Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Een cel-gebaseerde Assay te onderzoeken niet-spier Myosin II Contractility via de gevouwen-gastrulatie signalering traject in Drosophila S2R + cellen

Published: August 19, 2018 doi: 10.3791/58325
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 2, 1,3,4, 2
1Department of Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biology, Reed College, 3Carolina Center for Genome Sciences, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

Hier beschrijven we een test van de contractility met behulp van Drosophila S2R + cellen. De toepassing van een exogene ligand, gevouwen gastrulatie (Fog), leidt tot het activeren van de mist signalering traject en mobiele contractility. Deze test kan worden gebruikt om te onderzoeken van de regulering van cellulaire contractility eiwitten in de mist signalering traject.

Abstract

We hebben een cel-gebaseerde assay Drosophila cuvetten die apicale vernauwing geïnitieerd door gevouwen gastrulatie (Fog), een secreted epitheliale morphogen recapituleert ontwikkeld. In deze test, wordt mist gebruikt als een agonist Rho activeren via een signalering cascade waarin een G-eiwit-gekoppelde receptor (Mist), een Gα12/13 eiwitten (Concertina/Cta) en een PDZ-domein-bevattende guanine nucleotide uitwisseling factor (RhoGEF2). Mist signalering van resultaten in de reorganisatie van het snelle en dramatische van het cytoskelet van de actine contractiele portemonnee string vormen. Oplosbare mist wordt verzameld van een stabiele cellijn en ectopically toegepast op S2R + cellen, wat leidt tot morfologische veranderingen zoals apicale vernauwing, een proces waargenomen tijdens de ontwikkelings processen zoals gastrulatie. Deze test is vatbaar voor high-throughput screening en, met behulp van RNAi, kan vergemakkelijken de identificatie van extra genen betrokken in dit traject.

Introduction

Studies van embryogenese uitgevoerd met genetische modelorganismen hebben bleek van onschatbare waarde aan ons begrip van hoe cellen worden geassembleerd in weefsels. Studies van Drosophila melanogaster, in het bijzonder, hebben geleid tot de identificatie van belangrijke genen en biologische principes die direct van de voedselproductie en ontwikkeling van organismen, van bevruchting tot volwassenheid1,2 , 3. parallel aan de genetische onderzoek met Drosophila, gekweekte cellijnen die zijn afgeleid van de fruitvlieg weefsels hebben ook naar voren gekomen als een krachtig systeem inspelen op een breed scala van moleculaire en biologische cel vragen4, 5 , 6. drosophila weefselkweek cellen hebben minimale eisen voor onderhoud, zoals ze gekweekt op kamertemperatuur en zonder CO2 zijn. Zo, ze zijn vatbaar voor hoge resolutie beeldvorming, en ze hebben een hoge mate van gevoeligheid voor gene remming door RNAi6,7. Vele groepen hebben Drosophila weefselkweek cellen gebruikt als een instrument om te ontdekken van genen die betrokken zijn bij de vaststelling van cel vorm, cytoskeletal dynamics levensvatbaarheid, fagocytose en signaaltransductie trajecten4,8, 9,10,11. Wanneer werkzaam als een model naast het hele dier, bieden gekweekte Drosophila cellijnen een aantal zeer complementaire benaderingen die de identificatie van moleculen belangrijk voor de ontwikkeling te versnellen en bieden een kader om te het bepalen van hun mechanistische rollen12. Hier beschrijven we een cel-gebaseerde test om te bestuderen van de signaalroutes die leiden apicale vernauwing via de gevouwen-gastrulatie (Fog) traject13,14 tot. Deze cel-gebaseerde contractility assay kan onderzoekers te onderzoeken zowel de mist signalering traject en de moleculaire mechanismen die niet-spier myosin II contractility regelen.

Gastrulatie van het vroege embryo Drosophila is onderzocht voor vele jaren als een genetisch model voor de epitheliale genuitdrukking en de cellulaire overgang van epitheliale mesenchymale cel identiteit. Een van de belangrijkste gebeurtenissen van gastrulatie is de morfogenese van een subset van epitheliale cellen langs de embryonale ventral midline uit in kolomvorm aan piramidale vorm15,16,17,18. Deze eenvoudige cel shape wijzigen van resultaten in de internalisering van de vermoedelijke mesodermal cellen en wordt aangestuurd door de motorische activiteit van niet-spier myosin II vernauwen de actine netwerk16,19,20. Decennia van genetisch onderzoek heeft vastgesteld dat de moleculaire componenten van dit traject en heeft ze achter elkaar geplaatst in de volgende volgorde: 1) mist wordt uitgescheiden uit het apicale domein van de epitheliale cellen in de ventral midline; 2) mist bindt aan de G-eiwit-gekoppelde co receptoren, Mist en Smog, en signalen via een heterotrimeric G-eiwit complex met de Gα12/13 subeenheid Concertina (Cta), die is gechaperonneerd door de niet-canonieke GEF Ric-8; 3) Cta activeert een guanine nucleotide uitwisseling factor, RhoGEF2, die op zijn beurt de kleine Rho1 van de G-proteïne activeert; 4) Rho1 activeert Rho kinase (Rok); 5) Rok activeert niet-spier myosin II contractility in de apicale domein door fosforylering van de regelgevende lichtketting (RLC), waardoor de productie van apicale vernauwing (Figuur 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Mutaties in een aantal van deze componenten interfereren met de normale gastrulatie en andere morfogenetische bewegingen, met inbegrip van de vorming van de vleugel schijf en speekselklieren, die aangeeft dat dit traject wordt gebruikt in verschillende stadia van Drosophila embryogenese30,31,32. Het mist-traject is een van de best bestudeerde modellen voor epitheliale vormgeven en heeft verstrekt belangrijke inzichten in hoe weefsel-niveau morfogenese van gene transcriptie is geregeld tot en met cel cytoskelet gestuurde bewegingen14,15 ,21.

We ontwikkelden een test van cel-gebaseerde contractility dat veel van de cellulaire reacties stroomafwaarts van mist die zijn waargenomen in de ontwikkeling van vliegen embryo's17recapituleert. We ontworpen een stabiele S2 cellijn die mist uitdrukt tagged op haar C-terminus met myc onder de controle van de promotor van een afleidbare metallothionine dat bij de toevoeging van kopersulfaat (CuSO4) aan het medium kan worden geoogst. Wanneer media mist-geconditioneerd wordt toegepast ectopically op S2 receptoren + (S2R +) cellen, die een subline S2 cellen onderscheiden zich door hun differentiële expressie van receptoren zoals Gesist en integrine subeenheden, de cellen ondergaan een reorganisatie van de cytoskelet sterk denken aan apicale vernauwing12,17,27,33. Deze veranderingen kunnen worden waargenomen door fase contrast microscopie in welke mist behandeling leidt tot de verschijning van fase-donker ruches indicatief voor een verhoging van de radiale in niet-spier myosin II contractility, hetzij door fluorescentie microscopie waar mist behandeling leidt tot de vorming van niet-spier myosin II ringen in cellen uiten van EGFP-gelabeld RLC34. Deze ringen bevatten een myosin-phosphorylated regelgevende lichtketting (pRLC) zichtbaar via immunokleuring23,34,35. Deze reactie mist-geïnduceerde vereist Cta, RhoGEF2, Rho en Rok; Dus, met behulp van recombinant mist-Myc en S2R + cellen, we hebben opgebouwd een middel om te onderzoeken mist-geïnduceerde vernauwing in een weefsel cultuur-gebaseerde systeem24,25,34.

Protocol

1. onderhoud van Drosophila weefselkweek cellen

  1. Handhaven S2R + S2R +: RLC-EGFP en S2:Fog-Myc cellen bij kamertemperatuur, bij voorkeur tussen 20 ° C en 25 ° C, in Shield en zong M3 insect medium aangevuld met 10% foetale runderserum, 100 eenheden/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine en 0,25 amfotericine B op een dichtheid niet lager zijn dan 5 x 105 cellen/mL.
    Opmerking: Lagere dichtheden van de cel tot de dood leiden.
  2. Snel ontdooien cryo-bewaard flesjes van cellen en hen overbrengen in een maatkolf van weefselkweek. Begin met een kleine weefselkweek kolf (12,5 cm2 of 25 cm2) in een volume van 4-5 mL van cel kweekmedium totdat de cultuur is ontstaan en tekenen van celdood als gevolg van ontdooien verdwenen.
    Opmerking: Tekenen van celdood als gevolg van ontdooien zijn niet-aanhanger cellen dat het gebrek aan een vloeiend, afgerond vorm en kleine donkere stukjes van cellulaire puin in de weefselkweek middellange indicatieve van necrotisch cellen.
  3. Langzaam schaalbaar naar de grootte van de weefselkweek doordat de cellen groeien ongestoord voor meerdere dagen (4-8 d) tot 100% confluentie, waar er is weinig tot geen ruimte tussen de cellen en ze beginnen te stapelen op elkaar. Overbrengen in alle cellen van dit 100% confluente kleinere 12,5 cm2 of 25 cm2 kolf een grotere weefselkweek kolf (van 75 cm2) aangevuld met 10 mL cel kweekmedium.
    Opmerking: Handhaving van de cellen in een maatkolf van 75 cm2 genoeg cellen voor de meeste experimenten zal opleveren.
  4. Passage van de cellen elke 3-4-d door pipetteren omhoog en omlaag het kweekmedium cel, cellen van de weefselkweek plastic gebruiken om om het even welk losjes verjagen nageleefd. Overdracht van dit medium, nu met de geresuspendeerde cellen, in een maatkolf van vers. Verdun de cellen 1:4 met verse cel kweekmedium met elke passage en herhaal zo vaak als nodig.

2. RNAi behandeling van Drosophila S2R + cellen

Nota: Verwijs naar Rogers en Rogers6 voor gedetailleerde instructies over hoe te produceren dsRNA geschikt voor insecten cultuur.

  1. S2R + cellen overbrengen in een 6-well of 12-well weefselkweek plaat duikt met een dichtheid die bevorderlijk zijn voor de levensvatbaarheid, niet lager dan 5 x 105 cellen/mL, met behulp van de volledige schild en zong M3 cel voedingsbodems voor RNAi behandelingen.
  2. Werken in de kap van een weefselkweek, verwijder het oude cel-kweekmedium door het kantelen van de 6-well of 12-well weefselkweek plaat en aspirating van de cel-kweekmedium met een pipet zachtjes. Snel vervangen door deze oude cel-kweekmedium de 1 mL van de verse cel kweekmedium pipetteren het in elk putje.
    Opmerking: Dit kan worden gedaan zonder aanzienlijke schade na de cellen hebben toestemming gekregen om losjes houden voor 30-45 min vóór het kweekmedium cel uit te wisselen.
  3. Voeg 10 µg/mL dsRNA die is gegenereerd na het gedetailleerd protocol in Rogers en Rogers6 waarbij het rechtstreeks in het weefsel kweekmedium van elk putje van cellen per RNAi voorwaarde eveneens.
  4. Herhaal deze procedure dagelijks, het kweekmedium cel vervangen door 1 mL verse voedingsbodem en 10 µg/mL dsRNA per RNAi voorwaarde.
    Opmerking: RNAi experimenten worden gewoonlijk uitgevoerd voor 7 d; de exacte timing is echter afhankelijk van eiwit omzet en de werkzaamheid van de dsRNA. RNAi behandelingen zo kort 3 d afbreken effectief cellen van bepaalde eiwitten, terwijl andere doelen is langer behandelingen6vereist.

3. mist productie en oogst

  1. Schaal-up van de groei van de S2:Fog-Myc cellen doordat ze groeien ongestoord voor 4-8 d van het krijgen van een bijna 100% confluente 75 cm2 kolf van cellen in 10 mL cel kweekmedium (of als alternatief, een 150 cm2 maatkolf van 20 ml cel kweekmedium) tot maxi Mize mist productie.
  2. Voeg 50 µL van 100 mM CuSO4 (of 100 µL van 100 mM CuSO4 voor een kolf van 150 cm2 ) aan de bijna 100% confluente 75 cm2 kolf gedurende de inductie van de promotor van de metallothionine. Incubeer gedurende 48 uur bij kamertemperatuur.
  3. Verwijder het medium mist-Myc-bevattende uit de kolf weefselkweek door pipetteren en overbrengen naar een 15-mL of 50 mL conische buis. Centrifugeer bij 2.500 x g bij 4 ° C gedurende 10-15 minuten om te ontruimen het medium van cellen en cellulaire puin.
  4. Het gewiste cel medium overbrengen in een nieuwe conische buis en handhaven op het ijs. Werken in partijen, 5 mL van het gewiste medium overbrengen in 15 mL 3000 MW concentrators met geregenereerde cellulose membraan en Centrifugeer het bij 2.500 x g bij 4 ° C gedurende 30 minuten op een moment, om zich te concentreren op het medium.
    Opmerking: U kunt ook een concentrator met een grotere capaciteit van het volume zou gebruikte (50 mL). Tijdens de concentratie, zal een donkerder gekleurde medium, die is verrijkt met mist, beginnen te bouwen aan de onderkant van de V-vormige filter.
  5. Breng de pipet tip naar de onderkant van de "V" van de concentrator en verwijder de donkerder gekleurde media tussen elke ronde van centrifugeren en overbrengen naar een verse 1,7 mL microfuge buis. Het handhaven van de media op het ijs.
  6. Met behulp van de dezelfde concentrator, herhaal stap 3.4 en 3.5 doordat de donkerder gekleurde geconcentreerd mist-Myc media en vervangen door meer precleared medium, totdat het medium geconcentreerd op 1 is/10de van het oorspronkelijke volume (dat wil zeggen, 1 mL van 10 mL grondstof).
  7. Winkel de geconcentreerde mist-Myc bij 4 ° C.
    Opmerking: Na opslag, zorg ervoor dat controleren voor bacteriële besmetting, die uit langere opslag voortvloeien kan.
  8. SDS-pagina uit te voeren door het mengen van 10 µL van geconcentreerde mist-Myc medium met 10 µL van een denatureren SDS-bevattende buffer vormen een lysate. Draaien van de SDS-pagina gel op 35 mA voor ongeveer 1 h. overbrengen in de gel een membraan van het nitrocellulose (of als alternatief, een membraan PVDF) gedurende 1 uur op 120 mA. Het uitvoeren van een westelijke vlek met behulp van alle verkrijgbare Myc antilichaam een 150-kDa band.
    Opmerking: De concentratie van mist-Myc in de geconditioneerde medium kan per partij verschillen. Het is niet nodig om de exacte concentratie van mist-Myc om uit te voeren van de bepaling, maar de werkzaamheid van iedere partij moet worden getest voordat u een experiment uitvoert.
  9. Volgt 3.1-3.2, bereiden het besturingselement media S2-geconditioneerd door het verzamelen van 10 mL cel kweekmedium uit een bijna 100% confluente 75 cm2 kolf van S2 cellen (of, als alternatief, 20 mL van een kolf van 150 cm2 ) door pipetteren. Het besturingselement S2 cel kweekmedium overbrengen in een vers 15 mL of 50 mL conische buis.
  10. Volgt 3.4-3.7, schakelt u de lysate van cellen en cellulaire puin door middel van centrifugeren (bij 2.500 x g bij 4 ° C gedurende 30 min per keer) en dan de gewiste cel lysate overbrengen concentrators samen en centrifugeer hen om zich te concentreren het besturingselement medium in batches te 1/10e het oorspronkelijke volume.
    Opmerking: Toepassing van de S2-geconditioneerd media leidt niet tot substantiële cel contractility in de test.
  11. Bewaar de geconcentreerde S2 control media bij 4 ° C voor enkele maanden.
    Opmerking: Na opslag, zorg ervoor dat controleren voor de verontreiniging.

4. bereiding van Concanavalin-A-coated glassbottom gerechten en de beplating van S2R + cellen

  1. Door con A 5 mg oplossen in 10 mL water voor een eindconcentratie van 0,5 mg/mL 10 mL van de concanavalin een oplossing (con A) maken Aliquot deze oplossing in handiger volumes (500 µL tot 1 mL) en opslaan bij-20 ° C.
  2. 35-mm glassbottom gerechten bereiden door coating het glazen gedeelte van elk gerecht met 200 µL van de con A-oplossing en de gerechten gedurende ongeveer 2 minuten bij kamertemperatuur in een weefselkweek kap uit te broeden. Verwijder vervolgens alle de con A oplossing (die kan worden bewaard en hergebruikt voor toekomstige experimenten) en laat de gerechten volledig drogen.
    OPMERKINGEN: Gerechten in grote partijen kunnen worden voorbereid en kunnen worden opgeslagen voor maximaal 6 maanden op een droge plaats zoals een lab Bank lade.
  3. Ongeveer 2 mL verse cel voedingsbodems aan elk gerecht glassbottom toevoegen. Resuspendeer de cellen S2R + worden getest door de bepaling waarbij de cel kweekmedium omhoog en omlaag gebruiken om losjes daaraan vastzittende cellen los te maken.
  4. Overdracht van de geresuspendeerde S2R + cellen aan de 35-mm glassbottom gerechten met verse cel voedingsbodem zodat ze tussen 50-70% heuvels zijn. Controleer de celdichtheid onder de Microscoop weefselkweek door te focussen op en neer via verschillende vlakte van de cellen gesuspendeerd in het medium om een schatting van het aantal cellen.
    Opmerking: Via trial and error, de juiste dichtheid van cellen die nodig zijn om 50% - 70% confluentie kan worden bereikt.
  5. De cellen om te koppelen aan de con-A-coated glassbottom gerechten voor 45-60 min toestaan.
    Opmerking: Volledig bijgevoegde S2R + cellen verschijnen 'gebakken ei-lijkende,' afgeplatte en fase-donker.

5. werkzaamheid Test van het mist-geconditioneerd Medium, en de bepaling van de cellulaire Contractility

  1. Indien gewenst, bevestigen het rendement van mist-Myc geproduceerd en geconcentreerd uit de S2:Fog-Myc testing cellen lijnen door SDS-pagina en het westelijke bevlekken. Voeg toe 10 µL van SDS-bevattende monster buffer aan 10 µL van geconcentreerde mist-Myc en kook het voor 5 min. volgen de standaard SDS-pagina's en Westelijke Bevlekkende Protocollen en vlek voor anti-Myc te bevestigen mist-Myc productie.
  2. Verwijder alle schild en zong M3 medium uit de bijgevoegde S2R + cellen uit stap 4.3 door zachtjes pipetteren en voeg voorzichtig terug 75 µL van verse schild en Sang medium om de hoeveelheid mist-geconditioneerd medium gebruikt te beperken.
  3. Voeg 75 µL van mist-geconditioneerd media aan het glazen gedeelte van de schotel glassbottom uit stap 5.2 toe zodat het totale volume 150 µL, in een verhouding van 1:1 van mist-geconditioneerd media aan Shield en zong M3.
    Opmerking: Een totaal volume van 150-200 µL is nodig om het volledig te dekken het glazen gedeelte van een typisch glassbottom gerecht; Dit zal echter afhangen van de afmetingen van de glassbottom schotel gebruikt.
  4. De contractility van de cellen door fase contrast microscopie met behulp van 20 X of 40 X vergroting te observeren op een volledig veld van cellen controleren. Bijhouden van de morfologie van de cellen en zoekt het afwisselende patroon van fase donker en fase licht ruffling indicatief van de vormverandering.
    Opmerking: De toepassing van mist meestal leidt tot 30% - 50% van de cellen S2R + cellulaire vernauwing ondergaan, en na 10 min, de cellen beginnen te ontspannen, terug te keren naar hun smooth-edged, gebakken ei-lijkende morfologie.
  5. Controleren van de robuustheid van de cellulaire contractility. Als de cel-reactie zeer sterk met behulp van een 1:1 verhouding van mist-geconditioneerd medium naar verse schild en Sang medium is, verminderen de hoeveelheid mist-geconditioneerd middellange tot behoud van het geconcentreerde mist-Myc medium voor toekomstige experimenten. Gebruik van onverdunde mist-geconditioneerd medium als een 1:1 verhouding niet tot robuuste cellulaire vernauwing leidt; in het algemeen, een verhouding van 1:3 produceert genoeg antwoord met succes uit te voeren het experiment.
    Opmerking: Zodra de juiste verhouding van mist-geconditioneerd middellange tot verse schild en Sang medium is vastgesteld gezien batch van mist-geconditioneerd medium, gebruik deze verhouding voor alle andere experimenten.
  6. Toezicht op niet-spier myosin II dynamiek tijdens de cellulaire contractility bepaling met behulp van de stabiele S2R + cellijn die GFP-gelabeld regelgevende lichtketting (S2R +: Sqh-EGFP uitdrukt).
  7. Met behulp van de gevestigde verhouding van mist-geconditioneerd medium naar verse schild en zong M3 medium uit stappen 5.2-5.5, verwijderen van cel-gekweekte medium met een pipet en voeg terug verse schild en Sang medium in het glazen gedeelte van de schotel met glazen bodem. Perfuse mist-geconditioneerd medium bij de vooraf bepaalde verhouding tijdens het verwerven van een reeks afbeeldingen van de levende cellen; Zorg dat het niet bewegen van de schotel glassbottom tijdens de perfusie.

6. vaststelling en verkleuring van de vernauwde S2R + cellen

  1. Fix S2R + cellen met behulp van een 10%-oplossingligttussen paraformaldehyde in PEM buffer (100 mM pijpen, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, pH 6,9).
    Opmerking: PEM buffer wordt gewoonlijk tot stand gebracht op 2 x stockoplossing en kan worden opgeslagen voor maanden bij 4 ° C.
  2. Het kweekmedium cel uit mist-behandelde S2R + cellen verwijderen door pipetteren en onmiddellijk vervangen met 1,5-2,0 mL 10% paraformaldehyde oplossing. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Vaste cellen kunnen worden opgeslagen in fixatie oplossing bij 4 ° C voor meerdere dagen; het is echter belangrijk dat de eerste 15-min-fixatie bij kamertemperatuur gebeurt voordat u de cellen overdraagt tot 4 ° C.
  3. De 10% paraformaldehyde-oplossing verwijderen door pipetteren en gooi van deze organische afval product goed. Spoel de cellen door zachtjes pipetteren 1,5-2,0 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan de 35-mm glassbottom schotel. Verwijder de oude PBS door pipetteren en 1,5-2,0 mL verse PBS 2 x meer te verwijderen van de resterende fixatie oplossing te vervangen.
    Opmerking: Het is belangrijk dat de cellen niet vanaf dit punt op in het protocol uitdrogen doen.
  4. Het blokkeren van de cellen met ongeveer 200 µL van 5% normale geit serum verdund in PBS die is aangevuld met 0,1% niet-ionogene wasmiddel (PBST) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Blokkerende oplossingen bevatten doorgaans, serum dat overeenkomt met het organisme dat de secundaire antilichamen worden gefokt in.
  5. Bereid de primair antilichaam-oplossing door het verdunnen in PBST. Een volume van ongeveer 200 µL volledig voor het glazen gedeelte van de schotel glassbottom gebruiken.
    1. Verwijder de blokkerende oplossing door pipetteren en voeg de primair antilichaam oplossing direct aan het glazen gedeelte van de schotel. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of, als alternatief, na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
    2. Wanneer 's nachts bij 4 ° C aan het broeden, wikkel de 35-mm glassbottom schotel met parafilm ter voorkoming van verdamping.
  6. Verwijder het primaire antilichaam oplossing door pipetteren en spoel de cellen door pipetting 1,5-2,0 mL verse PBS op de 35-mm glassbottom dish. Verwijderen van PBS door pipetteren en 1,5-2,0 mL verse PBS 2 x meer te vervangen.
  7. Bereid een oplossing van secundair antilichaam door verdunnen het in PBST. Een volume van 200 µL is voldoende om alleen het glazen gedeelte van de schotel.
    1. De oplossing van secundair antilichaam rechtstreeks toevoegen aan het glazen gedeelte van de schotel. Incubeer de cellen met secundair antilichaam oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
    2. Wikkel de 35-mm schotel met parafilm als 's nachts, om te voorkomen dat verdamping aan het broeden.
  8. Verwijder de secundair antilichaam oplossing door pipetteren en spoel de cellen met PBS door pipetting 1,5-2,0 mL verse PBS op de schotel. Verwijder de oude PBS en vervang het 2 x meer, deze dezelfde procedure te volgen.
  9. De vaste en gekleurde cellen behouden door genoeg van een anti-fade fluorescerende montage medium ter dekking van het glazen gedeelte van de 35-mm glassbottom schotel toe te voegen.
  10. Opslaan van de monsters bij 4 ° C en weg van licht.
    Opmerking: Het fluorescent signaal zal langzaam verval maanden zelfs als goed opgeslagen. Voor de beste resultaten, afbeelding binnen een week.

7. imaging en kwantificering van de cellulaire Contractility Assay

  1. Vaste S2R + cellen met behulp van een standaard afbeelding ondersteboven licht microscope met phase contrast, DIC of fluorescentie imaging mogelijkheden. Met behulp van 20 X of 40 X vergroting, 10-30 overlappende afbeeldingsvelden van cellen afhankelijk van de celdichtheid, met als doel het verwerven van de beelden van 200 of meer cellen per voorwaarde vastleggen.
  2. Met behulp van een standaard cel counter, tellen en registreren het aantal gecontracteerde (fase-dark, neus cellen) en noncontracted cellen per elk veld gevangen.
    Opmerking: Het is het beste dat de twee onderzoekers onafhankelijk graven van gecontracteerde en noncontracted cellen per veld nemen, of als alternatief, de dezelfde onderzoeker kan rekenen het dezelfde afbeelding gebied van cellen driemaal, rekening houdend met een gemiddeld aantal opgelopen en noncontracted cellen per veld worden berekend.
  3. Bereiden van verschillende con-A-coated glassbottom gerechten per experimentele voorwaarde zoals beschreven in stap 4.2. Pipetteer op en neer het kweekmedium cel plaat hen zodat ze 50% - 70% heuvels in de 35-mm glassbottom gerechten te verjagen losjes aanhangend S2R +: Sqh-EGFP cellen. De cellen te voegen gedurende 30-45 minuten toestaan.
  4. Beeld de S2R +: Sqh-EGFP cellen live met behulp van een draaiende schijf, veegde-field confocal microscoop of er door licht vel microscopie 60 X - 100 X vergroting. Verwijder alle schild en zong M3 medium uit de glassbottom schotel met bijgevoegde S2R +: Sqh-EGFP cellen.
    1. Perfuse de vooraf bepaalde verhouding van mist-Myc geconditioneerde medium naar verse schild en zong M3 medium van stappen 5.2-5.5 direct op het glazen gedeelte van de glassbottom schotel met behulp van een precisiepipet, voorzichtig om niet te verstoren, de positie van de schotel op het doel. Verwerven beelden voor 12-15 min om te vangen de inleiding en de volledige samentrekking van de cellen S2R +: Sqh-EGFP.
      Opmerking: Als kleuring voor niet-spier myosin of myosin-pRLC, de vorming van een strakke myosin ring aan het oppervlak van de cellen is ook kenmerkend voor de contractility. Als het imaging S2R +: Sqh-EGFP cellen wonen, de RLC EGFP-gelabeld zal vormen soortgelijke strak (Zie Figuur 3) indicatie van contractility ringen. De vormverandering die optreedt zal leiden tot de cellen "motorkap", toegang tot de 3D-vorm; het vlak van de focus van de Microscoop wellicht worden aangepast om het bijhouden van de vormverandering van deze cel. Onder controle van RNAi voorwaarden, doorgaans 30-50% van de cellen ondergaan vernauwing op de toevoeging van mist. Wees ervan bewust dat sommige RNAi voorwaarden tot vernauwing in de afwezigheid van mist leiden kunnen.

Representative Results

S2 en S2:Fog-Myc cellen waren uitgegroeid tot in de buurt van confluente voorwaarden in een maatkolf van 150 cm2 weefselkweek en werden behandeld met 25-75 µM CuSO4 over een periode van 24-48 uur voor het opwekken van expressie van mist-Myc (Figuur 2). Monsters van een S2 cellen(Figuur 2)en S2:Fog-Myc cellen (Figuur 2B) werden verwijderd en mist-Myc productie werd gecontroleerd door westelijke vlek. Zoals verwacht, wij niet detecteren mist-Myc in media geoogst uit S2 cellen onder alle omstandigheden. Echter we mist heeft gedetecteerd in media geoogst van de S2:Fog-Myc stabiele cellijn zo spoedig 24 uur na de inductie met 75 µM CuSO4. S2R + cellen gekoppeld aan con-A-coated glassbottom gerechten uiting van een EGFP-gelabeld regelgevende lichtketting (GFP-RLC) van niet-spier myosin II (figuren 3A en 3B). Live-cel imaging werd uitgevoerd op een omgekeerde Microscoop voorzien van een 100 X / 1.4 objectief nb tijdens de perfusie van mist-geconditioneerd media. Ongeveer 5 minuten na de behandeling met mist-Myc, de RLC gevormd ringen indicatieve van niet-spier myosin II vernauwing. Deze ringen kunnen worden waargenomen door middel van immunokleuring S2R + cellen met een antilichaam aan de orde gesteld tegen een synthetische phosphopeptide overeenkomt met residuen omringende Ser19 van menselijke myosin RLC (cijfers 4A en 4B). Dit antilichaam cross-reacts met Drosophila RLC.

Hier hebben we een representatief voorbeeld van de bepaling van de cellulaire contractility na een 7-daagse behandeling van cellen met controle RNAi en dsRNA tegen Rho1 (cijfers 5A - 5E). S2R + cellen werden vergulde op con-A-coated glassbottom gerechten en behandeld met mist-geconditioneerd (+ mist) media of media control (-mist). Het aantal gecontracteerde cellen werden vervolgens gekwantificeerd na fixatie. De fase-dichte ruches indicatieve van vernauwing was prominent in de uitgeputte cellen behandeld met mist-geconditioneerd media (Figuur 5B). In Figuur 5Czijn Rho-verarmd cellen behandeld met S2-geconditioneerd medium een typisch voorbeeld van smooth-edged, gebakken ei-lijkende morfologie. Merk op dat Rho een rol in de signalering traject van mist en cytokinese speelt; Dus, Rho-verarmd cellen vaak niet goed verdelen, wat leidt tot een verhoging Celgrootte en ploïdie. Behandeling van besturingselement uitgeputte cellen met mist-geconditioneerd media typische leidt tot 30% - 50% van de cellen ondergaan vernauwing, overwegende dat wij niet in acht nemen van aanzienlijke vernauwing in Rho-uitgeputte cellen.

Figure 1
Figuur 1:de vermeende mist signalering pathway. Bij het ontbreken van mist, de Gα12/13 subeenheid, Concertina (Cta), samen met haar partners van de bindende Gϒ en Gβ, zijn niet actief en gekoppeld aan de co-receptoren, Mist en Smog. Ric-8 chaperones Cta en regelt haar subcellular localisatie. Bij mist bindend, Cta verbroken van Gϒ, en Gβ rekruten RhoGEF2 aan de celmembraan waar het de uitwisseling van het BBP voor GTP in de kleine GTPase Rho1 katalyseert. GTP-gebonden Rho1, nu actief, activeert Rho Kinase (Rok), die kinaseenzym de RLC van niet-spier myosin, wat leidt tot de activering en de daaropvolgende cellulaire contractility. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Time-loop van mist-Myc productie. Deze panelen Toon cel kweekmedium geoogst uit een in de omgeving van 100% confluente kolf (A) controle S2 cellen of (B) S2:Fog-Myc stabiele cellen. De cellen werden behandeld met 25-75 µM CuSO4 over een periode van 24-48 uur. Het kweekmedium cel werd verzameld en voorbereid voor SDS-pagina en het westelijke bevlekken. Mist-Myc werd ontdekt door een anti-Myc antilichaam. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Live-cel beeldvorming van mist-geïnduceerde vernauwing. Stabiele S2R + cellijnen uiting van EGFP-gelabeld RLC van niet-spier myosin II werden door veegde-veld confocale microscopie beeld tijdens de perfusie van mist-geconditioneerd media. Tijd wordt weergegeven in minuten en seconden. (A) dit deelvenster bevat een afbeelding van een brandvlak dicht bij de cel-dekglaasje aan interface op moment 0:00 voordat de perfusie van mist-Myc. (B) dit paneel een tijdreeks toont (0:30-10:00) voor de foto's genomen op een brandvlak in de buurt van de bovenkant van de cel. De witte pijlen geven de reorganisatie van de niet-spier myosin II zoals aangegeven door EGFP-RLC in contractiele ringen tijdens de vernauwing. De bar van de schaal is 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Phosphorylated-RLC lokaliseert contractiele ringen na inductie van vernauwing door mist-Myc. S2R + cellen waren vastgesteld en gekleurd voor actine met behulp van phalloidin (rood), gefosforyleerd RLC met behulp van een phosphoserine-19 antilichaam (groen) en DAPI (DNA, blauw), na behandeling met (A) controle of (B) mist-Myc-geconditioneerd media. Opmerking de reorganisatie van gefosforyleerd RLC in ringetjes op de toevoeging van mist-Myc. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Representatief kwantificering van de cellulaire contractility mist-geïnduceerde assay. S2R + cellen werden behandeld met (A en B) controle RNAi of (C en D) dsRNA tegen de kleine GTPase Rho1 voor 7 dagen. Na deze tijd, de cellen werden vergulde op con-A-coated glassbottom gerechten en werden behandeld met (A en C) controle media of (B en D) mist-Myc-geconditioneerd media. De schaal bar vertegenwoordigt 10 µm. (E) A scatterplot geeft aan dat de gemiddelde en 95%-betrouwbaarheidsintervallen van de Fractie van de gecontracteerde cellen per voorwaarde. Individuele punten vertegenwoordigen de Fractie van de gecontracteerde cellen per gezichtsveld bij 40 X vergroting (10-120 cellen per veld) en de getallen tussen haakjes geven dat het totale aantal cellen geteld voor zowel gecontracteerde als niet-gecontracteerde cellen over drie aparte RNAi experimenten. Sterretjes duiden een statistisch significant verschil tussen RNAi - en mist-testgroep voorwaarden zoals bepaald door de one-way ANOVA (p < 0.0001) met Tukey van meervoudige vergelijking post hoc analyse. Merk op dat er geen statistisch significant verschil (n.s.) was tussen Rho1 RNAi-behandelde degustaties neiging met control of met mist-Myc-geconditioneerd media. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor een cel-gebaseerde contractility assay met behulp van een Drosophila weefselkweek cellijn (S2R + cellen), die niet-spier myosin II vernauwing als reactie op de mist ondergaat signalering. Deze test is nuttig voor het onderzoeken van de mist weg, evenals de mechanismen die regelen niet-spier myosin II contractility.

Cel-kweken overwegingen:
De voorwaarden onder welke S2R + cellen worden onderhouden is cruciaal voor het bereiken van betrouwbare gegevens uit deze test. Bij de planning voor het uitvoeren van de bepaling van de contractility, het beste om S2R + cellen in Shield en zong M3 insect medium. Terwijl S2R + cellen in andere insecten cel-cultuur-media gedijen kunnen (bijvoorbeeldSF900 of Schneiders insect medium), zij vaak verliezen hun reactievermogen op mist. S2R + cellen met een hoge passage nummer, over het algemeen meer dan 20-25 passages, beginnen te verliezen van gevoeligheid aan RNAi. Het is best om vroeg-passage cellen gebruiken voor alle experimenten. Een ander belangrijk aspect RNAi uitputting experimenten is het kiezen van passende controles. Gemeenschappelijke negatieve controles omvatten dsRNA targeting EGFP of pBlueScript, noch van die homologie aan het vliegen genoom hebben. Gericht op eiwitten in de mist-traject (Rho, Rok, enz.), die als verarmd, te voorkomen dat de activering van niet-spier myosin contractility, zijn ook nuttig besturingselementen. S2:Fog-Myc cellen kunnen worden gehandhaafd in een kweekmedium alternatieve cel zoals SF900 aangevuld met 100 eenheden/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine, en 0,25 amfotericine B. opmerking dat FBS is niet verplicht bij het kweken van cellen in de SF900. Celdichtheid is ook een essentieel onderdeel voor alle aspecten van Drosophila weefselkweek cellen. In tegenstelling tot zoogdieren weefselkweek cellen, Drosophila-afgeleide weefselkweek cellen gedijen beste onder hogere dichtheden van de cel (dichtheden niet lager zijn dan 5 x 105 cellen/mL). Bij het uitvoeren van deze test, is het echter kritiek dat de cellen niet zijn verguld op con-A-coated glassbottom gerechten boven 80% samenvloeiing, zoals de kwantificering van de gecontracteerde versus niet-gecontracteerde cellen uiterst vervelend wordt.

Kritieke aspecten en alternatieve benaderingen van de cellulaire Contractility-test:
De productie van mist, de ligand die als trigger niet-spier myosin II contractility fungeert, is een essentieel onderdeel van deze test. Het mist gen codeert een eiwit van 730 aminozuren met een voorspelde molecuulgewicht van ~ 78 kDa26. Hydropathy analyse bleek een stuk van 12 hydrofobe residuen in mist de amino-terminus die als een reeks secretie signaal functioneren kon. Bovendien, bevat de codering reeks ook meerdere sites voor potentiële N - en O-gebonden glycosylatie, verder suggereren dat mist is een secreted eiwit26. Ter ondersteuning van dit, was de mist gelokaliseerd op secretoire blaasjes in vermoedelijke epidermale cellen ondergaan apicale vernauwing16. Mist-Myc expressie was geïnduceerd na toevoeging van kopersulfaat aan het medium en antilichamen tegen mist of Myc herkend een 150-kD eiwit uit kweekmedium geoogst uit geïnduceerde culturen maar niet van geïnduceerde media uit S2 cellen ontbreken de mist-Myc constructie. Deze moleculair gewicht was hoger dan de voorspelde 80-kD molecuulgewicht van mist en suggereert dat de secretoire machines van S2 cellen kan glycosylate het eiwit vóór exocytose. Vanwege de potentiële variabiliteit in mist zuivering is het raadzaam te gebruiken dezelfde batch van mist-geconditioneerd media voor alle experimenten. Maken van grote hoeveelheden van geconcentreerde mist-Myc media zal helpen bij het handhaven van de consistentie in de gehele rondes van experimenten.

Het succes van deze test is ook afhankelijk van vertrouwen die de cellen die vernauwing hebben ondergaan aangeeft. Terwijl vernauwde cellen kunnen worden waargenomen door fluorescentie microscopie, door kleuring voor actine of niet-spier myosin II, is de meest betrouwbare manier voor het identificeren en kwantificeren van vernauwde cellen door fase contrast of DIC microscopie. Nauwkeurige graven kunnen worden bereikt met behulp van 20 X - 40 X vergroting op de meeste standaard lichte microscopen. Hoewel het protocol geschreven hier glassbottom gerechten gebruikt, kan ook de bepaling worden uitgevoerd met behulp van standaard 1.5 glas coverslips bekleed met con-A. De toevoeging van mist kan worden gedaan in 35 mm voor weefselkweek op een dekglaasje aan geplaatst op parafilm, ter beperking van het bedrag van de mist gebruikt voor elke assay. De kwaliteit van fixatie is een essentieel onderdeel van de bepaling, zoals slecht vaste cellen tot valse positieven leiden kunnen. Met behulp van verse fixatie oplossing en ervoor zorgen dat zal de cellen nooit droog eenmaal vaste leiden tot meer betrouwbare resultaten. Tot slot is het belangrijk om te tellen van een groot aantal cellen. Meestal, slechts 30% - 50% van onbehandeld of besturingselement RNAi-behandelde cellen samentrekken na de perfusie van mist. Er is echter een basale niveau van vernauwing dat zich in S2R + cellen, voordoet zodat een groot aantal cellen is nodig om ervoor te zorgen dat elke wijziging in de Fractie van vernauwde cellen is te wijten aan behandelingen. Bovendien, de uitputting van bepaalde eiwitten die betrokken zijn bij de regulering van niet-spier myosin II contractility kan leiden tot hyper-contractility, zelfs in de afwezigheid van mist. De hier gepresenteerde gegevens is meer dan 3600 cellen die werden geteld in drie opeenvolgende RNAi behandelingen met de dezelfde batch van mist-geconditioneerd media.

Toepassingen van de cellulaire Contractility bepaling:
Deze contractility assay, wanneer in combinatie met RNAi screeningmethoden, biedt een krachtig systeem om te studeren cel signalering, genuitdrukking en cellulaire contractility. Eerder, is het gebruikt om te identificeren tot twee mist co receptoren21. Een gerichte scherm van 138 G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCRs) is uitgeput door RNAi in S2R + cellen, en zijn vermogen om te reageren op mist was bepaald zoals beschreven in het protocol hier gepresenteerd. Van de 138 GPCRs, een honkslag, werd eerder genfunctieonderzoek gen, nu bekend als Mist, ontdekt. Verder onderzoek naar de functie van Mist aangetoond dat niet alleen was het nodig voor mist-geïnduceerde cellulaire contractility in S2R + cellen, maar het was ook essentieel voor gastrulatie bij de ontwikkeling van Drosophila21. Bovendien, deze bepaling werd gebruikt om aan te tonen dat Ric-8, een niet-canonieke GEF, is ook een component in de mist signalering traject27. Een reeks Epistasie RNAi experimenten in combinatie met de bepaling van de contractility aangetoond dat Ric-8 met de Gα12/13 subeenheid Cta en functies omgaat te lokaliseren het binnen de cel, die essentieel zijn voor mist-geïnduceerde cellulaire contractility31 .

Drosophila weefselkweek is zeer geschikt voor beginners, zoals de cellen gemakkelijk te op kamertemperatuur onderhouden zijn, geen CO2 vereisen of gebufferd cel kweekmedium en robuust zijn, zolang juiste cel cultuur dichtheden worden gehandhaafd. De cellulaire contractility assay werd met succes uitgevoerd door het laboratorium deel van een undergraduate cel biologie cursus, waar de studenten had weinig tot geen ervaring met kweken cellen of microscopie. De bepaling van de cellulaire contractility hier gepresenteerd staat voor een krachtige, cel-gebaseerde hulpmiddel dat kan worden ingezet in de ontdekking van het gen, of om te ondervragen de mist signalering traject, ontwikkelings processen, zoals apicale vernauwing helpt ons om beter te begrijpen en niet-spier myosin II contractility, in het algemeen.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

De auteurs bedank leden van de Lab Rogers en de Applewhite lab, Greta Glover, en de studenten in het Reed College voorjaar 2018 cellulaire biologie cursus, die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van dit protocol. Bovendien, de auteurs bedank leden van the Ritz lab voor het zorgvuldig lezen en bewerken van dit manuscript. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door de National Science Foundation onder award nummer, 716964, D.A.A., A.R. en het Reed College biologie-afdeling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S2R+ cells Drosophila Genomics Resorce Center  150 cell culture line, exhibits contractility when treated with Fog
S2:Fog-myc cells Drosophila Genomics Resorce Center  218 cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter
S2R+ :Sqh-EGFP cells Drosophila Genomics Resorce Center  196 cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP
Shield and Sang M3 Sigma-Aldrich S3652 cell culture medium
SF900 insect medium Thermofisher Scientific 12658019 alternative cell cutlure medium
Schneider’s insect medium Thermofisher Scientific 21720024 alternative cell cutlure medium
Fetal Bovine Serum Thermofisher Scientific 16000044 media supplement
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermofisher Scientific 15240112 antimicrobial/antifugal media supplement
Concanavalin A MP Biomedicals 150710 used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion
Glass bottom plates Maktek P35G-1.5-10 used for assay and for fixing and staining cells
Glass cover slips Corning 2940-225 alternative to glass bottom dishes
Protein concentrators Millipore UFC903008 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks Genessee 25-204,25-206,25-208,25-210 used to culture cells
6-well and 12-well tissue culture dishes Genessee 25-105, 25-106 used to culture cells
Flourescent mounting medium Dako S3023 to preserve fixed cells
32% Paraformaldehyde EMS 15714-S used to fix cells
Pipes EMS 19240 used in PEM buffer for cell fixation
Anti-Myc Antibody Drosophila Hybirdoma Bank cat# 9E10 used to dectect Fog-Myc 
PhosphoSerine-19 antibody Cell Signaling 3671 antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19
488-Phalloidin, 568-Phalloidin Thermofisher Scientific A12379, A12380 to stain for f-actin
Hawk-VT multi-point array scanning confocal system  VisiTech International Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells
Eclipse TE300 Inverted microscope Nikon Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Model Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  2. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).
  3. Millburn, G. H., Crosby, M. A., Gramates, L. S., Tweedie, S., FlyBase, C. FlyBase portals to human disease research using Drosophila models. Disease Model Mechanisms. 9 (3), 245-252 (2016).
  4. Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Applications of high-throughput RNA interference screens to problems in cell and developmental biology. Genetics. 175 (1), 7-16 (2007).
  5. Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).
  6. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).
  7. Applewhite, D. A., Davis, C. A., Griffis, E. R., Quintero, O. A. Imaging of the Cytoskeleton Using Live and Fixed Drosophila Tissue Culture Cells. Methods Molecular Biology. 1365, 83-97 (2016).
  8. Rogers, S. L., Wiedemann, U., Stuurman, N., Vale, R. D. Molecular requirements for actin-based lamella formation in Drosophila S2 cells. The Journal of Cell Biology. 162 (6), 1079-1088 (2003).
  9. Yi, C. H., et al. A genome-wide RNAi screen reveals multiple regulators of caspase activation. The Journal of Cell Biology. 179 (4), 619-626 (2007).
  10. Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309 (5738), 1251-1253 (2005).
  11. Nir, O., Bakal, C., Perrimon, N., Berger, B. Inference of RhoGAP/GTPase regulation using single-cell morphological data from a combinatorial RNAi screen. Genome Research. 20 (3), 372-380 (2010).
  12. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), 98 (2013).
  13. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  14. Leptin, M. Gastrulation movements: the logic and the nuts and bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
  15. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  16. Dawes-Hoang, R. E., et al. folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  17. Rogers, S. L., Wiedemann, U., Häcker, U., Turck, C., Vale, R. D. Drosophila RhoGEF2 associates with microtubule plus ends in an EB1-dependent manner. Current Biology. 14 (20), 1827-1833 (2004).
  18. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical Sarcomere-like Actomyosin Contracts Nonmuscle Drosophila Epithelial Cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  19. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  20. Fox, D. T., Peifer, M. Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila. Development. 134 (3), 567-578 (2007).
  21. Manning, A. J., Rogers, S. L. The Fog signaling pathway: insights into signaling in morphogenesis. Developmental Biology. 394 (1), 6-14 (2014).
  22. Xie, S., Mason, F. M., Martin, A. C. Loss of Gα12/13 exacerbates apical area dependence of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3526-3536 (2016).
  23. Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. Dynamic myosin phosphorylation regulates contractile pulses and tissue integrity during epithelial morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 206 (3), 435-450 (2014).
  24. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  25. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  26. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  27. Peters, K. A., Rogers, S. L. Drosophila Ric-8 interacts with the Gα12/13 subunit, Concertina, during activation of the Folded gastrulation pathway. Molecular Biology of the Cell. 24 (21), 3460-3471 (2013).
  28. Jha, A., van Zanten, T. S., Philippe, J. M., Mayor, S., Lecuit, T. Quantitative Control of GPCR Organization and Signaling by Endocytosis in Epithelial Morphogenesis. Current Biology. 28 (10), 1570-1584 (2018).
  29. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  30. Myat, M. M., Andrew, D. J. Organ shape in the Drosophila salivary gland is controlled by regulated, sequential internalization of the primordia. Development. 127 (4), 679-691 (2000).
  31. Kanesaki, T., Hirose, S., Grosshans, J., Fuse, N. Heterotrimeric G protein signaling governs the cortical stability during apical constriction in Drosophila gastrulation. Mechanisms of Development. 130 (2-3), 132-142 (2013).
  32. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  33. Yanagawa, S., Lee, J. S., Ishimoto, A. Identification and characterization of a novel line of Drosophila Schneider S2 cells that respond to wingless signaling. Journal Biological Chemistry. 273 (48), 32353-32359 (1998).
  34. Mason, F. M., Xie, S., Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. RhoA GTPase inhibition organizes contraction during epithelial morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (5), 603-617 (2016).
  35. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).

Tags

Ontwikkelingsbiologie kwestie 138 apicale vernauwing mist signalering cellulaire contractility niet-spier myosin II actine signalering
Een cel-gebaseerde Assay te onderzoeken niet-spier Myosin II Contractility <em>via</em> de gevouwen-gastrulatie signalering traject in <em>Drosophila</em> S2R + cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peters, K. A., Detmar, E.,… More

Peters, K. A., Detmar, E., Sepulveda, L., Del Valle, C., Valsquier, R., Ritz, A., Rogers, S. L., Applewhite, D. A. A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells. J. Vis. Exp. (138), e58325, doi:10.3791/58325 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter