Summary
수정 된 난 자 마우스와 초기 단계 배아 zona pellucida, 유전자 배달에 대 한 장벽을 형성 하는 당단백질 매트릭스에 의해 보호 됩니다. 이 문서는 zona transduce lentiviral 벡터와 배아 세포와 유전자 변형 쥐를 만들고 레이저로 꿰뚫기 위한 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
Lentiviruses는 포유류 세포에 유전자 배달에 대 한 효율적인 벡터. 변환, 다음 lentiviral 게놈은 안정적으로 호스트 염색체에 통합 하 고 자손 전달 됩니다. 따라서, 그들은 안정 된 세포의 생성, 지표, vivo에서 배달 및 유전자 변형 동물을 만드는 단일 셀 수정 된 달걀의 변환에 대 한 이상적인 벡터. 그러나, 마우스 수정 된 계란 및 초기 단계 배아 zona pellucida, lentiviral 유전자 배달에 대 한 장벽을 형성 하는 당단백질 매트릭스에 의해 보호 됩니다. Lentiviruses 너무 커서는 zona 침투 하 고 perivitelline 구멍, 배아 세포는 구역 사이의 공간에 바이러스 성 입자의 microinjection에 의해 일반적으로 전달 됩니다. 고도로 숙련 된 기술자와 전문된 장비에 대 한 요구 사항을 마우스 배아에 유전자 배달 lentiviruses 사용 하 여를 최소화 했다. 이 문서는 레이저로는 zona 꿰뚫기에 의해 수정 된 마우스 달걀 permeabilizing 위한 프로토콜을 설명 합니다. 레이저 구멍 뚫 기 손해 태아를 초래 하지 않습니다 하 고 배아 세포에 유전자 배달에 대 한 액세스는 lentiviruses를 허용 한다. 불리고 배아 blastocyst 생체 외에서 로 발전 하 고 pseudopregnant 마우스에 이식 하는 경우 유전자 변형 새끼로 발전 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용 되는 레이저는 효과적이 고 사용 하기 쉬운. 유전자는 lentiviruses 안정적으로 전달 마우스 배아 세포로 통합 하 고 생식 전송 됩니다. 필요 없는 micromanipulation 유전자 변형 생쥐의 생성 및 수정 된 난 자의 microinjection에 대 한 대체 방법입니다.
Introduction
이 메서드는 lentiviruses에 의해 배아 세포 유전자 배달을 위한 액세스할 수 있도록 마우스 수정 된 달걀의 zona pellucida permeabilizing에 대 한 자세한 지침을 제공 합니다. Lentiviruses는 포유류 세포에 효율적인 유전자 전달에 대 한 자연에 의해 설계 되었습니다. 그들은 나누어 및 비 분열 세포를 감염 하 고 그들의 호스트 염색체1에 lentiviral 게놈을 통합. Lentiviral 호스트 셀 범위는 쉽게 확장 pseudotyping VSV G 단백질2의 광범위 한 차 있는 굴곡 운동으로 인해 vesicular 구내 염 바이러스 당단백질 (VSV-G)와 재조합 lentivirus. 변환, 다음 lentiviral 유전자는 안정적으로 통합 하 고 그들의 호스트 염색체 유전자 변형 동물을 생성 하기 위한 이상적인 도구를 만들기의 일환으로 표현. 초기 단계 배아 세포에 전달 하는 경우 lentiviral 게놈 복제 이며 전체 유기 체에 표현. Lentiviral 변환 쥐, 쥐, 닭, 메 추 라 기의 생산을 주도하 고 있다 고3,,45,,67 제 닉의 다른 종 중 돼지. 그러나 Lentiviral 유전자 전달의 일반적인 방법, 숙련 된 기술자 및 특수 장비 초기 단계 배아를 캡슐화 하는 zona pellucida 장벽을 극복 하기 위해 필요 합니다. 이 방법의 전반적인 목표 permeabilize lentiviral 유전자 납품을 촉진 하기 위하여 레이저를 사용 하 여 구역 하는 방법을 설명 하는 것입니다.
포유류 계란 zona pellucida는 polyspermy에 대 한 수정 된 알을 보호 하 고 환경 상호 작용8,9제한 수정에 따라 견고 하 게 둘러싸여 있습니다. 구역까지 태아는 blastocyst로 부 화는 lentiviruses 배아 세포에서 유지 하는 방 벽을 형성 한다. 교양된 마우스 4 일 후 계란 해치를 수정 하 고 pseudopregnant 쥐 새끼로 정상적인 개발을 위한 부 화 이전에 이식 해야 합니다. 따라서, 변환, lentiviruses perivitelline 구멍, 배아 세포는 구역 사이의 공간에는 구역에서 부 화 하기 전에 microinjected는.
Zona pellucida 종종 수정 속도10증가 인간의 계란의 체 외에서 수정에 대 한 제거 됩니다. 그러나, 마우스 zona pellucida의 화학 제거 부정적인 마우스 배아 개발에 영향을 하 고는 배아 세포11,12. 마우스 수정 된 달걀에 유전자 배달에 대 한 다른 방법 DNA의 세포 핵13에 직접 microinjection에 의해 zona pellucida 방 벽 극복. Pronuclear microinjection는 태아를 유전자를 전달 하는 효율적인 방법 이다. 그러나, 각 배아는 개별적으로 microinjection에 대 한 장소에서 개최 됩니다, 이후 연습 힘들고 초보자 사용자에 대 한 시간이 걸릴 수 있습니다.
Electroporation 및 photoporation 등 다른 방법을 과도에 유용 하며 마우스를 단기 유전자 전달 수정 된 달걀14,,1516. 이러한 방법은 광범위 하 게 recombinases CRISPR-Cas9 구성 요소를 제공 하는 데 사용 됩니다. 그러나, electroporation 그리고 photoporation 유전자의 배달 제 닉 생성을 효율적으로 사용할 수 없습니다. 구멍이 마우스 epididymis에서 수집 된 정 충 수 또한 lentiviruses에 의해 불리고 하 고 체 외에서 수정에 대 한 유전자 변형 동물17,,1819, 를 생산 하는 데 사용 20.
이 프로토콜에서 마우스 배아를 lentiviral 유전자 배달 permeabilizing 레이저를 사용 하 여 구역에 의해 촉진 된다. XYClone 레이저는 체 외에서 수정21 와22배아 줄기 세포 경작에 대 한 지원으로 개발 되었다. 그것은 설치 프로그램을 간단 하 고 사용 하기 쉬운 작은 기구 이다. 현미경에 설치, 그것은 대물 렌즈의 공간을 차지 하 고 동반 소프트웨어는 현미경 접 안 렌즈를 통해 찾고 있는 동안 레이저를 목표에 대 한 허용 ( 프로토콜참조: 3 절). zona XYClone 레이저 천공은, 일단 lentiviruses 유전자 배달23문화 미디어에 소개 될 수 있습니다. 여러 lentiviruses 염색체 설립에 대 한 여러 유전자를 동시에 제공 하 사용 될 수 있습니다.
이 프로토콜을 분리 하는 방법을 설명 합니다 및 문화 마우스 수정 된 계란, zona pellucida의 천공에 대 한 레이저의 사용을 보여 줍니다 lentiviruses로 마우스 배아 세포의 변환 방법을 보여 줍니다.
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Protocol
모든 동물 절차와이 프로토콜에 사용 되는 치료 NIH/NIEHS 동물 보호 지침을 준수 했다 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) NIH/NIEHS, 동물 프로토콜 2010-0004에 의해 승인 했다.
1입니다. 준비
- 관심사의 유전자를 운반 하는 재조합 형 비 전파 lentiviruses 준비/구매 이 연구에서 lentivirus SBI511 copepod 녹색 형광 단백질을 표현 (copGFP; GFP에 약식)는 신장에서 요소 1a 발기인 변환을 위해 사용 되었다. 2 생산 하는 데 사용 했다 표준 프로토콜 그리고 titer lentiviruses titers 1e8 시험 단위 (TU/mL) 당 보다 높은에서.
참고: 주의 사용 하 고 모든 자료는 lentiviruses 접촉 되어 표 백제. 안전 사용 및 lentiviruses의 취급에 대 한 연구소의 지침을 참조 하십시오. - 배아를 수확 하기 전에 하루 원하는 마우스 스트레인의 번 식 쌍 설치. 이 실험에서 쥐의 C57BL/6J 변형 사용 되었다. 여성 쥐 난소와 수 란 관 컬렉션 사용 superovulation에 대 한 어떤 호르몬으로 치료 하지 했다.
- 마우스 수정 된 달걀, 수확 전에 2-24 h 다음과 같이 몇 가지 칼륨 단면 최적화 된 매체24 (KSOM) 드롭 접시 준비: KSOM 매체의 50 μ 드롭의 2 mL와 함께 35 m m 조직 문화 취급 요리와 커버의 중간에 추가 Dimethylpolysiloxane (DMPS5X)과 equilibrate 37 oC, 5% CO2, 5% O2 와 90% N2 에서 장소.
주: 일회용 살 균 접시를 사용 하 고 lentiviruses에 노출 다음 삭제. - 재고 솔루션에서 M2 매체에 hyaluronidase의 1 x 솔루션을 준비 (100 x, 30 mg/mL,-20 ° C에 저장). 재고 솔루션 x 100는 물에서 준비 되었다.
- 24 시간 레이저를 이용한 변환 마우스 수정 된 달걀, pseudopregnant 여성 마우스를 준비 vasectomized 남성 및 여성 쥐 사이 쌍 사육 설정의 게시.
2. 절연 마우스의 수정 된 계란
- 16-24 h 게시물 짝짓기, 질 플러그 성공적인 짝짓기의 지표와 여성 쥐를 선택 하 고 고통 없이 안락사25. 이 연구에 사용 된 쥐 깊은 CO2 또는 isoflurane 흡입에서 자 궁 경부 전위에 의해 안락사 되었다.
- 난소와 표준 프로토콜25에 따르면 oviducts 격리.
- 난소와 oviducts M2 미디어를 포함 하는 35 mm 접시에 전송.
- 각 난소에 대 한 적 운 세포에 의해 포위 하는 수정 된 달걀을 풀어 ampulla 떨어져 눈물.
- 수정 된 난 자 전송 및 적 운 세포는 35 mm 접시 1 x hyaluronidase M2 매체에서를 포함 하 고 3-5 분 동안 실 온에서 품 어.
- 피펫으로 계란 적 운 세포를 아래로 수정 된.
- 수정 된 난 자 M2 미디어 및 아래로 씻어 hyaluronidase을 피펫으로 35 mm 접시에 전송.
- 수정 된 난 자 포함 된 KSOM 피펫으로 아래로 나머지 M2 미디어와 hyaluronidase 씻어 35 mm 접시에 전송 합니다.
- 1.3 단계에서 수정 된 난 자 준비 KSOM 드롭 격판덮개 전송.
참고: 마우스 수정 된 달걀 KSOM에 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 와 equilibrate를 90% N2 에서 조직 문화 인큐베이터에서 유지 되어야 한다. 15 분 이상 인큐베이터에서 번호판을 제거 배아에 손상 될 것 이다. - 다음 단계로 이동 하기 전에 인큐베이터에 2 h에 대 한 복구를 수정 된 알 수 있습니다.
3. 마우스의 천공 수정 XYClone 레이저와 계란
- 설치 하 고 XYClone 레이저 제조 업체의 권장 사항에 따라 보정. 수정 된 난 자에 구멍을 XYClone 레이저에 대 한 일반적으로 체 외에서 수정, 사용, 다른 레이저를 교체하실 수 있습니다.
- 현미경에 레이저 장치를 레이저 컨트롤러 상자 와이어를 연결 합니다.
- USB 포트를 통해 레이저 소프트웨어를 실행 하는 컴퓨터를 레이저 컨트롤러 상자를 연결 합니다. 3.1.3. 레이저 컨트롤러에 연결 하 고 켭니다.
- 테스트 샘플 (예: 유리 슬라이드에 드라이 지우기 표시)을 꿰뚫기 접 안 렌즈를 통해 찾습니다.
- (레이저 키트에 포함 된) 작은 스크루 드라이버를 사용 하 여 X 조정 및 LED에 맞게 레이저의 Y 위치 현미경 접 안 렌즈를 통해 보이는 빛 레이저 교정.
- 현미경 단계에 마우스 수정 된 달걀을 포함 KSOM 드롭 접시를 놓습니다. 15 분 이상 인큐베이터 외부 플레이트를 보관 하지 마십시오.
- 현미경 접 안 렌즈를 통해 모양과 태아의 zona pellucida 초점 고 레이저 발광 표시 됩니다.
- LED 빛/레이저 zona 대상 현미경 단계를 이동 합니다.
- 컴퓨터 소프트웨어를 사용 하 여 XYClone 레이저 250 µs 설정 합니다.
- LED 빛 크기 (이 실험에서 설정 5) 원하는 크기를 조정 합니다.
- 레이저로 몇 번이 고 각 수정 된 달걀의 zona 구멍. zona은 수 중 관통 하거나 thinned 수 있습니다. 위의 설정을 사용 하 여, 레이저는 직경 10 μ m (그림 2)의 구멍을 생산할 예정 이다.
참고: 배아 세포에서 레이저를 유지 북극 몸 가까이 목표로 합니다. - 다음 단계로 이동 하기 전에 조직 문화 인큐베이터에 2 h에 대 한 복구를 수정 된 알 수 있습니다.
4. 마우스의 변환 수정 된 달걀 다음 XYClone 레이저 구멍 뚫 기
- 피펫으로 2 50 μ KSOM 드롭에 집중된 lentivirus (1e8 TU/mL titer 이상)의 μ. 위쪽 및 아래쪽 피펫으로 하지 마십시오. 수정 된 난 자는 쉽게 피펫으로 끝에 연결합니다. 우리의 경험을 바탕으로, 1e5-5e5 시험 단위 lentivirus 3 μ 보다 작은 볼륨에 유전자 배달에 대 한 최적입니다.
- 수정 된 계란 인큐베이터에서 4 일 동안 blastocyst으로 개발을 허용 합니다. 미디어를 변경할 필요가 없습니다.
5. 비-외과 전송 불리고 마우스 배아의 의사 임신 쥐
- 1.5 단계에서 준비 pseudopregnant 마우스, 짝짓기 후 3.5 일에 사용 합니다.
- 비 수술 배아 전송 (NSET) 장치를 사용 하 여 pseudopregnant 마우스에 마우스 배아를 이식.
- 수술 또는 해 현미경을 사용 하 여, 자 궁 경부를 시각화 하기 위해 질 speculum을 삽입 합니다.
- 약 2 μ의 볼륨에서 자 궁 경부 및 예금 배아로 약 5 m m 비 수술 배아 전송 (NSET) 장치를 삽입 합니다.
참고: 살 균 NSET 장치는 각 전송에 대 한 사용 하 고 절차 후 삭제. 배아의 조작에 사용 되는 모든 시 약은 살 균 해야 합니다.
- 각 pseudopregnant 마우스 10-15 건강 blastocyst KSOM의 2 μ 볼륨에서을 전송.
- 계속 모니터링 하 고는 NSET 성공 했는지 확인 하려면 다음 일에 pseudopregnant 쥐에 있는 체중 증가 측정 합니다.
- 자연스럽 게 출산 임신 쥐 또는 17 일 후 배아 전송26제왕 섹션을 수행 하 여 새끼를 복구 합니다. 제왕 절 개는 경우 거의 배아 자연 출산에 대 한 너무 큰 성장 경우가 많습니다.
- Transgenesis27의 속도 결정 하는 유전형 새끼에서 티슈를 수집 합니다.
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Representative Results
절연/불리고 마우스 수정 된 달걀의 개발 매일 현미경 (그림 1)에서 확인할 수 있습니다. 건강 한 태아는 blastocyst으로 3-4 일 이내 발전. 이 프로토콜에서 치료 배아의 60-70%는 blastocyst23으로 발전. 54 blastocyst (47%의 비율)으로 발전 하는 114 레이저 천공 불리고 배아에서 46 blastocysts 표현 GFP (46/54 = 85%)23.
마우스 배아 수확의 날에 레이저 천공을 했다. 레이저 치료에 대 한 최적의 설정을 수정 란 당 3 구멍 그리고 250 양 레이저 구멍 (그림 2)을 만드는 대신 zona 얇은 목적으로 한다. 그대로 캡슐화 zona pellucida lentiviral 변환에 허용 되는 동안 혜택을 개발 배아 수 있습니다. 이 실험에서 마우스 배아 신장 요인 1a 발기인에서 재조합 lentivirus copepod GFP (약식된 GFP) 표현으로 불리고 있었다. 변환, lentivirus의 2 uL 문화 미디어에 도입 되었다. 바이러스의 양을 증가, 저하 blastocyst23으로 배아 개발 하는 동안 GFP를 표현 하는 불리고 배아의 수를 직접 영향을 받습니다. 바이러스 성 볼륨 KSOM 드롭 볼륨의 10% 보다 더 큰 것 또한 저하 blastocyst 형성 (예: 50 μ KSOM 드롭에서 바이러스의 5 μ 보다 큰).
생존의 유효성을 검사 하려면 불리고 마우스 배아 pseudopregnant 쥐 비 수술로 옮겨 졌다. 6 별도 NSET 이벤트, 총 58 blastocyst, 총 12, transgenesis 23의 75% 속도 양보에서 9 GFP 유전자 변형 새끼에 결과 전송 합니다. NSET 프로토콜은 30-35% 라이브 출생28 우리의 실험에서 관찰 된 21% 수익률에 비해 수익률 보고 (12/58). Lentiviral 치료 배아 개발에 역할을 했다 고 낮은 배아 전송 속도에 기여 할 수 있습니다. 새끼 lentiviral 통합 및 GFP의 높은 표현 했다 시각적으로 블루 LED 램프 (465-470 nm)에서 녹색 (그림 3). 0-6에서 배열 했다 법인 GFP 사본의 수 복사 하 고 강아지 조직23에서 고립 된 염색체 DNA에 질적 PCR을 수행 하 여 결정 했다.
그림 1: 불리고 마우스의 개발 문화에 계란 수정. C57BL/6J 마우스 수정 된 달걀 날 0 (수확된 수정 된 계란), 1 일 (2 셀), 주 2 (8-16 셀), 3 일 (morula), 그리고 4 일 (blastocyst)에 감시 되었다. 배아는 lentivirus GFP 유전자를 운반으로 불리고 있었다. 하루 2-3으로 불리고 배아에서 형광의 존재를 분명 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 마우스의 레이저 치료 수정 된 달걀. 꿰뚫기는 zona의 구멍 vs 숱이 생산 zona의 예.
그림 3: 표현 GFP 유전자 변형 쥐. 어두운 리더 (닥터 스팟 램프, DRSL-9) 어두운 환경에서 GFP 긍정적인 새끼를 시각화 하기 위해 사용 되었다. 비-유전자 변형 제어 새끼 대비를 위해 그룹에 추가 되었습니다. 결과 새끼 (빨간색 화살표) genotyped 및 0-6에서 포함 했다 lentiviral 유전자/GFP의 복사본.
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Discussion
그들의 호스트 게놈으로 통합 하는 lentiviruses의 능력은 그들이 안정적인 유전자 배달에 대 한 이상적인 벡터 합니다. Lentiviral 벡터 셀 또는 유도할 수 있는 발기인, 선택 표시, 또는 형광 moieties 수용할 수 있는 유전 물질의 최대 8.5 kilobase 쌍 (kbp)을 수행할 수 있습니다. 법인된 게놈 자료 그들의 호스트 게놈의 일환으로 복제할 수 고를 표현 하거나 원하는 시간 지점에서 비활성화할 통제 될. 이러한 벡터 spatiotemporal 제어할 유전자 배달에 대 한 강력한 도구로 개발 및 브랜드는 lentiviruses의 다양 한 단계에서 유전자 발현에 대 한 수 있습니다.
레이저를 이용한 lentiviral transgenesis 유전자 식에 비보에대 한 효과적이 고 사용 하기 쉬운 방법입니다. 이 메서드는 vivo에서 단백질 생산 유전자 인코딩된 지표, 또는 기능 연구의 식에 사용할 수 있습니다. 다른 방법에 비해 레이저를 이용한 lentiviral 유전자 전달 pronuclear microinjection 효과적 이지만 필요 없는 기술적인 기술 이나 비용이 많이 드는 microinjection 워크스테이션. XYClone 레이저는 작은, 휴대용, 쉽게 여러 연구소 들 간에 공유 될 수 있습니다.
레이저를 이용한 lentiviral 유전자 배달 안정적 이며 하지 과도, electroporation 또는 수정 된 난 자의 photoporation. 과도 유전자 전달이 이다 CRISPR Cas9 구성 요소 또는 recombinases의 납품에 대 한 더 많은 장점이 확장된 식 탈 선 결과로 이어질 수 있기 때문. 이 프로토콜에서 integrase 결핍 lentiviruses (IDLVs) 마우스 수정 된 달걀의 과도 변환에 대 한 대체 수 있습니다. IDLVs lentiviral infectivity 유지 하지만 lentiviruses29의 통합 능력의 일부 (8% 미만)를 유지. 레이저를 이용한 lentiviral transgenesis 그들의 원하는 결과에 따라 평가 하는 사용자를 위한 추가 유전자 배달 옵션입니다.
Lentiviral 변환의 주요 단점은 전달된 유전자의 무작위 삽입입니다. 또한, 동일한 배아에서 세포는 유전자 변형에 mosaicism 리드 여러 lentiviral 통합을 호스팅할 수 있습니다. 자손의 유전형와 계획 된 breeding의 여러 라운드 단일 로커 스 유전자 변형 동물을 설정할 필요가 있다. 비슷한 번 식 전략 또한 기존의 transgenesis 방법을30에서 채택 된다.
이 프로토콜의 중요 한 단계 레이저 구멍 뚫 기에 보낸 시간의 길이입니다. 수정 된 마우스 달걀 KSOM에 교양 15 분 이상 동안 인큐베이터 밖 유지 수 없습니다. 초보 사용자, M2 중간에 수정 된 달걀을 이동 해야 고급 KSOM 배아 매체를 사용 하거나 접시 당 배아의 수를 제한. 우리의 결과 불리고 교양된 마우스 수정 된 달걀의 47% blastocysts23으로 발전. 따라서 배양 접시 당 30-40 수정된 계란 불리고 blastocysts pseudopregnant 쥐로 전송 위한 한 접시에 적절 한 수를 보장 합니다.
마우스 수정 된 달걀 zona의 레이저를 이용한 천공 다른 종의 구역에 적용 되 고 다른 종류의 바이러스 또는 transfection 시 약에 대 한 항목을 허용 또한 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 연구소의 건강 (NIH), 국립 환경 보건 과학 연구소 (NIEHS)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다. 우리는 박사 로버트 페트 로비치와 박사 제이슨 윌리엄스는 원고 및 유용한 조언의 중요 한 독서에 대 한 감사입니다. 우리 또한 인정 하 고 박사 베른트 광택, 녹아웃 코어, Cytometry 교류 시설, 형광 현미경 및 이미징 센터, 그들의 기술적인 기여는 NIEHS의 비교 약 분기 시설 감사 하 고 싶습니다. 우리는 비교 약 지점에서 미스터 데이비드 Goulding와 사진 및 일러스트와 함께 우리를 제공 하기 위한 NIEHS에 이미징 센터의 양 로이스 Wyrick 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10 mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
References
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