Summary
Hier presenteren we een protocol om een nier cortex extracellulaire matrix afkomstige hydrogel te behouden van de inheemse nier extracellulaire matrix (ECM) structurele en biochemische samenstelling. Het fabricageprocédé en de toepassingen daarvan worden beschreven. Tot slot, een perspectief over het gebruik van deze hydrogel ter ondersteuning van de nier-specifieke cellulaire en weefsels regeneratie en bioengineering wordt besproken.
Abstract
Extracellulaire matrix (ECM) biedt belangrijke biofysische en biochemische signalen te handhaven van de weefsel homeostase. Huidige synthetische hydrogels bieden robuuste mechanische ondersteuning voor in vitro cultuur van de cel, maar gebrek aan de nodige eiwitten en ligand samenstelling om te ontlokken fysiologische gedrag uit cellen. Dit manuscript wordt een fabricage methode voor een nier cortex ECM-afgeleide hydrogel beschreven met goede mechanische robuustheid en ondersteunende biochemische samenstelling. De hydrogel is vervaardigd door mechanisch homogenisatie en solubilizing decellularized menselijke nieren cortex ECM. De matrix behoudt inheemse nier cortex ECM eiwit ratio's, maar ook het inschakelen van gelering aan fysiologische mechanische stiffnesses. De hydrogel fungeert als een substraat op welke nier cortex-afgeleide cellen onder fysiologische omstandigheden kunnen worden gehandhaafd. Bovendien kan de hydrogel samenstelling worden gemanipuleerd om het model van een zieke omgeving waarmee de toekomstige studie van nierziekten.
Introduction
Extracellulaire matrix (ECM) biedt belangrijke biofysische en biochemische signalen te handhaven van de weefsel homeostase. De complexe moleculaire samenstelling regelt zowel structurele en functionele eigenschappen van weefsel. Structurele proteïnen cellen voorzien van ruimtelijke bewustzijn en zorgen voor de hechting en migratie1. Afhankelijke liganden interactie met cel oppervlakte receptoren waarmee cel gedrag2. Nier ECM bevat een overvloed aan moleculen waarvan de samenstelling en structuur hangt af van de anatomische locatie, ontwikkelingsstadium en ziekte staat3,4. De complexiteit van ECM Recapitulerend is een belangrijk aspect bij het bestuderen van de nier-afgeleide cellen in vitro.
Eerdere pogingen om het repliceren van de ECM microenvironments hebben gericht op decellularizing hele weefsel maken steigers staat recellularization. Decellularization is uitgevoerd met chemische schoonmaakmiddelen zoals natrium dodecyl sulfaat (SDS) of niet-ionogene schoonmaakmiddelen, en het maakt gebruik van beide hele orgel perfusie of onderdompeling en agitatie methoden5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. De steigers die hier gepresenteerd behouden de signalen van het structurele en biochemische gevonden in native weefsel ECM; Bovendien, recellularization met donor-specifieke cellen heeft klinische relevantie van reconstructieve chirurgie14,15,16,17,18, 19. echter deze steigers ontbreken van structurele flexibiliteit en zijn daarom niet compatibel met vele huidige apparaten die worden gebruikt voor in vitro studies. Om deze beperking te overwinnen, hebben vele groepen decellularized ECM verder verwerkt tot hydrogels20,21,22,23,24. Deze hydrogels zijn compatibel met spuitgieten en bioink en micrometer schaal ruimtelijke beperkingen die decellularized steigers plaats op cellen te omzeilen. Bovendien zijn moleculaire samenstelling en ratio's gevonden in native ECM3,25bewaard. Hier tonen we een methode om een hydrogel afgeleid van nier cortex ECM (kECM).
Het doel van dit protocol is voor de productie van een hydrogel die de communicatie van de corticale nier-regio repliceert. Cortex nierweefsel is decellularized in een oplossing van de SDS 1% onder constante agitatie verwijderen van cellulaire zaak. SDS wordt vaak gebruikt voor decellularize weefsel vanwege de mogelijkheid om snel te verwijderen immunologische cellulaire materiële6,7,9,26. De kECM is vervolgens onderworpen aan mechanische homogenisering en lyofilisatie5,6,9,11,26. Solubilisatie in een sterk zuur met pepsine resulteert in een definitieve hydrogel stockoplossing20,27. Inheemse kECM eiwitten die belangrijk voor structurele zijn steun en signaal transductie3,25worden bewaard. De hydrogel kan ook worden gegeleerde naar binnen één orde van grootte van inheemse menselijke nieren cortex28,29,30. Deze matrix biedt een fysiologische omgeving die is gebruikt om de onbeweeglijkheid van nier-specifieke cellen in vergelijking met hydrogels van andere matrix-proteïnen. Bovendien, matrix samenstelling kan worden gemanipuleerd, bijvoorbeeld door de toevoeging van collageen-I model ziekte omgevingen voor de studie van de renale fibrose en andere nier ziekten31,32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijke nieren waren geïsoleerd door LifeCenter Northwest na ethische richtsnoeren die door de vereniging van orgel aanbestedingen organisaties. Dit protocol volgt dierlijke zorg en cel cultuur richtsnoeren door de Universiteit van Washington.
1. bereiding van menselijke nierweefsel
- Bereiding van de oplossing van de decellularization
- Steriliseren een 5000 mL-bekerglas en een roer-bar van 70 x 10 mm.
- Meng 1:1000 (gewicht: volume) natrium dodecyl sulfaat (SDS) in de gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water in het bekerglas. Laat de oplossing op een bord roer bij ongeveer 200 omwentelingen per minuut gedurende 24 uur of totdat de SDS volledig is opgelost.
Opmerking: 2500 mL 1% SDS oplossing is meestal voldoende om een enkele menselijke nier decellularize. - Breng de oplossing over in een 500 mL steriele vacuüm filter en het filter in gesteriliseerde afsluitbare containers.
- Verwerking van nierweefsel
- Wassen en autoclaaf een paar pincet, twee hemostat klemmen, een paar algemene dienst rang schaar, twee scalpel blad handvaten, een bekerglas van 1000 mL, bedekt met aluminiumfolie en een bar van de roer 36 x 9 mm.
- Lijn de kap van een weefselkweek met underpad. Plaats het bekerglas, een steriele weefselkweek schotel (150 x 25 mm), en de hele nier-orgel in de kap. Vul het bekerglas met 500 mL van 1% SDS-oplossing.
Opmerking: De menselijke nieren werden ontvangen op ijs vanuit het noordwesten van de LifeCenter. - Plaats de nier in de steriele weefselkweek schotel (figuur 1A). Verwijder alle perirenal vet door licht scheren rond de renale capsule met een scalpel (figuur 1B).
- Maak een incisie ondiepe 8-10 cm met de scalpel, gewoon diep genoeg open te breken de renale capsule zonder beschadiging van het onderliggende weefsel van de cortex, over de superieure einde van de nier. Verwijder de renale capsule door het uit de buurt van het weefsel van de cortex peeling met twee hemostat klemmen (Figuur 1 c).
- Bisect de nieren langs de coronale vlak met behulp van de scalpel langs de laterale kant van de nier (Figuur 1 d). Isoleren cortex weefsel van beide helften door houtsnijwerk uit de medullar regio met de scalpel (figuur 1E) en het weefsel van de cortex dobbelstenen in 0.5 cm3 stukken (figuur 1F). Verwijder geen grote zichtbaar schepen.
- Isolatie van extracellulaire matrix
- In de kap van een weefselkweek, vul in een bekerglas van 1000 mL met 500 mL van 1% SDS-oplossing. De blokjes cortex weefsel en roer de staaf van de plaats af in het bekerglas met SDS oplossing. Dek het bekerglas af met gesteriliseerde met autoclaaf aluminiumfolie en plaats deze op een bord roer van ongeveer 400 toeren per minuut buiten de weefselkweek kap.
- Nadat de cortex weefsel op de roer plaat voor 24u is, het bekerglas brengen een weefselkweek kap en voeg een 40 µm steriele cel zeef gemaakt met nylon gaas. Vul een aparte 1000 mL-bekerglas met 200 mL bleekwater en plaats deze in de weefselkweek kap.
- Pipetteer uit de SDS-oplossing door de zeef van de cel in het bekerglas van bleekmiddel. Pipetteer uit alle SDS oplossing totdat alleen decellularized weefsel en de cel zeef in het bekerglas overblijven.
Opmerking: De cel zeef moet voorkomen dat elk weefsel wordt verwijderd tijdens de oplossing streven. - Laat de zeef van de cel in het bekerglas en de opvulling met 500 mL verse SDS oplossing. Dek het bekerglas af met de dezelfde aluminiumfolie en plaats op een bord roer met dezelfde snelheid als vóór.
- Herhaal stappen 1.3.1-1.3.3 elke 24 uur met verse SDS oplossing voor een totaal van vijf dagen.
- Spoel decellularized weefsel met gesteriliseerde met autoclaaf DI water elke 24u voor 3 dagen totaal, volgend op de beschreven in stappen 1.3.1-1.3.3 techniek.
- Spoel decellularized weefsel met cel cultuur rang water elke 24u voor totaal in 2 dagen, volgend op de beschreven in stappen 1.3.1-1.3.3 techniek.
- Herhaal stappen 1.3.1-1.3.2. Breng het decellularized weefsel (hierna aangeduid als kECM vanaf dit punt op) in een 30 mL zelf permanent conische buis en vullen met cel cultuur rang water totdat al het weefsel ondergedompeld.
2. fabricage van Hydrogel Stock oplossing
- Machinale verwerking van decellularized weefsel
- In de kap van een weefselkweek, mechanisch Meng de kECM binnen de conische buis met een homogenizer weefsel gedurende 2 minuten.
Opmerking: Gehomogeniseerde kECM moet lijken op een ondoorzichtige oplossing met geen zichtbare stukken voor ECM. - Het onderdompelen van de conische buis met de kECM in vloeibare stikstof tot koken rond de buis niet langer aanhoudt. Slaan de kECM op-4 ˚C's nachts.
- In de kap van een weefselkweek, mechanisch Meng de kECM binnen de conische buis met een homogenizer weefsel gedurende 2 minuten.
- Lyofilisatie van bevroren decellularized weefsel
- Iets los de conische buis dop toestaan voor gasuitwisseling en plaats de buis in een lyofilisatie machine. Lyophilize de kECM gedurende drie dagen of totdat het lijkt op een fijn wit poeder. Winkel op-4 ˚C.
- Chemische spijsvertering en solubilisatie van gel
- Autoclaaf een flesje van 20 mL Scintillatie en GLB, een 15,9 x 7.9 mm roer bar, en een paar van de verlostang fine-tip.
- Wegen van het gelyofiliseerd kECM en berekenen van het volume van HCl en massa van pepsine die nodig zijn om de solubilize van de kECM tot een oplossing van 3% (30 mg/mL) met behulp van de volgende vergelijkingen, waar mpepsine is de massa van pepsine, m,weefsel is de massa van gelyofiliseerd weefsel, en VHCl is het volume 0,01 N HCl:
- In de kap van een weefselkweek, varkens maagzuur-pepsine, 0,01 N HCl en de roer-bar aan de Scintillatie flacon toevoegen, en laat het op een bord roer bij ongeveer 500 omwentelingen per minuut totdat alle de pepsine heeft opgelost. De gelyofiliseerd kECM overbrengen in de flacon Scintillatie en laat de oplossing op een bord roer bij ongeveer 500 t/min voor drie dagen.
3. Hydrogel gelering
- Nier ECM hydrogel voorbereiding
- De hydrogel door het mengen van de kECM hydrogel stockoplossing met 1 N NaOH, 10 x Media Supplement (M199), gel en cel voedingsbodems. Houd alle oplossingen op het ijs.
Opmerking: Definitieve gel concentraties van 7,5 mg/mL werden gebruikt voor de cultuur van de cel. 1 mL van kECM gel volstond voor cel cultuur experimenten gepresenteerd. - Bepalen van de hoeveelheid werkbare kECM gel geproduceerd en volume van voorraad kECM hydrogel nodig met behulp van de volgende vergelijking, waar laatste V = het volume van gel gemaakt, Vvoorraad kECM is de omvang van de voorraad kECM hydrogel nodig, Cvoorraad kECM is de concentratie van de voorraad kECM hydrogel en definitieve C is de concentratie van de uiteindelijke gel:
- Bepalen van de omvang van de reagentia die nodig zijn met behulp van de volgende vergelijkingen, waar VNaOH is het volume van 1 N NaOH te neutraliseren, 10 X V = het volume van M199 10 X media aanvullen en V1 X is de volume van cel-cultuur-media:
- Pipetteer in een weefselkweek kap, de neutraliserende reagentia (NaOH, M199 en cel voedingsbodems) in een steriele 30 mL zelf permanent conische buis. Meng de neutraliserende reagens-oplossing met een microspatula.
- Gebruik een steriele 1 mL spuit om de juiste hoeveelheid voorraad kECM hydrogel naar de neutraliserende reagens oplossing. Gebruik een microspatula om de oplossing voorzichtig mengen totdat een homogene in kleur hydrogel oplossing wordt verkregen.
Opmerking: Vermijd invoering van luchtbellen door langzaam en voorzichtig roeren. - Als u wilt nemen de cellen in de kECM hydrogel, aftrekken 10 µL van cel voedingsbodems (V1 X) van de neutraliserende oplossing volume berekeningen in stap 3.1.1.3.
- Cellen in 10 µL van cel voedingsbodems opschorten. Bepaal het aantal cellen worden opgeschort door met de volgende vergelijking, waar #cellen impliceert het aantal cellen op te schorten enlaatste V = het volume van gel gemaakt:
Opmerking: 300.000 cellen/mL is de concentratie van cellen die gebruikt worden in de kECM gel. - Pipetteer de 10 µL van cel geschorst oplossing in de laatste kECM gel nadat de stockoplossing van kECM heeft vermengd met het neutraliseren van reagens oplossing. Roer de oplossing om met een microspatula totdat de cellen zijn gelijkmatig verdeeld.
- Cellen in 10 µL van cel voedingsbodems opschorten. Bepaal het aantal cellen worden opgeschort door met de volgende vergelijking, waar #cellen impliceert het aantal cellen op te schorten enlaatste V = het volume van gel gemaakt:
- De hydrogel door het mengen van de kECM hydrogel stockoplossing met 1 N NaOH, 10 x Media Supplement (M199), gel en cel voedingsbodems. Houd alle oplossingen op het ijs.
- Gebruik een 1 mL spuit te vullen een gewenste cel cultuur apparaat met de kECM hydrogel.
- Laat de gel op 37 ˚C gedurende 1 uur vóór de overdracht of plating cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De kECM hydrogel biedt een matrix voor cultuur van de cel van de nier met dezelfde chemische samenstelling als de inheemse nier-communicatie. Om de hydrogel, is cortex nierweefsel mechanisch geïsoleerd uit een hele nier orgel en in blokjes gesneden (Figuur 1). Decellularization met een chemische schoonmaakmiddel (figuur 2A.1-A.3) gevolgd door spoelen met water om detergent deeltjes (figuur 2A.4-A.6) te verwijderen levert geïsoleerde nier cortex ECM. Histologische evaluatie bevestigt typische basale laminaire eiwitten zoals collageen-IV en laminin en structurele eiwitten zoals collageen-ik worden bewaard, met vitronectin als de enige opgemerkt uitzondering (figuur 2B). Bovendien blijft het eiwit samenstelling, met inbegrip van behoud van isoforms, in de ECM stroken met de waargenomen waarden in native nier ECM (Figuur 3). De ECM (figuur 4A) is mechanisch gehomogeniseerd en gelyofiliseerd (figuur 4B) vervolgens ontbindend tot de uiteindelijke kECM hydrogel (figuur 4C). De kECM hydrogel verscheen ondoorzichtig met kleine hoeveelheden zichtbare weefsel en was niet zo viskeuze als traditionele collageen-ik hydrogel. Rheologische meting van gegeleerde kECM met een concentratie van 15 mg/mL bleek een complexe modulus (dynamische elasticiteitsmodulus) van ongeveer 800 Pa over het lineaire bereik van stam waarden, aanzienlijk groter dan die van 7,5 mg/mL collageen-ik (p = 1.602E-14). Menselijke nier peritubular microvasculaire endotheliale cellen (HKMECs) gekweekt op collageen-I, kECM, en een 1:1-mengsel gel toonde verschillen in fenotype, specifiek in de CD31 expressie rond cel oppervlakken en kruispunten (Figuur 5). HKMECs gekweekt op collageen-ik uniforme CD31 expressie weergegeven terwijl HKMECs gekweekt is op de twee gels met kECM weergegeven verminderd CD31 expressie in ongelijke verdelingen. Type matrix lijken niet te beïnvloeden de hoge PV1 en lage VWF expressie in de HKMECs.
Figuur 1: isolatie van cortex nierweefsel. Machinale verwerking van een orgaan van de hele nier te isoleren van de cortex weefsel als een basismateriaal voor de kECM hydrogel. Mechanische isolatie begint met (A) het verwijderen van het vetweefsel van de perirenal. Grote stukken van vetweefsel kunnen worden gescheurd uit de buurt van de nier met hemostat klemmen. Resterende stukken van vetweefsel kan worden verwijderd door het uitvoeren van een scalpel tegen de renale capsule in een hoek. (B) de renale capsule is het best verwijderd door een ondiepe snede langs het superieure einde van de nier- en (C) de renale capsule uit de buurt van het onderliggende weefsel peeling met hemostat klemmen. (D) bisecting van de nier langs de coronale as zorgt voor de visualisatie van de cortex en medulla regio's. (E) isolatie van de cortex weefsel gebeurt best door houtsnijwerk uit stukken van de medulla weefsel met een scalpel. De kleur van de corticale regio merkbaar donkerder is dan die van de medullar regio en kan worden gebruikt onderscheiden van de twee anatomisch verschillende weefsels. Definitieve verwerking van het weefsel van de schors omvat (F) het weefsel dobbelen in 0.5 cm3 stukjes om te helpen bij de latere decellularization. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Decellularization van weefsel van de cortex. Visuele en histologische karakterisatie van decellularized weefsel. (A.1) Submerging in blokjes gesneden cortex weefsel in 1% SDS oplossing veroorzaakt lysing van cellen en verwijdering van celmateriaal. Na (A.2) 1 h en (A.3) 24 h, het weefsel begint te verliezen van kleur, met vermelding van de cellulaire kwestie wordt verwijderd. Door (A.4) 120 h het weefsel is geblancheerd en alleen de ECM blijft. Spoelen met water bij (A.5) 24u en (A.6) 120 h Toon geen zichtbare veranderingen in het weefsel. (B) immunofluorescentie vlekken van onbehandeld en decellularized cortex weefsel blijkt in de buurt van volledige verwijdering van cellulaire materie en het behoud van belangrijke structurele proteïnen (collageen-IV = Col-IV; laminin = LAM; fibronectine = FN; heparine proteoglycans sulfaat = HSPG; en vitronectin = VN). Schaal = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: massa spectroscopie van decellularized weefsel. Analyse van de decellularized cortex weefsel door massaspectrometrie ECM eiwit samenstelling bepalen. Alle verhoudingen worden gemeten als massa procent. (A) de structurele en andere eiwitten die zijn gekoppeld aan de basale lamina waren aanwezig met collageen-IV en -ik het sterkst vertegenwoordigd. (B.1) collageen-IV A1 en A2 kettingen, alomtegenwoordig in alle kelder membranen, werden bewaard. Collageen-IV A3 en A5 kettingen, huidige alleen in kelder membranen van de glomerulus, werden ook ontdekt. (B.2) gemeenschappelijke isoforms van laminins en (B.3) collageen-ik ook werden ontdekt. Deze afbeelding is gereproduceerd met toestemming12. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: fabricage kECM hydrogel. Mechanische en chemische verwerking van decellularized cortex weefsel levert een werkbare kECM hydrogel met voldoende mechanische eigenschappen na gelering met reagentia te neutraliseren. (A) decellularized cortex weefsel is mechanisch gehomogeniseerd met een homogenizer weefsel tot geen zichtbare stukken voor ECM blijven. (B) een grof poeder was na 3 dagen onder lyofilisatie opgeleverd. (C) solubilisatie in de HCl en chemische spijsvertering met pepsine in een flesje van scintillatie resulteerde in een werkbare kECM hydrogel. De hydrogel was ondoorzichtig en van een lage viscositeit. (D) lichamelijk karakterisatie van de kECM hydrogel na gelering met reagentia te neutraliseren. Rheologische experimenten werden uitgevoerd met een 30 mm diameter parallel-plaatsysteem. De randen van de steekproef zijn beveiligd met minerale olie en het laadplatform werd vastgesteld op 37 ˚C. De kECM hydrogel mocht gel gedurende 1 uur vóór de test. Visco eigenschappen van de gel werden gemeten met een sweep spanning tussen 0,01 tot 20%. Drie monsters van zowel kECM en collageen-ik werden getest (n = 3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: cel groei karakterisering. Karakterisatie van morfologische verschillen in HKMECs gekweekt op verschillende matrices. Hydrogels werden gemengd met het neutraliseren van reagentia en vastgesteld op 37 ˚C gedurende 45 min. in open-faced Polydimethylsiloxaan mallen. HKMECs werden zaadjes op het oppervlak van de gels en bewaard in cultuur gedurende 72 uur voordat wordt vastgesteld en gekleurd. Immunefluorescentie beelden van HKMECs gekweekt (A en D) 7,5 mg/mL collageen-ik gel; (B en E) 7,5 mg/mL kECM gel; en (C en F) 7,5 mg/mL 1:1-mengsel gel. (A-C): rood = CD31; groen = VWF; blauw = kernen; schaal bar = 50 µm. (D-F): rood = F-actine; groen = PV1; blauw = kernen; schaal bar = 50 µm. Deze afbeelding is gereproduceerd met toestemming12. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Matrices bieden belangrijke mechanische en chemische signalen die cel gedrag. Synthetische hydrogels kunnen ondersteunen complexe 3-dimensionale patronen, maar niet aan de uiteenlopende extracellulaire aanwijzingen gevonden in fysiologische matrix microenvironments geven. Hydrogels afgeleid van inheemse ECM zijn ideale materialen voor zowel in vivo en in vitro studies. Eerdere studies hebben gebruikt decellularized ECM hydrogels jas synthetische biomaterialen om te voorkomen dat de host immunologische reacties33,34, zodat u kunt onderscheiden van stamcellen35,36,,37 , 38, als substraat voor 2D en zachte lithografie cel cultuur39,40,41,42, en ter voorbereiding van bioinks van 3-dimensionale afdrukken43, 44 , 45 , 46. ECM hydrogels geven cellen met juiste signalering te initiëren hechting verder proliferatie en differentiatie van de2,47.
De ratio's en de samenstelling van de belangrijkste bestanddelen van de ECM, zoals collagens, laminins, elastine, fibronectin en glycosaminoglycanen, zijn sterk afhankelijk van de anatomische locatie en de functionaliteit van het weefsel48,49, 50. Het is reeds lang gevestigd dat het gebruik van nonspecific of nonnative ECM-afgeleide hydrogels ongepaste reacties van cellen21,51,52,53,,54zal ontlokken. In de nier varieert ECM samenstelling sterk tussen anatomische locatie1,2. Het is daarom belangrijk om te differentiëren tussen regio's zoals de cortex, medulla of Papil voordat het fabriceren van hydrogels voor experimenteel gebruik.
De kECM matrix vervaardigd hier bewaart inheemse nier cortex ECM eiwit ratio's na decellularization terwijl ook gelering tot een fysiologisch relevante mechanische stijfheid3,25,28, 29,30. Serumalbumine, een bloed plasma-eiwit, werd ontdekt in bedragen op te sporen binnen de decellularized cortex weefsel, mogelijk als gevolg van de binding met heparine die ontsnapt decellularization en spoelen55,,56. Hoewel pepsine, een uitheemse chemische stof aan nier cortex ECM, aanwezig in de voorraad kECM oplossing is, alleen bedraagt 2,5% (m/v) van het eindproduct gegeleerde. Bovendien wordt de pepsine gedeactiveerd met de toevoeging van de neutraliserende reagens oplossing57.
De kECM hydrogel fungeert als een substraat waarop nier cortex-specifieke cellen onder fysiologische omstandigheden kunnen worden gehandhaafd. We toonden aan dat deze matrix HKMEC groei op een vlakke ondergrond steunen kan. Deze HKMECs een sluimerende fysiologische staat zoals bepaald door functionele testen, fenotypische expressie en genetische expressie58. In tegenstelling, deze cellen werd geactiveerd wanneer collageen-ik, een onderdeel van de matrix gecorreleerd met nier fibrosis, werd toegevoegd aan de kECM hydrogel bij een verhouding 1:1-59. Ter vergelijking, wanneer menselijke navelstreng ader endotheliale cellen werden gekweekt op collageen-ik, ze geven, en wanneer gemengd met kECM ze werd geactiveerd12. Dienovereenkomstig, collageen-ik staat bekend als een integraal onderdeel van de kelder membraan samenstelling binnen de navelstreng en is afgenomen onder pathologische toestanden zoals pre-eclampsie38,60. Deze resultaten wijzen op het belang van het verstrekken van cellen met weefsel-specifieke signalen onbeweeglijkheid en ook hoe de manipulatie van de ECM-omgeving kan invloed hebben op homeostase te handhaven.
Overwegende dat alle stappen in de aangegeven procedure belangrijk zijn, hebben verscheidene stappen zorgen voor de levensvatbaarheid van de gefabriceerde hydrogel. De mate van homogenisering van de decellularized cortex weefsel zal variëren afhankelijk van de techniek of de apparatuur gebruikt. Het is belangrijk om te vinden van een techniek die zal best het homogeniseren van het weefsel. Tijdens solubilisatie, dient de pH-waarde worden bewaard bij 3-4 om dat de pepsine is actief. Bij het mengen van de hydrogel met reagentia te neutraliseren, moet de gel grondig en zonder de invoering van luchtbellen worden gemengd. Als een uniforme mengsel moeilijk is te verkrijgen, controleert u de pH van de gel-oplossing om ervoor te zorgen dat het is neutraal.
De representatieve resultaten gepresenteerd in deze methode tonen aan hoe een fysiologisch relevante matrix voor de in vitro -studie van nier cellen kan worden bereikt. Decellularized nier cortex ECM biedt een ideale basis materiaal ter ondersteuning van de nier afkomstige celgroei als ECM eiwit ratio's zijn bewaard in de definitieve hydrogel product3,25. Het gegeleerde product kunnen ook fysiologisch relevante mechanische eigenschappen28,29,30. De kECM hydrogel voorziet van de juiste cel-matrix interacties en is aangetoond dat grotere fysiologische gedrag van nier cellen dan collageen ontlokken-ik wanneer gekweekt op een vlakke ondergrond. Bovendien kan de hydrogel bezaaid worden met nier-specifieke cellen vóór gelering model een meer fysiologisch relevante 3-dimensionale omgeving. De samenstelling van de kECM hydrogel kan ook gemakkelijk worden gemanipuleerd. Bijvoorbeeld het mengen van de hydrogel met wisselende hoeveelheden van collageen-ik voorafgaand aan de gelering matrices die progressieve staten van renale fibrose31,32nabootsen kon produceren. De tunability van deze ECM-afgeleide hydrogel na te bootsen van bekende zieke ECM composities zal garandeert verder onderzoek en de toekomstige studie van nierziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs wil erkennen de Lynn en Mike Garvey Imaging laboratorium op het Instituut voor regeneratieve geneeskunde, stamcel en LifeCenter NorthWest. Zij wil ook de financiële steun van de National Institutes of Health subsidies, UH2/UH3 TR000504 (naar J.H.) en DP2DK102258 (voor Y.Z.), NIH T32 opleiding subsidie DK0007467 (R.J.N.) en een onbeperkte geschenk van de Northwest nier centra aan de Nier onderzoek instituut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
References
- Lelongt, B., Ronco, P. Role of extracellular matrix in kidney development and repair. Pediatric Nephrology. 18 (8), 731-742 (2003).
- Yue, B. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. Journal of Glaucoma. 23, S20-S23 (2014).
- Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney International. 56 (6), 2016-2024 (1999).
- Petrosyan, A., et al. Decellularized Renal Matrix and Regenerative Medicine of the Kidney: A Different Point of View. Tissue Engineering Part B. 22 (3), 183-192 (2016).
- Caralt, M., et al. Optimization and Critical Evaluation of Decellularization Strategies to Develop Renal Extracellular Matrix Scaffolds as Biological Templates for Organ Engineering and Transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (1), 64-75 (2015).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
- Nakayama, K. H., Lee, C. C. I., Batchelder, C. A., Tarantal, A. F. Tissue Specificity of Decellularized Rhesus Monkey Kidney and Lung Scaffolds. Public Library of Science ONE. 8 (5), (2013).
- Orlando, G., et al. Production and implantation of renal extracellular matrix scaffolds from porcine kidneys as a platform for renal bioengineering investigations. Annals of Surgery. 256 (2), 363-370 (2012).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choi, S. H., et al. Development of a porcine renal extracellular matrix scaffold as a platform for kidney regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1391-1403 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
- Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
- Gupta, S. K., Mishra, N. C., Dhasmana, A. Decellularization Methods for Scaffold Fabrication. Methods in Molecular Biology. , 1-10 (2017).
- Hudson, T., et al. Optimized Acellular Nerve Graft is Immunologically Tolerated and Supports Regeneration. Tissue Engineering. 10 (11), 1641-1651 (2004).
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Uygun, B., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularied liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
- Nagao, R. J., et al. Preservation of Capillary-beds in Rat Lung Tissue Using Optimized Chemical Decellularization. Journal of Materials Chemistry B. 1 (37), 4801-4808 (2013).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Wolf, M. T., et al. A hydrogel derived from decellularized dermal extracellular matrix. Biomaterials. 33 (29), 7028-7038 (2012).
- Fisher, M. B., et al. Potential of healing a transected anterior cruciate ligament with genetically modified extracellular matrix bioscaffolds in a goat model. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 20 (7), 1357-1365 (2012).
- Ghuman, H., et al. ECM hydrogel for the treatment of stroke: Characterization of the host cell infiltrate. Biomaterials. 91, 166-181 (2016).
- Rijal, G. The decellularized extracellular matrix in regenerative medicine. Regenerative Medicine. 12 (5), 475-477 (2017).
- Lennon, R., et al. Global Analysis Reveals the Complexity of the Human Glomerular Extracellular Matrix. Journal of the American Society of Nephrology. 25 (5), 939-951 (2014).
- Bonandrini, B., et al. Recellularization of Well-Preserved Acellular Kidney Scaffold Using Embryonic Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1486-1498 (2014).
- O'Neill, J. D., Freytes, D. O., Anandappa, A. J., Oliver, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. The regulation of growth and metabolism of kidney stem cells with regional specificity using extracellular matrix derived from kidney. Biomaterials. 34 (38), 9830-9841 (2013).
- Streitberger, K. -J., et al.
- Bensamoun, S. F., et al. Stiffness imaging of the kidney and adjacent abdominal tissues measured simultaneously using magnetic resonance elastography. Clinical Imaging. 35 (4), 284-287 (2011).
- Moon, S. K., et al. Quantification of Kidney Fibrosis Using Ultrasonic Shear Wave Elastography. Journal of Ultrasound in Medicine. 34, 869-877 (2015).
- Genovese, F., Manresa, A. A., Leeming, D. J., Karsdal, M. A., Boor, P. The extracellular matrix in the kidney: a source of novel non-invasive biomarkers of kidney fibrosis? Fibrogenesis & Tissue Repair. 7 (1), (2014).
- Hewitson, T. D. Fibrosis in the kidney: is a problem shared a problem halved? Fibrogenes & Tissue Repair. 5 (1), S14 (2012).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Faulk, D. M., et al. ECM hydrogel coating mitigates the chronic inflammatory response to polypropylene mesh. Biomaterials. 35 (30), 8585-8595 (2014).
- Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels To Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
- Kim, M. -S., et al. Differential Expression of Extracellular Matrix and Adhesion Molecules in Fetal-Origin Amniotic Epithelial Cells of Preeclamptic Pregnancy. Public Library of Science ONE. 11 (5), e0156038 (2016).
- Paduano, F., Marrelli, M., White, L. J., Shakesheff, K. M., Tatullo, M. Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells on Hydrogel Scaffolds Derived from Decellularized Bone Extracellular Matrix and Collagen Type I. Public Library of Science ONE. 11 (2), e0148225 (2016).
- Viswanath, A., et al. Extracellular matrix-derived hydrogels for dental stem cell delivery. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (1), 319-328 (2017).
- Uriel, S., et al. Extraction and Assembly of Tissue-Derived Gels for Cell Culture and Tissue Engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 15 (3), 309-321 (2009).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Faust, A., et al. Urinary bladder extracellular matrix hydrogels and matrix-bound vesicles differentially regulate central nervous system neuron viability and axon growth and branching. Journal of Biomaterials Applications. 31 (9), 1277-1295 (2017).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Pati, F., et al. Biomimetic 3D tissue printing for soft tissue regeneration. Biomaterials. 62, 164-175 (2015).
- Wang, R. M., Christman, K. L. Decellularized myocardial matrix hydrogels: In basic research and preclinical studies. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 77-82 (2016).
- Jang, J., et al. 3D printed complex tissue construct using stem cell-laden decellularized extracellular matrix bioinks for cardiac repair. Biomaterials. 112, 264-274 (2017).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 771-785 (2014).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials - Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Uriel, S., et al. The role of adipose protein derived hydrogels in adipogenesis. Biomaterials. 29 (27), 3712-3719 (2008).
- Singelyn, J. M., et al. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
- Loneker, A. E., Faulk, D. M., Hussey, G. S., D'Amore, A., Badylak, S. F. Solubilized liver extracellular matrix maintains primary rat hepatocyte phenotype in-vitro. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (4), 957-965 (2016).
- Hill, R. C., Calle, E. A., Dzieciatkowska, M., Niklason, L. E., Hansen, K. C. Quantification of extracellular matrix proteins from a rat lung scaffold to provide a molecular readout for tissue engineering. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 961-973 (2015).
- Li, Q., et al. Proteomic analysis of naturally-sourced biological scaffolds. Biomaterials. 75, 37-46 (2016).
- Tanaka, T., Yada, R. Y. N-terminal portion acts as an initiator of the inactivation of pepsin at neutral pH. Protein Engineering. 14 (9), 669-674 (2001).
- Ligresti, G., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (8), 2370-2381 (2016).
- Mozes, M. M., Böttinger, E. P., Jacot, T. A., Kopp, J. B. Renal expression of fibrotic matrix proteins and of transforming growth factor-beta (TGF-beta) isoforms in TGF-beta transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (2), 271-280 (1999).
- Romanowicz, L., Galewska, Z. Extracellular matrix remodeling of the umbilical cord in pre-eclampsia as a risk factor for fetal hypertension. Journal of Pregnancy. 2011, 542695 (2011).
