Summary
Nous présentons ici un protocole pour fabriquer un rein cortex extracellulaire dérivé de matrice hydrogel pour conserver la composition biochimiques et structurales du rein natif de la matrice extracellulaire (MEC). Le processus de fabrication et ses applications sont décrites. Enfin, un point de vue sur l’utilisation de cet hydrogel pour soutenir la bioingénierie et la régénération cellulaire et tissulaire rénale spécifique est discutée.
Abstract
Matrice extracellulaire (ECM) fournit des indices biochimiques et biophysiques importants pour maintenir l’homéostasie tissulaire. Hydrogels synthétiques actuels offrent soutien mécanique robuste pour in vitro culture cellulaire, mais n’ont pas la composition protéique et ligand nécessaire pour provoquer un comportement physiologique des cellules. Ce manuscrit décrit une méthode de fabrication pour un rein cortex dérivés ECM hydrogel avec bonne robustesse mécanique et la composition biochimique favorable. L’hydrogel est fabriquée par mécaniquement l’homogénéisation et cortex DECELLULARISE rein humain ECM de solubilisation. La matrice conserve les rapports de protéine native rein cortex ECM tout en permettant aussi de gélification à des rigidités mécaniques physiologiques. L’hydrogel sert de substrat sur lequel rein cortex dérivées des cellules peuvent être maintenus dans des conditions physiologiques. En outre, la composition de l’hydrogel peut être manipulée pour modéliser un environnement malade qui permet l’étude future des maladies rénales.
Introduction
Matrice extracellulaire (ECM) fournit des indices biochimiques et biophysiques importants pour maintenir l’homéostasie tissulaire. La composition moléculaire complexe régit les propriétés structurales et fonctionnelles du tissu. Protéines structurales confèrent des cellules la conscience spatiale et permettent pour l’adhérence et la migration1. Ligands liés interagissent avec les récepteurs de surface cellulaire pour contrôler le comportement de cellule2. Rein ECM contient une multitude de molécules dont la composition et structure varie selon la localisation anatomique, stade de développement et maladie état3,4. Récapitulant la complexité de l’ECM est un élément clé dans l’étude des cellules rénales in vitro.
Les tentatives précédentes à reproduire des micro-environnements ECM ont porté sur decellularizing tissus ensemble pour créer des échafaudages capables de recellularization. DÉCELLULARISATION a été exécutée avec des détergents chimiques comme le dodécylsulfate de sodium (SDS) ou détergents non ioniques, et il utilise soit organe entier perfusion ou immersion et agitation méthodes5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. Les échafaudages présentées ici préserver les indices biochimiques et structurales, trouvés dans les tissus natifs ECM ; en outre, recellularization avec les cellules de donneur spécifique a pertinence clinique en chirurgie reconstructive14,15,16,17,18, 19. Toutefois, ces échafaudages manquent de flexibilité structurelle et sont donc incompatibles avec de nombreux appareils actuelles utilisés pour des études in vitro . Pour contourner cette limitation, de nombreux groupes ont transformés DECELLULARISE ECM en hydrogels20,21,22,23,24. Ces hydrogels sont compatibles avec bioink et moulage par injection et contourner les contraintes spatiales d’échelle micromètre qui DECELLULARISE lieu d’échafaudages sur les cellules. En outre, composition moléculaire et ratios trouvés dans les natif CME sont conservés3,25. Nous démontrons une méthode pour fabriquer un hydrogel dérivé du cortex rénal ECM (kECM).
Ce protocole vise à produire un hydrogel qui réplique le microenvironnement de la région corticale du rein. Tissu de cortex rénal est DECELLULARISE dans une solution à 1 % SDS sous agitation constante pour enlever les matières cellulaires. SDS est couramment utilisé pour decellularize les tissus en raison de sa capacité à supprimer rapidement immunologique cellulaire matériau6,7,9,26. Le kECM est ensuite soumis à l’homogénéisation mécanique et lyophilisation5,6,9,11,26. Solubilisation dans un acide fort avec la pepsine se traduit par un hydrogel final solution mère20,27. Protéines kECM indigènes qui sont importants pour la structure support et signalent transduction sont conservés3,25. L’hydrogel peut également être gélifié à un ordre de grandeur du rein humain natif cortex28,29,30. Cette matrice fournit un environnement physiologique qui a été utilisé pour maintenir la quiescence des cellules de rein spécifiques par rapport aux hydrogels d’autres protéines de la matrice. En outre, composition de la matrice peut être manipulée, par exemple, grâce à l’ajout de collagène-je, aux milieux de maladie de modèle pour l’étude de la fibrose rénale et autres reins maladies31,32.
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Protocol
Reins humains ont été isolées du Nord-Ouest LifeCenter, suivant les directives éthiques fixés par l’Association des organisations de marchés orgue. Ce protocole suit animaux soins et cellule culture lignes directrices établies par l’Université de Washington.
1. préparation du tissu rénal humain
- Préparation de la solution de DÉCELLULARISATION
- Stériliser un bécher de 5000 mL et d’un bar de remuer de 70 x 10 mm.
- Mélanger 1/1000 (poids : volume) dodécylsulfate de sodium (SDS) dans l’eau désionisée autoclavé dans le bécher. Laisser la solution sur une plaque de remuer à environ 200 tr/min pendant 24 h ou jusqu'à ce que le SDS soit complètement dissout.
Remarque : En général, 2 500 mL de solution de SDS 1 % est suffisante pour decellularize un seul rein humain. - Transvaser la solution dans un filtre stérile sous vide de 500 mL et filtrer dans des contenants scellés stérilisés.
- Traitement du tissu rénal
- Laver et stériliser une paire de pinces, pince hémostatique deux pinces, une paire de ciseaux de qualité des services généraux, deux poignées de lame de bistouri Swann-Morton, un bécher de 1 000 mL, recouvert de papier d’aluminium et d’un bar de remuer de 36 x 9 mm.
- Ligne une hotte de culture tissulaire avec thibaude. Placer le bécher, un plat de vitroplants stérile (150 x 25 mm) et de l’organe rein entier dans la hotte. Remplir le bécher de 500 mL de solution de SDS de 1 %.
Remarque : Reins humains ont été reçus sur la glace du Nord-Ouest de LifeCenter. - Placer le rein dans le plat de vitroplants stérile (Figure 1 a). Enlevez toute la graisse périrénales en rasant légèrement autour de la capsule rénale avec un scalpel (Figure 1 b).
- Faire une incision peu profonde 8-10 cm avec le scalpel, juste assez profonde pour briser la capsule rénale sans endommager les tissus sous-jacents du cortex, à l’extrémité supérieure du rein. Retirer la capsule rénale par peeling il loin le tissu cortex avec deux colliers de serrage de pince hémostatique (Figure 1).
- Coupent les reins le long du plan coronal en utilisant le scalpel le long du côté latéral du rein (Figure 1). Isoler des tissus de cortex sur les deux moitiés de tailler la région médullaire avec le scalpel (Figure 1E) et couper en dés le tissu de cortex en morceaux de3 cm 0,5 (Figure 1F). Supprimer n’importe quel gros vaisseaux visibles.
- Isolement de la matrice extracellulaire
- Sous une hotte de culture tissulaire, remplir un bécher de 1 000 mL avec 500 mL de solution de SDS de 1 %. Placez la barre de tissu et remuez de cortex en dés dans le bécher contenant la solution SDS. Couvrir le bécher d’une feuille d’aluminium autoclavé et placez-le sur une plaque de remuer à environ 400 tr/min à l’extérieur de la hotte de la culture de tissus.
- Après que le tissu de cortex a été sur la plaque de remuer pendant 24 h, amener le bécher dans une hotte de culture de tissus et ajouter une crépine de cellules stériles de 40 µm faite d’un filet en nylon. Remplir un bécher distinct 1000 mL avec 200 mL d’eau de Javel et placez-le dans la hotte de la culture de tissus.
- Distribuer la solution SDS à travers le tamis cellulaire dans le bécher contenant l’eau de Javel. Pipetter tous la solution SDS jusqu'à ce que seulement le tissu DECELLULARISE et la crépine de la cellule restent dans le bécher.
Remarque : La crépine de la cellule devrait empêcher n’importe quel tissu de se détacher pendant l’aspiration de la solution. - Laissez la crépine de la cellule dans le gobelet et le remplir avec 500 mL d’une solution fraîche SDS. Couvrir le bécher avec la même feuille d’aluminium et placer sur une plaque de remuer à la même vitesse qu’avant.
- Répétez les étapes 1.3.1-1.3.3 toutes les 24 heures avec une solution fraîche SDS pour un total de cinq jours.
- Rincer le tissu DECELLULARISE avec autoclave DI l’eau toutes les 24 h pour total de 3 jours, suivant la technique décrite dans les étapes 1.3.1-1.3.3.
- TISSU DECELLULARISE rinçage avec l’eau de qualité de culture cellulaire toutes les 24 h pour 2 jours au total, selon la technique décrite dans étapes 1.3.1-1.3.3.
- Répétez les étapes 1.3.1-1.3.2. Transférer le tissu DECELLULARISE (dénommé kECM de ce point sur) dans un 30 mL autoportante tube à fond conique et remplissez-le d’eau de qualité de culture cellulaire jusqu'à ce que tous les tissus sont immergé.
2. fabrication de Solution-mère d’Hydrogel
- Traitement mécanique du tissu DECELLULARISE
- Sous une hotte de culture tissulaire, mécaniquement homogénéiser le kECM dans le tube à fond conique avec un homogénéisateur de tissu pendant 2 min.
Remarque : KECM homogénéisé doit ressembler à une solution opaque avec aucune pièce visible d’ECM. - Immerger le tube conique contenant le kECM dans l’azote liquide jusqu'à ébullition entourant le tube n’est plus persiste. Stocker le kECM à-4 ° c durant la nuit.
- Sous une hotte de culture tissulaire, mécaniquement homogénéiser le kECM dans le tube à fond conique avec un homogénéisateur de tissu pendant 2 min.
- Lyophilisation des gelées de tissu DECELLULARISE
- Desserrer légèrement le bouchon du tube à fond conique pour permettre l’échange de gaz et placer le tube dans une machine de lyophilisation. Lyophiliser le kECM pendant trois jours, ou jusqu'à ce qu’elle ressemble à une fine poudre blanche. Magasin à-4 ° c.
- Solubilisation de gel et de la digestion chimique
- Autoclave un flacon de 20 mL à scintillation et cap, un bar de remuer 15,9 x 7,9 mm et une paire de pinces de fine pointe.
- Peser le kECM lyophilisée et calculer le volume de HCl et de la masse de pepsine nécessaire à solubiliser le kECM à une solution à 3 % (30 mg/mL) en utilisant les équations suivantes, où lapepsine de m est la masse de la pepsine, mtissu est la masse de tissu lyophilisé et VHCl est le volume de 0,01 N HCl :
- Sous une hotte de culture de tissus, s’ajoute la pepsine gastrique porcine, 0,01 N HCl et la barre de remuer le flacon à scintillation et laissez-le dans une assiette mélanger à environ 500 tr/min, jusqu'à ce que toute la pepsine a dissous. Transférer le kECM lyophilisé dans le flacon à scintillation et laisser la solution sur une plaque de remuer à environ 500 tr/min pendant trois jours.
3. Hydrogel gélification
- Préparation d’hydrogel rein ECM
- L’hydrogel de gel en mélangeant la solution kECM hydrogel avec NaOH N 1, 10 x Media supplément (M199) et les milieux de culture de cellules. Garder toutes les solutions sur la glace.
Remarque : Gel définitif des concentrations de 7,5 mg/mL ont été utilisées pour la culture cellulaire. 1 mL de gel kECM suffisait pour les expériences de culture cellulaire présentés. - Déterminer le volume de gel kECM réalisable produit et le volume d’hydrogel kECM stock nécessaire à l’aide de l’équation suivante, où Vfinal est le volume de gel créé, Vstock kECM est le volume d’hydrogel kECM stock nécessaire, CkECM stock est la concentration de l’hydrogel kECM stock et Cfinal est la concentration du gel définitif :
- Déterminer le volume de neutraliser les réactifs utilisés en utilisant les équations suivantes, où VNaOH est le volume de NaOH N 1, V10 X est le volume de M199 s’ajoutent 10 médias de X et V1 X est la volume de milieux de culture cellulaire :
- Sous une hotte de culture tissulaire, Pipetter les réactifs neutralisants (NaOH, M199 et milieux de culture cellulaire) dans un 30 mL stérile autoportante tube à fond conique. Mélanger la solution de réactif neutralisant avec une microspatula.
- Utiliser une seringue stérile 1 mL pour transférer le volume approprié de stock kECM hydrogel à la solution de réactif neutralisant. Utiliser un microspatula pour mélanger doucement la solution jusqu'à l’obtention d’une homogène en solution d’hydrogel de couleur.
Remarque : Éviter l’introduction de bulles d’air en remuant délicatement. - Pour intégrer les cellules dans l’hydrogel kECM, soustraire les calculs de volume de solution neutralisante en étape 3.1.1.3 10 µL de milieux de culture cellulaire (V,1 X).
- Suspendre les cellules dans 10 µL de milieux de culture cellulaire. Déterminer le nombre de cellules ne s’appliquera pas à l’aide de l’équation suivante, où #cellules indique le nombre de cellules à suspendre et Vfinal est le volume de gel créé :
Remarque : 300 000 cellules/mL est la concentration de cellules utilisées dans le gel kECM. - Pipeter le 10 µL de solution de cellule suspendu dans le gel kECM final après que la solution kECM a été mélangée avec la solution de réactif de neutralisation. Agiter la solution avec un microspatula jusqu'à ce que les cellules sont réparties uniformément.
- Suspendre les cellules dans 10 µL de milieux de culture cellulaire. Déterminer le nombre de cellules ne s’appliquera pas à l’aide de l’équation suivante, où #cellules indique le nombre de cellules à suspendre et Vfinal est le volume de gel créé :
- L’hydrogel de gel en mélangeant la solution kECM hydrogel avec NaOH N 1, 10 x Media supplément (M199) et les milieux de culture de cellules. Garder toutes les solutions sur la glace.
- Utiliser une seringue de 1 mL pour remplir un dispositif de culture de cellule désirée avec l’hydrogel kECM.
- Laisser le gel à fixé à 37 ° c pendant 1 h avant de transférer ou d’électrodéposition de cellules.
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Representative Results
L’hydrogel kECM fournit une matrice pour culture de cellules de rein avec une composition chimique similaire comme le microenvironnement rein natif. Pour fabriquer l’hydrogel, tissu de cortex rénal est mécaniquement isolé d’un organe rein entier et coupé en dés (Figure 1). DÉCELLULARISATION avec un détergent chimique (Figure 2 a.1-A.3) suivie de rinçages à l’eau pour enlever les particules de détergent (Figure 2 a.4-A.6) conduit isolé rein cortex ECM. Une évaluation histologique confirme typiques basales protéines laminaires comme collagène-IV et la laminine et structurale des protéines comme le collagène-j’ai même conservé, a noté la vitronectine comme l’unique exception (Figure 2 b). En outre, la composition en protéines, y compris la préservation des isoformes, dans l’ECM reste conforme aux valeurs observées dans le rein natif ECM (Figure 3). L’ECM (Figure 4 a) est homogénéisé mécaniquement et lyophilisée (Figure 4 b) puis solubilisé pour produire l’hydrogel kECM final (Figure 4). L’hydrogel kECM apparu opaque avec de petites quantités de tissu visible et n’était pas aussi visqueux comme le collagène traditionnel-j’ai hydrogel. Mesure rhéologique de kECM gélifié à une concentration de 15 mg/mL a révélé un module complexe (module d’élasticité dynamique) d’environ 800 valeurs Pa pendant l’intervalle linéaire de souche, nettement supérieure à celle du collagène de 7,5 mg/mL-je (p = 1.602E-14). Rein humain péritubulaire cellules endothéliales microvasculaires (HKMECs) cultivés sur le collagène-I, kECM et un gel de mélange 1:1 a montré des différences dans le phénotype, spécifiquement dans l’expression de CD31 autour des surfaces cellulaires et jonctions (Figure 5). HKMECs cultivés sur le collagène-j’ai affiché uniforme CD31 expression HKMECs cultivés sur les deux gels contenant kECM affiche réduisant CD31 expression répartition inégale. Type de matrice ne semblait pas affect le PV1 élevé et faible expression de VWF dans les HKMECs.
Figure 1 : isolement du tissu de cortex rénal. Traitement mécanique d’un organe rein entier pour isoler le tissu cortex comme un matériau de base pour l’hydrogel kECM. Isolation mécanique commence par (A) l’ablation du tissu adipeux périrénal. Grandes pièces de tissu adipeux peuvent être arrachés au rein avec pinces pince hémostatique. Restant des morceaux de tissu adipeux peut être enlevé en exécutant un scalpel contre la capsule rénale à un angle. (B) la capsule rénale est mieux enlevée par une incision peu profonde le long de l’extrémité supérieure du rein et (C) peeling la capsule rénale loin les tissus sous-jacents aux pinces pince hémostatique. (D) traverse les reins le long de l’axe de la coronaire permet la visualisation des régions du cortex et médullaire. (E) isolation du tissu cortex est préférable en découpant des morceaux du tissu médullaire avec un scalpel. La couleur de la région corticale est nettement plus sombre que celle de la région médullaire et permet de différencier les deux tissus anatomiquement distinctes. Traitement final du tissu cortex (F) consiste à découper le tissu en morceaux de3 cm 0,5 pour aider à DÉCELLULARISATION ultérieure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : DÉCELLULARISATION de tissu de cortex. Caractérisation visuelle et histologique du tissu DECELLULARISE. Submerging (A.1) coupé en dés tissus cortex en solution à 1 % SDS provoque la lyse des cellules et l’enlèvement du matériel cellulaire. Après (A.2) 1 h et (A.3) 24h, le tissu commence à perdre la couleur, la matière cellulaire indiquant est enlevé. Par (A.4) 120 h, le tissu est blanchie et reste seulement l’ECM. Rinçages à l’eau à (A.5) 24h et (A.6) 120 h ne montrent aucun changement visible au tissu. (B) immunofluorescence la coloration des tissus non traités et DECELLULARISE cortex révèle près d’une élimination complète de la matière cellulaire et de la préservation des protéines structurales majeures (collagène-IV = Col-IV ; laminine = LAM ; la fibronectine = FN ; héparine sulfate de protéoglycanes = HSPG ; et la vitronectine = VN). Scale = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : spectroscopie de masse de tissu DECELLULARISE. Analyse du tissu DECELLULARISE cortex par spectrométrie de masse pour déterminer la composition en protéines ECM. Tous les rapports sont mesurés en pourcentage massique. (A) structural et autres protéines associées à la membrane basale étaient présents avec le collagène IV et - j’ai le plus fortement représenté. Chaînes (B.1) collagène-IV A1 et A2, omniprésents dans les membranes basales, ont été conservés. Chaînes de collagène-IV A3 et A5, présents seulement dans les membranes basales glomérulaires, ont aussi été détectés. (B.2) commune isoformes de laminines et du collagène (B.3)-je devais également détecté. Cette figure a été reproduite avec la permission de12. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Fabrication d’hydrogel kECM. Traitement mécanique et chimique des tissus du cortex DECELLULARISE donne un hydrogel kECM réalisable avec des propriétés mécaniques suffisantes après gélification avec neutralisation des réactifs. (A) cortex decellularized tissu est homogénéisé mécaniquement avec un homogénéisateur de tissu jusqu'à ce qu’aucune pièce visible d’ECM. (B) une poudre grossière a été donnée après 3 jours en vertu de la lyophilisation. (C) la solubilisation dans HCl et digestion chimique avec la pepsine dans un flacon à scintillation a entraîné un hydrogel kECM réalisable. L’hydrogel était opaque et d’une faible viscosité. (D) caractérisation physique de l’hydrogel kECM après gélification avec neutralisation des réactifs. Rhéologiques expériences ont été réalisées avec un système de plaques parallèles de diamètre 30 mm. Les bords de l’échantillon ont été protégés avec de l’huile minérale et la rampe de chargement a été fixée à 37 ° c. L’hydrogel kECM pouvait de gel pendant 1 h avant le test. Les propriétés viscoélastiques du gel ont été mesurées avec un balayage de souche entre 0,01 à 20 %. Trois échantillons de kECM et collagène-j’étais mis à l’essai (n = 3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : caractérisation de la croissance des cellules. Caractérisation des différences morphologiques dans HKMECs cultivés sur différentes matrices. Hydrogels ont été mélangées avec neutralisation réactifs et fixés à 37 ° c pendant 45 min dans des moules de polydiméthylsiloxane claire-voie. HKMECs ont été ensemencées sur la surface des gels et maintenues en culture pendant 72 h avant d’être fixées et colorées. Images par immunofluorescence des HKMECs cultivées en collagène de 7,5 mg/mL (A et D)-j’ai le gel ; Gel de kECM 7,5 mg/mL (B et E) ; et le gel de mélange 1:1 de 7,5 mg/mL (C et F). (A-C) : rouge = CD31 ; vert = VWF ; bleu = noyaux ; Echelle = 50 µm. (D-F) : rouge = actine-F ; vert = PV1 ; bleu = noyaux ; Echelle = 50 µm. Cette figure a été reproduite avec la permission de12. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Matrices fournissent des signaux mécaniques et chimiques importantes qui régissent le comportement de la cellule. Hydrogels synthétiques sont capables de soutenir la structuration 3-dimensional complexe mais ne parviennent pas à fournir les divers signaux extracellulaires dans des micro-environnements matrice physiologique. Hydrogels dérivés ECM natif sont des matériaux idéaux pour les études aussi bien in vivo et in vitro . Des études antérieures ont utilisé DECELLULARISE ECM hydrogels pour enrober des biomatériaux synthétiques afin d’éviter les33,des réponses immunologiques hôte34, pour différencier des cellules souches35,,du3637 , 38, comme substrat pour lithographie 2D et soft cell culture39,40,41,42et en prévision de bioinks pour impression 3 dimensions43, 44 , 45 , 46. hydrogels ECM fournissent des cellules avec une signalisation appropriée initialiser adhérence et contrôler davantage la prolifération et la différenciation de2,47.
Les ratios et la composition des principaux composants de l’ECM, tels que les collagènes laminines, élastine, fibronectine et glycosaminoglycanes, sont fortement tributaires de la localisation anatomique et la fonctionnalité des tissus48,49, 50. Il est bien établi que l’utilisation non spécifiques ou exotiques dérivés ECM hydrogels sera provoquer des réponses incorrects de cellules21,51,52,53,54. Dans le rein, composition ECM varie beaucoup entre les sites anatomiques1,2. Par conséquent, il est important de différencier entre les régions comme le cortex, bulbe ou papille avant fabrication hydrogels pour utilisation expérimentale.
La matrice kECM fabriquée ici conserve les rapports protéines ECM de rein natif cortex suite DÉCELLULARISATION tout en permettant aussi de gélification à une rigidité mécanique physiologiquement pertinents3,25,28, 29,30. Sérum albumine, une protéine du plasma sanguin, a été détectée dans des traces dans le tissu DECELLULARISE cortex, peut-être en raison de la liaison à l’héparine qui s’était échappée de DÉCELLULARISATION et rinçage55,56. Bien que la pepsine, un produit chimique non indigènes rein cortex ECM, est présente dans la solution stock kECM, il ne représente que 2,5 % (p/v) du produit final gélifié. En outre, la pepsine devient désactivée avec l’addition des réactifs solution neutralisante57.
L’hydrogel kECM sert de substrat sur lequel les cellules rénales cortex spécifiques peuvent être maintenus dans des conditions physiologiques. Nous avons démontré que cette matrice peut soutenir la croissance de HKMEC sur une surface plane. Ces HKMECs maintient un état de repos physiologique tel que déterminé par le biais de tests fonctionnels, l’expression phénotypique et génétique expression58. En revanche, ces cellules sont devenus activées lorsque collagène-I, un élément de matrice en corrélation avec la fibrose rénale, on m’a ajouté à l’hydrogel kECM à un ratio de 1:159. Par comparaison, lorsque les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine ont été cultivées sur le collagène-je, ils étaient tranquilles, et lorsqu’il est mélangé avec kECM ils deviennent activés12. Par conséquent, le collagène-I est connu pour être une partie intégrante de la composition de la membrane basale dans le cordon ombilical et diminue sous états pathologiques tels que la prééclampsie38,60. Ces résultats soulignent l’importance de fournir des cellules avec des indices de tissu-spécifique pour maintenir la quiescence et aussi comment la manipulation du milieu ECM peut affecter l’homéostasie.
Considérant que toutes les étapes de la procédure décrite sont importants, plusieurs étapes sont essentielles pour assurer la viabilité de l’hydrogel fabriqué. Le degré d’homogénéisation du tissu DECELLULARISE cortex variera selon la technique ou le matériel utilisé. Il est important de trouver une technique qui sera mieux homogénéiser les tissus. Au cours de la solubilisation, le pH doit être maintenu au 3-4 pour s’assurer que la pepsine est active. Lorsque vous mélangez l’hydrogel avec neutralisation des réactifs, le gel doit être mélangé à fond et sans l’introduction de bulles d’air. Si un mélange uniform est difficile à obtenir, vérifier le pH de la solution de gel pour assurer qu'il est neutre.
Les résultats représentatifs présentés dans cette méthode démontrent comment une matrice physiologiquement pertinente pour l’étude in vitro de cellules rénales peut être atteints. DECELLULARISE rein cortex ECM propose un matériau de base idéal pour soutenir la croissance des cellules dérivées de rein comme protéines ECM, les rapports sont conservés dans l’hydrogel final produit3,25. Le produit gélifié peut atteindre également des propriétés mécaniques physiologiquement pertinents28,29,30. L’hydrogel kECM permet des interactions cellule-matrice appropriée et a été montré pour susciter une plus grande comportement physiologique des cellules de rein de collagène-j’ai lorsqu’il est cultivé sur une surface plane. En outre, l’hydrogel peut être ensemencée avec des cellules de rein spécifiques avant gélification pour modéliser un environnement 3D plus physiologiquement pertinent. La composition de l’hydrogel kECM peut également être facilement manipulée. Par exemple, mélanger l’hydrogel avec des quantités variables de collagène-j’avant gélification pouvais produire des matrices qui imitent les États progressistes de la fibrose rénale31,32. La première de cet hydrogel dérivé ECM pour imiter les célèbres compositions de ECM malades garantit davantage enquête et permettra l’étude future des maladies rénales.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à souligner la Lynn et Mike Garvey Imaging de laboratoire à l’Institut des cellules souches et médecine régénérative et LifeCenter du Nord-Ouest. Ils aimerait également remercier le soutien financier de subventions National Institutes of Health, TR000504 UH2/UH3 (à J.H.) et DP2DK102258 (à Y.Z.), NIH T32 formation grant DK0007467 (pour R.J.N.) et un don sans restriction par les centres de rein du Nord-Ouest à la Institut de recherche de rein.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
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