Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Implantation eines Glasfensters auf das Rückenmark einer Maus, um die Visualisierung durch intravitale Mikroskopie zu erleichtern.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Rückenmarkslaminektomie und Glasfensterimplantation zur In-vivo-Bildgebung des Mausrückenmarks. Ein integrierter digitaler Verdampfer wird verwendet, um eine stabile Anästhesieebene bei einer niedrigen Durchflussrate von Isofluran zu erreichen. Eine einzelne Wirbelsäule wird entfernt und ein handelsübliches Deckglas auf einem dünnen Agarosebett überlagert. Anschließend wird eine 3D-gedruckte Kunststoff-Rückplatte mit Gewebekleber und Zahnzement an den angrenzenden Wirbeldornen befestigt. Eine Stabilisierungsplattform wird verwendet, um Bewegungsartefakte durch Atmung und Herzschlag zu reduzieren. Diese schnelle und klemmfreie Methode eignet sich gut für die akute Multiphotonenfluoreszenzmikroskopie. Repräsentative Daten sind für eine Anwendung dieser Technik auf die Zwei-Photonen-Mikroskopie der Rückenmarksvaskulatur bei transgenen Mäusen enthalten, die eGFP:Claudin-5 exzessiv exzessiv exzessither exemiten: ein enges Knotenprotein.
Introduction
Transgene Tiermodelle, die fluoreszierende Proteine exezieren, bieten in Kombination mit der intravitalen Mikroskopie eine leistungsstarke Plattform für die Auseinandersetzung mit Biologie und Pathophysiologie. Um diese Techniken auf das Rückenmark anzuwenden, sind spezielle Protokolle erforderlich, um das Rückenmark für die Bildgebung vorzubereiten. Eine solche Strategie ist die Durchführung einer Laminektomie und rückenmarksfensterimplantation. Zu den Hauptmerkmalen eines idealen Laminektomieprotokolls für die Mikroskopie gehören die Erhaltung der nativen Gewebestruktur und -funktion, die Stabilität des Bildgebungsfeldes, die schnelle Verarbeitungszeit und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Eine besondere Herausforderung besteht darin, das Bildgebungsfeld gegen die durch Atmung und Herzschlag induzierte Bewegung zu stabilisieren. Mehrere ex vivo und in vivo Strategien wurden berichtet, um diese Ziele zu erreichen1,2,3,4,5. Die meisten In-vivo-Methoden beinhalten das Spannen der Seiten der Wirbelsäule2,4 und wird oft durch die Implantation eines starren Metallapparates3,4 zur Stabilität während der Operation und nachgeschaltete Bildgebungsanwendungen. Das Spannen der Wirbelsäule kann den Blutfluss beeinträchtigen und eine Protein-Umgestaltung der Blut-Hirn-Schranke (BBB) induzieren.
Der Zweck dieser Methode ist es, das intakte Rückenmark für die optische Bildgebung in der lebenden Maus zur Verfügung zu stellen und gleichzeitig die Invasivität des Protokolls zu minimieren und die Ergebnisse zu verbessern. Wir beschreiben ein einziges Laminektomie- und Deckglas-Implantationsverfahren gepaart mit einer minimalinvasiven ovalen 3D-gedruckten 3D-gedruckten Rückplatte, die dennoch eine robuste mechanische Stabilität erreicht. Die Rückplatte wird direkt an den vorderen und hinteren Wirbeldornen mit Zahnzement aufgehalten. Die Rückwand ist mit seitlichen Verlängerungsarmen mit Schraublöchern ausgestattet, die über einen Metallarm fest an der Mikroskopbühne befestigt werden. Dadurch wird der intakte vordere und hintere Wirbel effektiv an der Mikroskopstufe verankert und bietet eine mechanische Beständigkeit gegen das Bewegungsartefakt, das sonst durch Atmung und Herzschlag eingeführt würde. Das Verfahren wurde für die Laminektomie eines einzelnen Wirbels auf Thoraxstufe 12 optimiert, wodurch die In-vivo-Bildgebung in alternativen Stabilitätsstrategien ausgelassen wird. Das Verfahren ist schnell und dauert ca. 30 min pro Maus.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Krankheitsmechanismen der BBB zu untersuchen. Das BBB ist ein dynamisches mikrovaskuläres System, das aus Endothelzellen, vaskulären glatten Muskeln, Pericyten und Astrozytenfußprozessen besteht, die eine hochselektive Umgebung für das zentrale Nervensystem (ZNS) bieten. Repräsentative Daten zeigen die Anwendung dieses Protokolls bei transgenen Mäusen, die entwickelt wurden, um verbessertes grünes fluoreszierendes Protein (eGFP) auszudrücken:Claudin-5, ein BBB-Protein mit fester Verbindung. Die mitgelieferten Backplate-Druckdateien können auch für alternative Anwendungen angepasst werden.
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Protocol
Alle Experimente folgen den Protokollen des Institutional Animal Care and Use Committee der University of Illinois, Chicago. Dies ist ein Terminalverfahren.
1. Reagenz-Vorbereitung
- Bereiten Sie künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit (aCSF) vor, die 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl26H2O, 2 mM CaCl22Oin ddH2O. Sterilfilter und Einfrieren in individuellen Aliquots enthält. ACSF in einem Wasserbad vor Gebrauch auf 39 °C erwärmen.
- Warmer Niedriger Schmelzpunkt Agarose (2%) in einem CSF bis vollständig gelöst in einem Wasserbad auf 65 °C eingestellt. Während der Laminektomie die geschmolzene Agarose aliquot auf 39 °C in einem Wasserbad abkühlen, so dass sie bei der physiologischen Temperatur für Schritt 5.2 bereitstehen kann.
Hinweis: Die Agarose-Lösung kann bei -20 °C in Einweg-Aliquots gelagert werden. - Bereiten Sie sterile 50 mg/ml Carprofen in bakteriostatischem Wasser vor. Bei 4 °C lagern.
- Reinigen Sie die Deckgläser mit 70% Ethanol, drei Wäschen ddH2O, und lagern Sie trocken in einem staubfreien Behälter.
2. Backplate 3D-Druck
- Verwenden Sie 3D-CAD-Software wird verwendet, um ein Modell für die Abmessungen in Abbildung 1zu erstellen. Der Innenraum ist eine Ellipse am weitesten an der unteren Oberfläche in Bezug auf den Drucker und geschnitten mit einem erhabenen Schnitt zu einer kleineren Ellipse bilden ein Lumen an der gegenüberliegenden Oberfläche. Zwei projizierte Arme mit Löchern, um Schrauben zu akzeptieren, erstrecken sich seitlich, um die Rückplatte zu halten Gabel. Erstellen Sie aus dieser 3D-Struktur eine triangulierte 3D-Netzdatei (. STL-Datei).
Hinweis: Siehe Abbildung 1B-D und Zusatzdateien 1 und 2. - Laden Sie die triangulierte 3D-Netzdatei auf einen 3D-Drucker hoch.
- Drucken Sie Backplates mit einer 0,4 mm Heißenddüse und einer Schichthöhe von 0,2 mm. Wählen Sie Eine Düsentemperatur von 205 °C, eine Betttemperatur von 45 °C und eine Druckgeschwindigkeit von 45 mm/s.
- Bewerten Sie die resultierenden 3D-gedruckten Backplates visuell auf strukturelle Integrität (Abbildung 1E); grobes strukturelles Versagen (fehlendes Lumen, eingestürzte Wand) weist auf Druckfehler hin (Abbildung 1F).
3. Chirurgische Vorbereitung
- Heizen Sie das Heizkissen vor.
- Last Isofluran in die Förderspritze, während sie in einer chemischen Rauchhaube arbeiten. Befestigen Sie die Förderspritze an der Isofluran-Einheit.
- Wählen Sie eine 8-u201212-Woche alte Maus aus. Wiegen Sie das Tier. Induzieren Sie anästhesie mit 2% Isofluran in einer Induktionskammer. Carprofen mit 5 mg/kg subkutan injizieren.
- Positionieren Sie den Nasenkegel und liefern Sie Isofluran bei 2% mit einer Durchflussrate von 150 ml/min für die Aufrechterhaltung einer chirurgischen Anästhesieebene (Abbildung 2A- U2012E). Wickeln Sie das Heizkissen mit einem Einweg-Absorber-Pad für eine einfache Reinigung.
- Positionieren Sie ein Tier auf dem Heizkissen an der chirurgischen Station und installieren Sie den Nasenkegel. Schmieren Sie das Thermometer mit Petroleumgelee und legen Sie es 5 mm in das Rektum. Verkleben Sie die Thermometersonde an den Schwanz, um stabilitätsstabil zu sein. Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen der Maus auf.
- Um die Hydratation aufrechtzuerhalten, wenden Sie bis zum Ende des Experiments alle 30 min 200 L laktierte Ringerlösung durch subkutane Injektion an.
- Das Dorsum mit 70% Ethanol besprühen, Fell mit Clippern entfernen und die Stelle mit Povidon-Jod reinigen.
4. Laminektomie
- Positionieren Sie das Tier zwischen den Ohrstangen; diese halten die Kopfposition der Maus in Bezug auf den Nasenkegel.
- Bestätigen Sie, dass das Tier tief beästhetisiert ist, wie durch den Mangel an interdigitalen Pinch-Reflex und stetigen Atemmuster beurteilt.
- Machen Sie einen 1,5 cm rostral-kaudalen Schnitt an der Mittellinie über dem unteren Brust-/Oberen Lendenbereich mit #11 Klinge (Abbildung 2). Trennen Sie die Haut, indem Sie sie mit stumpfer Zahnzange und/oder gehandicapten Fingern erfassen. Verwenden Sie Zangen, um das verbleibende transparente Bindegewebe unter der Haut zu trennen und abzuziehen. Die oberflächliche Muskulatur sollte nun freigelegt werden; mit einem Schaumchirurgischen Speer zu verdrängen.
- Verwenden Sie Schaumchirurgische Speere (oder eine Kurette), um die verbleibende, tiefere Muskulatur des Zielwirbels (thorakal 12) zu entfernen. Um einen Sitz für die Rückwand zu schaffen, auch weg Muskel aus dem hinteren Aspekt der Brust 11, und der vordere Aspekt der Brust 13. Kontrollieren Sie Blutungen, indem Sie sanften Druck mit einem chirurgischen Speer ausüben oder verwenden Sie einen minimalen Puls mit einer Kauterpistole. Weiter, um den verbleibenden Muskel weg von den Sehnen mit Zangen zu entfernen
- Sobald die Muskeln entfernt sind, lösen Sie die Sehnen vorsichtig, indem Sie sie mit Zangen schneiden. Es sollte genügend Platz zum Visualisieren und Manipulieren der Schnur vorhanden sein, wenn dieser Schritt abgeschlossen ist. Prüfen Sie, ob die Dura-Materie des Intervertebral-Raums, der halbtransparente Laminarknochen, das zentrale oberflächliche Blutgefäß unter dem Knochen und die anterior estrahlende Arterie nun deutlich sichtbar sind.
- Befeuchten Sie die Region mit warmem ACSF. Verwenden Sie den Mikrobohrer, um den laminaren Knochen mit geraden Strichen parallel zur langen Achse des Rückenmarks zu verdünnen (Abbildung 2, Abbildung 3). Verwenden Sie auf Wunsch eine Gleitstufe, um die operationschirurgische Plattform für einen verbesserten ergonomischen Komfort zu drehen (z. B. kann ein Rechtshänder die Operationsplattform für den Bohrschritt gegen den Uhrzeigersinn drehen).
Hinweis: Die verwendete Gleitstufe besteht aus einer oberen Aluminiumplatte, die in Bezug auf die feste Grundplatte um 15 mm gleitet. - Greifen Sie vorsichtig den oberflächlichen Spinnprozess mit Zangen und heben Sie den Wirbel; der Knochen sollte leicht wegheben. Wenn es Widerstand gibt, wiederholen Sie die Knochenverdünnung mit dem Bohrer und verwenden Sie bei Bedarf iris Schere, vorsichtig zu zielen die Schere Spitzen nach oben, um zu vermeiden, das Gewebe zu beschädigen.
Hinweis: Um die Dura intakt zu halten, ist es wichtig, nicht auf den Knochen zu ziehen. - Verwenden Sie #4 Zange, um alle Knochenscherben zu löschen. Verwenden Sie einen chirurgischen Speer, um sanften konstanten Druck anzuwenden, um alle Blutungen zu kontrollieren. Gewebe mit warmem aCSF abspülen. Lassen Sie das Gewebe nicht austrocknen.
5. Abdeckung-Glas-Implantation
- Tragen Sie ein 3 mm Borosilikat-Abdeckungsglas vorsichtig auf die freiliegende Schnur auf.
- Stellen Sie sicher, dass Agarose auf 39 °C abgekühlt ist. Mit einem kleinen Spachtel warme 2% Agarose/aCSF auf den Rand des Deckglases auftragen und Kapillarwirkung unter die Oberfläche ziehen lassen.
Hinweis: Bei Temperaturen unter 39 °C kann die Agarose gelieren. Wenn dies der Fall ist, sollten Sie mit einem Wasserbad oder einer Mikrowelle aufwärmen. Einige Betreiber ziehen es vor, zuerst einen Tropfen Agarose aufzutragen und das Deckglas darüber zu legen. - Wenden Sie Gewebekleber auf die exponierten knöchernen Gelenkprozesse des intakten benachbarten Wirbels auf Thoraxebene 11 Wirbelwirbelsäule und Brustbruststufe 13 Wirbelwirbelsäule auf. Tragen Sie zusätzlichen Gewebekleber in einem Ring um die Laminektomie-Stelle, über die angrenzende Sehne und Querprozess.
Hinweis: Gewebekleber ist für die ordnungsgemäße Haftung des Zahnzementes in den nachfolgenden Schritten erforderlich. Die Gelenkprozesse bilden einen natürlichen Sitz, auf dem die Rückwand stabil ruhen kann (Abbildung 3). Die Haftung an den Gelenkprozessen bildet die stärksten Befestigungspunkte. - Zahnzement mit Beschleuniger in einem Porzellanmischtablett mischen. Verwenden Sie einen kleinen Spachtel, um Zahnzement auf die Gewebeklebeschicht zu übertragen. Verwenden Sie Dentalzement, um die Rückplatte auf dem chirurgischen Feld zu haften, zentriert über dem Fenster. Lassen Sie 10 Minuten für den Zahnzement zu heilen.
Hinweis: Die feste Haftung der Rückplatte an den vorderen und hinteren Gelenkprozessen sorgt für die grundlegende strukturelle Stabilität des Implantats. - Verwenden Sie zusätzlichen Zahnzement, um die innere Basis der Rückplatte und die Unterseite der Backplate zu füllen: Gewebeschnittstelle.
Hinweis: Die zusätzliche Anwendung von Zahnzement verbessert die Haftung und reduziert das Risiko von Leckagen von Mikroskop objektiv tauchflüssigkeit (saline) aus dem Boden der Rückplatte. - Bringen Sie den gabelten Rückplattenhalter in die entsprechende Position über das Fenster. Befestigen Sie die Rückplatte mit Schrauben in den Rückblechhalter.
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet einen benutzerdefinierten Backplate-Halter (Abbildung 2G- 2012H). - Tragen Sie Kochsaline auf die Rückplatte auf, um auf Leckage zu testen. Wenn Flüssigkeit austritt, trocknen Sie den Bereich und tragen Sie mehr Zahnzement auf.
6. Bildgebungsvorbereitung
- Übertragen Sie das Tier auf der chirurgischen Plattform auf den optischen Tisch.
Hinweis: Unsere chirurgische Plattform, Backplate Halter und Isoflurane Nasenkegelhalter kann zwischen chirurgischen und zwei-Photon-Bildgebungsstationen als eine Einheit transportiert werden, während kontinuierliche Isoflurananästhesie angewendet werden (Abbildung 2D,H). Ähnliche Einheiten können aus Haltegabeln, Balken und tragenden Säulenpfosten aus kommerziellen Quellen(z.B.. ThorLabs). Für die intravitale Mikroskopie sollte es mindestens 11 Zoll Abstand zwischen dem Mikroskopobjektiv und dem optischen Tisch geben, um die Höhe der chirurgischen Plattform aufzunehmen. - Befestigen Sie die chirurgische Plattform mit einem Edelstahl-Montagepfosten und einer gegenbohrenden Spanngabel am optischen Tisch.
- Frische Kochwäsche in den Brunnen der Backplate auftragen. Senken Sie eine Wasser-Immersion-Linse in den Brunnen.
- Verwenden Sie übertragenes oder epifluoreszenzlicht, um den Interessenbereich und fokussierend zu identifizieren. Wechseln Sie in den Laser-Scanning-Modus und führen Sie in vivo-Bildgebung entsprechend der entsprechenden Zwei-Photonen-Laser-Erregungswellenlänge, Dichroics und Bandpassfilter für die im Gewebe6vorhandenen Fluorophore durch.
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Representative Results
Implantierte Glasfenster und die intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie sind ein nützliches Werkzeug zur Beurteilung dynamischer Veränderungen in ZNS-Proteinen. Die funktionelle Integrität des BBB wird durch die Expression, subzelluläre Lokalisierung und Fluktuationsraten von engen Knotenproteinenbeeinflusst 7. Frühere Studien haben gezeigt, dass enge Knotenproteine schnell und dynamisch im stationären Zustand8umgebaut werden. Die derzeit beschriebene Laminektomie und Glasfenstervorbereitung wurde in transgenen eGFP:Claudin-5-Mäusen9verwendet, die fluoreszierende enge Knotenproteine tragen, um den BBB-Engstellenumbau in der experimentellen Autoimmun-Neuentbäuerung zu bewerten. Enzephalomyelitis (EAE) Modell der Multiplen Sklerose10. In den repräsentativen Daten wurde die Bildgebung von eGFP:Claudin-5 mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop mit 920 nm Anregung, einem 40-Zoll-Infrarotobjektiv (0,8 NA) und einem grünen Fluoreszenz-Emissionsfilter(Abbildung 4) erreicht. Optische Stapel wurden in 2'm axialen Schritten bis zu 100 m unter der Duraloberfläche abgetastet. Die Daten zeigen die Visualisierung der fluoreszierend markierten Knoten in einem Gefäßplexus. Einzelne optische Slices und Z-Projektionsbilder sind enthalten (Abbildung 4). Die klare Abgrenzung enger Anschlussstrukturen in der Z-Projektion (Abbildung 4B) zeigt an, dass nach erfolgreicher Laminektomie, Fensterplatzierung und Rückfallimplantation eine minimale X-Y-Bildverschiebung entsteht.
Abbildung 1. Benutzerdefinierte gedruckte Backplate Stabilisierungsgerät. A) Orthogonale Backplate-Ansichten. B-D) Triangulierte Netzmodelle von dorsalen und ventralen Oberflächen der Rückwand. E) Korrekt bedruckte Rückwandplatte. F) Falsch gedruckte Rückwand. Siehe Ergänzende Dateien 1 und 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Chirurgische Schritte für die Laminektomie. A) Isoflurane Anästhesie-Liefersystem mit integriertem digitalen Verdampfer inklusive (i) Touchscreen-Display zur Steuerung der Anästhesie, (ii) Steuerzifferblätter, (iii) Eingänge für optionale Add-on-Physiologiemodule, (iv) Anästhesiekonzentration Einstellknopf, (v) Spritzenpumpenschieberblock, (vi) Spritze mit Isofluran, (vii) integrierter digitaler Verdampfer, (viii) Inspirationsschläuche, (ix) Inspirationsschläuche für Induktionskammer, (x) Induktionskammer, (xi) Inspirationsschläuche für Nasenkegel, (xii) Ablaufschläuche für Nasenkegel, (xiii) Ablaufschläuche für Induktionskammer. B) Zu den in der Laminektomie verwendeten Instrumenten gehören (i) rückkopplungsgesteuerte Heizeinheit, (ii) K-gekoppelte rektale Thermometersonde, (iii) flexibles Silikonheizkissen, (iv) #11 Klinge, (v) #5 Zangen, (vi) zahnförmige Titanzangen, (vii) Titan-Iris Schere, (viii) Knochenmikrobohrer, (ix) Kauterpistole, (x) 3D bedruckte Backplate, (xi) saugfähiger Schaum chirurgische Speere, (xii) Keramik-Mischtablett für Acrylharz, (xiii) Acrylharz und Beschleuniger, (xiii) Gewebekleber, (xiv) ophthalmologisches Schmiermittel, (xv) 3 mm Abdeckungsglas. C) Stereomikroskop und chirurgische Plattform. Während der Operation sitzt die Operationsplattform auf einer Gleitbühne (silberne und schwarze runde Basis auf der Mikroskopbühne). D) Maus auf der benutzerdefinierten chirurgischen Plattform mit beheiztem Bett, nach oberflächlichem Mittellinienschnitt. Der isoflurane nosecone Halter ist in den Y- und Z-Achsen verstellbar, um kleine und große Mäuse aufzunehmen. Ohrstangen stabilisieren den Kopf in Bezug auf das Nosecone. Die rektale Thermoprobe misst die Kerntemperatur. E) Chirurgisches Feld im Schritt der Muskelentfernung. F) Chirurgisches Feld nach Entfernung des Muskels. G) Chirurgisches Feld bei der Ausdünnung des Wirbelknochens. H) Chirurgisches Feld nach Entfernung des Wirbelknochens. I) Chirurgisches Feld bei der Platzierung von Deckglas. J) Chirurgisches Feld nach Platzierung des Deckglases. K) Chirurgisches Feld bei der Erstbeschichtung mit Acryl. L) Chirurgisches Feld nach Abschluss der Rückbau-Implanation. M-N) Maus in der chirurgischen Station positioniert nach abgeschlossener Laminektomie. Die Messinggabel ist in X-, Y- und Z-Achsen zur Positionierung über die Wirbelsäulenlaminektomie verstellbar. Die Gabel ist mechanisch an der chirurgischen Plattform verankert, um eine optimale Stabilisierung des bildgebenden Feldes während der Operation und nachgelagerten Anwendungen einschließlich der zweiphotonen intravitalen Mikroskopie zu gewährleisten. Während der Operation wird die operationschirurgische Plattform auf einer Gleitbühne montiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Schematische Darstellung der anatomischen Platzierung des Rückenmarksfensters. A) Schematische Darstellung der überlegenen Ansicht eines unteren Brustwirbelkörpers, des spinalen Prozesses und des Rückenmarks (sc). Ein gepunkteter Kreis zeigt den Sitz des Gelenkprozesses, den Hauptstützpunkt für die Hinterplattenhaftung. B) Schematische Darstellung der überlegenen Ansicht des Rückenmarksfensters. Die Zielwirbelwirbelsäule (hier, T12) wurde entfernt. Eine dünne Schicht Agarose überlagert das Rückenmark. Ein Deckglas ruht auf der Agarose. Gewebekleber wird über die Querprozesse aufgetragen (und, hier nicht gezeigt, auf den exponierten Gelenkprozess der angrenzenden, intakten Wirbeldornen). Dentalzement überlagert den Gewebekleber. Die Rückplatte haftet am Gewebezement und ruht auf den Querprozessen (angezeigt) und dem Gelenkprozess der angrenzenden, intakten Wirbeldornen (nicht in diesem Panel dargestellt). Eine zusätzliche dünne Schicht aus Zahnzement wird auf das Innere der Hinterplatte aufgetragen. Die Rückwand wird in einer Schnittansicht dargestellt, um das Deckglas zu visualisieren. C) Schematische Darstellung der seitlichen Ansicht des Rückenmarksfensters. Die Zielwirbelwirbelsäule (hier, T12) wurde entfernt. Eine dünne Schicht Agarose überlagert das Rückenmark. Ein Deckglas ruht auf der Agarose. Gewebekleber wird über den exponierten Gelenkprozess der angrenzenden, intakten Wirbeldornen T11 und T13 aufgetragen. Dentalzement überlagert den Gewebekleber. Die Rückplatte haftet am Gewebezement und ruht auf den Querprozessen und dem Gelenkprozess der angrenzenden, intakten Wirbeldornen (angezeigt). Die Rückwand ist in einer Schnittansicht dargestellt; in einer echten seitlichen Ansicht würden die Agarose und das Deckglas durch die Seitenwand der Rückwand verdeckt. Anatomische Strukturen basieren auf einer detaillierten Magnetresonanztomographie der C57Bl/6 Wirbelsäule, die von Harrison und Kollegen 11durchgeführt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Enge Kreuzung Mikrostruktur visualisiert durch eGFP:Claudin-5 in der Maus Rückenmark durch intravitale Zwei-Photon-Mikroskopie. A) Ein einziger optischer Abschnitt, der bei 30 m unter der Duraloberfläche in einer gesunden eGFP:Claudin-5-Maus aufgenommen wurde. Roter Pfeil zeigt ein eGFP:Claudin-5 enges Kreuzungssegment, das sich senkrecht zur längsengen Kreuzungsachse erstreckt. Der Maßstabsbalken steht für 5 m. Einschub: Skalenbalken steht für 10 m. B) Z-Projektion des Gefäßnetzes, das sich 100 m unter der Duraloberfläche des gesunden Mausrückenmarks erstreckt. Der optische Stapel wurde in einer axialen Schrittgröße von 2 m abgetastet und enthält die Scheibe aus dem Panel A. Es wurde keine Bildausrichtung durchgeführt. Die scharfe Abgrenzung der Knotenstrukturen in der Z-Projektion zeigt eine minimale Bildverschiebung zwischen aufeinander folgenden Frames. C) Repräsentative Teilmenge der optischen Scheiben, die in 10 m Intervallen aus dem resultierenden Z-Stack entnommen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Datei 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht eine stabile Bildgebung des Rückenmarks bei Mäusen durch ein Glasfenster. Diese Methode wurde angewendet, um die BBB-Umgestaltung in transgenen eGFP:Claudin5+/- Mäusen zu bewerten, die ein fluoreszierendes BBB-Protein mit fester Verbindung ausdrücken, aber es könnte ebenso gut für Studien von fluoreszierenden Proteinen oder Zellen im Rückenmark angewendet werden.
Es wurden mehrere Methoden zur Laminektomie und Rückenmarksstabilisierung entwickelt. Alle Protokolle befassen sich mit der Stabilisierung des Rückenmarks während der Bildgebung und Fensterimplementierung für den visuellen Zugriff auf die Struktur des Interesses. Die Anzahl der entfernten Wirbel und der Grad der Invasivität der verfügbaren Protokolle variieren(z. B. Komponenten, die auf der Oberfläche des oberflächlichen Knochens geklebt werden, wie im vorliegenden Protokoll, im Vergleich zu tiefer eingebetteten). Davalos und Akassoglou2 entwickelten eine Laminektomie-Methode mit abnehmbaren Klemmen auf jeder Seite der Wirbelsäule und einer Klemme an der Basis des Schwanzes der Maus, um das Rückenmark zu stabilisieren. Diese innovative Strategie, das Tier auszusetzen, entlastete einen Teil der Brustverdrängung, die durch die Bewegung der Lunge verursacht wurde, die sich gegen den Operationstisch ausdehnte. Um einen Brunnen für die Eintauchen von Flüssigkeit für eine wassertauchende mikroskopische Linse zu schaffen, wurde eine Felge aus Gelatinedichtung(z.B. Gelseal) um das Rückenmark herum hergestellt und mit einem CSF gefüllt. Die Dichtungsfelge könnte während der Bildgebung gestört werden, aber auch leicht am Ende der Sitzung weggewischt werden, um Wundverschluss und anschließende Reimaging zu ermöglichen. Diese Methode wurde weit verbreitet12,13. Andere Gruppen haben alternative Stabilisierungsmethoden entwickelt. Fenrich et al. 4 handvorbereitete modifizierte Büroklammern zur Sicherung der Wirbelsäule. Diese modifizierten Büroklammern wurden in den seitlichen Wirbel-Pedikeln mit Cyanoacrylatkleber gesichert und als dauerhaft implantierte Griffe für einen abnehmbaren Außenclip und eine externe Haltegabel für eine hervorragende Bewegungsstabilität gehalten. Cupido und Kollegen haben Variationen über die oben genannten Methoden mit der Einbeziehung von Agarose auf der Schnur überlagert2,4,12vorgestellt. Farrar und Schaffer3 entwickelten einen vierseitigen Metallstabilisator, der die Umsetzung eines Glasfensters auf drei Wirbel nützen konnte und nicht nur einen. Diese Methode ermöglichte es auch, das Rückenmark während der Bildgebung mit Schrauben an einem größeren Brückenstabilisator zu befestigen, um mögliche Bewegungen zu reduzieren. Ein miniaturisiertes Ein-Photon-Mikroskop, das direkt in die Bildgebungskammer der Laminektomie implantiert wurde, wurde ebenfalls für die In-vivo-Aufzeichnung in frei beweglichen Mäusen auf Ein-Photon-Ebene entwickelt, ist aber für die meisten Laboratorien noch nicht ohne weiteres verfügbar13 . In einem anderen Ansatz, Weinger et al. 1 sezierte ein ganzes Rückenmark und eingebettete es in Agarose für ex vivo Bildgebung, die eine unübertroffene Bewegungsstabilität und Zugang zum ventralen Rückenmark ermöglicht, aber den Blutfluss abhebt. Einige Einschränkungen dieser Entwicklungen umfassen lange chirurgische Zeit4, mögliche Störung der Gelatine Dichtung Felge2, die Notwendigkeit, die Abdeckung-Glas-Abmessungen an den gewünschten Bereich des Rückenmarks4, manuell anpassen Modifikation von Büroklammern4,12, relativ invasive chirurgische Techniken12,14, und Luftblasen bilden sich bei Verwendung des Siliziumelastomers3,4.
Wir haben eine alternative Methode entwickelt, die mehrere Vorteile bietet. Dieses Protokoll wurde optimiert, um die Zeit während der Operation zu reduzieren. Einige chirurgische Protokolle erfordern längere Eingriffszeiten vonanderthalb Stunden bis zu einer Stunde3. Einmal gemeistert, kann diese Laminektomie-Methode in ca. 30 min durchgeführt werden. Die Reduzierung der Zeit in der Chirurgie kann physiologischen Stress für die Maus verringern und höhere Durchsatzexperimente ermöglichen. Dieses Protokoll entfernt einen einzelnen Wirbel und beinhaltet eine oberflächliche Haftung des Stabilisierungsgeräts, wodurch es weniger invasiv ist als einige vergleichbare Protokolle4,5,12,14. Wie die Methode von Figley et al.bietet dieses Protokoll durch die Verwendung eines Kunststoffimplantats Kompatibilität mit der akustischen Bildgebung5.
Um Lichtstreuungen (während der intravitalen Mikroskopie) zu vermeiden, die durch die Unterschiede zwischen den Brechungsindizes von Luft, Wasser und Gewebe verursacht werden könnten, überlagern die meisten Protokolle ein optisch transparentes Substrat über dem exponierten Rückenmark. Häufige Substrate sind hochreine, niedrigschmelzende Temperatur Agarose10,12 oder Silikonpolymere3,4,5. Agarose bietet den Vorteil der Benutzerfreundlichkeit, mit minimaler Blasenbildung, und eignet sich für akute Bildgebungsitzungen. Um das Gewebe vor Hitzeschäden zu schützen, ist es bequem, die Agarose über den Schmelzpunkt hinaus zu erwärmen und dann in einem Wasserbad während der Laminektomie auf 39 °C abkühlen zu lassen, so dass sie zur richtigen Zeit für die Anwendung am exponierten Rückenmark bereit sein kann. Für die chronische Bildgebung sind Silikonpolymere resistenter gegen Dehydrierung. Pilotversuche während der Entwicklung des aktuellen Protokolls verzichteten entweder auf die Agaroseschicht oder das darüber liegende Deckglas und stellten fest, dass die daraus resultierende Lichtstreuung die verfügbare Bildtiefe reduzierte.
Eine Unterscheidungsmerkmal dieses Protokolls ist die Einbindung einer 3D-gedruckten Rückplatte und eines unterstützenden Backplate-Gabelhalters. Nach der Laminektomie und Der Fensterimplantation wird das Präparat durch Zugabe einer 3D-gedruckten ovalen Rückwand stabilisiert, die mit Zahnzement fixiert ist. Die Backplate erfüllt zwei Funktionen: erstens bietet sie strukturelle Unterstützung und Stabilisierung des Rückenmarks, und zweitens erzeugt sie eine Lippe, um Flüssigkeit für Tauchziele für die Mikroskopie zu halten. In Prototypen dieses Setups wurden handelsübliche Säulenpfosten, Adapter und Haltegabeln verwendet; wir haben vor kurzem auf kundenspezifische bearbeitete Teile umgestellt, wie hier dargestellt. In beiden Fällen besteht das wesentliche Merkmal darin, strukturelle Strenge zu bieten, um das Bildgebungsfeld gegen die Störungen in Raum und Zeit zu stabilisieren, die durch Herzschlag und Atmung induziert werden. Obwohl der Körper des Tieres lose auf dem Heizkissen ruht, sind das Rückenmark und sein Bildgebungsfeld leicht von der Haltegabel abgehängt, was auch die Atemverschiebung verringert. Das Kunststoffsubstrat bietet eine geringe Flexibilität, um die Spannung durch Verschrauben in den Plattenhalter aufzunehmen. Die schwarze Kunststofffarbe, die für den Druck verwendet wird, reflektiert minimales Licht in das Fluoreszenzfeld. Mit diesen Methoden generieren wir erfolgreich Image-Stacks, die ohne Post-hoc-Ausrichtungsanpassung verwendet werden können. Darüber hinaus ist die hier beschriebene 3D-Rückwand kostengünstig herzustellen und kostet nach dem Kauf des Druckers nur 100 Cent Material für jeden Druck. Darüber hinaus sind die Kosten für 3D-Drucker in den letzten Jahren gesunken. Die mit diesem Protokoll veröffentlichten 3D-gedruckten Backplate-Strukturdateien (siehe Ergänzende Dateien 1 und 2), die mit diesem Protokoll veröffentlicht wurden, können leicht an individuelle Laboranforderungen angepasst werden. Wir haben die lange Dimension der Rückwand entworfen, um den intervertebralen Raum unterzubringen, der durch Entfernung der Brustwirbelsäule 12 Wirbelwirbelsäulen entsteht, die die Lenden2/3 Rückenmarkssegmente11überwindet. Um diese Technik auf einen anderen Wirbelabschnitt anzuwenden, können die zugehörigen CAD-Dateien geändert werden.
Dieses Protokoll verwendet ein kommerziell erhältliches Low-Flow-Anästhesiesystem, das einen digitalen integrierten Direkteinspritzverdampfer als Alternative zum herkömmlichen passiven Verdampfer einsetzt. Das Hauptmerkmal der Low-Flow-Einheit ist die reduzierte Exposition des Bedieners gegenüber Isofluran, einem erheblichen gesundheitlichen Nutzen. Die Strömungs-Anästhesieeinheit bietet zudem Kosteneinsparungen durch den reduzierten Verbrauch von Isofluran und die Nutzung von Raumluft anstelle von Komprimiertes Gas. In der vorliegenden Studie erreichten 2% Isofluran, das durch einen integrierten digitalen Verdampfer bei 150 ml/min geliefert wird, zusammen mit einer rückkopplungsgesteuerten thermischen Unterstützung eine stabile Anästhesieebene und eine angemessene Aufrechterhaltung der Körperkerntemperatur. In Diesem Einklang haben veröffentlichte Vergleiche von digitalen integrierten Verdampfern und traditionellen Verdampfern auch zu dem Schluss gekommen, dass der digitale integrierte Verdampfer eine stabile Anästhesieebene und eine gute Erhaltung der Körperkerntemperatur, Herzfrequenz, Atemfrequenz, und Erholung bei der Verwendung von weniger Isoflurane 15,16.
Ein nichtsteroidales entzündungshemmendes Medikament (NSAID) wie Carprofen kann präoperativ als zusätzliches Analgetikum verabreicht werden. Im Laufe von wenigen Stunden hemmen NSAIDs entzündliche Zytokintranskription und interstitielle Ödeme; Mehrtägige Verabreichung dämmen schwere neuroinflammatorische Erkrankungen einschließlich experimentelle rantile Enzephalomyelitis, ein Tiermodell der Multiplen Sklerose17,18. Insbesondere bei der Untersuchung neuroinflammatorischer Erkrankungen müssen die positiven Wirkungen der Karprofenanalgesie bei der Bestimmung von Analgesie und Anästhesie für ein Experiment in enger Abstimmung mit entsprechenden Regulierungsgremien.
Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass sie nicht ohne weiteres für wiederholte Bildgebungssitzungen über mehrere Tage hinweg möglich ist. Der Hauptgrund ist, dass die Backplate-Struktur zu groß ist, um die Haut zu schließen. Daher besteht die Gefahr, dass eine Maus die Rückwand nach dem Aufwachen aus der Anästhesie vertreibt. Wenn eine wiederholte Bildgebung unerlässlich ist, gibt es mehrere Strategien, die eingesetzt werden könnten, einschließlich der Reduzierung der Größe der Rückwand oder des Änderns der Halterung. Wie bei jedem chirurgischen Eingriff gibt es eine Lernkurve für bediener. Eine enge Abstimmung mit den institutionellen Tierpflegeämtern und Fachkollegien ist erforderlich.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
S.E. Lutz wird vom National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, unter dem Grant KL2TR002002 und den Start-up-Fonds des University of Illinois Chicago College of Medicine unterstützt. Simon Alford wird von RO1 MH084874 unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des NIH dar. Die Autoren danken Dritan Agalliu in der Abteilung für Neurologie am Columbia University Medical Center für die Tg eGFP:Claudin-5 Mäuse, wissenschaftliche Diskussionen und Einblicke in die Entwicklung des chirurgischen Protokolls und bildgebende Anwendungen. Die Autoren danken Sunil P. Gandhi im Department of Neurobiology and Behavior der University of California, Irvine für die Entwicklung des ersten Prototyps des stereotaktischen Apparats und des Tiertemperaturreglers, die Diskussion des operationsischen Protokolls und Ausbildung in der Zwei-Photonen-Mikroskopie. Die Autoren danken auch Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) für die Unterstützung bei der Anpassung des chirurgischen Stereomikroskops und Ron Lipinski (Whale Manufacturing) für die Bearbeitung stereotaktischer Teile.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
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