Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Bir böbrek korteks ekstraselüler matrisi elde edilen hidrojel imalatı

Published: October 13, 2018 doi: 10.3791/58314
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Department of Bioengineering, Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington, 3Department of Medicine, Kidney Research Institute, University of Washington

Summary

Burada bir iletişim kuralı yerel böbrek hücre dışı matriks (ECM) yapısal ve biyokimyasal kompozisyonu tutulacağı bir böbrek korteks ekstraselüler matrisi elde edilen hidrojel imal etmek mevcut. İmalat süreci ve uygulamaları açıklanmıştır. Son olarak, böbrek özel cep ve doku rejenerasyonu ve Biyomühendislik desteklemek için bu hidrojel kullanarak bir bakış açısı ele alınmıştır.

Abstract

Hücre dışı matriks (ECM) doku homeostazı korumak için önemli biyofiziksel ve biyokimyasal ipuçları sağlar. Vitro kültür hücre ama fizyolojik davranış hücrelerden temin için gerekli protein ve ligand kompozisyon eksikliği için geçerli sentetik hydrogels güçlü mekanik destek sunuyoruz. Bu el yazması için bir böbrek korteks hidrojel ECM kaynaklı imalat yöntemi uygun mekanik sağlamlık ve destekleyici biyokimyasal kompozisyonu ile açıklar. Hidrojel mekanik homojenizasyon ve decellularized insan böbrek korteks ECM çözücü fabrikasyon olduğunu. Matrix yerli böbrek korteks ECM protein oranları da jelleşme fizyolojik mekanik stiffnesses için izin verirken korur. Hidrojel hangi böbrek korteks kaynaklı hücreleri fizyolojik koşullar altında korunabilir substratı olarak hizmet vermektedir. Ayrıca, hidrojel kompozisyon böbrek hastalıkları gelecekteki çalışma sağlayan bir hastalıklı ortam modellemek için manipüle edilebilir.

Introduction

Hücre dışı matriks (ECM) doku homeostazı korumak için önemli biyofiziksel ve biyokimyasal ipuçları sağlar. Karmaşık moleküler kompozisyonu doku yapısal ve işlevsel özellikleri düzenler. Yapısal proteinler hücre ile mekansal farkındalık sağlamak ve yapışma ve geçiş1için izin verir. İlişkili ligandlar hücre davranış2denetlemek için hücre yüzey reseptörleri ile etkileşim. Böbrek ECM moleküller olan kompozisyon ve yapısı değişir anatomik konumu, gelişimsel sahne ve hastalık durumu3,4bağlı olarak bir bolluk içerir. ECM karmaşıklığı recapitulating böbrek kaynaklı hücreler içinde vitroeğitim önemli bir yönüdür.

ECM microenvironments çoğaltılıyor önceki girişimleri iskele recellularization yeteneğine oluşturmak için decellularizing bütün doku üzerinde odaklanmıştır. Decellularization Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) gibi kimyasal deterjan veya non-iyonik deterjanlar ile gerçekleştirilen ve her iki bütün organ perfüzyon veya daldırma ve ajitasyon yöntemleri5,6,7 kullanır ,8,9,10,11,12,13. Burada sunulan iskele yerel doku ECM bulundu yapısal ve biyokimyasal ipuçları korumak; Ayrıca, recellularization donör özgü hücrelerle Rekonstrüktif Cerrahi14,15,da16,17,18, klinik önemi vardır 19. ancak, bu iskele eksikliği yapısal esneklik ve bu nedenle vitro çalışmalar için kullanılan birçok geçerli aygıtlar ile uyumsuzdur. Bu sınırlamayı aşmak için çok grup daha fazla hydrogels20,21,22,23,24decellularized ECM işleme. Bu hydrogels enjeksiyon kalıplama ve bioink ile uyumlu ve iskele yer hücrelerde decellularized mikrometre ölçekli kayma kısıtlamaları aşmak. Ayrıca, moleküler kompozisyonu ve yerel ECM bulundu oranları3,25korunur. Burada böbrek korteks ECM (kECM) elde edilen bir hidrojel imal etmek bir yöntemi göstermektedir.

Bu iletişim kuralının amacını microenvironment böbrek kortikal bölgesinin çoğaltır hidrojel üretmektir. Böbrek korteks doku hücresel madde kaldırmak için sürekli ajitasyon altında % 1 SDS çözümünde decellularized. SDS doku immünolojik hücresel malzeme6,7,9,26hızlı bir şekilde kaldırmak için onun yetenek nedeniyle decellularize için yaygın olarak kullanılır. KECM sonra mekanik homojenizasyon ve lyophilization5,6,9,11,26bağlıdır. Pepsin ile güçlü bir asit solubilization bir son hidrojel hisse senedi çözüm20,27içinde sonuçlanır. Yapısal için önemli yerli kECM protein desteği ve sinyal iletim3,25korunur. Hidrojel da için bir büyüklük içinde yerel insan böbrek korteks28,29,30gelled. Bu matris hydrogels için diğer matris proteinler karşılaştırıldığında böbrek özel hücre sendika korumak için kullanılan fizyolojik bir ortam sağlar. Ayrıca, matris kompozisyon, örneğin, kollajen eklenmesi manipüle edilebilir-ben modeli hastalığı ortamlara çalışma için böbrek fibrozis ve diğer böbrek hastalıkları31,32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

İnsan böbrek LifeCenter Derneği, Organ tedarik kuruluşlar tarafından ayarla etik yönergeleri izleyerek Kuzeybatı tarafından izole. Bu iletişim kuralı Washington Üniversitesi tarafından özetlenen hayvan bakım ve hücre kültür kuralları izler.

1. insan böbrek doku hazırlanması

  1. Decellularization çözüm hazırlanması
    1. 5000 mL kabı ve 70 x 10 mm heyecan bar sterilize.
    2. 1: 1000 (ağırlık: cilt) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) kabı autoclaved deiyonize suyla karıştırın. Çözüm yaklaşık 200 devirde 24 h ya da SDS tamamen eriyene kadar karıştırın tabakta bırakın.
      Not: Genellikle, 2500 mL % 1 SDS çözeltisi tek insan böbreğe decellularize için yeterli olur.
    3. Çözüm 500 mL steril Vakumlu filtre aktarmak ve steril yapışmalı kaplara filtre.
  2. Böbrek dokusunun işleme
    1. Yıkama ve basınçlı kap forseps, iki hemostat bir çift kıskaç, genel hizmet notu makas, iki neşter bıçak kolları, alüminyum folyo ve 36 x 9 mm heyecan bar ile kaplı bir 1000 mL kabı.
    2. Underpad bir doku kültürü başlık satırı. Kabı, steril doku kültürü çanak (150 x 25 mm) ve bütün böbrek organ kapağın yerleştirin. Kabı 500 mL % 1 SDS çözeltisi ile doldurun.
      Not: İnsan böbrekler buz LifeCenter Kuzeybatı dan alınmıştır.
    3. Böbrek steril doku kültürü tabak (Şekil 1A) yerleştirin. Tüm perirenal yağlı hafifçe bir neşter (Şekil 1B) ile renal kapsül çevresinde tıraş tarafından kaldırın.
    4. Neşter, renal kapsül arasında böbrek sonunda üstün temel korteks doku zarar vermeden açık kırmak için yeterince derin ile sığ 8-10 cm kesi yapmak. Böbrek kapsülü iki hemostat kelepçeler (Şekil 1 c) ile korteks doku uzak soyulması tarafından kaldırın.
    5. Koronal uçak boyunca böbrek böbrek (Şekil 1 d) yan tarafındaki neşter kullanarak bisect. Neşter (Şekil 1E) medullar bölgesiyle dışarı oyma tarafından iki yarıyı da dokudan korteks yalıtmak ve korteks doku 0.5 cm3 adet (Şekil 1F) zar. Herhangi bir büyük görünür gemi kaldırın.
  3. Hücre dışı matriks yalıtım
    1. Bir doku kültürü başlık, 1000 mL kabı 500 mL % 1 SDS çözeltisi ile doldurun. Doğranmış korteks doku ve heyecan bar SDS solüsyon içeren kabı yerleştirin. Autoclaved alüminyum folyo ile kabı kapağı ve yaklaşık 400 rpm doku kültürü başlık dışında bir heyecan tabak yerleştirin.
    2. Korteks doku 24 h için heyecan plaka üzerinde kaldıktan sonra kabı bir doku kültürü hood getirmek ve naylon mesh ile yapılan bir 40 µm steril hücre süzgeç ekleyin. Ayrı 1000 mL kabı çamaşır suyu 200 mL ile doldurulması ve doku kültürü mahallede yerleştirin.
    3. SDS Çözüm hücre süzgeç aracılığıyla çamaşır suyu içeren kabı pipet. Sadece decellularized doku ve hücre süzgeç kabı içinde kalıncaya kadar tüm SDS Çözüm pipet.
      Not: Çözüm aspirasyon sırasında kaldırıldı herhangi bir doku hücre süzgeç engelleyecektir.
    4. Hücre süzgeç beher ve dolgu 500 mL taze SDS çözeltisi ile bırakın. Kabı aynı alüminyum folyo ile kapak ve daha önce aynı hızda karıştırın plaka üzerine yerleştirin.
    5. Adımları 1.3.1-1.3.3 24 saatte taze SDS Çözüm ile toplam beş gün için yineleyin.
    6. Durulama decellularized doku autoclaved DI suyla 3 gün toplam her 24 saat teknik takip özetlenen adımları 1.3.1-1.3.3.
    7. Durulama decellularized doku hücre kültür sınıf su her 2 gün toplam 24 h ile teknik takip özetlenen adımları 1.3.1-1.3.3.
    8. Adımları 1.3.1-1.3.2 tekrarlayın. (KECM bu noktadan üzerinde konik tüp kendini ayakta 30 mL anılacaktır) decellularized doku transferi ve tüm doku batık kadar hücre kültür sınıf su ile doldurun.

2. hidrojel hisse senedi çözüm imalatı

  1. Decellularized doku mekanik işleme
    1. Bir doku kültürü başlık, konik tüp içinde kECM 2 min için bir doku homogenizer ile mekanik lunaparkçı.
      Not: Homojenize kECM görünür no adet ECM ile opak bir çözüm benzemelidir.
    2. Artık devam ederse tüp çevreleyen kaynar kadar kECM sıvı azot içeren konik tüp daldırın. KECM-4 ˚C adlı gecede saklayın.
  2. Lyophilization donmuş decellularized doku
    1. Biraz gaz değişimine izin ver ve tüp lyophilization makineye yerleştirmek için konik tüp kapağı gevşetin. KECM üç gündür veya ince, beyaz bir toz benzer kadar lyophilize. -4 ˚C mağazasında.
  3. Solubilization jel ve kimyasal sindirim
    1. Otoklav 20 mL mercek flakon ve kap, 15,9 x 7,9 mm heyecan bar ve ince uçlu forseps bir çift.
    2. Lyophilized kECM tartmak ve HCl ve pepsin kütlesi mpepsin nerede aşağıdaki denklemleri kullanarak bir % 3 (30 mg/mL) çözüm için kECM solubilize için gerekli pepsin kütlesi hacmi hesaplamak, mdoku kütlesi liyofilize doku ve VHCl 0,01 N HCl hacmi.
      Equation 1
      Equation 2
    3. Doku kültürü başlıklı domuz gastrik pepsin, 0.01 N HCl ve heyecan bar mercek şişeyi ekleyin ve tüm pepsin eriyene kadar yaklaşık 500 rpm'de heyecan tabakta bırakın. Lyophilized kECM mercek şişeyi aktarmak ve üç gün boyunca heyecan plaka yaklaşık 500 rpm çözüm bırakmaktır.

3. hidrojel jelleşme

  1. Böbrek ECM hidrojel hazırlık
    1. 1 N NaOH, medya ek (M199), x 10 ile kECM hidrojel hisse senedi çözüm karıştırılarak hidrojel jel ve Kültür medya hücre. Tüm çözümler buz üzerinde tutun.
      Not: 7,5 mg/mL konsantrasyonda son jel hücre kültürü için kullanılmıştır. 1 mL kECM jel sunulan hücre kültürü deneyleri için yeterli idi.
    2. Vson oluşturulan jel hacmi nerede aşağıdaki denklemi kullanarak gerekli stok kECM hidrojel hacmi ve uygulanabilir kECM jel üretilen ses belirlemek için gerekli stok kECM hidrojel hacmi Vhisse senedi kECM olduğunu, Chisse senedi kECM hisse senedi kECM hidrojel konsantrasyonu ise Cson final jel konsantrasyonu:
      Equation 3
    3. 1 N NaOH hacmi VNaOH nerede aşağıdaki denklemleri kullanarak gerekli reaktifler nötralize birim belirlemek, V10 X M199 hacmi 10 X medya ek ve V 1 X hücre kültür medya hacmi:
      Equation 4
      Equation 5
      Equation 6
    4. Bir doku kültürü başlık, steril bir 30 konik tüp kendini ayakta mL nötralize reaktifleri (NaOH, M199 ve hücre kültür medya) pipette. Nötralize reaktif çözüm microspatula ile karıştırın.
    5. Steril 1 mL şırınga hisse senedi kECM hidrojel uygun hacmi nötralize reaktif çözüm aktarmak için kullanın. Bir microspatula kadar homojen bir renk hidrojel çözüm elde edilen karışımı yavaşça çözüm için kullanın.
      Not: yavaş yavaş ve yavaşça karıştırarak tarafından hava kabarcıkları tanıtan kaçının.
    6. Hücreleri kECM hidrojel dahil etmek için kimden adım 3.1.1.3 nötralize çözüm cilt Hesaplamalarda hücre kültür ortamının (V1 X) 10 µL çıkarma.
      1. Hücreleri hücre kültür medya 10 µL askıya alma. Burada #hücreleri askıya almak için hücre sayısı anlamına gelir ve Vson oluşturulan jel hacmi aşağıdaki denklemi kullanarak askıya hücrelerinin sayısı belirleyin:
        Equation 7
        Not: 300.000 hücre/mL kECM jel kullanılan hücre bölgedir.
      2. KECM hisse senedi çözüm reaktif çözüm nötralize ile karışık sonra askıya hücre çözümü 10 µL son kECM jel pipette. Hücreler eşit şekilde dağıtılır kadar çözüm bir microspatula ile karıştırın.
  2. 1 mL şırınga istenen hücre kültür aygıt kECM hidrojel ile doldurmak için kullanın.
  3. Jel aktarma veya hücreleri kaplama önce 1 h için 37 ˚C ayarlamak izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

KECM hidrojel böbrek hücre kültürü ile yerel böbrek microenvironment olarak benzer kimyasal bileşimi için bir matris sağlar. Hidrojel imal etmek, böbrek korteks doku tüm böbrek organ ve doğranmış (Şekil 1) mekanik olarak izole edilmiştir. Decellularization deterjan parçacıkları (Şekil 2A.4-A.6) kaldırmak için su ile durular ardından kimyasal deterjan (Şekil 2A.1-A.3) ile izole böbrek korteks ECM verir. Histolojik değerlendirme onaylar tipik bazal laminer protein kollajen-IV ve laminin ve yapısal protein kollajen gibi gibi-tek olarak vitronectin ile özel durum (2B rakam) kaydetti korunur. Ayrıca, protein kompozisyon, ECM izoformlarının, korunması dahil olmak üzere yerel böbrek ECM (Şekil 3) gözlenen değerleri ile tutarlı kalır. ECM (Şekil 4A) mekanik homojenize ve liyofilize (Şekil 4B) sonra son kECM hidrojel (Şekil 4 c) üretmek için çözündürüldükten. KECM hidrojel opak görünür doku küçük miktarda ile ortaya çıktı ve geleneksel kollajen viskoz değildi-ben hidrojel. 15 mg/mL bir konsantrasyon, genellikle kECM rheological ölçümü ortaya bir karmaşık mod (dinamik elastik modül) yaklaşık 800 Pa üzerinde zorlanma doğrusal dizi değerleri, 7.5 mg/mL kollajen daha önemli ölçüde daha fazla-ben (p = 1.602E-14). Kollajen üzerinde kültürlü insan böbrek peritubular mikrovasküler endotel hücreleri (HKMECs)-ben, kECM ve 1:1 karışımı jel hücre yüzeyleri ve kavşak (Şekil 5) çevresinde CD31 ifadesinde özellikle fenotip, farklılıkları gösterdi. Kollajen üzerinde kültürlü HKMECs-HKMECs içeren kECM görüntülenen iki jeller üzerinde kültürlü düzensiz dağılımları ifadeye CD31 azaltılmış ben üniforma CD31 ifade görüntülenir. Matris türü etkiler yüksek PV1 ve HKMECs düşük VWF ifadede görünmedi.

Figure 1
Şekil 1: yalıtım böbrek korteks dokusunun. Mekanik işleme korteks doku kECM hidrojel için temel bir malzeme olarak izole etmek için bütün böbrek organ. Mekanik yalıtım başlar (A) perirenal yağ dokusu çıkarılması. Yağ dokusundan parça büyük böbrek uzak hemostat kelepçeler ile parçalanmış olması. Yağ doku parçaları kalan bir açıyla renal kapsül karşı bir neşter çalıştırarak kaldırılabilir. (B) renal kapsül en iyi temel doku uzak renal kapsül hemostat kelepçeler ile peeling üstün sonuna böbrek ve (C) boyunca sığ bir kesi yaparak kaldırılır. (D) parçalamak koronal eksen boyunca böbrek korteks ve medulla bölgeleri görselleştirme için sağlar. (E) yalıtım korteks dokusunun en iyi bir neşter ile medulla doku parçalarını oyularak yapılır. Kortikal alanının rengi medullar bölge belirgin bir şekilde koyu ve kullanılabilir iki anatomik olarak farklı dokuları ayırt etmek. Korteks doku son işleme içerir (F) doku içine sonraki decellularization yardım etmek için 0.5 cm3 adet dicing. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: korteks dokusunun Decellularization. Görsel ve histolojik decellularized doku karakterizasyonu. Doğranmış (A.1) Submerging % 1 SDS Çözüm dokusunda korteks neden olan hücreleri ve hücresel malzeme kaldırılması lysing. (A.2) sonra 1 h ve (A.3) 24 h, doku başlar renk kaybetmek, gösteren hücresel madde kaldırıldı olmak. (A.4) 120 h doku beyazlatılmış ve sadece ECM kalır. Durular su (A.5) 24 h ve (A.6) 120 h ile doku herhangi görünür bir değişiklik gösterir. (B) ayirt tedavi edilmezse ve decellularized korteks dokusunun boyama ortaya koymaktadır hücresel maddenin tamamen kaldırılması ve önemli yapısal proteinler korunması (kollajen-IV Col-IV; = laminin LAM; = fibronektin = FN; proteoglikanlar sülfat heparin = HSPG; ve vitronectin VN =). Ölçek = 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: decellularized doku kütle spektroskopisi. Decellularized korteks doku ECM protein kompozisyonu belirlemek için kütle spektrometresi ile analizi. Tüm oranları kitle yüzde ölçülür. (A) yapısal ve bazal lamina ile ilişkili diğer protein kollajen-IV ve ben en çok temsil - hazır bulundu. (B.1) kolajen-IV A1 ve A2 zincirleri, tüm Bodrum membranlar içinde her yerde korunmuş. Kollajen-IV A3 ve A5 zincirleri, mevcut glomerulus sadece membranlar Bodrum da tespit edildi. (B.2) ortak izoformlarının (B.3) kolajen ve laminins-da tespit. Bu rakam izni12ile yeniden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: kECM hidrojel imalatı. Decellularized korteks doku mekanik ve kimyasal işleme uygulanabilir kECM hidrojel jelleşme reaktifler nötralize ile takip yeterli mekanik özellikleri ile verir. (A) ECM görünür No adet kalıncaya kadar decellularized korteks doku mekanik olarak bir doku homogenizer ile homojenize. (B) bir kaba toz lyophilization altında 3 gün sonra kazandıran. (C) Solubilization HCl ve kimyasal sindirim mercek şişe pepsin ile bir uygulanabilir kECM hidrojel sonuçlandı. Hidrojel opak ve bir düşük viskozite. (D) jelleşme reaktifler nötralize ile takip kECM hidrojel fiziksel alan nitelik özellikleri. Rheological deneyler 30 mm çap paralel plaka sistemi ile gerçekleştirilmiştir. Örnek kenarları mineral yağ ile korunan ve yükleme platformu 37 ˚C kurulmuştur. KECM hidrojel test önce 1 h için jel için izin verildi. Visko elastik özellikleri jel % 0,01-20 arasında bir gerginlik süpürme ile ölçüldü. Üç örnek kECM ve kollajen-test edildi (n = 3). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: hücre büyüme karakterizasyonu. Farklı matrisler üzerinde yetiştirilen HKMECs morfolojik farklılıkları karakterizasyonu. Hydrogels reaktifler nötralize ile karışık ve 37 ˚C fresnels polydimethylsiloxane kalıpları içinde 45 dk için ayarlanan. HKMECs jeller yüzeyinde tohumlari ve kültür sabit ve lekeli önce 72 h için devam etti. HKMECs içinde kültürlü immünfloresan görüntüleri (A ve D) 7.5 mg/mL kollajen-ben jel; (B ve E) 7.5 mg/mL kECM jel; ve (C ve F) 7.5 mg/mL 1:1 karışımı jel. (A-C): kırmızı CD31; = yeşil VWF; = Mavi çekirdeği; = ölçek çubuğu 50 µm. (D-F) =: kırmızı F-aktin; = yeşil = PV1; Mavi çekirdeği; = ölçek çubuğu 50 µm =. Bu rakam izni12ile yeniden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Matrisler hücre davranış yöneten önemli mekanik ve kimyasal yardımlar sağlayabilirsiniz. Sentetik hydrogels karmaşık 3 boyutlu desenlendirme destekler ancak fizyolojik matris microenvironments içinde bulunan çeşitli hücre dışı yardım sağlamak başarısız edebiliyoruz. Yerel ECM türetilmiş Hydrogels in vivo ve in vitro çalışmalar için ideal malzemelerdir. Önceki çalışmalarda decellularized ECM hydrogels kök hücre35,36,37 ayırt etmek için ana bilgisayar immünolojik yanıt33,34, önlemek için sentetik Biyomalzeme kat için kullandık , 38, 2D ve yumuşak litografi hücre kültür39,40,41,42için ve 3 boyutlu baskı43, için bioinks hazırlanmasında bir substrat olarak 44 , 45 , 46. ECM hydrogels hücre adezyon başlatmak ve daha fazla yayılmasını önleme ve farklılaşma2,47denetlemek uygun sinyal ile sağlar.

Oranları ve ECM, collagens, laminins, elastin, fibronektin ve glikozaminoglikan, gibi önemli bileşenleri bileşimi doku48,49işlevselliğini ve anatomik konumunu son derece bağlı olan, 50. De ettiren veya nonnative ECM kaynaklı hydrogels kullanarak hücreleri21,51,52,53,54uygunsuz tepkiler temin kuruldu. Böbrek, ECM kompozisyon yaygın anatomik mekanlar1,2arasında değişir. Bu, bu nedenle, korteks, medulla veya Deneysel kullanım için hydrogels imalatı önce papilla gibi bölgeler arasında ayırt etmek önemlidir.

Burada fabrikasyon kECM matris yerli böbrek korteks ECM protein oranları da jelleşme bir fizyolojik ilgili mekanik sertlik3,25,28etkinleştirme sırasında decellularization takip korur, 29,30. Serum albümin, kan plazma protein, eser miktarda büyük olasılıkla decellularization kaçtı heparin bağlama ve55,56durulama nedeniyle decellularized korteks doku içinde tespit edildi. Pepsin, böbrek korteks ECM, yerel olmayan kimyasal hisse senedi kECM çözüm mevcut olsa da, sadece için % 2.5 (w/v) nihai genellikle ürünün hesapları. Ayrıca, pepsin nötralize reaktif çözüm57eklenmesiyle devre dışı olur.

KECM hidrojel böbrek korteks özel hücreleri fizyolojik koşullar altında korunabilir substratı olarak hizmet vermektedir. Bu matris düzlemsel bir yüzeye HKMEC büyüme destekleyebilir gösterdi. Bu HKMECs sakin bir fizyolojik devlet fonksiyonel deneyleri, fenotipik ifade ve genetik ifade58aracılığıyla belirlenen yapılmaktadır. Buna ek olarak, bu hücreleri aktive oldu ne zaman kollajen-ben böbrek fibrozis ile ilişkili bir matris bileşeni kECM hidrojel bir 1:1 oran59eklenmiştir. Buna karşılık, ne zaman insan göbek damar endotel hücreleri kültürlü kollajen üzerinde-, onlar deneniyor yerinde, ve zaman ile karışık oldular kECM12harekete geçirmek. Buna göre kollajen-membran kompozisyon göbek kordonu içinde ayrılmaz bir bileşeni olduğu bilinmektedir ve patolojik devletler gibi preeklampsi38,60altında azalır. Bu sonuçlar hücreleri ile sendika ve aynı zamanda ECM ortamın manipülasyon homeostazı nasıl etkileyebileceğini korumak için doku özel ipuçları sağlayan önemini vurgulayın.

Seviyelendirilmiş yordamdaki tüm adımları önemli ise, birkaç adım fabrikasyon hidrojel canlılığı sağlamada kritik öneme sahiptir. Decellularized korteks doku homojenizasyon derecesini tekniği veya cihazları göre değişir. En iyi doku homojenize bir teknik bulmak önemlidir. Solubilization sırasında pH 3-4 pepsin etkin olduğundan emin olmak için tutulmalıdır. Ne zaman hidrojel reaktifler nötralize ile karıştırma, jel iyice ve hava kabarcıkları giriş olmadan karışık olması gerekir. Tek tip bir karışım elde etmek zor ise, tarafsız olduğundan emin olmak için jel çözüm pH kontrol edin.

Nasıl böbrek hücreleri vitro incelenmesi için fizyolojik ilgili bir matris elde edilebilir bu yöntemde sunulan temsilcisi sonuçlar gösterilmektedir. Decellularized böbrek korteks ECM son hidrojel ürün3' te,25ECM protein oranları korunmuş olarak böbrek kaynaklı hücre büyümesini desteklemek için ideal bir temel malzeme sağlar. Genellikle ürün aynı zamanda fizyolojik ilgili mekanik özelliği28,29,30elde edebilirsiniz. KECM hidrojel için uygun hücre-matris etkileşim sağlar ve böbrek hücreleri daha büyük fizyolojik davranışından daha kollajen temin için gösterilen-ben ne zaman düzlemsel bir yüzeye kültürlü. Ayrıca, hidrojel jelleşme daha fizyolojik ilgili bir 3 boyutlu ortamı modellemek için önce böbrek özgü hücrelerle tohumlari. KECM hidrojel bileşimi de kolayca manipüle edilebilir. Örneğin, hidrojel kollajen değişen miktarlarda karıştırma-ben jelleşme önce böbrek fibrozis31,32ilerici Birleşik taklit matrisler üretmek olabilir. Bilinen hastalıklı ECM besteleri taklit etmek için bu ECM kaynaklı hidrojel ayar daha da soruşturma garanti eder ve böbrek hastalıkları gelecekteki çalışma sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazar Lynn ve Mike Garvey görüntüleme Laboratuvarı kök hücre ve rejeneratif tıp ve LifeCenter Kuzeybatı Enstitüsü'nde kabul etmek istiyorum. Ayrıca mali destek Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe, UH2/UH3 TR000504 (için J.H.) ve DP2DK102258 (için Y.Z.), NIH T32 eğitim hibe DK0007467 (R.J.N.) ve Kuzeybatı böbrek merkezleri için sınırsız bir hediye kabul etmek istiyorum Böbrek Araştırma Enstitüsü.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Preparation of Kidney Tissue
5000 mL Beaker Sigma-Aldrich Z740589
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 436143
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Stir Bar (70 x 10 mm) Fisher Science 14-512-128
500 mL Vacuum Filter VWR 97066-202
Stir Plate Sigma-Aldrich CLS6795420D
1000 mL Beaker Sigma-Aldrich CLS10031L
Forceps Sigma-Aldrich F4642 Any similar forceps may be used
Scissor-Handle Hemostat Clamp Sigma-Aldrich Z168866
Dissecting Scissors Sigma-Aldrich Z265977
Scalpel Handle, No. 4 VWR 25859-000 Any similar scalpel handle may be used
Scalpel Blade, No. 20 VWR 25860-020 Any similar scalpel blade may be used
Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) Fisher Science 14-513-52
Absorbent Underpad VWR 82020-845
Petri Dish (150 x 25 mm) Corning 430597
Autoclavable Biohazard Bag VWR 14220-026
Sterile Cell Strainer (40 um) Fisher Science 22-363-547
Cell Culture Grade Water HyClone SH30529.03
30 mL Freestanding Tube VWR 89012-778
Fabrication of ECM Gel
Tissue Homogenizer Machine Polytron PCU-20110
Freeze Dryer Labconco 7670520
20 mL Glass Scintillation Vials and Cap Sigma-Aldrich V7130
Stir Bar (15.9 x 8 mm) Fisher Science 14-513-62
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa Sigma-Aldrich P7012
0.01 N HCl Sigma-Aldrich 320331 Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water
Kidney ECM Gelation
1 N NaOH (Sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
Medium 199 Sigma-Aldrich M4530
15 mL Conical Tube ThermoFisher 339651
Cell Culture Media ThermoFisher 11330.032 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10082147
Antibiotic-Antimycotic 100X Life Technologies 15240-062
Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X Life Technologies 51300-044
1 mL Syringe Sigma-Aldrich Z192325
Microspatula Sigma-Aldrich Z193208

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lelongt, B., Ronco, P. Role of extracellular matrix in kidney development and repair. Pediatric Nephrology. 18 (8), 731-742 (2003).
  2. Yue, B. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. Journal of Glaucoma. 23, S20-S23 (2014).
  3. Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney International. 56 (6), 2016-2024 (1999).
  4. Petrosyan, A., et al. Decellularized Renal Matrix and Regenerative Medicine of the Kidney: A Different Point of View. Tissue Engineering Part B. 22 (3), 183-192 (2016).
  5. Caralt, M., et al. Optimization and Critical Evaluation of Decellularization Strategies to Develop Renal Extracellular Matrix Scaffolds as Biological Templates for Organ Engineering and Transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (1), 64-75 (2015).
  6. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
  7. Nakayama, K. H., Lee, C. C. I., Batchelder, C. A., Tarantal, A. F. Tissue Specificity of Decellularized Rhesus Monkey Kidney and Lung Scaffolds. Public Library of Science ONE. 8 (5), (2013).
  8. Orlando, G., et al. Production and implantation of renal extracellular matrix scaffolds from porcine kidneys as a platform for renal bioengineering investigations. Annals of Surgery. 256 (2), 363-370 (2012).
  9. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
  10. Choi, S. H., et al. Development of a porcine renal extracellular matrix scaffold as a platform for kidney regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1391-1403 (2015).
  11. Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
  12. Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
  13. Gupta, S. K., Mishra, N. C., Dhasmana, A. Decellularization Methods for Scaffold Fabrication. Methods in Molecular Biology. , 1-10 (2017).
  14. Hudson, T., et al. Optimized Acellular Nerve Graft is Immunologically Tolerated and Supports Regeneration. Tissue Engineering. 10 (11), 1641-1651 (2004).
  15. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
  16. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
  17. Uygun, B., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularied liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
  18. Nagao, R. J., et al. Preservation of Capillary-beds in Rat Lung Tissue Using Optimized Chemical Decellularization. Journal of Materials Chemistry B. 1 (37), 4801-4808 (2013).
  19. Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
  20. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  21. Wolf, M. T., et al. A hydrogel derived from decellularized dermal extracellular matrix. Biomaterials. 33 (29), 7028-7038 (2012).
  22. Fisher, M. B., et al. Potential of healing a transected anterior cruciate ligament with genetically modified extracellular matrix bioscaffolds in a goat model. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 20 (7), 1357-1365 (2012).
  23. Ghuman, H., et al. ECM hydrogel for the treatment of stroke: Characterization of the host cell infiltrate. Biomaterials. 91, 166-181 (2016).
  24. Rijal, G. The decellularized extracellular matrix in regenerative medicine. Regenerative Medicine. 12 (5), 475-477 (2017).
  25. Lennon, R., et al. Global Analysis Reveals the Complexity of the Human Glomerular Extracellular Matrix. Journal of the American Society of Nephrology. 25 (5), 939-951 (2014).
  26. Bonandrini, B., et al. Recellularization of Well-Preserved Acellular Kidney Scaffold Using Embryonic Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1486-1498 (2014).
  27. O'Neill, J. D., Freytes, D. O., Anandappa, A. J., Oliver, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. The regulation of growth and metabolism of kidney stem cells with regional specificity using extracellular matrix derived from kidney. Biomaterials. 34 (38), 9830-9841 (2013).
  28. Streitberger, K. -J., et al. High-resolution mechanical imaging of the kidney. Journal of Biomechanics. 47 (3), 639-644 (2014).
  29. Bensamoun, S. F., et al. Stiffness imaging of the kidney and adjacent abdominal tissues measured simultaneously using magnetic resonance elastography. Clinical Imaging. 35 (4), 284-287 (2011).
  30. Moon, S. K., et al. Quantification of Kidney Fibrosis Using Ultrasonic Shear Wave Elastography. Journal of Ultrasound in Medicine. 34, 869-877 (2015).
  31. Genovese, F., Manresa, A. A., Leeming, D. J., Karsdal, M. A., Boor, P. The extracellular matrix in the kidney: a source of novel non-invasive biomarkers of kidney fibrosis? Fibrogenesis & Tissue Repair. 7 (1), (2014).
  32. Hewitson, T. D. Fibrosis in the kidney: is a problem shared a problem halved? Fibrogenes & Tissue Repair. 5 (1), S14 (2012).
  33. Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
  34. Faulk, D. M., et al. ECM hydrogel coating mitigates the chronic inflammatory response to polypropylene mesh. Biomaterials. 35 (30), 8585-8595 (2014).
  35. Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels To Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
  36. Kim, M. -S., et al. Differential Expression of Extracellular Matrix and Adhesion Molecules in Fetal-Origin Amniotic Epithelial Cells of Preeclamptic Pregnancy. Public Library of Science ONE. 11 (5), e0156038 (2016).
  37. Paduano, F., Marrelli, M., White, L. J., Shakesheff, K. M., Tatullo, M. Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells on Hydrogel Scaffolds Derived from Decellularized Bone Extracellular Matrix and Collagen Type I. Public Library of Science ONE. 11 (2), e0148225 (2016).
  38. Viswanath, A., et al. Extracellular matrix-derived hydrogels for dental stem cell delivery. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (1), 319-328 (2017).
  39. Uriel, S., et al. Extraction and Assembly of Tissue-Derived Gels for Cell Culture and Tissue Engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 15 (3), 309-321 (2009).
  40. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  41. Faust, A., et al. Urinary bladder extracellular matrix hydrogels and matrix-bound vesicles differentially regulate central nervous system neuron viability and axon growth and branching. Journal of Biomaterials Applications. 31 (9), 1277-1295 (2017).
  42. Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
  43. Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
  44. Pati, F., et al. Biomimetic 3D tissue printing for soft tissue regeneration. Biomaterials. 62, 164-175 (2015).
  45. Wang, R. M., Christman, K. L. Decellularized myocardial matrix hydrogels: In basic research and preclinical studies. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 77-82 (2016).
  46. Jang, J., et al. 3D printed complex tissue construct using stem cell-laden decellularized extracellular matrix bioinks for cardiac repair. Biomaterials. 112, 264-274 (2017).
  47. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
  48. Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 771-785 (2014).
  49. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
  50. Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials - Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
  51. Uriel, S., et al. The role of adipose protein derived hydrogels in adipogenesis. Biomaterials. 29 (27), 3712-3719 (2008).
  52. Singelyn, J. M., et al. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
  53. Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
  54. Loneker, A. E., Faulk, D. M., Hussey, G. S., D'Amore, A., Badylak, S. F. Solubilized liver extracellular matrix maintains primary rat hepatocyte phenotype in-vitro. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (4), 957-965 (2016).
  55. Hill, R. C., Calle, E. A., Dzieciatkowska, M., Niklason, L. E., Hansen, K. C. Quantification of extracellular matrix proteins from a rat lung scaffold to provide a molecular readout for tissue engineering. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 961-973 (2015).
  56. Li, Q., et al. Proteomic analysis of naturally-sourced biological scaffolds. Biomaterials. 75, 37-46 (2016).
  57. Tanaka, T., Yada, R. Y. N-terminal portion acts as an initiator of the inactivation of pepsin at neutral pH. Protein Engineering. 14 (9), 669-674 (2001).
  58. Ligresti, G., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (8), 2370-2381 (2016).
  59. Mozes, M. M., Böttinger, E. P., Jacot, T. A., Kopp, J. B. Renal expression of fibrotic matrix proteins and of transforming growth factor-beta (TGF-beta) isoforms in TGF-beta transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (2), 271-280 (1999).
  60. Romanowicz, L., Galewska, Z. Extracellular matrix remodeling of the umbilical cord in pre-eclampsia as a risk factor for fetal hypertension. Journal of Pregnancy. 2011, 542695 (2011).

Tags

Biyomühendislik sayı: 140 biyomühendislik doku mühendisliği hücre dışı matriks hidrojel böbrek endotel hücreleri
Bir böbrek korteks ekstraselüler matrisi elde edilen hidrojel imalatı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hiraki, H. L., Nagao, R. J.,… More

Hiraki, H. L., Nagao, R. J., Himmelfarb, J., Zheng, Y. Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel. J. Vis. Exp. (140), e58314, doi:10.3791/58314 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter