Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

تحليل يستند إلى الخلية للتحقيق غير العضلات الميوسين الثاني Contractility عبر gastrulation مطوية إشارات الطريق في المورفولوجية S2R + الخلايا

doi: 10.3791/58325 Published: August 19, 2018

Summary

هنا يصف لنا مقايسة contractility المورفولوجية S2R + الخلايا باستخدام. ويؤدي التطبيق [ليغند] خارجية، مطوية جاستروليشن (الضباب)، إلى تفعيل الضباب مما يشير إلى كونتراكتيليتي المسار والخلوية. يمكن استخدام هذا الفحص للتحقيق في تنظيم البروتينات الخلوية كونتراكتيليتي في الضباب مما يشير إلى المسار.

Abstract

وقد وضعنا يستند إلى الخلية مقايسة استخدام الخلايا المورفولوجية التي يجمل انقباض قمي بدأها gastrulation مطوية (الضباب)، مورفوجين طلائي يفرز. في هذا التحليل، كالضباب مؤثر لتنشيط رو من خلال سلسلة إشارات تتضمن مستقبلات (ميست) إلى جانب البروتين ز وبروتين Gα12/13 (سلك شائك/Cta)، والتي تحتوي على مجال بدز جوانين النوكليوتيدات تبادل عامل (RhoGEF2). الضباب مما يشير إلى النتائج في إعادة تنظيم cytoskeleton أكتين لتشكيل سلسلة مال الهوس سريعة ودراماتيكية. الضباب للذوبان يتم جمعها من خط خلية مستقرة وتطبيق اكتوبيكالي S2R + الخلايا، مما يؤدي إلى التغييرات الشكلية مثل انقباض قمي، لوحظت عملية خلال العمليات الإنمائية مثل جاسترولاتيون. هذا التحليل هو قابلة للفرز الفائق، واستخدام [رني]، يمكن أن تسهل تحديد جينات إضافية تشارك في هذا المسار.

Introduction

وأثبتت الدراسات embryogenesis أجريت مع الكائنات نموذج الجينية لا تقدر بثمن لفهمنا لكيفية تجميع الخلايا في الأنسجة. الدراسات المورفولوجية ميلانوجاستير، على وجه الخصوص، أدت إلى تحديد الجينات الرئيسية والمبادئ البيولوجية أن المباشرة في morphogenesis والتنمية من الكائنات الحية من الإخصاب إلى مرحلة البلوغ1،2 , 3-بالتوازي مع البحث الجيني الذي أجرى مع المورفولوجية، خطوط الخلايا المستزرعة المستمدة من الأنسجة ذبابة الفاكهة وظهرت أيضا كنظام قوي لمعالجة مجموعة واسعة من الجزيئات والخلايا البيولوجية الأسئلة4، 5 , 6- المورفولوجية زراعة أنسجة خلايا لها متطلبات الحد الأدنى للصيانة، كما أنها تربى في درجة حرارة الغرفة ودون CO2. على هذا النحو، فقابله للتصوير عالي الدقة، ولديهم درجة عالية من القابلية لتثبيط الجينات [رني]6،7. العديد من المجموعات قد استخدمت خلايا الأنسجة ثقافة المورفولوجية كأداة لاكتشاف الجينات المعنية في تحديد شكل الخلية وديناميكية cytoskeletal والجدوى، البلعمه والإشارات تنبيغ مسارات4،8، 9،،من1011. عندما تستخدم كنموذج جنبا إلى جنب مع الحيوان كله، خطوط الخلايا المورفولوجية المستزرعة توفر مجموعة من نهج تكميلية جداً أن التعجيل بتحديد الجزيئات الهامة لتطوير وتوفير إطار تحديد هذه الأدوار آليا إلى12. هنا، نحن تصف تحليل يستند إلى الخلية لدراسة مسارات الإشارات التي تؤدي إلى انقباض قمي عبر gastrulation مطوية (الضباب) مسار13،14. يسمح هذا التحليل يستند إلى الخلية contractility الباحثين للتحقيق على حد سواء الضباب مما يشير إلى المسار والآليات الجزيئية التي تنظم contractility الثاني غير العضلات الميوسين.

ودرست gastrulation الجنين المبكر المورفولوجية لسنوات عديدة كنموذج الجيني morphogenesis الظهارية والانتقال الخلوية من الظهارية إلى هوية الخلايا الوسيطة. واحدة من الأحداث الرئيسية التي وقعت في جاستروليشن هو morphogenesis لمجموعة فرعية خلايا الظهارية على طول خط الوسط البطني الجنينية من عمودي إلى الهرمية في الشكل15،16،،من1718. تغيير النتائج في استيعاب الخلايا ميسوديرمال الظني هذا الشكل خلية بسيطة وتحركها النشاط الحركي من الميوسين غير العضلات ثانيا تقيد أكتين الشبكة16،،من1920. عقود أبحاث الجينية وحددت المكونات الجزيئية لهذا المسار ووضعت لهم التسلسل بالترتيب التالي: 1) ويفرز الضباب من المجال قمي من الخلايا الظهارية في خط الوسط البطني؛ 2) الضباب بربط إلى جانب البروتين ز المشارك المستقبلات، الضباب والضباب الدخاني، وإشارات عن طريق هيتيروتريميريك ز-البروتين المعقدة التي تحتوي على وحدة فرعية12/13 Gα سلك شائك (Cta)، الذي هو تشابيرونيد ريك "مرفق البيئة العالمية" غير المقبول-8؛ 3) تنشيط كبار المستشارين التقنيين جوانين النوكليوتيدات صرف عاملاً، RhoGEF2، الذي بدوره يقوم بتنشيط Rho1 ز-البروتين الصغيرة؛ 4) Rho1 ينشط رو كيناز (جمهورية كوريا)؛ 5) كوريا الجنوبية ينشط الميوسين غير العضلات كونتراكتيليتي الثاني في المجال قمي من خلال الفسفرة السلسلة الخفيفة التنظيمية (RLC)، وبالتالي إنتاج انقباض قمي (الشكل 1)15،21،22 23، ،،من2426،25،27،،من2829. الطفرات في العديد من هذه العناصر تتداخل مع جاسترولاتيون العادية وغيرها من الحركات مورفوجينيتيك، بما في ذلك تكوين القرص الجناح والغدد اللعابية، مما يشير إلى أن يتم استخدام هذا المسار في عدة مراحل من المورفولوجية امبريوجينيسيس30،،من3132. مسار الضباب هو واحد من النماذج أفضل درس لتشكيل الظهارية، وقدمت أفكاراً هامة في morphogenesis كيف مستوى الأنسجة وينظم من النسخ الجيني للخلية cytoskeleton يحركها حركات14،15 ،21.

لقد طورنا مقايسة contractility يستند إلى الخلية التي يلخص الردود كثيرة على الهاتف الخلوي المصب من الضباب التي لوحظت في تطوير الأجنة يطير17. نحن إجراء هندسة عكسية S2 مستقرة معلم خط الخلية التي تعرب عن الضباب في نهايته ج مع حركة تحت سيطرة مروج ميتالوثيونيني إيندوسيبلي التي يمكن أن تحصد عند إضافة كبريتات النحاس (CuSO4) إلى المتوسط. عندما يتم تطبيق وسائل الإعلام مكيفة الضباب اكتوبيكالي على مستقبلات S2 + (S2R +) الخلايا، وسبليني الخلايا S2 يتميز بهم التعبير التفاضلية من مستقبلات مثل مفارز فريزليد وانتغرين، الخلايا الخضوع لإعادة تنظيم سيتوسكيليتون تذكرنا بدرجة عالية من انقباض قمي12،17،،من2733. ويمكن ملاحظة هذه التغييرات بالتباين مرحلة الفحص المجهري في الضباب الذي العلاج يؤدي إلى ظهور الكشكشة الظلام-المرحلة الإرشادية زيادة شعاعي في contractility الثاني الميوسين غير العضلات، أو بالأسفار الفحص المجهري حيث يؤدي العلاج الضباب إلى تشكيل عصابات الثاني الميوسين غير العضلات في الخلايا معربا عن معلم اجفب RLC34. وتتضمن هذه الحلقات سلسلة خفيفة تنظيمية فوسفوريلاتيد الميوسين (برلك) مرئية عبر إيمونوستينينج23،34،35. تتطلب هذه الاستجابة التي يسببها الضباب كبار المستشارين التقنيين، RhoGEF2، رو، وجمهورية كوريا؛ وهكذا، باستخدام S2R + خلايا والمؤتلف حركة الضباب، أنشأنا وسيلة للتحقيق انقباض المستحثة بالضباب في نظام يقوم على ثقافة الأنسجة24،25،34.

Protocol

1-الحفاظ على خلايا الأنسجة ثقافة المورفولوجية

  1. المحافظة على S2R + S2R +: RLC-اجفب و S2:Fog-حركة الخلايا في درجة حرارة الغرفة، يفضل أن تكون بين 20 درجة مئوية و 25 درجة مئوية في المتوسط الحشرات درع وغنت M3 تستكمل مع 100 وحدة/مل من البنسلين و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، 10% مصل بقرى الجنين وب الامفوتريسين 0.25 في الكثافة لا أقل من 5 × 105 خلايا/مل.
    ملاحظة: أقل كثافة الخلية يؤدي إلى الوفاة.
  2. بسرعة ذوبان الجليد قارورة cryo-الحفاظ على الخلايا ونقلها إلى قارورة زراعة الأنسجة. تبدأ قارورة صغيرة من زراعة الأنسجة (12.5 سم2 أو 25 سم2) في وحدة تخزين 4-5 مل من مستنبت الخلية حتى يتم تأسيس الثقافة وقد خمدت دلائل على موت الخلايا نتيجة لذوبان الجليد.
    ملاحظة: علامات موت الخلايا نتيجة لذوبان الجليد تشمل الخلايا غير ملتصقة التي تفتقر شكل سلس، وتقريب وبت مظلمة صغيرة من الحطام الخلوية في الإرشادي المتوسط زراعة الأنسجة من الخلايا نخرية.
  3. بطء زيادة حجم زراعة الأنسجة بالسماح للخلايا أن تنمو دون عائق لعدة أيام (4-8 د) إلى 100% كونفلوينسي، حيث هناك القليل إلى أي مسافة بين الخلايا وتبدأ تتراكم على بعضها البعض. نقل كافة الخلايا من هذا 100% المتلاقية الأصغر 12.5 سم2 أو قارورة 25 سم2 إلى قارورة زراعة الأنسجة أكبر (من 75 سم2) تستكمل مع 10 مل من خلية الثقافة المتوسطة.
    ملاحظة: الحفاظ على الخلايا في قارورة 75 سم2 سوف تسفر عن خلايا كافية لمعظم التجارب.
  4. مرور الخلايا د 3-4 كل من بيبيتينج مستنبت الخلية صعودا وهبوطاً، واستخدامه لإزاحة أي تساهل التقيد بها الخلايا من البلاستيك زراعة الأنسجة. نقل هذا المتوسط، الآن تحتوي على خلايا ريسوسبينديد، إلى قارورة جديدة. تمييع الخلايا 1:4 مع المتوسطة الثقافة خلية جديدة مع كل مرور وكرر حسب الحاجة.

2-[رني] معاملة المورفولوجية S2R + الخلايا

ملاحظة: تشير إلى روجرز وروجرز6 للحصول على إرشادات مفصلة حول كيفية إنتاج دسرنا مناسبة للثقافة الحشرات.

  1. نقل الخلايا S2R + لوح زراعة الأنسجة جيدا 6 أو 12-جيدا في كثافة مواتية للبقاء، لا أقل من 5 × 105 خلايا مليلتر، باستخدام كامل درع وغنت M3 خلية ثقافة وسائل الإعلام للعلاجات [رني].
  2. تعمل في غطاء زراعة الأنسجة، إزالة المتوسطة ثقافة الخلية القديمة بإمالة لوحة زراعة الأنسجة جيدا 6 أو 12-جيدا بلطف ويسفط مستنبت الخلية مع ماصة. استبدال هذه الخلية القديمة الثقافة المتوسطة بسرعة مع 1 مل مستنبت خلايا جديدة قبل بيبيتينج أنه في كل بئر.
    ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك دون خسارة كبيرة بعد أن تم السماح للخلايا بالتقيد فضفاضة لمدة 30-45 دقيقة قبل تبادل مستنبت الخلية.
  3. إضافة 10 ميكروغرام/مل من دسرنا التي تم إنشاؤها في أعقاب البروتوكول مفصلاً في روجرز وروجرز6 من بيبيتينج أنها مباشرة في المتوسط زراعة الأنسجة لكل بئر من الخلايا في حالة [رني].
  4. كرر هذا الإجراء يوميا، استبدال مستنبت الخلية مع 1 مل من الطازجة المتوسطة و 10 ميكروغرام/مل من دسرنا كل شرط [رني].
    ملاحظة: [رني] يتم عادة إجراء التجارب لمد 7؛ ومع ذلك، التوقيت الدقيق تعتمد على دوران البروتين وكفاءة دسرنا. [رني] علاجات قصيرة قدر د 3 فعالية تستنزف خلايا بعض البروتينات، بينما أهداف أخرى تتطلب علاجات أطول6.

3-الضباب الحصاد والإنتاج

  1. الارتقاء بنمو S2:Fog-حركة الخلايا بالسماح لها بالنمو دون عائق ل 4-8 (د) الحصول 100 ٪ المتلاقية 75 سم2 قارورة على ما يقرب من الخلايا في 10 مل من مستنبت الخلية (أو قارورة 150 سم2 في 20 مل من خلية الثقافة المتوسطة بدلاً من ذلك،) إلى ماكسي mize إنتاج الضباب.
  2. إضافة 50 ميليلتر من 100 ملم CuSO4 (أو 100 ميليلتر من 100 ملم CuSO4 لقارورة 150 سم2 ) إلى قارورة 100% المتلاقية 75 سم2 تقريبا لاستحثاث المروج ميتالوثيونيني. احتضانها ل 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة المتوسطة التي تحتوي على حركة الضباب من قارورة زراعة الأنسجة بيبيتينج وتحويلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل أو 50 مل. الطرد المركزي في 2,500 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة لمسح الخلايا والحطام الخلوية.
  4. نقل متوسطة الخلية الممسوحة إلى أنبوب مخروطي الشكل جديد والحفاظ عليه على الجليد. وتعمل على دفعات، نقل 5 مل المتوسطة المجازين إلى 15 مل مركزات ميغاواط 3,000 مع أغشية السيليلوز المجددة والطرد المركزي في س 2,500 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في وقت، للتركيز على المديين المتوسط.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، مركز بسعة تخزين كبيرة يمكن أن تستخدم (50 مل). أثناء الاعتقال، ستبدأ متوسطة ملونة أكثر قتامة، مما أثري مع الضباب، لبناء في الجزء السفلي من عامل التصفية على شكل V.
  5. إدراج تلميح الماصة إلى الجزء السفلي من "الخامس" من مركزات وقم بإزالة الوسائط الملونة الداكنة بين كل جولة من الطرد المركزي وتحويلها إلى أنبوب طازجة 1.7 مل [ميكروفوج]. الحفاظ على وسائل الإعلام على الجليد.
  6. استخدام مركزات نفسه، كرر الخطوات 3-4 و 3.5 عن طريق إزالة اللون الأغمق تتركز الضباب-حركة وسائط الإعلام واستبدالها بأخرى أكثر بريكليريد المتوسطة، حتى المتوسطة كانت تتركز على 1/10th من حجمه الأصلي (أي، 1 مل من 10 مل من ابتداء من المواد).
  7. تخزين الضباب-حركة مركزة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بعد التخزين، يجب التأكد من رصد للتلوث بالبكتيريا، التي قد تنجم عن فترات طويلة من التخزين.
  8. أداء الحزب الديمقراطي الصربي صفحة بخلط 10 ميليلتر من تتركز حركة الضباب المتوسطة مع 10 ميليلتر من المخزن المؤقت يشوه المحتوية على الحزب الديمقراطي الصربي لتشكيل. تشغيل هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة في 35 mA لحوالي 1 حاء نقل الهلام غشاء النيتروسليلوز (أو بدلاً من ذلك، غشاء PVDF) ح 1 في 120 اماه. أداء وصمة عار غربية باستخدام أي جسم حركة المتاحة تجارياً للكشف عن عصابة كاتشين 150.
    ملاحظة: قد تختلف تركيز حركة الضباب في الأجلين المتوسط ومكيفة كل دفعة. فإنه ليس من الضروري لتحديد التركيز الدقيق للضباب-حركة من أجل القيام التحليل، ولكن ينبغي اختبار الفعالية من كل دفعة قبل إجراء تجربة.
  9. إعداد الخطوات التالية 3، 1-3-2 ومراقبة وسائط الإعلام S2 مكيفة بجمع 10 مل من خلية الثقافة المتوسطة من قارورة 100% المتلاقية 75 سم2 تقريبا من خلايا S2 (أو، بدلاً من ذلك، 20 مل من قارورة 150 سم2 ) بيبيتينج. نقل السيطرة S2 خلية الثقافة المتوسطة إلى أنبوب مخروطي 15 مل أو 50 مل طازجة.
  10. الخطوات التالية 3، 4-3-7، امسح الخلايا والحطام الخلوية بالطرد المركزي (في س 2,500 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في وقت واحد) ثم نقل الخلية الممسوحة ليستي إلى مركزات والطرد المركزي لهم للتركيز المتوسط السيطرة على دفعات إلى 1/10 وحدة التخزين الأصلية.
    ملاحظة: لا يؤدي تطبيق وسائل الإعلام مكيفة S2 إلى contractility خلية كبيرة في المقايسة.
  11. تخزين الوسائط التحكم S2 تتركز في 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
    ملاحظة: بعد التخزين، يجب التأكد من رصد للتلوث.

4-إعداد كونكانافالين A-المغلفة بأطباق زجاجية وتصفيح S2R + الخلايا

  1. جعل 10 مل كونكانافالين حلاً (con A) بإذابة 5 ملغ يخدع A في 10 مل الماء لتركيز نهائي من 0.5 ملغ/مل. اليكووت هذا الحل إلى أحجام أكثر ملاءمة (500 ميليلتر لمل 1) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  2. إعداد أطباق زجاجية 35 ملم بطلاء جزء الزجاج في كل طبق مع 200 ميليلتر من يخدع بالحل واحتضان الأطباق لحوالي 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غطاء زراعة الأنسجة. بعد ذلك، إزالة جميع الحل A يخدع (التي يمكن الاحتفاظ بها واستخدامها للتجارب المقبلة) والسماح للاطباق أيردري تماما.
    الملاحظات: الأطباق يمكن إعدادها في دفعات كبيرة ويمكن تخزينها لمدة تصل إلى 6 أشهر في مكان جاف مثل درج مقاعد البدلاء مختبر.
  3. إضافة حوالي 2 مل وسائط الثقافة خلية جديدة لكل طبق زجاجية. ريسوسبيند S2R + الخلايا لفحصها قبل الفحص قبل بيبيتينج مستنبت الخلية صعودا وهبوطاً، استخدامه لفصل أي خلايا فضفاضة المنضمة.
  4. نقل الخلايا S2R + ريسوسبينديد إلى أطباق زجاجية 35 ملم يحتوي على مستنبت الخلية الطازجة حيث تكون بين روافد 50%-70%. فحص كثافة الخلية تحت المجهر زراعة الأنسجة بتركيز أعلى وأسفل عبر سهول عدة خلايا معلقة في المتوسط للحصول على تقدير لعدد الخلايا.
    ملاحظة: من خلال التجربة والخطأ، ويمكن تحقيق الكثافة المناسبة للخلايا اللازمة لتحقيق كونفلوينسي 50%-70%.
  5. السماح للخلايا لنعلق على أطباق زجاجية المغلفة بالاشتراكات لمدة 45-60 دقيقة.
    ملاحظة: تظهر تماما المرفقة S2R + الخلايا 'مقلي-البيض-مثل،' الأرض والظلام-المرحلة.

5-فعالية الاختبار متوسطة مكيفة الضباب، والمقايسة الخلوية كونتراكتيليتي

  1. إذا رغبت في ذلك، تأكيد العائد من الضباب-حركة أنتجت ومركزة من S2:Fog-حركة مستقرة خلايا الأسطر بواسطة الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والنشاف الغربية. إضافة 10 ميليلتر من المخزن المؤقت للعينة المحتوية على الحزب الديمقراطي الصربي إلى 10 ميليلتر تتركز حركة الضباب ويغلي للحد الأدنى 5 اتباع الحزب الديمقراطي الصربي صفحة قياسية والبروتوكولات الغربية النشاف ولطخة لحركة مناهضة لتأكيد إنتاج الضباب-حركة.
  2. إزالة المتوسطة جميع درع وغنت M3 من الخلايا S2R + المرفقة من الخطوة 4، 3 بلطف بيبيتينج، وإضافة ميليلتر العودة 75 المتوسطة درع وسانغ الطازجة إلى الحد من كمية متوسطة مكيفة الضباب المستخدمة بعناية.
  3. إضافة ميليلتر 75 مكيفة الضباب وسائل الإعلام إلى الجزء الزجاج للطبق زجاجية من الخطوة 5، 2 لكي الحجم الإجمالي 150 ميليلتر، بنسبة 1:1 لوسائل الإعلام الضباب مكيفة لدرع وغنت M3.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى إجمالي حجم 150-200 ميليلتر تغطية كامل الجزء الزجاج صحن زجاجية نموذجية؛ غير أن هذا سيتوقف على أبعاد الطبق زجاجية المستخدمة.
  4. رصد كونتراكتيليتي للخلايا بالفحص المجهري مرحلة التباين باستخدام 20 X أو 40 X التكبير للاحتفال حقل بأكمله من الخلايا. تتبع مورفولوجيا الخلايا وابحث عن خطة التناوب مرحلة الظلام والنور مرحلة الإزعاج الإرشادية لتغيير الشكل.
    ملاحظة: يؤدي تطبيق الضباب عادة إلى 30-50% الخلايا S2R + تمر انقباض الخلوية، وبعد 10 دقائق، تبدأ الخلايا للاسترخاء، العودة إلى مورفولوجيا بهم ذات حواف ناعمة، مثل البيض المقلي.
  5. رصد مدى متانة contractility الخلوية. إذا كانت الاستجابة الخلية قوية جداً باستخدام نسبة 1:1 المتوسطة المتوسطة درع وسانغ جديدة مكيفة الضباب، تقليل كمية متوسطة الضباب مكيفة للمحافظة على متوسط حركة الضباب مركزة للتجارب المقبلة. استخدام غير مخفف مكيفة الضباب متوسطة إذا كانت نسبة 1:1 لا يؤدي إلى انقباض الخلوية قوية؛ عموما، ينتج بنسبة 1:3 استجابة كافية للاضطلاع بنجاح التجربة.
    ملاحظة: حالما يتم إنشاء نسبة مناسبة مكيفة الضباب المتوسطة والمتوسطة درع وسانغ الطازجة الواحدة نظراً لدفعة متوسطة مكيفة الضباب، تستخدم هذه النسبة لجميع التجارب الأخرى.
  6. مراقبة ديناميات الثاني الميوسين غير العضلات أثناء الفحص contractility الخلوية باستخدام مستقرة الخلية خط S2R + التي تعرب عن سلسلة الخفيفة التنظيمية معلم التجارة والنقل (S2R + سقة:-اجفب).
  7. استخدام النسبة المعتمدة مكيفة الضباب المتوسطة إلى المتوسطة درع وغنت M3 الطازجة من الخطوات 5.2-5.5، إزالة مثقف الخلية المتوسطة مع ماصة وإضافة المتوسطة درع وسانغ الطازجة مرة أخرى في جزء الزجاج في صحن زجاج-القاع. نتخلل المتوسطة مكيفة الضباب في نسبة محددة سلفا في حين الحصول على تسلسل صورة للخلايا الحية؛ العناية فيما يتعلق بعدم تحريك الطبق زجاجية أثناء نضح.

6-تحديد وتلطيخ مقيدة S2R + الخلايا

  1. فيكس S2R + الخلايا باستخدام حل بارافورمالدهيد 10% في المخزن المؤقت ليم (100 ملم أنابيب، 1 مم عطا، مجكل 1 مم2، الرقم الهيدروجيني 6.9).
    ملاحظة: المخزن المؤقت ليم هو عادة مصنوعة في 2 × الحل الأسهم ويمكن تخزينها لمدة أشهر في 4 درجات مئوية.
  2. إزالة مستنبت الخلية من S2R تعامل الضباب + الخلايا عن طريق بيبيتينج واستبداله فورا مع 1.5-2.0 مل من محلول بارافورمالدهيد 10%. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا الثابتة في تثبيت الحل عند 4 درجة مئوية لعدة أيام؛ ومع ذلك، من المهم أن يتم التثبيت الأولى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل نقل الخلايا إلى 4 درجات مئوية.
  3. إزالة الحل بارافورمالدهيد 10% من بيبيتينج والتخلص من هذا المنتج العضوي من النفايات بشكل صحيح. شطف الخلايا بلطف بيبيتينج 1.5-2.0 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) للطبق زجاجية 35 ملم. إزالة برنامج تلفزيوني القديم عن طريق بيبيتينج واستبدله 1.5-2.0 مل من برنامج تلفزيوني جديد 2 x أكثر إزالة التثبيت المتبقية الحل.
    ملاحظة: من المهم أن الخلايا لم تجف من هذه النقطة في البروتوكول.
  4. كتلة الخلايا مع حوالي 200 ميليلتر من مصل الماعز العادي 5% المخفف في برنامج تلفزيوني التي استكملت بالمنظفات غير الأيونية (ببست) 0.1% لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: عادة، عرقلة الحلول تحتوي على المصل الذي يطابق الكائن يتم رفع الأجسام المضادة الثانوية في.
  5. إعداد الحل جسم الأولية باذابته في ببست. استخدام وحدة تخزين حوالي 200 ميليلتر لتغطي كامل الجزء الزجاج للطبق زجاجية.
    1. إزالة الحل حجب عن طريق بيبيتينج وإضافة حل جسم الأولية مباشرة إلى الجزء الزجاج للطبق. احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة، أو بدلاً من ذلك، تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    2. عندما تفرخ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، التفاف الطبق زجاجية 35 ملم مع بارافيلم لمنع التبخر.
  6. إزالة الحل جسم الأولية عن طريق بيبيتينج وشطف الخلايا من بيبيتينج 1.5-2.0 مل من برنامج تلفزيوني جديد للطبق زجاجية 35 ملم. إزالة برنامج تلفزيوني عن طريق بيبيتينج واستبدله 1.5-2.0 مل من برنامج تلفزيوني جديد 2 x أكثر.
  7. تعد حلاً لجسم الثانوية باذابته في ببست. وحدة تخزين من 200 ميليلتر كافية لتغطية مجرد جزء الزجاج في الطبق.
    1. إضافة حل جسم الثانوية مباشرة إلى الجزء الزجاج للطبق. احتضان الخلايا مع الجسم المضاد الثانوي حل ح 1 في درجة حرارة الغرفة أو بين ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية.
    2. لف الطبق 35 ملم مع بارافيلم إذا تفرخ بين عشية وضحاها، لمنع التبخر.
  8. إزالة الحل جسم الثانوية عن طريق بيبيتينج وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني قبل بيبيتينج 1.5-2.0 مل من برنامج تلفزيوني جديد للطبق. قم بإزالة برنامج تلفزيوني القديم واستبداله 2 x أكثر، اتباع هذا الإجراء نفسه.
  9. الحفاظ على الخلايا الثابتة والملون بإضافة ما يكفي من وسيط تتلاشى لمكافحة تصاعد الفلورسنت لتغطية الجزء الزجاج طبق 35 ملم زجاجية.
  10. تخزين العينات عند 4 درجة مئوية وبعيدا عن الضوء.
    ملاحظة: إشارة الفلورسنت سيتم ببطء تسوس الأشهر حتى لو المخزنة بشكل صحيح. لأفضل النتائج، الصورة في غضون أسبوع.

7-التصوير والتحديد الكمي للفحص الخلوي كونتراكتيليتي

  1. الصورة الثابتة S2R + الخلايا باستخدام معيار مقلوب مجهر الخفيفة مع تباين المرحلة، DIC، أو الأسفار قدرات التصوير. استخدام 20 X أو 40 X التكبير، التقاط حقول الصورة شكل متجانب غير 10-30 من الخلايا اعتماداً على كثافة الخلية، بهدف الحصول على صور 200 أو أكثر الخلايا كل شرط.
  2. استخدام عداد خلايا قياسية، عد وتسجيل عدد المتعاقد عليها (الخلايا مرحلة الظلام، بونيتيد) والخلايا نونكونتراكتيد كل حقل كل أسر.
    ملاحظة: من الأفضل أن يكون اثنين من الباحثين أن التهم مستقلة من الخلايا نونكونتراكتيد والتعاقد مع كل حقل، أو بدلاً من ذلك، الباحث نفسه يمكن عد نفس الحقل صورة للخلايا ثلاث مرات، مما يسمح لعدد متوسط من التعاقد و نونكونتراكتيد الخلايا في كل حقل يتم حسابها.
  3. إعداد A المغلفة يخدع زجاجية أطباق عدة كل شرط التجريبية كما هو موضح في الخطوة 4، 2. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً مستنبت الخلية إزاحة أي الخلايا اجفب S2R +: سقة ملتصقة فضفاضة ولوحة عليها حيث تكون روافد 50%-70% في أطباق زجاجية 35 ملم. السماح للخلايا لإرفاق ل 30-45 دقيقة.
  4. الصورة S2R + سقة:-اجفب الخلايا الحية استخدام مجهر [كنفوكل] القرص الغزل، اجتاحت الميدان، أو بالفحص المجهري الورقة الضوء باستخدام 60 س-100 X التكبير. إزالة المتوسطة جميع درع وغنت M3 من طبق زجاجية تحتوي على خلايا اجفب S2R +: سقة المرفقة.
    1. نتخلل نسبة محددة سلفا من الضباب-حركة مكيفة المتوسطة إلى المتوسطة درع وغنت M3 الطازجة من الخطوات 5.2-5.5 مباشرة على الجزء الزجاج للطبق زجاجية باستخدام ماصة، حذراً فيما لا لزعزعة الموقف الذي طبق على الهدف. الحصول على الصور لمدة 12-15 دقيقة من أجل القبض على بدء وانكماش كامل للخلايا S2R + سقة:-اجفب.
      ملاحظة: إذا كان تلطيخ الميوسين غير العضلات أو الميوسين-برلك، تشكيل عصابة الميوسين مشددة على سطح الخلايا أيضا يدل على كونتراكتيليتي. إذا التصوير اجفب S2R +: سقة الخلايا الحية، ستشكل RLC معلم اجفب مماثلة ضيق الخاتم يدل كونتراكتيليتي (انظر الشكل 3). تغيير الشكل الذي يحدث سوف تتسبب الخلايا إلى "بونيه"، تناول الشكل الثلاثي الأبعاد؛ الطائرة من تركيز المجهر قد تحتاج إلى تعديل لتعقب هذا تغير شكل الخلية. تحت مراقبة الظروف [رني]، وعادة ما يخضع 30%-50% الخلايا انقباض عند إضافة الضباب. كن على علم أن بعض الظروف [رني] قد تؤدي إلى انقباض في الغياب من الضباب.

Representative Results

S2 و S2:Fog-حركة الخلايا كانت تزرع لظروف المتلاقية في قارورة زراعة الأنسجة 150 سم2 بالقرب وتعامل مع 25-75 ميكرون CuSO4 على مدى فترة من 24-48 ساعة للحث على التعبير عن الضباب-حركة (الشكل 2). عينات من خلايا S2 (الشكل 2ألف) و S2:Fog--أزيلت حركة الخلايا (الشكل 2ب) وإنتاج حركة الضباب كان يرصدها لطخة غربية. كما هو متوقع، فشلنا في الكشف عن حركة الضباب في وسائل الإعلام التي تحصد من الخلايا S2 تحت أي ظروف. بيد أننا كشف الضباب في وسائل الإعلام التي تحصد من S2:Fog-حركة خط الخلية مستقرة لها في أقرب وقت بعد التعريفي مع 75 ميكرون CuSO424 ساعة. S2R + الخلايا المرفقة يخدع A-المغلفة بأطباق زجاجية معربا عن معلم اجفب تنظيمية خفيفة سلسلة (بروتينات فلورية خضراء-RLC) غير العضلات الميوسين الثاني (الأرقام 3A و 3 باء). أجرى تصوير خلية يعيش على مجهر مقلوب مجهزة 100 X/1.4 عدسة الهدف نا خلال نضح مكيفة الضباب وسائط الإعلام. حوالي 5 دقائق بعد العلاج مع حركة الضباب، شكلت RLC الخواتم يدل على انقباض العضلات غير الميوسين الثاني. يمكن ملاحظة هذه الحلقات عن طريق immunostaining S2R + الخلايا بجسم المثارة ضد فوسفوبيبتيدي اصطناعية المقابل لبقايا المحيطة Ser19 الميوسين البشرية RLC (الأرقام 4A و 4B). هذه الأجسام المضادة كروسريكتس مع المورفولوجية RLC.

ولدينا هنا مثال ممثل للانزيم كونتراكتيليتي الخلوية بعد علاج 7 أيام من الخلايا التي تحتوي على عنصر تحكم [رني] ودسرنا ضد Rho1 (5A الأرقام - 5E). S2R + الخلايا كانت مطلية على الاشتراكات A-المغلفة بأطباق زجاجية وتعامل مع الضباب مكيفة (+ الضباب) وسائط الإعلام أو مراقبة وسائط الإعلام (-الضباب). ثم تم قياس كمية عدد الخلايا المتعاقد عليها بعد التثبيت. الإرشادي الكشكشة المرحلة كثيفة من انقباض كان بارزا في التحكم استنفاد الخلايا تعامل مع وسائل الإعلام مكيفة الضباب (الشكل 5ب). في الشكل 5ج، خلايا المنضب رو تعامل مع مكيفة S2 المتوسطة مثال نموذجي مورفولوجية ذات حواف ناعمة، مثل البيض المقلي. ملاحظة أن رو يلعب دوراً في مسار الإشارات الضباب، وكذلك في cytokinesis؛ وبالتالي، تفشل الخلايا المنضب رو غالباً ما لتقسيم بشكل صحيح، مما يؤدي إلى زيادة في حجم الخلايا وبلويدي. العلاج لمراقبة الخلايا المنضب مع وسائل الإعلام مكيفة الضباب نموذجي يؤدي إلى 30-50% خلايا تمر بانقباض، بينما نحن فشلت في مراعاة انقباض كبيرة في الخلايا المنضب رو.

Figure 1
الشكل 1:الضباب المفترضة إشارات الطريق. نظراً لغياب الضباب، Gα12/13 وحدة فرعية، سلك شائك (Cta)، جنبا إلى جنب مع شركائها ملزمة Gϒ و Gβ، غير نشطة والمرتبطة بمستقبلات المشارك الضباب والضباب الدخاني. ريك-8 مشرفات كبار المستشارين التقنيين، وينظم به التعريب سوبسيلولار. عند الضباب ملزمة، ينأى كبار المستشارين التقنيين من Gϒ، و Gβ المجندين RhoGEF2 لغشاء الخلية حيث أنه يحفز التبادل للناتج المحلي الإجمالي لأنشئ في Rho1 جتباسي الصغيرة. Rho1 أنشئ زمنياً، نشط الآن، ينشط "كيناز رو" (جمهورية كوريا)، الذي فوسفوريلاتيس RLC الميوسين غير العضلات، مما يؤدي إلى التنشيط و contractility الخلوية اللاحقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : الوقت-بالطبع إنتاج حركة الضباب. هذه اللوحات تظهر الخلية الثقافة المتوسطة حصادها من قرب قارورة المتلاقية 100 ٪ من الخلايا التحكم S2 (أ) أو (ب) S2:Fog-حركة خلايا مستقرة. الخلايا تعامل مع 25-75 ميكرون CuSO4 على مدى فترة من 24-48 ساعة. مستنبت الخلية كان جمعها وإعدادها للحزب الديمقراطي الصربي صفحة والنشاف الغربية. تم الكشف عن حركة الضباب بجسم حركة مناهضة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : خلية يعيش التصوير من انقباض الناجمة عن الضباب. مستقرة S2R + خطوط الخلايا معربا عن معلم اجفب RLC لغير العضلات الميوسين الثاني تم تصويرها التي اجتاحت حقل [كنفوكل] مجهرية أثناء التروية مكيفة الضباب وسائط الإعلام. يتم عرض الوقت بالدقائق والثواني. (A) هذا الفريق يظهر صورة تنسيق الطائرة قريبة من واجهة ساترة خلية الوقت 0:00 قبل التروية من الضباب--Myc. (ب) هذا الفريق ويبين سلسلة زمنية (0:30-10:00) من الصور التي التقطت في المستوى البؤري القرب من الجزء العلوي من الخلية. الأسهم البيضاء تشير إلى إعادة تنظيم غير العضلات الميوسين الثاني حسبما أوضحه RLC اجفب إلى عصابات الهوس أثناء انقباض. هو شريط مقياس 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : فوسفوريلاتيد RLC يموضع لعصابات الهوس بعد الاستقراء انقباض بالضباب--Myc. S2R + الخلايا الثابتة والملون أكتين باستخدام فالويدين (أحمر)، فوسفوريلاتيد RLC استخدام جسم فوسفوسيريني-19 (أخضر) و DAPI (DNA، الأزرق)، وبعد العلاج مع مراقبة () أو (ب) وسائل الإعلام الضباب-حركة-مكيفة. ملاحظة إعادة تنظيم RLC فوسفوريلاتيد في الحلقات عند إضافة الضباب--Myc. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : الممثل الكمي للانزيم كونتراكتيليتي الخلوية المستحثة بالضباب. S2R + الخلايا تعامل مع عنصر التحكم (A و B) [رني] أو دسرنا (C و D) ضد Rho1 جتباسي الصغيرة لمدة 7 أيام. بعد هذا الوقت، كانت مطلية على أطباق زجاجية المغلفة من A يخدع الخلايا وتعامل مع الوسائط التحكم (A و C) أو الوسائط (ب ود) الضباب-حركة-مكيفة. يشير الحجم شريط يمثل 10 ميكرون. () مؤامرة مبعثر بفواصل الثقة 95% ويعني لجزء صغير خلايا التعاقد مع كل حالة. تمثل النقاط الفردية جزء صغير خلايا التعاقد مع كل حقل من عرض في 40 X التكبير (10-120 الخلايا كل حقل) والأرقام بين قوسين تشير إلى العدد الإجمالي للخلايا تحسب للتعاقد وعدم التعاقد مع خلايا منفصلة على مدى ثلاث [رني] تجارب. تدل العلامات النجمية فرقا يعتد به إحصائيا بين شروط معاملة [رني] والضباب كما يحددها أحادي الاتجاه ANOVA (ف < 0.0001) مع المقارنة متعددة الوظائف المخصصة التحليل في توكي. لاحظ أنه لا يوجد أي فرق معتد به إحصائيا (نوفاسكوتيا) بين العينات المعالجة Rho1 [رني] تعامل مع عنصر تحكم أو الضباب-حركة-تكييف وسائل الإعلام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

نقدم هنا، بروتوكول مفصل مقايسة contractility يستند إلى الخلية استخدام زراعة الأنسجة المورفولوجية خط خلية (S2R + الخلايا)، الذي يخضع انقباض الثاني الميوسين غير العضلات كاستجابة للضباب الإشارات. هذا التحليل مفيد للتحقيق في مسار الضباب، فضلا عن الآليات التي تنظم contractility الثاني غير العضلات الميوسين.

الاعتبارات استزراع الخلايا:
الشروط التي S2R + الخلايا يتم في ظلها أمر حاسم لتحقيق بيانات موثوقة من هذا التحليل. عند التخطيط لإجراء الفحص contractility، هو أفضل وسيلة للحفاظ على S2R + الخلايا في متوسط حشرة درع وغنت M3. بينما S2R + الخلايا يمكن أن تزدهر في وسائل الإعلام ثقافة الخلية الحشرات الأخرى (مثلاً، متوسط حشرة SF900 أو شنايدر)، كثيرا ما تفقد قدرتها على الاستجابة للضباب. S2R + الخلايا التي تحتوي على رقم مرور عالية، الممرات عموما أكثر من 20-25، تبدأ بتفقد حساسية إلى [رني]. فمن الأفضل ﻻستخدام خلايا المرور المبكر لجميع التجارب. جانب مهم آخر للتجارب استنفاد [رني] هو اختيار عناصر التحكم المناسبة. تتضمن عناصر التحكم السلبية الشائعة دسرنا استهداف اجفب أو ببلويسكريبت، ولا من الذي يكون التماثل إلى جينوم ذبابة. استهداف البروتينات في مسار الضباب (رو، جمهورية كوريا، إلخ)، والتي، عندما تستنفد، منع تنشيط contractility الميوسين غير العضلات، وأيضا عناصر مفيدة. S2:Fog-يمكن الحفاظ على حركة الخلايا في وسيط ثقافة بديلة خلية مثل SF900 وتستكمل مع 100 وحدة/مل من البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، و 0.25 الامفوتريسين باء علما أن FBS مطلوب ليس عند استزراع الخلايا في SF900. كثافة الخلية أيضا عنصر حاسم في جميع جوانب المورفولوجية زراعة أنسجة الخلايا. خلافا لخلايا الثدييات زراعة الأنسجة، المورفولوجية-الخلايا المشتقة من زراعة الأنسجة تزدهر أفضل تحت أعلى الخلية الكثافة (الكثافة لا أقل من 5 × 105 خلايا/مل). ومع ذلك، عند إجراء هذا الفحص، المهم أن الخلايا هي مطلي لا يخدع A-المغلفة بالاطباق زجاجية أعلاه التقاء 80%، التحديد الكمي للمتعاقد معها مقابل عدم التعاقد مع الخلايا سوف تصبح مملة جداً.

الجوانب الحرجة والنهج البديلة للفحص الخلوي كونتراكتيليتي:
إنتاج الضباب، يجند أن يطلق الميوسين غير العضلات كونتراكتيليتي الثاني، عنصر أساسي في هذا التحليل. بترميز الجينات الضباب وتين أحماض الأمينية 730 مع وزن الجزيئي توقع ~ 78 كاتشين26. وكشف تحليل هيدروباثي تمتد من بقايا مسعور 12 في الأمينية-المحطة النهائية في الضباب التي يمكن أن تعمل كتسلسل إشارة إفراز. وبالإضافة إلى ذلك، يحتوي أيضا على مواقع متعددة لاحتمال glycosylation N و O مرتبطة، كذلك اقتراح الضباب هو بروتين يفرز26تسلسل الترميز. ودعما لذلك، كان المترجمة الضباب إلى الحويصلات الافرازية في خلايا البشرة الظني تمر انقباض قمي16. حملت حركة الضباب التعبير عند إضافة كبريتات النحاس إلى المتوسط، والأجسام المضادة ضد الضباب أو حركة المعترف بها بروتين 150 ديناراً من الثقافة المتوسطة تحصد من الثقافات المستحث ولكن ليس من فعل وسائط الإعلام من الخلايا S2 تفتقر إلى بناء حركة الضباب. هذا الوزن الجزيئي أعلى من الوزن الجزيئي 80 ديناراً المتوقعة من الضباب ويوحي بأن الآلية الافرازية للخلايا S2 قد جليكوسيلاتي البروتين قبل الرقابة. بسبب التقلبات المحتملة في تنقية الضباب، فمن المستحسن استخدام نفس الدفعة وسائط الضباب مكيفة لجميع التجارب. يشكلون مجموعات كبيرة من مركزة الضباب-حركة وسائط سيساعد في الحفاظ على الاتساق في جميع جولات التجارب.

أن نجاح هذا الفحص يعتمد أيضا على ثقة تحديد الخلايا التي مرت بانقباض. في حين يمكن ملاحظة الخلايا مقيدة بالفحص المجهري الأسفار، تلطيخ أكتين أو غير العضلات الميوسين الثاني، الطريقة الأكثر موثوقية لتحديد وتقدير حجم الخلايا مقيدة من خلال مرحلة التباين أو مجهرية DIC. التهم دقيقة يمكن تحقيقه باستخدام 20 X-40 X التكبير على مجاهر الخفيفة القياسية. على الرغم من أن يستخدم البروتوكول مكتوب هنا أطباق زجاجية، المقايسة يمكن أيضا إجراء باستخدام معيار الزجاج 1.5 كوفيرسليبس مغلفة بألف يخدع يمكن أن يتم إضافة الضباب في 35 مم لزراعة الأنسجة في ساترة وضعها في بارافيلم، بغية الحد من الضباب المستخدمة لفحص كل. نوعية التثبيت عنصر حاسم للمقايسة، الخلايا الثابتة سيئة يمكن أن يؤدي إلى إيجابيات كاذبة. استخدام الحل تثبيت الطازجة، والتأكد من أن الخلايا الجافة ابدأ مرة واحدة ثابتة سيؤدي إلى نتائج أكثر موثوقية. وأخيراً، من المهم لعد عدد كبير من الخلايا. عادة، فقط 30%-50% من دون علاج أو انقباض الخلايا المعالجة [رني] التحكم بعد نضح الضباب. ومع ذلك، هناك مستوى القاعدية لانقباض التي تحدث في S2R + الخلايا، حيث هناك حاجة إلى عدد كبير من الخلايا للتأكد من أي تغيير في جزء صغير خلايا مقيدة بسبب العلاجات. وعلاوة على ذلك، نضوب بعض البروتينات المشاركة في تنظيم كونتراكتيليتي الثاني الميوسين غير العضلات قد يؤدي إلى فرط contractility، حتى في حالة عدم وجود الضباب. البيانات المعروضة هنا من أكثر من 3,600 الخلايا التي تم حسابها في ثلاثة علاجات [رني] متعاقبة باستخدام نفس الدفعة من الضباب مكيفة وسائل الإعلام.

تطبيقات للفحص الخلوي كونتراكتيليتي:
ويوفر هذا الإنزيم contractility، عندما يقترن مع [رني] فحص أساليب، نظاما قويا لدراسة الخلية إشارات و morphogenesis و contractility الخلوية. سابقا، قد استخدمت للتعرف على واحد من اثنين من مستقبلات المشارك الضباب21. شاشة مستهدفة من 138 إلى جانب البروتين ز مستقبلات (جبكرس) يتم استنفادها في [رني] في S2R + الخلايا، وقدرته على الاستجابة للضباب كان جزيئي كما هو موضح في البروتوكول المعروضة هنا. جبكرس 138، واحد، جين أونتشاراكتيريزيد سابقا، المعروفة الآن بالضباب، وكان كشفت. أظهر التحقيق في الدالة من الضباب أن يتطلبها contractility الخلوية المستحثة بالضباب في S2R + الخلايا، بل من الضروري أيضا جاستروليشن في تطوير المورفولوجية21. وعلاوة على ذلك، استخدمت هذا الفحص لإثبات أن ريك-8، مرفق البيئة العالمية غير متعارف عليه، أيضا عنصر في الضباب مما يشير إلى المسار27. أظهرت سلسلة من التجارب [رني] epistasis مقترنة بمقايسة contractility أن ريك-8 يتفاعل مع Gα12/13 وحدة فرعية كبار المستشارين التقنيين ومهامها إلى ترجمة ذلك داخل الخلية، هو أمر حيوي ل contractility الخلوية المستحثة بالضباب31 .

زراعة الأنسجة المورفولوجية مناسبة تماما للمبتدئين، الخلايا تمسك بسهولة في درجة حرارة الغرفة، ولا تتطلب CO2 أو مخزنة خلية الثقافة المتوسطة، وقوية ما دامت تتم المحافظة على كثافة ثقافة الخلية الصحيحة. الفحص الخلوي contractility أنجز بنجاح قسم المختبر دورة بيولوجيا الخلية قبل التخرج، حيث كان الطلاب القليل إلى أي خبرة في تثقيف الخلايا أو الفحص المجهري. والرزن contractility الخلوية المقدمة هنا يمثل أداة قوية، ويستند إلى الخلية التي يمكن أن تستخدم في اكتشاف الجينات، أو استجواب الضباب مما يشير إلى المسار، تساعدنا على تحسين فهم العمليات الإنمائية، من قبيل انقباض قمي و الميوسين غير العضلات كونتراكتيليتي الثاني، بصورة عامة.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

المؤلف يود أن يشكر أعضاء المختبر روجرز ومختبر أبليوهيتي، غريتا غلوفر، والطلبة في كلية ريد في ربيع عام 2018 "البيولوجيا الخلوية" الحال، الذين ساهموا في وضع هذا البروتوكول. علاوة على ذلك، المؤلف يود أن يشكر أعضاء المختبر ريتز لقراءة وتحرير هذه المخطوطة بعناية. وأيد "المؤسسة الوطنية للعلوم" تحت رقم جائزة 716964 D.A.A. وا. ر. وقسم الأحياء كلية ريد البحث عنها في هذا المنشور.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S2R+ cells Drosophila Genomics Resorce Center  150 cell culture line, exhibits contractility when treated with Fog
S2:Fog-myc cells Drosophila Genomics Resorce Center  218 cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter
S2R+ :Sqh-EGFP cells Drosophila Genomics Resorce Center  196 cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP
Shield and Sang M3 Sigma-Aldrich S3652 cell culture medium
SF900 insect medium Thermofisher Scientific 12658019 alternative cell cutlure medium
Schneider’s insect medium Thermofisher Scientific 21720024 alternative cell cutlure medium
Fetal Bovine Serum Thermofisher Scientific 16000044 media supplement
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermofisher Scientific 15240112 antimicrobial/antifugal media supplement
Concanavalin A MP Biomedicals 150710 used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion
Glass bottom plates Maktek P35G-1.5-10 used for assay and for fixing and staining cells
Glass cover slips Corning 2940-225 alternative to glass bottom dishes
Protein concentrators Millipore UFC903008 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks Genessee 25-204,25-206,25-208,25-210 used to culture cells
6-well and 12-well tissue culture dishes Genessee 25-105, 25-106 used to culture cells
Flourescent mounting medium Dako S3023 to preserve fixed cells
32% Paraformaldehyde EMS 15714-S used to fix cells
Pipes EMS 19240 used in PEM buffer for cell fixation
Anti-Myc Antibody Drosophila Hybirdoma Bank cat# 9E10 used to dectect Fog-Myc 
PhosphoSerine-19 antibody Cell Signaling 3671 antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19
488-Phalloidin, 568-Phalloidin Thermofisher Scientific A12379, A12380 to stain for f-actin
Hawk-VT multi-point array scanning confocal system  VisiTech International Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells
Eclipse TE300 Inverted microscope Nikon Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Model Mechanisms. 9, (3), 235-244 (2016).
  2. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nature Reviews Genetics. 6, (1), 9-23 (2005).
  3. Millburn, G. H., Crosby, M. A., Gramates, L. S., Tweedie, S., FlyBase, C. FlyBase portals to human disease research using Drosophila models. Disease Model Mechanisms. 9, (3), 245-252 (2016).
  4. Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Applications of high-throughput RNA interference screens to problems in cell and developmental biology. Genetics. 175, (1), 7-16 (2007).
  5. Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6, (10), 1632-1641 (2011).
  6. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3, (4), 606-611 (2008).
  7. Applewhite, D. A., Davis, C. A., Griffis, E. R., Quintero, O. A. Imaging of the Cytoskeleton Using Live and Fixed Drosophila Tissue Culture Cells. Methods Molecular Biology. 1365, 83-97 (2016).
  8. Rogers, S. L., Wiedemann, U., Stuurman, N., Vale, R. D. Molecular requirements for actin-based lamella formation in Drosophila S2 cells. The Journal of Cell Biology. 162, (6), 1079-1088 (2003).
  9. Yi, C. H., et al. A genome-wide RNAi screen reveals multiple regulators of caspase activation. The Journal of Cell Biology. 179, (4), 619-626 (2007).
  10. Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309, (5738), 1251-1253 (2005).
  11. Nir, O., Bakal, C., Perrimon, N., Berger, B. Inference of RhoGAP/GTPase regulation using single-cell morphological data from a combinatorial RNAi screen. Genome Research. 20, (3), 372-380 (2010).
  12. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6, (301), 98 (2013).
  13. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110, (1), 73-84 (1990).
  14. Leptin, M. Gastrulation movements: the logic and the nuts and bolts. Developmental Cell. 8, (3), 305-320 (2005).
  15. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141, (10), 1987-1998 (2014).
  16. Dawes-Hoang, R. E., et al. folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132, (18), 4165-4178 (2005).
  17. Rogers, S. L., Wiedemann, U., Häcker, U., Turck, C., Vale, R. D. Drosophila RhoGEF2 associates with microtubule plus ends in an EB1-dependent manner. Current Biology. 14, (20), 1827-1833 (2004).
  18. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical Sarcomere-like Actomyosin Contracts Nonmuscle Drosophila Epithelial Cells. Developmental Cell. 39, (3), 346-358 (2016).
  19. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15, (8), 926-936 (2013).
  20. Fox, D. T., Peifer, M. Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila. Development. 134, (3), 567-578 (2007).
  21. Manning, A. J., Rogers, S. L. The Fog signaling pathway: insights into signaling in morphogenesis. Developmental Biology. 394, (1), 6-14 (2014).
  22. Xie, S., Mason, F. M., Martin, A. C. Loss of Gα12/13 exacerbates apical area dependence of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 27, (22), 3526-3536 (2016).
  23. Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. Dynamic myosin phosphorylation regulates contractile pulses and tissue integrity during epithelial morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 206, (3), 435-450 (2014).
  24. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64, (2), 447-458 (1991).
  25. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91, (7), 905-915 (1997).
  26. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76, (6), 1075-1089 (1994).
  27. Peters, K. A., Rogers, S. L. Drosophila Ric-8 interacts with the Gα12/13 subunit, Concertina, during activation of the Folded gastrulation pathway. Molecular Biology of the Cell. 24, (21), 3460-3471 (2013).
  28. Jha, A., van Zanten, T. S., Philippe, J. M., Mayor, S., Lecuit, T. Quantitative Control of GPCR Organization and Signaling by Endocytosis in Epithelial Morphogenesis. Current Biology. 28, (10), 1570-1584 (2018).
  29. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18, (3), 261-270 (2016).
  30. Myat, M. M., Andrew, D. J. Organ shape in the Drosophila salivary gland is controlled by regulated, sequential internalization of the primordia. Development. 127, (4), 679-691 (2000).
  31. Kanesaki, T., Hirose, S., Grosshans, J., Fuse, N. Heterotrimeric G protein signaling governs the cortical stability during apical constriction in Drosophila gastrulation. Mechanisms of Development. 130, (2-3), 132-142 (2013).
  32. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14, (20), 1822-1826 (2004).
  33. Yanagawa, S., Lee, J. S., Ishimoto, A. Identification and characterization of a novel line of Drosophila Schneider S2 cells that respond to wingless signaling. Journal Biological Chemistry. 273, (48), 32353-32359 (1998).
  34. Mason, F. M., Xie, S., Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. RhoA GTPase inhibition organizes contraction during epithelial morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214, (5), 603-617 (2016).
  35. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457, (7228), 495-499 (2009).
تحليل يستند إلى الخلية للتحقيق غير العضلات الميوسين الثاني Contractility <em>عبر</em> gastrulation مطوية إشارات الطريق في <em>المورفولوجية</em> S2R + الخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peters, K. A., Detmar, E., Sepulveda, L., Del Valle, C., Valsquier, R., Ritz, A., Rogers, S. L., Applewhite, D. A. A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells. J. Vis. Exp. (138), e58325, doi:10.3791/58325 (2018).More

Peters, K. A., Detmar, E., Sepulveda, L., Del Valle, C., Valsquier, R., Ritz, A., Rogers, S. L., Applewhite, D. A. A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells. J. Vis. Exp. (138), e58325, doi:10.3791/58325 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter