Her beskriver vi en kontraktilitet analyse ved hjælp af Drosophila S2R + celler. Anvendelsen af en udefrakommende ligand, foldede gastrulation (tåge), fører til aktivering af tågen signalering pathway og cellulære kontraktilitet. Denne analyse kan bruges til at undersøge regulering af cellulære kontraktilitet proteiner i tågen signalering pathway.
Vi har udviklet en celle-baserede analyse ved hjælp af Drosophila celler der sammenfatter apikale konstriktion initieret af foldet gastrulation (tåge), en udskilles epitelial morphogen. I denne analyse bruges tåge som en agonist til aktivere Rho gennem en signal kaskade, der omfatter en G-protein-koblet receptor (tåge), en Gα12/13 protein (harmonika/Cta) og en PDZ-domæne-holdige guanin nukleotid udveksling faktor (RhoGEF2). Tåge signalering resultater i den hurtige og dramatiske reorganisering af actin cytoskelettet til at danne en kontraktile pung streng. Opløselige tåge er indsamlet fra en stabil cellelinie og anvendes ectopically til S2R + celler, førende til morfologiske ændringer som apikale konstriktion, en proces observeret under udviklingsmæssige processer som gastrulation. Denne analyse er indstillet til høj overførselshastighed screening og ved hjælp af RNAi, kan lette identifikation af yderligere gener involveret i denne vej.
Undersøgelser af embryogenese udført med genetiske modelorganismer har vist sig uvurderlig for vores forståelse af, hvordan celler er samlet ind i væv. Undersøgelser af Drosophila melanogaster, især har ført til identifikation af centrale gener og biologiske principper, der direkte morfogenese og udvikling af organismer fra befrugtning til voksenalderen1,2 , 3. parallelt med den genetiske forskning udført med Drosophilakulturperler cellelinjer afledt af bananfluen væv er også dukket op som et kraftfuldt system til at løse en bred vifte af molekylære og celle biologiske spørgsmål4, 5 , 6. drosophila vævskultur celler har minimal behov for vedligeholdelse, da de er kulturperler ved stuetemperatur og uden CO2. Som sådan, de er indstillet til høj opløsning billeder, og de har en høj grad af følsomhed over for gen hæmning af RNAi6,7. Mange grupper har brugt Drosophila vævskultur celler som et redskab til at opdage gener involveret i celle form, cytoskeletal dynamics, levedygtighed, fagocytose og signaltransduktion veje4,8, 9,10,11. Når de anvendes som model ved siden af hele dyret, tilbyder kulturperler Drosophila cellelinjer en række meget komplementære metoder, at fremskynde identifikationen af molekyler vigtige for udviklingen og skabe en ramme til at bestemme deres mekanistiske roller12. Her, beskriver vi en celle-baseret analyse for at studere de signaling veje, der udløser apikale konstriktion via foldet gastrulation (tåge) vej13,14. Denne celle-baserede kontraktilitet assay gør det muligt for forskere at undersøge begge tågen signalering pathway og de molekylære mekanismer, der regulerer ikke-muskel myosin II kontraktilitet.
Gastrulation af de tidlige Drosophila embryo er blevet studeret i mange år som en genetiske model for den epitelial morfogenese og cellulære overgangen fra epitelial mesenchymale celler identitet. En af de vigtigste begivenheder i gastrulation er morfogenese af en delmængde af epitelceller langs den embryonale ventrale midterlinjen fra kolonneformat til pyramide i figur15,16,17,18. Denne enkle celle figur ændre resultater i en internalisering af de formodede mesodermale celler og er drevet af den motorisk aktivitet af ikke-muskel myosin II snærende actin netværk16,19,20. Årtier af genetisk forskning har identificeret de molekylære komponenter af denne vej og sekventielt har placeret dem i følgende rækkefølge: 1) tåge udskilles fra det apikale domæne af epitelceller på den ventrale midterlinjen; 2) tåge binder til G-protein-koblet Co receptorer, tåge og Smog, og signaler gennem et heterotrimeric G-protein kompleks, der indeholder Gα12/13 subunit harmonika (Cta), som er chaperoned af ikke-kanoniske GEF Ric-8; 3) Cta aktiveres en guanin nukleotid udveksling faktor, RhoGEF2, som igen aktiverer de små G-protein Rho1; 4) Rho1 aktiveres Rho kinase (Rok); 5) Rok aktiveres ikke-muskel myosin II kontraktilitet på den apikale domæne gennem fosforylering af den lovgivningsmæssige lys kæde (RLC), herigennem producerer apikale konstriktion (figur 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Mutationer i flere af disse komponenter forstyrre den normale gastrulation og andre morfogenetiske bevægelser, herunder dannelsen af wing disc og spytkirtler, der angiver, at denne sti bruges på flere stadier af Drosophila embryogenese30,31,32. Tåge pathway er en af de bedst undersøgte modeller for epitelial forme og har givet vigtige indsigt i hvordan væv-niveau morfogenese reguleres fra gen transskription til cytoskeleton-drevet celle bevægelser14,15 ,21.
Vi udviklede en celle-baserede kontraktilitet assay, der sammenfatter mange af de cellulære svar nedstrøms af tåge, der konstateres i udvikle flyve embryoner17. Vi konstruerede en stabil S2 cellelinie, der udtrykker tåge markeret på sine C-terminus med myc under kontrol af en inducerbar metallothionine promotor, der kan høstes efter tilsætning af kobber sulfat (CuSO4) til medium. Når tågen-aircondition medier anvendes ectopically til S2 receptorer + (S2R +) celler, som er en underlinje S2 celler udmærker sig ved deres differentiel ekspression af receptorer som Frizzled og integrin underenheder, cellerne undergår en omorganisering af de cytoskelettet meget minder om apikale konstriktion12,17,27,33. Disse ændringer kan observeres ved fasekonstrastmikroskopi i hvilke Fog behandling fører til udseendet af fase-mørke flæser vejledende af en radial stigning i ikke-muskel myosin II kontraktilitet eller ved Fluorescens mikroskopi hvor tågen behandling fører til den dannelsen af ikke-muskel myosin II ringe i celler, der udtrykker EGFP-tagged RLC34. Disse ringe indeholder en myosin-fosforyleret regulerende lys kæde (pRLC) ses via immunfarvning23,34,35. Denne tåge-induceret svar kræves Cta, RhoGEF2, Rho og Rok; således, ved hjælp af rekombinant tåge-Myc og S2R + celler, har vi etableret et middel til at undersøge tåge-induceret konstriktion i et væv-kultur-baseret system24,25,34.
Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for en celle-baserede kontraktilitet analyse ved hjælp af en Drosophila vævskultur cellelinje (S2R + celler), som gennemgår ikke-muskel myosin II konstriktion som en reaktion på tåge signalering. Denne analyse er nyttige for efterforskningen tåge pathway, samt mekanismer, der regulerer ikke-muskel myosin II kontraktilitet.
Dyrkning af celle overvejelser:
De betingelser, under hvilke S2R + celler bevares er afgørende for at opnå pålidelige oplysninger fra denne analyse. Når du planlægger at udføre kontraktilitet assay, det bedst at opretholde S2R + celler i skjold og Sang M3 insekt medium. Mens S2R + celler kan trives i andre insekt celle kultur medier (f.eks.SF900 eller Schneiders insekt medium), de ofte mister deres lydhørhed at tåge. S2R + celler, der har en høj passage nummer, generelt mere end 20-25 passager, begynder at miste følsomhed til RNAi. Det er bedst at bruge tidlige-passage celler for alle eksperimenter. Et andet vigtigt aspekt at RNAi udtynding eksperimenter er at vælge passende kontrol. Fælles negativ kontrol omfatter dsRNA rettet mod EGFP eller pBlueScript, heller ikke af som har homologi at flyve genomet. Målretning proteiner i tåge pathway (Rho, Rok, etc.), som, når opbrugt, forhindrer aktivering af ikke-muskel myosin kontraktilitet, er også nyttige kontrol. S2:Fog-Myc celler kan opretholdes i en alternativ cellekulturmedium såsom SF900 suppleret med 100 enheder/mL af penicillin, 100 µg/mL streptomycin, og 0,25 amphotericin B. Bemærk at FBS er ikke påkrævet, når dyrkning af celler i SF900. Celle tæthed er også en vigtig komponent til alle aspekter af Drosophila vævskultur celler. I modsætning til pattedyr vævskultur celler, Drosophila-afledte vævskultur celler trives bedst under højere celle tætheder (tætheder ikke er lavere end 5 x 105 celler/mL). Når du udfører denne analyse, dog det afgørende, at cellerne ikke er belagt på con-A-belagt glas-bund retter over 80% sammenløb, som kvantificering af kontraherede versus ikke-kontraherede celler vil blive yderst kedelig.
Kritiske aspekter og Alternative tilgange til cellulære kontraktilitet Assay:
Produktionen af tåge, ligand, der udløser ikke-muskel myosin II kontraktilitet, er et nøgleelement i denne analyse. Tåge -genet koder et protein af 730 aminosyrer med en forventet molekylvægt af ~ 78 kDa26. Hydropatianalyse analyse afslørede en strækning af 12 hydrofobe rester på Fogs amino-terminus, som kunne fungere som en sekretion signal sekvensen. Derudover indeholder de kodende sekvens også flere steder for potentielle N – og O-linked glykosylering, yderligere tyder på tåge er en udskilles protein26. Til støtte for dette, var tåge lokaliseret til sekretoriske vesikler i formodede epidermale celler under apikale konstriktion16. Tåge-Myc udtryk er fremkaldt ved tilsætning af kobber sulfat til mediet, og antistoffer mod tåge eller Myc anerkendt en 150-kD protein fra næringssubstratet høstet fra induceret kulturer, men ikke fra induceret medier fra S2 celler mangler tåge-Myc konstruktion. Denne molekylvægt var højere end den forudsagte 80-kD molekylvægt af tåge og tyder på, at den sekretoriske celler, S2 kan glycosylate protein før exocytose. På grund af den potentielle variabilitet i tåge rensning er det tilrådeligt at bruge det samme parti af tåge-aircondition medier for alle eksperimenter. At gøre op store partier af koncentreret tåge-Myc media vil hjælpe med at opretholde sammenhæng i hele runder af eksperimenter.
Denne analyse succes afhænger også trygt at identificere celler, der har undergået konstriktion. Mens sammensnøret celler kan observeres ved Fluorescens mikroskopi, ved farvning for actin eller ikke-muskel myosin II, er den mest pålidelige måde at identificere og kvantificere sammensnøret celler gennem fasekontrast eller DIC mikroskopi. Nøjagtig tæller kan opnås ved hjælp af 20 X – 40 X forstørrelse på de fleste standard lys mikroskoper. Selv om den protokol, der er skrevet her bruger glas-bund retter, kan analysen også udføres ved hjælp af standard 1,5 glas coverslips belagt med con A. Tilsætning af tåge kan gøres i 35 mm af vævskultur på en coverslip placeret på parafilm, for at begrænse mængden af tåge bruges for hvert assay. Kvaliteten af fiksering er et afgørende element i analysen, som dårligt fast celler kan føre til falske positiver. Ved hjælp af friske fiksering løsning og sørge for vil cellerne aldrig tør engang fast føre til mere pålidelige resultater. Endelig er det vigtigt at tælle et stort antal celler. Typisk, kun 30% – 50% af ubehandlet eller kontrol RNAi-behandlede celler snøre efter perfusion af tåge. Der er imidlertid en basal grad af forsnævring, der opstår i S2R + celler, så et stort antal celler er nødvendige for at sikre, at enhver ændring i brøkdel af sammensnøret celler skyldes behandlinger. Desuden kan nedbrydning af nogle proteiner involveret i reguleringen af ikke-muskel myosin II kontraktilitet føre til hyper-kontraktilitet, selv i mangel af tåge. De data præsenteres her er fra over 3.600 celler, der blev talt i tre successive RNAi behandlinger ved hjælp af det samme parti af tåge-aircondition medier.
Anvendelser af cellulære kontraktilitet Assay:
Denne kontraktilitet assay, når kombineret med RNAi screening-metoder, tilbyder et kraftfuldt system for at studere celle signalering, morfogenese og cellulære kontraktilitet. Det har tidligere været brugt til at identificere en af to tåge Co receptorer21. En målrettet skærm af 138 G-protein-koblede receptorer (GPCRs) er forarmet af RNAi i S2R + celler, og dens evne til at reagere på tåge var analyseres som beskrevet i den protokol, der præsenteres her. Af de 138 GPCRs, en enkelt, blev tidligere uncharacterized gen, nu kendt som tåge, afsløret. Yderligere undersøgelse funktionen af tåge demonstreret at ikke blot var det nødvendigt for tåge-induceret cellulære kontraktilitet i S2R + celler, men det var også vigtigt for gastrulation i at udvikle Drosophila21. Desuden, denne analyse blev brugt til at vise, at Ric-8, en ikke-kanoniske GEF, er også en komponent i tågen signalering vej27. En række epistasis RNAi eksperimenter kombineret med kontraktilitet Analysen viste, at Ric-8 interagerer med Gα12/13 subunit Cta og funktioner til at lokalisere det inden for den celle, som er kritiske for tåge-induceret cellulære kontraktilitet31 .
Drosophila vævskultur er velegnet til nybegyndere, som cellerne er let vedligeholdes ved stuetemperatur, kræver ikke CO2 eller buffered cellekulturmedium og er robust, så længe korrekt celle kultur tætheder vedligeholdes. Cellulære kontraktilitet analysen blev med held udført af laboratoriet del af en bachelor celle biologi kursus, hvor studerende havde lidt eller ingen erfaring med dyrkningsbaserede celler eller mikroskopi. Den cellulære kontraktilitet assay præsenteres her repræsenterer et stærkt, celle-baseret værktøj, der kan være ansat i gen discovery, eller for at afhøre tågen signalering pathway, hjælper os til bedre forstå udviklingsmæssige processer, såsom apikale konstriktion og ikke-muskel myosin II kontraktilitet, i almindelighed.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af Rogers Lab og Applewhite lab, Greta Glover, og de studerende i Reed colleges foråret 2018 cellebiologi kursus, der har bidraget til udviklingen af denne protokol. Desuden vil forfatterne gerne takke medlemmerne af Ritz lab for omhyggeligt læse og redigere dette håndskrift. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Science Foundation award nummer 716964 D.A.A. og A.R. og Reed College biologi afdeling.
S2R+ cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 150 | cell culture line, undergoes apical constriciton |
S2:Fog-myc cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 218 | cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter |
S2R+ :Sqh-EGFP cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 196 | cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP |
Shield and Sang M3 | Sigma-Aldrich | S3652 | cell culture medium |
SF900 insect medium | Thermofisher Scientific | 12658019 | alternative cell cutlure medium |
Schneider’s insect medium | Thermofisher Scientific | 21720024 | alternative cell cutlure medium |
Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 16000044 | media supplement |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermofisher Scientific | 15240112 | antimicrobial/antifugal media supplement |
Concanavalin A | MP Biomedicals | 150710 | used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion |
Glass bottom plates | Maktek | P35G-1.5-10 | used for assay and for fixing and staining cells |
Glass cover slips | Corning | 2940-225 | alternative to glass bottom dishes |
Protein concentrators | Millipore | UFC903008 | 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media |
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks | Genessee | 25-204,25-206,25-208,25-210 | used to culture cells |
6-well and 12-well tissue culture dishes | Genessee | 25-105, 25-106 | used to culture cells |
Flourescent mounting medium | Dako | S3023 | to preserve fixed cells |
32% Paraformaldehyde | EMS | 15714-S | used to fix cells |
Pipes | EMS | 19240 | used in PEM buffer for cell fixation |
Anti-Myc Antibody | Drosophila Hybirdoma Bank | cat# 9E10 | used to dectect Fog-Myc |
PhosphoSerine-19 antibody | Cell Signaling | 3671 | antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19 |
488-Phalloidin, 568-Phalloidin | Thermofisher Scientific | A12379, A12380 | to stain for f-actin |
Hawk-VT multi-point array scanning confocal system | VisiTech International | Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells | |
Eclipse TE300 Inverted microscope | Nikon | Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells |