هنا يصف لنا مقايسة contractility المورفولوجية S2R + الخلايا باستخدام. ويؤدي التطبيق [ليغند] خارجية، مطوية جاستروليشن (الضباب)، إلى تفعيل الضباب مما يشير إلى كونتراكتيليتي المسار والخلوية. يمكن استخدام هذا الفحص للتحقيق في تنظيم البروتينات الخلوية كونتراكتيليتي في الضباب مما يشير إلى المسار.
وقد وضعنا يستند إلى الخلية مقايسة استخدام الخلايا المورفولوجية التي يجمل انقباض قمي بدأها gastrulation مطوية (الضباب)، مورفوجين طلائي يفرز. في هذا التحليل، كالضباب مؤثر لتنشيط رو من خلال سلسلة إشارات تتضمن مستقبلات (ميست) إلى جانب البروتين ز وبروتين Gα12/13 (سلك شائك/Cta)، والتي تحتوي على مجال بدز جوانين النوكليوتيدات تبادل عامل (RhoGEF2). الضباب مما يشير إلى النتائج في إعادة تنظيم cytoskeleton أكتين لتشكيل سلسلة مال الهوس سريعة ودراماتيكية. الضباب للذوبان يتم جمعها من خط خلية مستقرة وتطبيق اكتوبيكالي S2R + الخلايا، مما يؤدي إلى التغييرات الشكلية مثل انقباض قمي، لوحظت عملية خلال العمليات الإنمائية مثل جاسترولاتيون. هذا التحليل هو قابلة للفرز الفائق، واستخدام [رني]، يمكن أن تسهل تحديد جينات إضافية تشارك في هذا المسار.
وأثبتت الدراسات embryogenesis أجريت مع الكائنات نموذج الجينية لا تقدر بثمن لفهمنا لكيفية تجميع الخلايا في الأنسجة. الدراسات المورفولوجية ميلانوجاستير، على وجه الخصوص، أدت إلى تحديد الجينات الرئيسية والمبادئ البيولوجية أن المباشرة في morphogenesis والتنمية من الكائنات الحية من الإخصاب إلى مرحلة البلوغ1،2 , 3-بالتوازي مع البحث الجيني الذي أجرى مع المورفولوجية، خطوط الخلايا المستزرعة المستمدة من الأنسجة ذبابة الفاكهة وظهرت أيضا كنظام قوي لمعالجة مجموعة واسعة من الجزيئات والخلايا البيولوجية الأسئلة4، 5 , 6– المورفولوجية زراعة أنسجة خلايا لها متطلبات الحد الأدنى للصيانة، كما أنها تربى في درجة حرارة الغرفة ودون CO2. على هذا النحو، فقابله للتصوير عالي الدقة، ولديهم درجة عالية من القابلية لتثبيط الجينات [رني]6،7. العديد من المجموعات قد استخدمت خلايا الأنسجة ثقافة المورفولوجية كأداة لاكتشاف الجينات المعنية في تحديد شكل الخلية وديناميكية cytoskeletal والجدوى، البلعمه والإشارات تنبيغ مسارات4،8، 9،،من1011. عندما تستخدم كنموذج جنبا إلى جنب مع الحيوان كله، خطوط الخلايا المورفولوجية المستزرعة توفر مجموعة من نهج تكميلية جداً أن التعجيل بتحديد الجزيئات الهامة لتطوير وتوفير إطار تحديد هذه الأدوار آليا إلى12. هنا، نحن تصف تحليل يستند إلى الخلية لدراسة مسارات الإشارات التي تؤدي إلى انقباض قمي عبر gastrulation مطوية (الضباب) مسار13،14. يسمح هذا التحليل يستند إلى الخلية contractility الباحثين للتحقيق على حد سواء الضباب مما يشير إلى المسار والآليات الجزيئية التي تنظم contractility الثاني غير العضلات الميوسين.
ودرست gastrulation الجنين المبكر المورفولوجية لسنوات عديدة كنموذج الجيني morphogenesis الظهارية والانتقال الخلوية من الظهارية إلى هوية الخلايا الوسيطة. واحدة من الأحداث الرئيسية التي وقعت في جاستروليشن هو morphogenesis لمجموعة فرعية خلايا الظهارية على طول خط الوسط البطني الجنينية من عمودي إلى الهرمية في الشكل15،16،،من1718. تغيير النتائج في استيعاب الخلايا ميسوديرمال الظني هذا الشكل خلية بسيطة وتحركها النشاط الحركي من الميوسين غير العضلات ثانيا تقيد أكتين الشبكة16،،من1920. عقود أبحاث الجينية وحددت المكونات الجزيئية لهذا المسار ووضعت لهم التسلسل بالترتيب التالي: 1) ويفرز الضباب من المجال قمي من الخلايا الظهارية في خط الوسط البطني؛ 2) الضباب بربط إلى جانب البروتين ز المشارك المستقبلات، الضباب والضباب الدخاني، وإشارات عن طريق هيتيروتريميريك ز-البروتين المعقدة التي تحتوي على وحدة فرعية12/13 Gα سلك شائك (Cta)، الذي هو تشابيرونيد ريك “مرفق البيئة العالمية” غير المقبول-8؛ 3) تنشيط كبار المستشارين التقنيين جوانين النوكليوتيدات صرف عاملاً، RhoGEF2، الذي بدوره يقوم بتنشيط Rho1 ز-البروتين الصغيرة؛ 4) Rho1 ينشط رو كيناز (جمهورية كوريا)؛ 5) كوريا الجنوبية ينشط الميوسين غير العضلات كونتراكتيليتي الثاني في المجال قمي من خلال الفسفرة السلسلة الخفيفة التنظيمية (RLC)، وبالتالي إنتاج انقباض قمي (الشكل 1)15،21،22 23، ،،من2426،25،27،،من2829. الطفرات في العديد من هذه العناصر تتداخل مع جاسترولاتيون العادية وغيرها من الحركات مورفوجينيتيك، بما في ذلك تكوين القرص الجناح والغدد اللعابية، مما يشير إلى أن يتم استخدام هذا المسار في عدة مراحل من المورفولوجية امبريوجينيسيس30،،من3132. مسار الضباب هو واحد من النماذج أفضل درس لتشكيل الظهارية، وقدمت أفكاراً هامة في morphogenesis كيف مستوى الأنسجة وينظم من النسخ الجيني للخلية cytoskeleton يحركها حركات14،15 ،21.
لقد طورنا مقايسة contractility يستند إلى الخلية التي يلخص الردود كثيرة على الهاتف الخلوي المصب من الضباب التي لوحظت في تطوير الأجنة يطير17. نحن إجراء هندسة عكسية S2 مستقرة معلم خط الخلية التي تعرب عن الضباب في نهايته ج مع حركة تحت سيطرة مروج ميتالوثيونيني إيندوسيبلي التي يمكن أن تحصد عند إضافة كبريتات النحاس (CuSO4) إلى المتوسط. عندما يتم تطبيق وسائل الإعلام مكيفة الضباب اكتوبيكالي على مستقبلات S2 + (S2R +) الخلايا، وسبليني الخلايا S2 يتميز بهم التعبير التفاضلية من مستقبلات مثل مفارز فريزليد وانتغرين، الخلايا الخضوع لإعادة تنظيم سيتوسكيليتون تذكرنا بدرجة عالية من انقباض قمي12،17،،من2733. ويمكن ملاحظة هذه التغييرات بالتباين مرحلة الفحص المجهري في الضباب الذي العلاج يؤدي إلى ظهور الكشكشة الظلام-المرحلة الإرشادية زيادة شعاعي في contractility الثاني الميوسين غير العضلات، أو بالأسفار الفحص المجهري حيث يؤدي العلاج الضباب إلى تشكيل عصابات الثاني الميوسين غير العضلات في الخلايا معربا عن معلم اجفب RLC34. وتتضمن هذه الحلقات سلسلة خفيفة تنظيمية فوسفوريلاتيد الميوسين (برلك) مرئية عبر إيمونوستينينج23،34،35. تتطلب هذه الاستجابة التي يسببها الضباب كبار المستشارين التقنيين، RhoGEF2، رو، وجمهورية كوريا؛ وهكذا، باستخدام S2R + خلايا والمؤتلف حركة الضباب، أنشأنا وسيلة للتحقيق انقباض المستحثة بالضباب في نظام يقوم على ثقافة الأنسجة24،25،34.
نقدم هنا، بروتوكول مفصل مقايسة contractility يستند إلى الخلية استخدام زراعة الأنسجة المورفولوجية خط خلية (S2R + الخلايا)، الذي يخضع انقباض الثاني الميوسين غير العضلات كاستجابة للضباب الإشارات. هذا التحليل مفيد للتحقيق في مسار الضباب، فضلا عن الآليات التي تنظم contractility الثاني غير العضلات الميوسين.
الاعتبارات استزراع الخلايا:
الشروط التي S2R + الخلايا يتم في ظلها أمر حاسم لتحقيق بيانات موثوقة من هذا التحليل. عند التخطيط لإجراء الفحص contractility، هو أفضل وسيلة للحفاظ على S2R + الخلايا في متوسط حشرة درع وغنت M3. بينما S2R + الخلايا يمكن أن تزدهر في وسائل الإعلام ثقافة الخلية الحشرات الأخرى (مثلاً، متوسط حشرة SF900 أو شنايدر)، كثيرا ما تفقد قدرتها على الاستجابة للضباب. S2R + الخلايا التي تحتوي على رقم مرور عالية، الممرات عموما أكثر من 20-25، تبدأ بتفقد حساسية إلى [رني]. فمن الأفضل ﻻستخدام خلايا المرور المبكر لجميع التجارب. جانب مهم آخر للتجارب استنفاد [رني] هو اختيار عناصر التحكم المناسبة. تتضمن عناصر التحكم السلبية الشائعة دسرنا استهداف اجفب أو ببلويسكريبت، ولا من الذي يكون التماثل إلى جينوم ذبابة. استهداف البروتينات في مسار الضباب (رو، جمهورية كوريا، إلخ)، والتي، عندما تستنفد، منع تنشيط contractility الميوسين غير العضلات، وأيضا عناصر مفيدة. S2:Fog-يمكن الحفاظ على حركة الخلايا في وسيط ثقافة بديلة خلية مثل SF900 وتستكمل مع 100 وحدة/مل من البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، و 0.25 الامفوتريسين باء علما أن FBS مطلوب ليس عند استزراع الخلايا في SF900. كثافة الخلية أيضا عنصر حاسم في جميع جوانب المورفولوجية زراعة أنسجة الخلايا. خلافا لخلايا الثدييات زراعة الأنسجة، المورفولوجية-الخلايا المشتقة من زراعة الأنسجة تزدهر أفضل تحت أعلى الخلية الكثافة (الكثافة لا أقل من 5 × 105 خلايا/مل). ومع ذلك، عند إجراء هذا الفحص، المهم أن الخلايا هي مطلي لا يخدع A-المغلفة بالاطباق زجاجية أعلاه التقاء 80%، التحديد الكمي للمتعاقد معها مقابل عدم التعاقد مع الخلايا سوف تصبح مملة جداً.
الجوانب الحرجة والنهج البديلة للفحص الخلوي كونتراكتيليتي:
إنتاج الضباب، يجند أن يطلق الميوسين غير العضلات كونتراكتيليتي الثاني، عنصر أساسي في هذا التحليل. بترميز الجينات الضباب وتين أحماض الأمينية 730 مع وزن الجزيئي توقع ~ 78 كاتشين26. وكشف تحليل هيدروباثي تمتد من بقايا مسعور 12 في الأمينية-المحطة النهائية في الضباب التي يمكن أن تعمل كتسلسل إشارة إفراز. وبالإضافة إلى ذلك، يحتوي أيضا على مواقع متعددة لاحتمال glycosylation N و O مرتبطة، كذلك اقتراح الضباب هو بروتين يفرز26تسلسل الترميز. ودعما لذلك، كان المترجمة الضباب إلى الحويصلات الافرازية في خلايا البشرة الظني تمر انقباض قمي16. حملت حركة الضباب التعبير عند إضافة كبريتات النحاس إلى المتوسط، والأجسام المضادة ضد الضباب أو حركة المعترف بها بروتين 150 ديناراً من الثقافة المتوسطة تحصد من الثقافات المستحث ولكن ليس من فعل وسائط الإعلام من الخلايا S2 تفتقر إلى بناء حركة الضباب. هذا الوزن الجزيئي أعلى من الوزن الجزيئي 80 ديناراً المتوقعة من الضباب ويوحي بأن الآلية الافرازية للخلايا S2 قد جليكوسيلاتي البروتين قبل الرقابة. بسبب التقلبات المحتملة في تنقية الضباب، فمن المستحسن استخدام نفس الدفعة وسائط الضباب مكيفة لجميع التجارب. يشكلون مجموعات كبيرة من مركزة الضباب-حركة وسائط سيساعد في الحفاظ على الاتساق في جميع جولات التجارب.
أن نجاح هذا الفحص يعتمد أيضا على ثقة تحديد الخلايا التي مرت بانقباض. في حين يمكن ملاحظة الخلايا مقيدة بالفحص المجهري الأسفار، تلطيخ أكتين أو غير العضلات الميوسين الثاني، الطريقة الأكثر موثوقية لتحديد وتقدير حجم الخلايا مقيدة من خلال مرحلة التباين أو مجهرية DIC. التهم دقيقة يمكن تحقيقه باستخدام 20 X-40 X التكبير على مجاهر الخفيفة القياسية. على الرغم من أن يستخدم البروتوكول مكتوب هنا أطباق زجاجية، المقايسة يمكن أيضا إجراء باستخدام معيار الزجاج 1.5 كوفيرسليبس مغلفة بألف يخدع يمكن أن يتم إضافة الضباب في 35 مم لزراعة الأنسجة في ساترة وضعها في بارافيلم، بغية الحد من الضباب المستخدمة لفحص كل. نوعية التثبيت عنصر حاسم للمقايسة، الخلايا الثابتة سيئة يمكن أن يؤدي إلى إيجابيات كاذبة. استخدام الحل تثبيت الطازجة، والتأكد من أن الخلايا الجافة ابدأ مرة واحدة ثابتة سيؤدي إلى نتائج أكثر موثوقية. وأخيراً، من المهم لعد عدد كبير من الخلايا. عادة، فقط 30%-50% من دون علاج أو انقباض الخلايا المعالجة [رني] التحكم بعد نضح الضباب. ومع ذلك، هناك مستوى القاعدية لانقباض التي تحدث في S2R + الخلايا، حيث هناك حاجة إلى عدد كبير من الخلايا للتأكد من أي تغيير في جزء صغير خلايا مقيدة بسبب العلاجات. وعلاوة على ذلك، نضوب بعض البروتينات المشاركة في تنظيم كونتراكتيليتي الثاني الميوسين غير العضلات قد يؤدي إلى فرط contractility، حتى في حالة عدم وجود الضباب. البيانات المعروضة هنا من أكثر من 3,600 الخلايا التي تم حسابها في ثلاثة علاجات [رني] متعاقبة باستخدام نفس الدفعة من الضباب مكيفة وسائل الإعلام.
تطبيقات للفحص الخلوي كونتراكتيليتي:
ويوفر هذا الإنزيم contractility، عندما يقترن مع [رني] فحص أساليب، نظاما قويا لدراسة الخلية إشارات و morphogenesis و contractility الخلوية. سابقا، قد استخدمت للتعرف على واحد من اثنين من مستقبلات المشارك الضباب21. شاشة مستهدفة من 138 إلى جانب البروتين ز مستقبلات (جبكرس) يتم استنفادها في [رني] في S2R + الخلايا، وقدرته على الاستجابة للضباب كان جزيئي كما هو موضح في البروتوكول المعروضة هنا. جبكرس 138، واحد، جين أونتشاراكتيريزيد سابقا، المعروفة الآن بالضباب، وكان كشفت. أظهر التحقيق في الدالة من الضباب أن يتطلبها contractility الخلوية المستحثة بالضباب في S2R + الخلايا، بل من الضروري أيضا جاستروليشن في تطوير المورفولوجية21. وعلاوة على ذلك، استخدمت هذا الفحص لإثبات أن ريك-8، مرفق البيئة العالمية غير متعارف عليه، أيضا عنصر في الضباب مما يشير إلى المسار27. أظهرت سلسلة من التجارب [رني] epistasis مقترنة بمقايسة contractility أن ريك-8 يتفاعل مع Gα12/13 وحدة فرعية كبار المستشارين التقنيين ومهامها إلى ترجمة ذلك داخل الخلية، هو أمر حيوي ل contractility الخلوية المستحثة بالضباب31 .
زراعة الأنسجة المورفولوجية مناسبة تماما للمبتدئين، الخلايا تمسك بسهولة في درجة حرارة الغرفة، ولا تتطلب CO2 أو مخزنة خلية الثقافة المتوسطة، وقوية ما دامت تتم المحافظة على كثافة ثقافة الخلية الصحيحة. الفحص الخلوي contractility أنجز بنجاح قسم المختبر دورة بيولوجيا الخلية قبل التخرج، حيث كان الطلاب القليل إلى أي خبرة في تثقيف الخلايا أو الفحص المجهري. والرزن contractility الخلوية المقدمة هنا يمثل أداة قوية، ويستند إلى الخلية التي يمكن أن تستخدم في اكتشاف الجينات، أو استجواب الضباب مما يشير إلى المسار، تساعدنا على تحسين فهم العمليات الإنمائية، من قبيل انقباض قمي و الميوسين غير العضلات كونتراكتيليتي الثاني، بصورة عامة.
The authors have nothing to disclose.
المؤلف يود أن يشكر أعضاء المختبر روجرز ومختبر أبليوهيتي، غريتا غلوفر، والطلبة في كلية ريد في ربيع عام 2018 “البيولوجيا الخلوية” الحال، الذين ساهموا في وضع هذا البروتوكول. علاوة على ذلك، المؤلف يود أن يشكر أعضاء المختبر ريتز لقراءة وتحرير هذه المخطوطة بعناية. وأيد “المؤسسة الوطنية للعلوم” تحت رقم جائزة 716964 D.A.A. وا. ر. وقسم الأحياء كلية ريد البحث عنها في هذا المنشور.
S2R+ cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 150 | cell culture line, undergoes apical constriciton |
S2:Fog-myc cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 218 | cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter |
S2R+ :Sqh-EGFP cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 196 | cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP |
Shield and Sang M3 | Sigma-Aldrich | S3652 | cell culture medium |
SF900 insect medium | Thermofisher Scientific | 12658019 | alternative cell cutlure medium |
Schneider’s insect medium | Thermofisher Scientific | 21720024 | alternative cell cutlure medium |
Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 16000044 | media supplement |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermofisher Scientific | 15240112 | antimicrobial/antifugal media supplement |
Concanavalin A | MP Biomedicals | 150710 | used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion |
Glass bottom plates | Maktek | P35G-1.5-10 | used for assay and for fixing and staining cells |
Glass cover slips | Corning | 2940-225 | alternative to glass bottom dishes |
Protein concentrators | Millipore | UFC903008 | 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media |
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks | Genessee | 25-204,25-206,25-208,25-210 | used to culture cells |
6-well and 12-well tissue culture dishes | Genessee | 25-105, 25-106 | used to culture cells |
Flourescent mounting medium | Dako | S3023 | to preserve fixed cells |
32% Paraformaldehyde | EMS | 15714-S | used to fix cells |
Pipes | EMS | 19240 | used in PEM buffer for cell fixation |
Anti-Myc Antibody | Drosophila Hybirdoma Bank | cat# 9E10 | used to dectect Fog-Myc |
PhosphoSerine-19 antibody | Cell Signaling | 3671 | antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19 |
488-Phalloidin, 568-Phalloidin | Thermofisher Scientific | A12379, A12380 | to stain for f-actin |
Hawk-VT multi-point array scanning confocal system | VisiTech International | Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells | |
Eclipse TE300 Inverted microscope | Nikon | Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells |