Summary
ここで我々 はショウジョウバエS2R + 細胞を用いた収縮アッセイをについて説明します。外因性リガンド、折原腸陥入 (霧) のアプリケーションは、シグナル伝達経路と細胞の収縮性の霧の活性化に します。この試金を使用して、シグナル伝達経路霧の中で細胞の収縮性蛋白質の規制を調査できます。
Abstract
細胞に基づく試金ショウジョウバエのセルを使用して折り畳まれた腸 (霧) 分泌上皮モルフォゲンによる細胞頂端収縮を繰り返すことを開発しました。このアッセイの霧は、PDZ ドメインを含むグアニンヌクレオチド交換因子 (RhoGEF2)、Gα12/13蛋白質 (コンサーティーナ/Cta)、G タンパク質共役受容体 (ミスト) シグナル伝達カスケードを通じて Rho をアクティブにアゴニストとして使用されます。霧信号収縮の財布のひもを形成するアクチン細胞骨格の迅速かつ劇的な再編の結果。水溶性の霧が安定したセルラインから収集され、S2R + 細胞、腸などの発達過程、過程を観察細胞頂端収縮のような形態学的変化につながる異所萌出へ適用。この試金は高スループット スクリーニングを受けやすいし、この経路に関与する遺伝子の同定を容易にすることができます、RNAi を用いたします。
Introduction
胚遺伝モデル有機体と実施の研究は組織に細胞をアセンブルする方法の私達の理解に非常に貴重証明しました。ショウジョウバエの研究は特に、成人1,2受精からの重要な遺伝子と形態形成を直接生物学的原則の同定と生物の開発につながっています。,3ショウジョウバエを用いた遺伝学的研究に並行して、はミバエ組織由来の培養細胞はまた分子の広い範囲に対処するための強力なシステムとして浮上していると細胞生物学的質問4, 。5,6。ショウジョウバエ培養細胞維持のための最小限の要件をあるは、部屋の温度、CO2せずに培養すると、。など、高解像度の画像に従う、RNAi6,7による遺伝子阻害に感受性の高度があります。多くのグループは、細胞の形態、細胞骨格の動態、生存率、貪食能、および信号伝達経路4,8の定義に関与する遺伝子を発見するのにツールとしてショウジョウバエ培養細胞を使用しています。 9,10,11。ショウジョウバエの培養細胞が開発の重要な分子の同定の短縮とするための枠組みを提供する非常に相補的なアプローチのセットを提供する全体の動物と一緒にモデルとして採用する場合12彼らの機構の役割を決定します。ここでは、我々 は細胞頂端収縮トリガー経由で折り返されている原腸陥入 (霧) 経路13,14シグナル伝達経路を研究するセルベースのアッセイをについて説明します。この収縮の細胞ベースのアッセイでは、両方の霧信号経路と非筋肉ミオシン II の収縮を調節する分子メカニズムを調査する研究者をことができます。
ショウジョウバエの初期胚の原腸陥入は、上皮の形態形成と上皮から間葉系細胞のアイデンティティへの細胞移行のため遺伝的モデルとして長年にわたって研究されています。原腸陥入の主要なイベントの 1 つは図形15,16,17,18錐体に柱状から胚の腹側正中線に沿って上皮細胞のサブセットの形態です。この単純なセル形状は推定中胚葉細胞の内面化の結果を変更し、非筋ミオシン II アクチン ネットワーク16,19,20の収縮運動によって駆動されます。遺伝子研究の数十年はこの経路の分子構成を識別している順番に次の順序でそれらを置いた、: 1) 霧が腹側正中線; で上皮細胞のアピカル ドメインから分泌されます。2) 霧、G タンパク質共役型共受容体に結合、霧、スモッグと信号をヘテロ三量体 G タンパク質を介して Gα12/13サブユニットによって非正規 GEF Ric-8; を付け添人コンサーティーナ (Cta) を含む複雑です3) Cta は、グアニンヌクレオチド交換因子で、RhoGEF2 は、小さい G 蛋白質 Rho1; を起動をアクティブに4) Rho1 アクティブに Rho キナーゼ (Rok);5) 韓国は、こうして細胞頂端収縮 (図 1)15,21,22 を生産 (RLC) 調節軽鎖のリン酸化によってアピカル ドメインで非筋ミオシン II 収縮をアクティブに ,23,24,25,26,27,28,29。これらのコンポーネントのいくつかの突然変異を通常の原腸陥入翼ディスクおよび唾液腺、この経路がショウジョウバエの複数の段階で使用されることを示すを含む他の造地形運動妨害します。胚発生30,31,32。霧経路上皮を形成するため学んだ最高のモデルの一つで、どのように組織レベルの形態形成に重要な洞察が骨格スタンダードセル動き14,15 に規制された遺伝子の転写から提供しています。 ,21。
細胞の応答の下流霧17ハエの胚の開発に観察されている多くを繰り返す収縮のセルベースのアッセイを開発しました。私たちは霧を表現したセルラインmyc媒体に硫酸銅 (CuSO4) の添加によって収穫することができます metallothionine 誘導性プロモーターの制御下でその C 末端のタグ付きの安定した S2 を設計されています。セルがの再編成を受ける S2 細胞受容体サブユニット Frizzled とインテグリンなどの差動表現によって区別の株である S2 受容体 + (S2R +) 細胞に異所萌出へフォグ付きメディアを適用する場合、細胞骨格が細胞頂端収縮12,17,27,33高を連想させる。これらの変更はフォグの治療は非筋ミオシン II の収縮性のある放射状の増加を示す段階暗いフリルの外観につながる位相差顕微鏡によるまたは霧は治療がリード蛍光顕微鏡で観察できる、タグ付きの EGFP RLC34を発現する細胞の非筋ミオシン II リングの形成。これらのリングは、ミオシンのリン酸化調節軽鎖 (pRLC) 表示を介して免疫染色23,34,35を含まれています。この霧による応答必要 Cta、RhoGEF2、Rho、韓国;したがって、霧 Myc 遺伝子組換え、S2R + 細胞を使用して、我々 は、霧が組織文化系24,25,34収縮作用を調査する手段を確立しました。
Protocol
1.ショウジョウバエ培養細胞のメンテナンス
- S2R +、S2R +: RLC の EGFP と S2:Fog を維持-Myc セル室温 20 ° C そして 25 ° C, 10% 牛胎児血清、ペニシリンの 100 単位/ml、100 μ g/mL ストレプトマイシンで 0.25 アムホテリシン B とシールドと歌った M3 昆虫培の間が望ましい、密度 5 x 105セル/mL よりも低くします。
注: セル密度が低い死に至る。 - すぐに細胞の低温保存バイアルを解凍し、培養フラスコに転送します。文化が確立され、解凍により細胞死の兆候が沈静化しているまで、細胞培養液中の 4-5 mL の容積の小さな組織培養のフラスコ (12.5 cm2または 25 cm2) で開始します。
注: 融解による細胞死の兆候には、滑らかで、丸みを帯びた形状と壊死細胞の組織培養の培地直説法で細胞の残骸の小さい暗いビットを欠いている非付着性のセルが含まれます。 - ゆっくりとにより、100% の confluency、細胞間スペースがほとんどない、彼らは互いに積み上げを開始する (4-8 d) 数日間妨げられていない成長する細胞組織培養のサイズをスケール アップ。細胞培養培地 10 mL を添加した (75 cm2) の大きい組織培養フラスコにこの 100% コンフルエント小さい 12.5 cm2または 25 cm2フラスコからすべてのセルを転送します。
注: 75 cm2のフラスコの中の細胞を維持する十分な細胞ほとんどの実験になります。 - 上下、組織培養プラスチックから、緩く付着細胞を取り除くためにそれを使用して細胞培養液をピペットでセルごとの 3-4 d の通路します。今新鮮なフラスコに再懸濁細胞を含むこの媒体を転送します。各通路の新鮮な細胞培養培地で細胞 1:4 を希釈し、必要に応じて繰り返します。
2 ショウジョウバエS2R + 細胞の RNAi 治療
注: ロジャース、ロジャースを参照して6昆虫事情に適した dsRNA を生成する方法の詳細について。
- S2R + 細胞を密度 105セル/mL、完全なシールドと歌った M3 を使用して x 5 細胞培養媒体 RNAi 治療よりも生存率も低くを助長または 6-12 ウェルの組織培養プレートに転送します。
- ティッシュ文化フードで働いて、優しく 6 ウェルまたは 12 ウェルの組織培養プレートの傾斜やピペットで細胞培養の培地を吸引によって古い細胞培養培地を削除します。すぐに各ウェルにピペッティングによる新鮮な細胞培養液の 1 mL でこの古い細胞培養液を置き換えます。
注: この行うことができます実質的な損失することがなく細胞を細胞培養液を交換する前に 30-45 分緩く付着する許可されている後。 - ロジャース、ロジャースの詳細なプロトコルに従う生成された dsRNA の 10 μ G/ml を追加6 RNAi 条件ごとのセルの各ウェルの組織培養の培地に直接ピペッティングによる。
- 毎日、新鮮な培地 1 mL と RNAi 条件ごとの dsRNA の 10 μ G/ml で細胞培養液を交換するこの手順を繰り返します。
注: RNAi 実験は通常実施 7 d;しかし、正確なタイミングは蛋白質の転換および dsRNA の有効性に依存しています。他のターゲットは、長く治療6を必要としながら、RNAi 治療 3 d と短くは効果的にある特定の蛋白質の細胞を使い果たします。
3. 霧の生産と収穫
- スケール アップ、S2:Fog の成長-マキシへほぼ 100% 合流 75 cm2のフラスコ細胞培養培地 (あるいは細胞培養培地 20 mL で 150 cm2フラスコ) の 10 mL のセルを取得する 4-8 d の妨げられていない成長させることで Myc セルマイズ霧生産。
- 100 mM CuSO4 (または 100 mm CuSO4 150 cm2フラスコ 100 μ L) の metallothionine プロモーターの誘導のためにほぼ 100% コンフルエント 75 cm2のフラスコに 50 μ L を追加します。48 時間室温で孵化させなさい。
- ピペッティングによる組織培養用フラスコから霧 Myc 含有培地を削除し、15 mL や 50 mL の円錐管にそれを転送します。細胞および細胞残骸の中をオフに 10-15 分のための 4 ° C で 2,500 × gで遠心分離機します。
- 新しい円錐管にクリアされたセル培地を転送し、氷の上にそれを維持します。作業のバッチ, 再生セルロース膜で 3,000 MW コンセントレーターの 15 mL にクリアされた培地 5 mL を転送し、媒体を集中する時 4 ° C、30 分で 2,500 × gで遠心分離機のそれ。
注: また、大容量ボリュームをコンセントレーター可能性があります使用される (50 mL)。濃度、中に霧を豊かに、暗い色培地は V 形フィルターの下部を構築する開始されます。 - コンセントレーターの"V"の下にピペット チップを挿入し、遠心分離の各ラウンド間暗い着色されたメディアを削除、新鮮な 1.7 mL および microfuge の管にそれを転送します。氷の上のメディアを維持します。
- 手順 3.4 と 3.5 暗い色を削除することによって集中霧 Myc メディアとより多くの交換を繰り返して同じコンセントレーターを使用して職員への贈り物媒体、媒体が 1 に集中してになるまで、元のボリューム (つまり、10 mL から 1 mL の 10 分開始材料)。
- 4 ° C で集中霧 Myc を格納します。
注: 後、必ずストレージの拡張の期間に起因する可能性があります細菌の汚染を監視するため。 - Lysate を形成する変性 SDS 含んでいるバッファーの 10 μ L を高濃度霧 Myc 培地の 10 μ L を混合することにより SDS ページを実行します。35 で SDS ページのゲルを実行 mA 約 1 h. ゲル硝酸セルロースの膜 (または転送または、PVDF 膜) 120 で 1 時間の mA。150 kDa のバンドを検出する市販 Myc 抗体を用いたウエスタンブロットを実行します。
注: バッチごと馴化培地霧 Myc の濃度が異なる場合があります。それは、分析を実行するために霧 Myc の正確な濃度を測定する必要はありませんが、各バッチの有効性は実験を実行する前にテストする必要があります。 - 次の手順、3.1 3.2 S2 細胞のほぼ 100% コンフルエント 75 cm2のフラスコから細胞培養培地 10 mL (または 150 cm2フラスコからまた、20 mL) までにピペッティングを収集 S2 エアコン メディア コントロールを準備します。新鮮な 15 mL や 50 mL の円錐管に S2 細胞培養培地コントロールを転送します。
- 手順 3.4 3.7、(2,500 x をg時に 30 分の 4 ° C) での遠心分離によって細胞および細胞残骸のライセートをオフにクリア細胞ライセートをコンセントレーターに転送し、遠心分離機のバッチ内で制御媒体を集中させる1/10 元のボリューム。
注: S2 調節されたメディアの応用は実質的な細胞収縮アッセイにはつながらない。 - 数ヶ月間集中の S2 の 4 ° C でメディア コントロールを格納します。
注: ストレージ後、必ず汚染を監視します。
4. コンカナバリン A コーティング ガラス底皿の S2R + 細胞のメッキ準備
- コンカナバリン a (con A) ソリューションの 10 mL を最終濃度 0.5 mg/mL を水 10 mL に con A 5 mg を溶解してください。分注このソリューションをより便利なボリューム (1 mL を 500 μ L) し、-20 ° C で保存
- コン A 溶液 200 μ L を各皿のガラス部分をコーティングすることにより 35 mm ガラス底の料理を準備し、ティッシュ文化フードの室温で約 2 分間料理を孵化させなさい。次に、(これは保持および未来の実験のために再利用できる) すべての con A ソリューションを削除し、完全に風乾する料理。
ノート: 料理大量に準備することができます、研究室のベンチ引き出しなど乾燥した場所で 6 ヶ月保存できます。 - ガラス底皿ごとに新鮮な細胞の培養基約 2 mL を追加します。任意の緩く付着細胞をデタッチするのにはそれを使用して上下、細胞培養液を分注してアッセイによってテストする S2R + 細胞を再懸濁します。
- 合流 50%-70% の間にあるので新鮮な培養液を含んでいる 35 mm ガラス底皿に再懸濁の S2R + 細胞を転送します。培養顕微鏡下で細胞密度を確認するには、セルの数の見積もりを取得する媒体中に浮遊細胞のいくつかの平野を通して上下に焦点を当ててします。
注: 試行錯誤 50%-70% の confluency を達成するために必要な細胞の適切な密度を達成することができます。 - 45-60 分の con A コーティング ガラス底皿に付けるセルを許可します。
注: 完全にアタッチされた S2R + セルの表示 '揚げ-卵のような' 平坦化され、段階暗い。
5 霧条件培地および細胞収縮アッセイの有効性テスト
- 必要な場合、確認霧 Myc の収量を生産し、S2:Fog から集中-Myc 安定細胞 SDS-PAGE および西部にしみが付くことによってライン。10 μ L の濃縮霧 Myc および沸騰 5 分のためにそれは標準的な SDS-PAGE および西部のしみが付くプロトコルに従うし、霧 Myc 生産を確認する反 Myc のしみに SDS 含んでいるサンプルバッファーの 10 μ L を追加します。
- 軽くピペッティングして手順 4.3 から添付の S2R + 細胞からすべてのシールドと歌った M3 媒体を削除し、慎重に使用霧調節された媒体の量を制限する盾と相培の背面 75 μ L を追加します。
- ガラス底皿のガラス部分にステップ 150 μ L、フォグ付きメディアをシールドと歌った M3 の 1:1 の比率で総量をさせる 5.2 からフォグ付きメディアの 75 μ L を追加します。
注: 150-200 μ L の総ボリュームは典型的なガラス底皿; のガラス部分を完全にカバーするために必要なただし、使用されるガラス底皿の大きさに応じて変わります。 - 20 倍または 40 倍の倍率を使用してセルのフィールド全体を観察する位相差顕微鏡による細胞の収縮性を監視します。細胞の形態を追跡し、暗い相と波打ち形状変化を示す段階光の交互になるパターンを探します。
注: 霧のアプリケーションは通常、細胞の収縮を経る S2R + セルの 30%-50% に、10 分後セルは、リラックスを開始, 彼らの滑らかなエッジ、揚げ卵のような形態に戻る。 - 細胞の収縮性の堅牢性を監視します。細胞の応答が非常に強力な盾と相培霧調節された媒体の 1:1 の比率を使用して場合は、未来の実験のための高濃度の霧 Myc 培地を節約するために霧調整培の量を減らします。1:1 の比率は堅牢な細胞収縮; につながらない場合原液のフォグ付きのメディアを使用します。一般的には、1:3 の比率は、実験を成功させるための十分な応答を生成します。
注: 霧調節された培地バッチ与えられたあたりフォグ付きシールドと相培中長期の適切な比率が確立されるは、他のすべての実験のためこの比率を使用します。 - ラインを使用して安定した S2R + セル GFP 付けられた調節軽鎖 (S2R +: Sqh EGFP) を表現する細胞収縮アッセイ中非筋ミオシン II のダイナミクスを監視します。
- 確立された霧調整培率新鮮なシールドと歌った M3 媒体を使って手順 5.2 〜 5.5 からピペットで細胞培養培地を取り除きし、ガラス張り底皿のガラス部分に戻って新鮮なシールドとサンウの媒体を追加します。所定の比率で霧調整培を灌流した生きているセルのイメージ シーケンスを取得中灌流時にガラス底皿を移動しないよう注意してください。
6. 固定と収縮 S2R + 細胞の染色
- S2R + PEM バッファー (100 mM パイプ、1 mM 1 mM MgCl2、グリコールエーテルジアミン四酢酸 pH 6.9) で 10% パラホルムアルデヒド溶液を使用してセルを修正します。
注: PEM バッファー原液 x 2 では、だいたい、4 ° C で数ヶ月保存できます。 - ピペッティングによる霧処理 S2R + 細胞から細胞培養培地を削除し、すぐに 10% パラホルムアルデヒド溶液 1.5 2.0 mL に置き換えます。室温で 15 分間インキュベートします。
注: 固定セルに格納できる 4 ° C での固定の解決数日間ただし、最初の 15 分固定が 4 ° C にセルを転送する前に室温で行われることが重要です。 - ピペッティングで 10% パラホルムアルデヒド ソリューションを削除し、この有機廃棄物を適切に処分します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 35 mm ガラス底皿に 1.5 2.0 mL を軽くピペッティングにより細胞をすすいでください。ピペッティングで古い PBS を削除し、1.5 2.0 mL の新鮮な PBS 2 倍以上残留固定ソリューションを削除するとそれを置き換えます。
注: ことセルこの点から上で乾かさないプロトコルが重要です。 - 0.1% 非イオン性洗剤 (pbst;) 室温で 20 分間で補われた PBS で希釈した 5% ヤギ血清の約 200 μ L で細胞をブロックします。
注: 通常、ブロッキング剤は血清で二次抗体が発生生物に一致する含まれています。 - PBST でそれを希釈して一次抗体溶液を準備します。ガラス底皿のガラス部分を完全にカバーするのに約 200 μ L のボリュームを使用します。
- ピペッティングによるブロッキングのソリューションを削除し、料理のガラス部分に直接一次抗体のソリューションを追加します。室温で 1 時間インキュベートまたは、代わりに、4 ° C で一晩インキュベート
- 4 ° C で一晩インキュベート、蒸発を防ぐためにパラフィルムで 35 mm ガラス底皿をラップします。
- ピペッティング一次抗体・ ソリューションを取り外し、35 mm ガラス底皿に新鮮な PBS の 1.5 2.0 mL のピペットで細胞をすすいでください。ピペッティングで PBS を削除し、1.5 2.0 mL の新鮮な PBS 2 倍以上でそれを置き換えます。
- PBST でそれを希釈、二次抗体溶液を準備します。200 μ L のボリュームは十分にちょうど皿のガラス部分をカバーします。
- 料理のガラス部分に直接二次抗体溶液を追加します。室温で 1 時間二次抗体溶液をセルを孵化させなさいまたは 4 ° C で一晩
- 場合は蒸発を防止するために、一晩インキュベート パラフィルムで 35 mm ディッシュをラップします。
- ピペッティングによる二次抗体溶液を削除、料理に新鮮な PBS のピペッティング 1.5 2.0 mL の PBS のセルをすすいでください。古い PBS を削除し、置き換えます 2 倍以上、この同じ手順に従います。
- 35 mm のガラス底皿のガラス部分をカバーする耐フェード蛍光灯取付中の十分を追加することによって固定と染色細胞を保持します。
- 4 ° c およびライトからのサンプルを格納します。
注: 正しく格納されて場合でも蛍光シグナルはヶ月以上崩壊ゆっくり。最高の結果を得るには、一週間以内のイメージします。
7. イメージングと細胞収縮アッセイの定量
- S2R + 標準を使用してセルを固定像は逆位相コントラスト、DIC、または蛍光イメージング機能と光学顕微鏡です。20 倍または 40 倍の倍率を使用して、200 の画像を取得することを目標に、細胞密度によって細胞の 10-30 重複しないイメージ フィールドまたは 1 つの条件より多くの細胞をキャプチャします。
- 標準セルのカウンターを使用して、カウントし、キャプチャ フィールドごと契約 (段階暗い、bonneted 細胞) と noncontracted の数を記録します。
注: それは最高のフィールドごとに独立した契約と noncontracted の細胞数を取る 2 人の研究者を持っているかまたは、同じ研究者数えることができる細胞の同じイメージ フィールド 3 回契約の平均数を可能にして計算されるフィールドごと noncontracted 細胞。 - 4.2 の手順で説明するよう、いくつかの 1 つの実験条件 con A コーティング ガラス底・料理を準備します。上下に緩く付着 S2R +: Sqh EGFP セルをずらすし、35 mm ガラス底皿の 50%-70% の合流しているのでそれらをプレートに培養液のピペットします。30-45 分を付けるセルを許可します。
- ライブ画像 S2R +: Sqh EGFP 細胞回転ディスク、掃引フィールド共焦点の顕微鏡を使用してまたは光シート顕微鏡による 60 倍 - 100 倍の倍率。添付の S2R +: Sqh EGFP セルを含むガラス底皿からすべてのシールドと歌った M3 媒体を削除します。
- ピペット、目的の皿の位置を邪魔しないように、注意を使用してガラス底皿のガラス部分に直接手順 5.2 5.5 から新鮮なシールドと歌った M3 媒体に霧 Myc 馴化培地の所定の比率を灌流します。開始、S2R +: Sqh EGFP 細胞における収縮をキャプチャするために 12-15 分の画像を取得します。
注: 非筋ミオシンのミオシン pRLC 染色する場合、細胞の表面でタイトなミオシン リングの形成は収縮を示すものも。かどうかは収縮の (図 3参照) を示すリング イメージ投射 S2R +: Sqh EGFP セル ライブ、EGFP タグ RLC タイトと同様となります。発生する形状の変化、細胞が「ボンネット」に 3 D 図形を取って顕微鏡の焦点面は、この細胞の形態変化を追跡するために調整する必要があります。下で RNAi 条件のコントロールは、通常、細胞の 30-50% が霧の添加によって収縮を受けます。いくつかの RNAi の条件が不在で霧を圧迫することにつながる可能性があります注意してください。
- ピペット、目的の皿の位置を邪魔しないように、注意を使用してガラス底皿のガラス部分に直接手順 5.2 5.5 から新鮮なシールドと歌った M3 媒体に霧 Myc 馴化培地の所定の比率を灌流します。開始、S2R +: Sqh EGFP 細胞における収縮をキャプチャするために 12-15 分の画像を取得します。
Representative Results
S2 と S2:Fog-Myc セル 150 cm2培養フラスコで合流条件の近くに栽培し、, 霧 Myc (図 2) の発現を誘導するために 24-48 時間の期間にわたって 25 75 μ M CuSO4で扱われました。S2 細胞 (図 2A) および S2:Fog からのサンプル-Myc 細胞 (図 2B) 除去し、霧 Myc 生産を監視する西部のしみ。予想通り、私たちは、任意の条件の下で S2 細胞から収穫されるメディアで霧 Myc を検出できませんでした。しかし、メディア、S2:Fog から収穫で霧を検出するか-Myc 安定したセルライン 75 μ M CuSO4誘導後 24 時間には早くも。S2R + 細胞、EGFP タグ調節軽鎖 (GFP RLC) 非筋ミオシン II (図 3 aと3 b) を表現するコン A コーティング ガラス底皿に接続されています。100 X を搭載した倒立顕微鏡で行われた住セルイメージ投射/1.4 フォグ付きメディアの灌 NA 対物レンズ。約 5 分後治療霧 Myc、RLC 形成リング非筋ミオシン II 収縮を示すものです。これらのリングで観察できる染色を通じて S2R + 細胞周囲の人間ミオシン RLC (図 4 aおよび4 b) の Ser19 残基に対応する合成リン酸化ペプチドに対する抗体。この抗体は、ショウジョウバエRLC で cross-reacts します。
ここで次のコントロール RNAi セルは、Rho1 に対して dsRNA の 7 日間の治療細胞収縮アッセイの代表的な例がある (図 5 a - 5E)。S2R + 細胞 con A コーティング ガラス底皿にメッキされた、メディアまたはメディア コントロールを霧完備で治療 (+ 霧) (-霧)。契約のセルの数は、次の固定、定量化されました。相密なフリルを表した狭窄のフォグ付きメディア (図 5B) 枯渇コントロール細胞で顕著であった。図 5Cで S2 調整培 Rho 枯渇細胞、滑らかなエッジ、揚げ卵のような形態の典型的な例です。霧のシグナル伝達経路だけでなく、細胞質分裂; Rho が役割を果たしていることに注意してください。したがって、Rho が使い果たされた細胞は、しばしばセル サイズと倍数性の増加につながる適切に分割する失敗します。Rho 枯渇細胞における実質的な収縮を観察することができなかったに対し、フォグ付きメディアの典型的な劣化電池リード、収縮を経るセルの 30%-50% に制御の治療。
図 1:シグナル伝達経路と推定される霧です。霧のない場合は、Gα12/13サブユニット、Gϒ、Gβ、その結合パートナーと一緒にコンサーティーナ (Cta) がアクティブではない、霧、スモッグ、共受容体に関連付けられています。Ric 8 Cta のシャペロンとして働くし、その細胞内の局在化を調節します。霧にバインド、Cta の関連付けを解除、Gϒ と Gβ からそれが小さい gtp アーゼ Rho1 に GTP を GDP の交換を触媒する細胞膜に新兵 RhoGEF2。GTP 結合 Rho1、現在アクティブなは、その活性化とそれに続く細胞収縮につながる非筋ミオシンの RLC を廃止 Rho キナーゼ (Rok) をアクティブにします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 霧 Myc 制作の時間コース。これらのパネルの表示細胞培養培地コントロール S2 セルの (A) または (B) S2:Fog の近く 100% コンフルエント フラスコから収穫-Myc 安定した細胞。セルは、24-48 時間の期間にわたって 25 75 μ M CuSO4と扱われました。細胞培養培地は、収集され、SDS-PAGE および西部にしみが付くことのために準備します。霧 Myc は、反 Myc 抗体によって検出されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 霧収縮作用の住セルイメージ投射します。S2R + II は、フォグ付きメディアの灌掃引フィールド共焦点顕微鏡によるイメージしました非筋ミオシンの EGFP タグ RLC を表現する細胞を安定してください。時間は、分と秒で表示されます。(A) このパネル時 0 セル coverslip インターフェイスに近い焦点面のイメージが表示されます: 00 霧 Myc. (B) このパネルの灌流は、時系列を示しています前に (0:30-10:00) セルの上部にある焦点平面で撮影した画像の。白い矢印は、収縮中に収縮リングに EGFP RLC によって示されるように非筋ミオシン II の再編を示します。スケール バーは、10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: リン酸化-の RLC 鈍痛霧 Myc. によって次の収縮の誘発収縮リングS2R + 細胞は固定され、アクチン ファロイジン (赤) を使用して、リン酸化 (緑)、役割 19 抗体を用いた RLC ・ DAPI (DNA、青)、コントロール (A) または (B) 霧 Myc エアコン メディアで治療の後染色します。霧 Myc. 添加時にリングにリン酸化 RLC の再編成に注意してくださいこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 霧誘起細胞収縮アッセイの代表的な定量化します。S2R + 細胞は、7 日間 (AとB) コントロール RNAi または小さい gtp アーゼ Rho1 に対して (CとD) dsRNA と扱われました。今回は、セル コン A コーティング ガラス底皿にメッキされた、メディア コントロール (A 、 C) や (B 、 D) の霧 Myc エアコン メディアで扱われました。スケール バーを表す 10 μ m. (E) A 散布条件ごとの契約のセルの割合の平均値と 95% 信頼区間を示しています。個々 の点は、40 倍の倍率 (フィールドごとの 10-120 セル) でビューのフィールドごとの契約セルの分数を表し、括弧内の数字を示す契約と非契約の両方のセルのセルの合計数のカウント以上 3 つの別々RNAi 実験。アスタリスクは、テューキーの多重比較アドホックの記事分析と一方通行 ANOVA (p < 0.0001) によって決定される RNAi と霧処理条件の間に有意差を示します。制御か霧 Myc エアコン メディア治療 Rho1 RNAi 扱われたサンプル間 (グレゴリオ暦) に統計的に有意な差がなかったことに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
ここでは、霧への応答として非筋ミオシン II 収縮を経るショウジョウバエ培養細胞株 (S2R + 細胞) を使用して収縮の細胞に基づく試金のための詳しいプロトコルを提案する信号します。この試金は非筋ミオシン II の収縮を調節するメカニズムと同様、霧の経路を調査するため便利です。
細胞培養に関する考慮事項:
細胞の維持、S2R + 条件は、この試金から信頼性の高いデータを達成するために重要です。一番良いのシールドと歌った M3 昆虫媒体 S2R + 細胞を維持するために収縮性分析を実行する計画。S2R + セルすることができます他の昆虫の細胞培養媒体で繁栄する間 (例えば、SF900 またはシュナイダーの昆虫媒体)、彼らはしばしば霧に反応性を失います。S2R + 高通過数、一般に以上 20-25 通路を持っている細胞は、RNAi に感度を失うことを開始します。すべての実験に早期成立のセルを使用することをお勧めします。RNAi 枯渇実験を別の重要な側面は、適切なコントロールを選んでいます。一般的なマイナス コントロールを含めるターゲット EGFP または pBlueScript、どちらも dsRNA のフライのゲノムの相同性があります。霧経路(Rho、韓国等)で蛋白質は、なくなると、非筋ミオシン収縮性の活性化を防ぐ、便利なコントロールがあります。S2:Fog-100 μ G/ml ストレプトマイシン、ペニシリンの 100 単位/ml を添加した SF900 など代替セル培地の Myc 細胞を維持でき、SF900 で細胞を培養するとき、0.25 アムホテリシン b. メモその FBS は必須ではありません。細胞密度はまたショウジョウバエ培養細胞のすべての側面に重要なコンポーネントです。哺乳類培養細胞、ショウジョウバエとは異なり-派生組織培養細胞より高い細胞密度の下で最高の繁栄 (密度 5 x 105セル/mL よりも低く)。ただし、この分析を実行すると、80% 合流上 con A コーティング ガラス底皿にセルはメッキパーツいない重要な契約対非感染細胞の定量は非常に面倒になってきます。
重要な側面と細胞収縮アッセイの代替的なアプローチ:
霧、非筋ミオシン II の収縮をトリガーするリガンドの生産は、このアッセイの重要なコンポーネントです。霧の遺伝子 〜 78 kDa26の予測分子量 730 アミノ酸のタンパク質をエンコードします。水の分析では、霧のアミノ末端の分泌シグナル配列として機能する疎水性残基 12 ストレッチを明らかにしました。さらに、コーディング シーケンスには、潜在的な N と O リンク糖鎖、さらに霧が分泌蛋白質26を示唆しているため複数のサイトも含まれています。これを支持する細胞頂端収縮16推定表皮細胞分泌小胞に霧はローカライズされました。霧 Myc 発現は、中に銅硫酸塩の添加によって誘導された、霧または Myc 抗体認識培地から 150 kD 蛋白質誘導培養から収穫しますが、ないから霧 Myc 構造に欠けている S2 セルからメディアを誘導しました。この分子量霧の予測 80 kD の分子量より高かったし、S2 細胞の分泌の機械が glycosylate 開口放出前にタンパク質をことを示唆しています。霧浄化における潜在的な可変性のためすべての実験にフォグ付きメディアの同じバッチを使用することをお勧めします。集中して霧 Myc メディアの大規模なバッチを作る実験のラウンド全体の一貫性を維持するために役立ちます。
この試金の成功は、また自信を持って収縮を受けているセルを識別するのに依存します。アクチンまたは非筋ミオシン II、染色で収縮細胞を蛍光顕微鏡で観察できる識別し、細胞の収縮を定量化する最も確実な方法は、位相コントラストや DIC 顕微鏡。正確な数は、最も標準的な光顕微鏡で 20 倍・ 40 倍の倍率を使用して実現できます。ここ使用しますガラス底の料理が書かれたプロトコル、分析も行える標準 1.5 ガラス coverslips con a コートを使用して各アッセイ用の霧の量を制限するために、パラフィルム上に配置 coverslip の組織培養の 35 mm でフォグの追加を行うことができます。不十分な固定セルは、偽陽性につながる可能性として、固定の品質はアッセイの重要なコンポーネントです。新鮮な固定ソリューションを使用することを確認し、一度固定細胞の乾燥してなかったより信頼性の高い結果に します。最後に、多数のセルをカウントすることが重要です。通常、のみ 30%-50% の未処理または霧の灌流後 RNAi 扱われた細胞が収縮します。しかし、S2R + 細胞で発生するため、治療のため収縮細胞の割合の変更が確実に多数のセルを必要くびれの基底のレベルがあります。さらに、非筋ミオシン II 収縮の調節に関与するいくつかの蛋白質の枯渇ハイパー収縮性、霧のない状態でもあります。今回発表されたデータは以上の 3 つの連続した RNAi 治療フォグ付きメディアの同じバッチを使用で数えられた 3,600 の細胞です。
細胞収縮アッセイのアプリケーション:
この収縮アッセイ、スクリーニング法、RNAi と組み合わせるには、細胞シグナル伝達、形態形成、細胞の収縮性研究する強力なシステムがご利用いただけます。以前は、それは 2 つの霧共受容体21の 1 つを識別するために使用されています。138 G タンパク質共役受容体 (Gpcr) の対象となる画面が S2R + 細胞、RNAi による消耗し、ここで提示されたプロトコルに従って霧に対応するその能力検定しました。138 Gpcr、単一の霧として今知られている以前未同定の遺伝子が発見されました。霧の関数に更なる調査を示したことだけでなくそれだった霧誘起 S2R + 細胞、細胞収縮のために必要なまた、原腸陥入ショウジョウバエ21の開発のために不可欠だった。さらに、この試金はことを示す Ric 8、非正規の GEF も霧の中でコンポーネント信号経路27に使用されました。一連の収縮アッセイと相まってエピスタシス RNAi 実験実証 Ric 8 が Gα12/13サブユニット Cta および霧誘起細胞収縮31 にとって重要な細胞内でローカライズする機能と対話すること.
ショウジョウバエ培養は、セル室温で簡単に維持が、CO2を必要としないまたは細胞培養液をバッファーし、適切な細胞文化の密度が維持される限り、堅牢な初心者に適しています。学生が顕微鏡や培養細胞で経験はほとんどないを持っていた、学部細胞生物学コースの研究室セクションによって細胞収縮アッセイが完了しました。ここで示した細胞収縮アッセイを表す遺伝子検出に用いることができる強力な細胞ベースのツールまたは霧のシグナル伝達経路を調査するより私たちを助ける細胞頂端収縮などの発達過程を理解し、一般の非筋ミオシン II 収縮。
Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
著者は、ロジャース ラボ ・ アップルワイト ラボ、グレタ グラバーとリード カレッジの春 2018年細胞生物学コースでは、このプロトコルの開発に貢献している学生のメンバーに感謝したいと思います。さらに、著者は慎重に読んで、この原稿を編集のザ ・ リッツ ・ ラボのメンバーに感謝したいと思います。この出版物で報告された研究は、D.A.A. とアリフール リード大学生物学部門受賞番号 716964 の下で全米科学財団によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S2R+ cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 150 | cell culture line, exhibits contractility when treated with Fog |
| S2:Fog-myc cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 218 | cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter |
| S2R+ :Sqh-EGFP cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 196 | cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP |
| Shield and Sang M3 | Sigma-Aldrich | S3652 | cell culture medium |
| SF900 insect medium | Thermofisher Scientific | 12658019 | alternative cell cutlure medium |
| Schneider’s insect medium | Thermofisher Scientific | 21720024 | alternative cell cutlure medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 16000044 | media supplement |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermofisher Scientific | 15240112 | antimicrobial/antifugal media supplement |
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 150710 | used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion |
| Glass bottom plates | Maktek | P35G-1.5-10 | used for assay and for fixing and staining cells |
| Glass cover slips | Corning | 2940-225 | alternative to glass bottom dishes |
| Protein concentrators | Millipore | UFC903008 | 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media |
| 25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks | Genessee | 25-204,25-206,25-208,25-210 | used to culture cells |
| 6-well and 12-well tissue culture dishes | Genessee | 25-105, 25-106 | used to culture cells |
| Flourescent mounting medium | Dako | S3023 | to preserve fixed cells |
| 32% Paraformaldehyde | EMS | 15714-S | used to fix cells |
| Pipes | EMS | 19240 | used in PEM buffer for cell fixation |
| Anti-Myc Antibody | Drosophila Hybirdoma Bank | cat# 9E10 | used to dectect Fog-Myc |
| PhosphoSerine-19 antibody | Cell Signaling | 3671 | antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19 |
| 488-Phalloidin, 568-Phalloidin | Thermofisher Scientific | A12379, A12380 | to stain for f-actin |
| Hawk-VT multi-point array scanning confocal system | VisiTech International | Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells | |
| Eclipse TE300 Inverted microscope | Nikon | Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells |
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