homogenisierte kECM sollte eine opake Lösung mit keine sichtbaren Stücke von ECM ähneln. - Tauchen Sie das konische Rohr mit kECM in flüssigem Stickstoff bis Kochen rund um das Rohr nicht mehr besteht. Speichern Sie die kECM bei-4 ° c über Nacht.
- In einer Gewebekultur Haube mechanisch Homogenisieren Sie kECM innerhalb der konischen Röhre mit einem Gewebe-Homogenisator für 2 min.
- Gefriertrocknung von gefrorenen decellularized Gewebe
- Lösen Sie leicht konischem Rohr Kappe, damit für Gasaustausch und legen Sie das Rohr in eine Gefriertrocknung-Maschine. Die kECM lyophilize, drei Tage lang oder bis es ein feines, weißes Pulver ähnelt. Bei-4 ° c.
- Chemische Verdauung und Solubilisierung Gel
- Autoklaven ein 20 mL-Fläschchen funkeln und GAP 15,9 x 7,9 mm rühren und eine Bar, ein paar feine Spitze Pinzetten.
- Wiegen die lyophilisierten kECM und berechnen Sie das Volumen von HCl und Pepsin musste solubilisieren kECM zu einer 3 % (30 mg/mL) Lösung mit den folgenden Gleichungen, wo mPepsin ist die Masse von Pepsin Masse, mGewebe ist die Masse des lyophilisierter Gewebe und VHCl ist das Volumen von 0,01 N HCl:
- In einer Gewebekultur-Haube das Funkeln Fläschchen porcinen Magen Pepsin, 0,01 N HCl und Stir Bar hinzu, und lassen Sie es auf einer Platte unter Rühren auf ca. 500 u/min, bis alle Pepsin aufgelöst hat. Transfer der gefriergetrockneten kECM zum Funkeln Fläschchen und lassen Sie die Lösung auf einem Teller rühren bei ca. 500 u/min für drei Tage.
3. Hydrogel Gelierung
- Niere ECM Hydrogel Vorbereitung
- Das Hydrogel durch Mischen der kECM Hydrogel-Stammlösung mit 1 N NaOH, 10 x Medien Ergänzung (M199), Gel und Zell-Kultur, Medien. Halten Sie die Lösungen auf dem Eis.
Hinweis: Letzte Gel Konzentrationen von 7,5 mg/mL waren für die Zellkultur verwendet. 1 mL kECM Gel war ausreichend für Zellexperimente Kultur vorgestellt. - Bestimmen Sie die Lautstärke praktikable kECM Gel produziert und Volumen der Lager kECM Hydrogel benötigt mithilfe der folgenden Gleichung, wo Vfinal ist das Volumen des Gels erstellt, VLager kECM ist das Volumen der Lager kECM Hydrogel benötigt, CLager kECM ist die Konzentration Lager kECM Hydrogel und Cfinal ist die Konzentration des endgültigen Gels:
- Bestimmen Sie die Lautstärke mithilfe der folgenden Gleichungen, wo VNaOH ist das Volumen von 1 N NaOH benötigte Reagenzien zu neutralisieren, 10 X V ist das Volumen des M199 10 X Medien ergänzen und V1 X ist die Volumen von Zellkulturmedien:
- In einer Gewebekultur-Haube pipette die neutralisierenden Reagenzien (NaOH, M199 und Zellkulturmedien) in eine sterile 30 mL Selbststehend konischem Rohr. Mischen Sie die neutralisierende Reagenzlösung mit einer Microspatula.
- Verwenden Sie eine sterile 1 mL Spritze, um das entsprechende Volumen der Lager kECM Hydrogel zu neutralisierende Reagenzlösung übertragen. Verwenden Sie eine Microspatula, um die Lösung vorsichtig mischen, bis eine homogene Farbe Hydrogel Lösung erreicht ist.
Hinweis: Vermeiden Sie Luftblasen unter Rühren langsam und vorsichtig einführen. - Um Zellen in kECM Hydrogel enthalten, subtrahieren Sie 10 µL Zellkulturmedien (V1 X) aus die neutralisierende Lösung Mengenberechnungen im Schritt 3.1.1.3.
- Suspendieren Sie Zellen in 10 µL Zellkulturmedien. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen ausgesetzt werden mithilfe der folgenden Gleichung, wo #Zellen bedeutet die Anzahl der Zellen, auszusetzen und Vfinal ist das Volumen des Gels erstellt:
Hinweis: 300.000 Zellen/mL ist die Konzentration der Zellen in der kECM Gel verwendet. - Pipette 10 µL der Zelle gesperrt-Lösung in das endgültige kECM Gel nach kECM-Stammlösung vermischt worden ist, mit Reagenzlösung zu neutralisieren. Rühren Sie die Lösung mit einer Microspatula, bis die Zellen gleichmäßig verteilt sind.
- Suspendieren Sie Zellen in 10 µL Zellkulturmedien. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen ausgesetzt werden mithilfe der folgenden Gleichung, wo #Zellen bedeutet die Anzahl der Zellen, auszusetzen und Vfinal ist das Volumen des Gels erstellt:
- Das Hydrogel durch Mischen der kECM Hydrogel-Stammlösung mit 1 N NaOH, 10 x Medien Ergänzung (M199), Gel und Zell-Kultur, Medien. Halten Sie die Lösungen auf dem Eis.
- Verwenden Sie eine 1 mL Spritze, um eine gewünschte Zelle Kultur Gerät mit kECM Hydrogel auszufüllen.
- Lassen Sie das Gel auf 37 ° c für 1 h vor dem übertragen oder galvanischen Zellen festgelegt.
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Representative Results
KECM Hydrogel stellt eine Matrix für Niere Zellkultur mit ähnlicher chemischer Zusammensetzung als die native Niere Mikroumgebung. Um das Hydrogel zu fabrizieren, ist Cortex nierengewebe mechanisch isoliert aus eine ganze Niere Orgel und gewürfelte (Abbildung 1). Decellularization mit einem chemischen Reinigungsmittel (Abbildung 2A.1-a. 3), gefolgt von Spülungen mit Wasser Spülmittel Partikel (Abbildung 2A.4-6) zu entfernen ergibt isolierten Niere Kortex ECM. Histologische Auswertung bestätigt typische basal laminar Proteine wie Kollagen IV und Laminin und strukturelle Proteine wie Kollagen-ich werden beibehalten, mit Vitronectin als einzige Ausnahme (Abbildung 2 b) festgestellt. Weiterhin Proteinzusammensetzung, einschließlich der Erhaltung der Isoformen, die ECM konsistent mit den beobachteten Werten in native Niere ECM (Abbildung 3). Das ECM (Abb. 4A) wird mechanisch homogenisiert und lyophilisiert (Abbildung 4 b) solubilisiert dann die endgültige kECM Hydrogel (Abbildung 4) zu produzieren. KECM Hydrogel erschien deckend mit geringen Mengen an sichtbaren Gewebe und war nicht so dickflüssig wie traditionelle Kollagen-ich Hydrogel. Rheologische Messung von gegelten kECM in einer Konzentration von 15 mg/mL ergab eine komplexe e-Modul (dynamische Elastizitätsmodul) rund 800 Pa über den linearen Bereich der Belastung Werte, wesentlich größer als die von 7,5 mg/mL Kollagen-ich (p = 1.602E-14). Menschliche Niere Peritubular mikrovaskuläre Endothelzellen (HKMECs) kultiviert auf Kollagen-I, kECM und ein 1:1 Mischung Gel zeigten Unterschiede im Phänotyp, speziell in CD31 Ausdruck auf Zelloberflächen und Kreuzungen (Abbildung 5). HKMECs kultiviert auf Kollagen-ich einheitliche CD31 Ausdruck angezeigt, während HKMECs kultivierten auf die zwei Gele enthaltenden kECM angezeigt CD31 Ausdruck in ungleichmäßigen Verteilungen reduziert. Matrixtyp erscheinen nicht beeinflussen die hohe PV1 und geringe VWF-Expression in der HKMECs.
Abbildung 1: Isolierung des Kortex nierengewebe. Mechanische Bearbeitung einer ganzen Niere Orgel, die Rinde Gewebe als Ausgangsmaterial für die kECM Hydrogel zu isolieren. Mechanische Isolation beginnt mit (A) die Entfernung des Fettgewebes Tubulussystem. Große Stücke des Fettgewebes können von der Niere mit Gefäßklemme Schellen abgerissen werden. Restlichen Stücke des Fettgewebes kann entfernt werden, indem man ein Skalpell gegen die renale Kapsel in einem Winkel. (B) die renale Kapsel wird am besten durch einen flachen Einschnitt entlang überlegenen Ende der Niere und (C) peeling die renale Kapsel entfernt das darunter liegende Gewebe mit Gefäßklemme Klemme entfernt. (D) halbiert die Niere der koronalen Achse ermöglicht die Visualisierung der Cortex und Medulla Regionen. (E) Isolation des Kortex Gewebes erfolgt am besten durch Ausgliederung der Medulla Gewebestücke mit einem Skalpell. Die Farbe der kortikalen Region ist deutlich dunkler als die der medullären Region und kann verwendet werden zwei anatomisch unterschiedliche Gewebe zu unterscheiden. Abschließende Bearbeitung von Kortex Gewebe beinhaltet (F) Würfeln das Gewebe in 0,5 cm3 Stücke um spätere Decellularization zu unterstützen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Decellularization der Hirnrinde Gewebe. Visuelle und histologische Charakterisierung von decellularized Gewebe. (A. 1) Submerging gewürfelt Kortex Gewebe in 1 % SDS-Lösung verursacht Lyse der Zellen und Entnahme von Zellmaterial. Nach (a. 2) 1 h und (a. 3) 24 h, das Gewebe fängt an Farbe verlieren, anzeigende zellulären Angelegenheit wird entfernt. Durch (a. 4) 120 h das Gewebe blanchiert und nur die ECM bleibt. Spülungen mit Wasser an (a. 5) 24 h und (6) 120 h zeigen keine erkennbaren Veränderungen des Gewebes. (B) Immunfluoreszenz Färbung des unbehandelten und decellularized Kortex Gewebe in der Nähe von vollständige Entfernung der zellulären Materie und Erhaltung der wichtigsten Strukturproteine offenbart (Kollagen-IV = Col-IV; Laminin = LAM; Fibronektin = FN; Heparin Sulfat Proteoglycans = HSPG; und Vitronectin = VL). Skala = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Masse Spektroskopie von decellularized Gewebe. Analyse der decellularized Kortex Gewebe durch Massenspektrometrie ECM Proteinzusammensetzung zu bestimmen. Alle Kennzahlen werden als Masse Prozent gemessen. (A) Struktur- und andere Proteine der Basallamina zugeordnet waren mit Kollagen-IV und -ich, am stärksten vertreten. (B. 1) Kollagen IV A1 und A2 Ketten, allgegenwärtig in alle Keller Membranen wurden konserviert. Kollagen IV A3 und A5 Ketten, nur im Keller Membranen der Glomerulus, wurden auch gefunden. (B. 2) gemeinsame Isoformen von Laminins und Kollagen (b. 3)-Ich wurde auch erkannt. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis12wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Herstellung von kECM Hydrogel. Mechanische und chemische Aufbereitung des decellularized Kortex Gewebe erhält eine praktikable kECM Hydrogel mit ausreichenden mechanischen Eigenschaften nach Gelierung mit Reagenzien zu neutralisieren. (A) Decellularized Kortex Gewebe wird mechanisch mit einem Gewebe-Homogenisator homogenisiert, bis keine sichtbaren Stücke von ECM bleiben. (B) ein grobes Pulver war nach 3 Tagen unter Lyophilisierung ergab. (C) Solubilization in HCl und chemische Verdauung mit Pepsin in einer Durchstechflasche Funkeln führte eine praktikable kECM Hydrogel. Das Hydrogel war undurchsichtig und eine niedrige Viskosität. (D) physikalische Charakterisierung der kECM Hydrogel nach Gelierung mit Reagenzien zu neutralisieren. Rheologische Experimente wurden mit einem 30 mm Durchmesser parallelen Plattensystem durchgeführt. Die Ränder der Probe mit Mineralöl geschützt waren und die Ladefläche wurde bei 37 ° c festgelegt. Die kECM Hydrogel durfte für 1 h vor dem Test gel. Viskoelastische Eigenschaften des Gels wurden mit einer Belastung zwischen 0,01 bis 20 % gemessen. Drei Proben von kECM und Kollagen-ich habe getestet wurden (n = 3). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Zelle Wachstum Charakterisierung. Charakterisierung der morphologischen Unterschiede in HKMECs auf verschiedenen Matrizen angebaut. Hydrogele wurden gemischt mit Reagenzien zu neutralisieren und bei 37 ° c für 45 min. in offenen Polydimethylsiloxan Formen gesetzt. HKMECs wurden auf der Oberfläche der Gele entkernt und in Kultur für 72 h bevor Sie fixiert und gefärbt gehalten. Immunofluorescent Bilder von HKMECs in kultiviert (A und D) 7,5 mg/mL Kollagen-gel ich; (B und E) 7,5 mg/mL kECM Gel; und (C und F) 7,5 mg/mL 1:1 Mischung Gel. (A-C): rot = CD31; grün = VWF; blau = Kerne; Maßstabsleiste = 50 µm. (D-F): rot = F-Aktin; grün = PV1; blau = Kerne; Maßstabsleiste = 50 µm. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis12wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Matrizen liefern wichtige mechanische und chemische Signale, die Zelle Verhalten steuern. Synthetische Hydrogele sind in der Lage, komplexe 3-dimensionale Musterung unterstützen, aber nicht die vielfältigen extrazelluläre Signale in physiologischen Matrix Mikroumgebungen gefunden. Hydrogele native ECM abgeleitet sind ideale Materialien für in Vivo und in Vitro Studien. Frühere Studien haben decellularized ECM Hydrogele verwendet, um synthetische Biomaterialien zur Vermeidung Host Immunreaktionen33,34, um Stammzellen35,36,37 unterscheiden Beschichten , 38, als Substrat für 2D- und weiche Lithographie Zelle Kultur39,40,41,42, und in der Vorbereitung des Bioinks für 3-dimensionale Drucken43, 44 , 45 , 46. ECM Hydrogele geben Zellen mit korrekten Signalisierung Adhäsion zu initiieren und Steuern weitere Proliferation und Differenzierung2,47.
Die Verhältnisse und die Zusammensetzung der Hauptkomponenten des ECM, z. B. kollagene Laminins, Elastin, Fibronektin und Glykosaminoglykane, sind stark abhängig von der anatomischen Lage und Funktionalität des Gewebes48,49, 50. Es ist allgemein bekannt, dass unspezifische oder programmfremdes Format ECM-abgeleitete Hydrogele verwenden falsche Antworten von Zellen21,51,52,53,54hervorrufen wird. In der Niere ECM Zusammensetzung sehr unterschiedlich zwischen anatomischen Standorten1,2. Deshalb ist es wichtig, zwischen den Regionen wie den Kortex, Medulla oder Papille vor Herstellung Hydrogele für Versuchszwecke zu unterscheiden.
Die kECM Matrix hergestellt hier bewahrt native Niere Kortex ECM Protein Verhältnisse nach Decellularization Gelierung auf eine physiologisch relevanten mechanischen Steifigkeit3,25,28ermöglicht, 29,30. Serum-Albumin, ein Blut Plasmaprotein wurde in Spurenmengen innerhalb des Gewebes decellularized Kortex, möglicherweise durch Bindung an Heparin, der Decellularization zu entkommen und spülen55,56erkannt. Obwohl Pepsin, einer nicht-Native Chemikalie, Niere Kortex ECM in die Lager kECM Lösung vorhanden ist, macht es nur 2,5 % (w/V) des Endprodukts gelierte. Darüber hinaus wird mit dem Zusatz der neutralisierende Reagenz Lösung57Pepsin deaktiviert.
Die kECM Hydrogel dient als Substrat auf dem Cortex-spezifische Nierenzellen unter physiologischen Bedingungen aufrechterhalten werden können. Wir bewiesen, dass diese Matrix HKMEC Wachstum auf eine planare Fläche unterstützen kann. Diese HKMECs physiologischen Ruhezustand als durch funktionelle Assays, Phänotyp und Genexpression58gepflegt. Im Gegensatz dazu wurde diese Zellen aktiviert wenn Kollagen-I, eine Matrix-Komponente korreliert mit Niere Fibrose, wurde hinzugefügt, um die kECM Hydrogel bei einem Verhältnis 1:1-59. Im Vergleich dazu, wenn menschliche nabelader endothelial Zellen Kollagen kultiviert wurden-ich, sie waren ruhig, und wenn Sie mit gemischt kECM sie wurden aktiviert12. Entsprechend, Kollagen-ich ist bekannt, dass ein integraler Bestandteil der Basalmembran Zusammensetzung innerhalb der Nabelschnur und sinkt unter pathologischen Zuständen wie Präeklampsie38,60. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Bereitstellung von Zellen mit Gewebe-spezifische Hinweise zu pflegen, Ruhe und auch, wie die Manipulation des ECM Milieus Homöostase beeinflussen kann.
Während alle Schritte in der beschriebenen Prozedur wichtig sind, sind mehrere Schritte in der Lebensfähigkeit der vorgefertigten Hydrogel entscheidend. Der Grad der Homogenisierung des decellularized Kortex Gewebes variiert je nach Technik oder Ausrüstung verwendet. Es ist wichtig, eine Technik zu finden, die am besten das Gewebe homogenisiert wird. Im Solubilisierung sollte der pH-Wert gehalten werden, bei 3-4 um sicherzustellen, dass die Pepsin aktiv ist. Wenn das Hydrogel mischen mit Reagenzien zu neutralisieren, muss das Gel gründlich und ohne die Einführung von Luftblasen gemischt werden. Wenn eine gleichmäßige Mischung schwer zu bekommen ist, überprüfen Sie den pH-Wert der Lösung Gel um sicherzustellen, dass es neutral ist.
Die repräsentativen Ergebnisse bei dieser Methode zeigen, wie eine physiologisch relevante Matrix für die in-vitro- Untersuchung von Nierenzellen erreicht werden kann. Decellularized Niere Kortex ECM bietet ein ideales Grundmaterial zur Unterstützung Niere abgeleitet Zellwachstum als ECM-Protein, die Verhältnisse zu erhalten, werden in die endgültige Hydrogel Produkt3,25. Das gelierte Produkt erreichen auch physiologisch relevanten mechanischen Eigenschaften28,29,30. Die kECM Hydrogel ermöglicht die richtige Zelle-Matrix Interaktionen und hat gezeigt, dass höhere physiologische Verhalten von Nierenzellen als Kollagen zu entlocken-ich, wenn auf eine planare Fläche kultiviert. Darüber hinaus kann das Hydrogel mit Nieren-spezifischen Zellen vor Gelierung eine mehr physiologisch relevante 3-dimensionalen Umgebung modellieren ausgesät werden. Die Zusammensetzung der kECM Hydrogel kann auch leicht manipuliert werden. Mischen Sie z. B. das Hydrogel mit unterschiedlichen Mengen von Kollagen-Matrizen, die progressive Staaten von renal Fibrose31,32nachahmen konnte ich vor Gelierung produzieren. Die Einstellbarkeit von dieser ECM-abgeleitete Hydrogel, bekannte erkrankten ECM Zusammensetzungen zu imitieren Optionsscheine weitere Untersuchung und ermöglichen die Zukunftsstudie von Nierenerkrankungen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Lynn und Mike Garvey Imaging Laboratory am Institut für Stammzellen und Regenerationsmedizin und LifeCenter Nordwesten anzuerkennen. Sie möchten auch die finanzielle Unterstützung der National Institutes of Health Zuschüsse, UH2/UH3 TR000504 (, j.h.) und DP2DK102258 (um Y.Z), NIH T32 Ausbildung Grant DK0007467 (R.J.N.), und ein uneingeschränkter Geschenk aus Nordwesten Niere Zentren zu erkennen an der Niere-Forschungsinstitut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
References
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