Summary
इस प्रोटोकॉल intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा दृश्य की सुविधा के लिए एक माउस की रीढ़ की हड्डी पर एक कांच की खिड़की के प्रत्यारोपण का वर्णन करता है.
Abstract
यह प्रोटोकॉल माउस रीढ़ की हड्डी की विवो इमेजिंग में रीढ़ की हड्डी laminectomy और कांच खिड़की प्रत्यारोपण के लिए एक विधि का वर्णन करता है. एक एकीकृत डिजिटल vaporizer isoflurane की एक कम प्रवाह दर पर संज्ञाहरण के एक स्थिर विमान को प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है. एक एकल कशेरुकी रीढ़ हटा दिया जाता है, और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कवर ग्लास एक पतली agarose बिस्तर पर मढ़ा है. एक 3 डी मुद्रित प्लास्टिक backplate तो ऊतक चिपकने वाला और दंत सीमेंट का उपयोग कर आसन्न कशेरुक रीढ़ के लिए चिपका है. एक स्थिरीकरण मंच श्वसन और दिल की धड़कन से गति कलाकृति को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह तेजी से और क्लैम्प मुक्त विधि तीव्र बहु-फोटोन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। प्रतिनिधि डेटा इस तकनीक के एक आवेदन के लिए शामिल किए गए हैं ट्रांसजेनिक चूहों में रीढ़ की हड्डी vascualture के दो-photon माइक्रोस्कोपी eGFP व्यक्त:Claudin-5 - एक तंग जंक्शन प्रोटीन.
Introduction
ट्रांसजेनिक पशु मॉडल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त, जब intravital माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त, जीव विज्ञान और pathophysiology को संबोधित करने के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करते हैं. रीढ़ की हड्डी के लिए इन तकनीकों को लागू करने के लिए, विशेष प्रोटोकॉल इमेजिंग के लिए रीढ़ की हड्डी तैयार करने के लिए आवश्यक हैं। ऐसी ही एक रणनीति एक laminectomy और रीढ़ की हड्डी खिड़की प्रत्यारोपण का संचालन करने के लिए है. माइक्रोस्कोपी के लिए एक आदर्श laminectomy प्रोटोकॉल की प्रमुख विशेषताओं देशी ऊतक संरचना और समारोह के संरक्षण, इमेजिंग क्षेत्र की स्थिरता, जल्दी प्रसंस्करण समय, और परिणामों की reproducibility शामिल हैं. एक विशेष चुनौती श्वसन और दिल की धड़कन से प्रेरित गति के खिलाफ इमेजिंग क्षेत्र को स्थिर करने के लिए है। इनलक्ष्योंको प्राप्त करने के लिए अनेक पूर्व विवो और विवो रणनीतियों की सूचना दी गई है. विवो विधियों में अधिकांश रीढ़ की हड्डी के कॉलम2,4 के पक्षों clamping शामिल है और अक्सर एक कठोर धातु उपकरण प्रत्यारोपण द्वारा पीछा किया जाता है3,4 सर्जरी के दौरान स्थिरता के लिए और डाउनस्ट्रीम इमेजिंग अनुप्रयोगों. रीढ़ की हड्डी स्तंभ दबाना संभावित रक्त प्रवाह समझौता कर सकते हैं और रक्त मस्तिष्क बाधा प्रेरित (BBB) प्रोटीन remodeling.
इस विधि का उद्देश्य प्रोटोकॉल के आक्रामकता को कम करते हुए और परिणामों में सुधार करते हुए जीवित माउस में ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए बरकरार रीढ़ की हड्डी उपलब्ध कराना है। हम अभी भी मजबूत यांत्रिक स्थिरता प्राप्त करता है कि एक न्यूनतम इनवेसिव अंडाकार अंडाकार प्लास्टिक 3 डी मुद्रित backplate के साथ रखा एक एकल laminectomy और कवर ग्लास प्रत्यारोपण प्रक्रिया का वर्णन. बैकप्लेट को सीधे दंत सीमेंट के साथ पूर्वकाल और पीछे की कशेरुकी रीढ़ का पालन किया जाता है। बैकप्लेट पेंच छेद के साथ पार्श्व विस्तार हथियारों से सुसज्जित है जो एक धातु हाथ के माध्यम से माइक्रोस्कोप चरण को सख्ती से संलग्न करता है। यह प्रभावी रूप से माइक्रोस्कोप चरण के लिए बरकरार पूर्वकाल और पीछे कशेरुक लंगर, गति कलाकृति है कि अन्यथा श्वसन और दिल की धड़कन द्वारा पेश किया जाएगा करने के लिए यांत्रिक प्रतिरोध प्रदान करते हैं. विधि वक्ष स्तर 12 पर एक कशेरुक के laminectomy के लिए अनुकूलित किया गया है, vivo इमेजिंग में स्थिरता के लिए वैकल्पिक रणनीतियों में उपयोग clamps omitting. प्रक्रिया तेजी से है, माउस प्रति लगभग 30 मिनट ले रही है.
इस प्रोटोकॉल BBB के रोग तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. BBB एक गतिशील microvascular प्रणाली endothelial कोशिकाओं के शामिल है, संवहनी चिकनी मांसपेशियों, pericytes, और astrocyte पैर प्रक्रियाओं है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के लिए एक अत्यधिक चयनात्मक वातावरण प्रदान करते हैं. प्रतिनिधि डेटा ट्रांसजेनिक चूहों में इस प्रोटोकॉल के आवेदन को दर्शाती बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर (eGFP):Claudin-5, एक BBB तंग जंक्शन प्रोटीन. प्रदान की backplate मुद्रण फ़ाइलें भी वैकल्पिक अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
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Protocol
सभी प्रयोगों इलिनोइस विश्वविद्यालय का पालन करें, शिकागो संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति प्रोटोकॉल. यह एक अंत: टर्मिनल प्रक्रिया है।
1. अभिकर्मक तैयारी
- 125 एम एम एन सीएल, 5 एमएम केसीएल, 10 एमएम ग्लूकोज, 10 एमएम हैप्स, 2 एमएम एमजीसीएल2$6एच2ओ, 2 एम एम सी एल 2 जेड एच2ओ डीडीएच2ओ स्टराइल फिल्टर में और व्यक्तिगत-उपयोग एलिकोट में फ्रीज करने के लिए कृत्रिम सेरेब्रल मेरुदांव तरल पदार्थ (एसीएसएफ) तैयार करें। उपयोग करने से पहले 39 डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी के स्नान में गर्म aCSF.
- गर्म कम पिघलने बिंदु agarose (2%) एकसीएसएफ में जब तक पूरी तरह से एक पानी के स्नान में भंग 65 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट. लेमिनेक्टॉमी के दौरान, पिघले हुए अगारोस ऐलिकोट को पानी के स्नान में 39 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें, ताकि यह चरण 5.2 के लिए शारीरिक तापमान के करीब तैयार हो सके।
नोट: agarose समाधान एकल उपयोग alicots में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। - बैक्टीरियोस्टैटिक पानी में बाँझ 50 मिलीग्राम/एमएल कार्प्रोफेन तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- 70% इथेनॉल, डीडीएच2ओ के तीन washes के साथ स्वच्छ कवर चश्मा, और एक धूल मुक्त कंटेनर में सूखी दुकान.
2. बैकप्लेट 3 डी प्रिंटिंग
- 3डी CAD सॉफ़्टवेयर का उपयोग चित्र 1में दर्शाए गए आयामों के लिए एक मॉडल बनाने के लिए किया जाता है। इंटीरियर प्रिंटर के संबंध में नीचे की सतह पर एक दीर्घवृत्त चौड़ा है और विपरीत सतह पर एक लुमेन बनाने के लिए एक छोटे दीर्घवृत्त में एक lofted कटौती के साथ काटा। शिकंजा स्वीकार करने के लिए छेद के साथ दो पेश हथियार बाद में विस्तार, backplate पकड़े कांटा करने के लिए लगाव के लिए. इस 3 डी संरचना से, एक triangulated 3 डी जाल फ़ाइल बनाएँ (. STL फ़ाइल).
नोट: चित्र 1B]u2012D और अनुपूरक फ़ाइलें 1 और 2देखें. - एक 3 डी प्रिंटर के लिए triangulated 3 डी जाल फ़ाइल अपलोड करें।
- एक 0.4 मिमी गर्म अंत नोजल और एक 0.2 मिमी परत ऊंचाई का उपयोग कर backplates प्रिंट. 205 डिग्री सेल्सियस के नोजल तापमान, 45 डिग्री सेल्सियस के बिस्तर के तापमान, और 45 मिमी/s की मुद्रण गति का चयन करें।
- संरचनात्मक अखंडता के लिए परिणामी 3 डी मुद्रित बैकप्लेट्स का आकलन करें (चित्र 1E; सकल संरचनात्मक विफलता (अनिवार्य लुमेन, ढही हुई दीवार) मुद्रण दोष इंगित करती है (चित्र 1 एफ)।
3. सर्जिकल तैयारी
- हीटिंग पैड को पहले से गरम करें।
- एक रासायनिक धूआं हुड में काम करते समय प्रसव सिरिंज में लोड isoflurane. डिलीवरी सिरिंज को इसोफ्लुरेन यूनिट में संलग्न करें।
- एक 8-u201212-सप्ताह पुराने माउस का चयन करें। जानवर का वजन करें। एक प्रेरण कक्ष में 2% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करसंज्ञाकोज को प्रेरित करें। 5 मिलीग्राम/किग्रा पर कार्प्रोफेन इंजेक्शन।
- संज्ञाहरण के एक शल्य विमान के रखरखाव के लिए 150 एमएल/मिनट की प्रवाह दर के साथ 2% पर नाक-कोन की स्थिति और वितरित करें(चित्र 2Aज़ु2012ई)। सफाई की आसानी के लिए एक डिस्पोजेबल शोषक पैड के साथ हीटिंग पैड लपेटें।
- सर्जिकल स्टेशन पर हीटिंग पैड पर एक जानवर की स्थिति और नाक शंकु स्थापित करें। थर्मामीटर को पेट्रोलियम जेली के साथ चिकना करें और इसे मलाशय में 5 मिमी डालें। स्थिरता के लिए पूंछ के लिए थर्मामीटर जांच टेप. माउस की आंखों में नेत्र मलम लागू करें।
- जलयोजन बनाए रखने के लिए, प्रयोग की समाप्ति तक हर 30 मिनट में उपत्वचा इंजेक्शन द्वारा स्तनपान कराने वाली रिंगर के समाधान के 200 $L लागू करें।
- 70% इथेनॉल के साथ डोर्सम स्प्रे, क्लिपर के साथ फर को दूर करने, और povidone-आयोडीन के साथ साइट को साफ.
4. लेमिनेक्टॉमी
- कान सलाखों के बीच जानवर की स्थिति; ये नाक-कोन के संबंध में माउस की सिर की स्थिति को बनाए रखते हैं।
- पुष्टि करें कि पशु गहराई से interdigital चुटकी पलटा और स्थिर श्वसन पैटर्न की कमी से मूल्यांकन के रूप में anesthetized है.
- #11 ब्लेड का उपयोग करते हुए निचले वक्ष/ऊपरी कटि क्षेत्र पर मिडलाइन पर 1.5 सेमी रोस्ट्रिक-कैडल चीरा बनाएं (चित्र 2)। यह कुंद दांतों वाले संदंश और / या दस्ताने उंगलियों के साथ पकड़ द्वारा त्वचा को अलग. त्वचा के नीचे किसी भी शेष पारदर्शी संयोजी ऊतक को अलग और वापस छील करने के लिए संदंश का उपयोग करें। सतही पेशी अब उजागर किया जाना चाहिए; एक फोम सर्जिकल भाला के साथ इस विस्थापित.
- लक्ष्य कशेरुक (थोरेसिक 12) के शेष, गहरी पेशी को दूर करने के लिए फोम सर्जिकल भाले (या एक क्यूरेट) का उपयोग करें। बैकप्लेट के लिए एक सीट बनाने के लिए, वक्ष 11 के पीछे के पहलू से मांसपेशियों को दूर करने और वक्ष 13 के पूर्ववर्ती पहलू को भी दूर करें। एक शल्य भाले के साथ कोमल दबाव लागू करने से किसी भी खून बह रहा नियंत्रण या एक cautery बंदूक के साथ एक न्यूनतम नाड़ी का उपयोग करें। संदंश का उपयोग कर tendons से दूर शेष मांसपेशियों को दूर करने के लिए जारी रखें
- एक बार मांसपेशियों को हटा दिया जाता है, ध्यान से संदंश के साथ काटने से tendons अलग. इस कदम के पूरा होने पर कॉर्ड को विज़ुअलाइज़ करने और जोड़-तोड़ करने के लिए बहुत जगह होनी चाहिए। जाँच करें कि अंतर-कशेरुक अंतरिक्ष के ड्यूरा पदार्थ, अर्द्ध पारदर्शी पटलीय हड्डी, हड्डी के नीचे केंद्रीय सतही रक्त वाहिका, और पूर्वकाल विकिरण धमनी अब स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं।
- गर्म aCSF के साथ क्षेत्र गीला. रीढ़ की हड्डी के लंबे अक्ष के समानांतर सीधे स्ट्रोक का उपयोग करके लैमिनर हड्डी को बार-बार पतला करने के लिए माइक्रोड्रिल का प्रयोग करें (चित्र 2, चित्र 3)। यदि वांछित, बढ़ाया ergonomic आराम के लिए शल्य मंच बारी बारी से करने के लिए एक ग्लाइडिंग चरण का उपयोग (उदाहरण के लिए, एक दाएँ हाथ ऑपरेटर ड्रिलिंग कदम के लिए शल्य मंच counterclockwise बारी बारी से कर सकते हैं).
नोट: इस्तेमाल ग्लाइडिंग चरण एक ऊपरी एल्यूमीनियम प्लेट का निर्माण किया है कि स्लाइड $ 15 मिमी निश्चित आधार प्लेट के संबंध में. - संदंश के साथ सतही स्पिनप्रक्रिया को धीरे से समझें और कशेरुक को उठाएं; हड्डी आसानी से दूर उठा चाहिए. यदि प्रतिरोध है, ड्रिल के साथ हड्डी thinning दोहराने और यदि आवश्यक हो तो आईरिस कैंची कैंची का उपयोग करें, ऊतक को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए ऊपर की ओर कैंची युक्तियाँ उद्देश्य के लिए सावधान किया जा रहा है।
नोट: ड्यूरा को बरकरार रखने के लिए, हड्डी पर टग न करना आवश्यक है। - किसी भी हड्डी shards दूर साफ करने के लिए #4 बल का प्रयोग करें. किसी भी खून बह रहा है को नियंत्रित करने के लिए कोमल स्थिर दबाव लागू करने के लिए एक शल्य भाले का प्रयोग करें। गर्म एसी एस एफ के साथ ऊतक कुल्ला. ऊतक को सूखने की अनुमति न दें।
5. कवर ग्लास प्रत्यारोपण
- धीरे से उजागर कॉर्ड के लिए एक 3 मिमी borosilicate कवर ग्लास लागू होते हैं.
- सुनिश्चित करें कि agarose 39 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा किया जाता है। एक छोटे से स्पैचुला का उपयोग करके, कवर ग्लास के किनारे पर गर्म 2% agarose/aCSF लागू करें और केशिका कार्रवाई की अनुमति के लिए यह सतह के नीचे आकर्षित करने के लिए।
नोट: 39 डिग्री सेल्सियस से नीचे के तापमान पर, agarose जेल के लिए शुरू कर सकते हैं। यदि ऐसा होता है, एक पानी स्नान या माइक्रोवेव का उपयोग rewarm. कुछ ऑपरेटरों को पहले agarose की एक बूंद लागू करते हैं और शीर्ष पर कवर ग्लास रखना पसंद करते हैं. - वक्ष स्तर 11 कशेरुक रीढ़ और वक्ष स्तर 13 कशेरुक रीढ़ की हड्डी में बरकरार आसन्न कशेरुक के उजागर बोनी आर्टिकुलर प्रक्रियाओं के लिए ऊतक चिपकने वाला लागू करें। आसन्न कण्डरा और अनुप्रस्थ प्रक्रिया पर, laminectomy साइट के आसपास एक अंगूठी में अतिरिक्त ऊतक चिपकने वाला लागू करें।
नोट: बाद के चरणों में दंत सीमेंट के उचित पालन के लिए ऊतक चिपकने वाला आवश्यक है। संधि प्रक्रम एक प्राकृतिक सीट है जिस पर बैकप्लेट को स्पष्ट रूप से विश्राम दिया जासकताहै ( चित्र 3 ) । संधि प्रक्रियाओं के लिए आसंजन लगाव के सबसे मजबूत अंक के रूप में होगा। - एक चीनी मिट्टी के बरतन मिश्रण ट्रे में accelerant के साथ दंत सीमेंट मिक्स. ऊतक चिपकने वाली परत पर दंत सीमेंट हस्तांतरण करने के लिए एक छोटे से spatula का उपयोग करें। सर्जिकल क्षेत्र के लिए backplate का पालन करने के लिए दंत सीमेंट का प्रयोग करें, खिड़की पर केंद्रित. दंत सीमेंट के इलाज के लिए 10 मिनट की अनुमति दें.
नोट: पूर्वकाल और पीछे की संधि प्रक्रियाओं के लिए बैकप्लेट की फर्म आसंजन प्रत्यारोपण के मौलिक संरचनात्मक स्थिरता प्रदान करता है। - बैकप्लेट के आंतरिक आधार को भरने के लिए अतिरिक्त दंत सीमेंट का उपयोग करें, और बैकप्लेट के नीचे: ऊतक इंटरफ़ेस।
नोट: दंत सीमेंट के अतिरिक्त आवेदन पालन में सुधार और बैकप्लेट के नीचे माइक्रोस्कोप उद्देश्य विसर्जन तरल पदार्थ (सेलिन) के रिसाव के जोखिम को कम कर देता है। - खिड़की पर उचित स्थिति के लिए कांटेदार बैकप्लेट धारक अग्रिम। शिकंजा के साथ backplate धारक में backplate सुरक्षित.
नोट: इस प्रोटोकॉल एक कस्टम machined backplate धारक का उपयोग किया (चित्र 2Gu2012एच). - रिसाव के लिए परीक्षण करने के लिए बैकप्लेट पर नमकीन लागू करें। यदि कोई तरल पदार्थ लीक होता है, तो क्षेत्र को सुखालें और अधिक दंत सीमेंट लागू करें।
6. इमेजिंग तैयारी
- ऑप्टिकल टेबल के लिए शल्य मंच पर पशु स्थानांतरण।
नोट: हमारे सर्जिकल मंच, बैकप्लेट धारक, और आइसोलुरेन नाक-कोन धारक को शल्य चिकित्सा और दो-फोटोन इमेजिंग स्टेशनों के बीच एक इकाई के रूप में ले जाया जा सकता है, जबकि सतत आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण लागू करना(चित्र 2 डी,एच)। इसी प्रकार की इकाइयों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्य कांटे, बीम, और सहायक स्तंभ पदों को धारण करने से इकट्ठा किया जा सकता है ( उदाहरण केलिए. ThorLabs). इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी के लिए, सर्जिकल प्लेटफॉर्म की ऊंचाई को समायोजित करने के लिए माइक्रोस्कोप उद्देश्य और ऑप्टिकल टेबल के बीच कम से कम 11 इंच की निकासी होनी चाहिए। - ऑप्टिकल टेबल के लिए सर्जिकल मंच Affix एक स्टेनलेस स्टील बढ़ते पोस्ट और counterbored clamping कांटा का उपयोग कर.
- बैकप्लेट के कुएं में ताजा नमकीन लगाएं। कुएं में पानी के विसर्जन के लेंस को कम करें।
- ब्याज और ध्यान के क्षेत्र की पहचान करने के लिए प्रेषित या एपिफ्लोरेसेंस प्रकाश का उपयोग करें। लेजर स्कैनिंग मोड में स्विच और ऊतक6में मौजूद फ्लोरोफोर्स के लिए उपयुक्त दो-फोटोन लेजर उत्तेजना तरंगदैर्ध्य, dichroics और bandpass फिल्टर के अनुसार विवो इमेजिंग में प्रदर्शन करते हैं।
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Representative Results
लगाए गए कांच की खिड़कियां और इंट्राविटल दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी सीएनएस प्रोटीन में गतिशील परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है। BBB के कार्यात्मक अखंडता अभिव्यक्ति से प्रभावित है, subcellular स्थानीयकरण, और तंग जंक्शन प्रोटीन7के कारोबार की दर . पिछले अध्ययनों से पता चला है कि तंग जंक्शन प्रोटीन स्थिर राज्य8पर तेजी से और गतिशील remodeling से गुजरना . वर्तमान में वर्णित laminectomy और कांच खिड़की की तैयारी ट्रांसजेनिक eGFP में इस्तेमाल किया गया है:Claudin-5 चूहों9, जो फ्लोरोसेंट तंग जंक्शन प्रोटीन सहन, प्रयोगात्मक autoimmune में BBB तंग जंक्शन remodeling का आकलन करने के लिए मल्टिपल स्क्लेरोसिस10का एन्सेफेलोमाइलाइटिस (ईई) मॉडल | प्रतिनिधि डेटा में, eGFP की इमेजिंग:Claudin-5 920 एनएम उत्तेजना के साथ एक दो-फोटोमाइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया गया था, एक 40 डिग्री अवरक्त उद्देश्य (0.8 एनए), और एक हरे रंग की फ्लोरोसेंट उत्सर्जन फिल्टर (चित्र 4). ऑप्टिकल स्टैक dural सतह के नीचे 100 डिग्री करने के लिए 2 डिग्री मीटर अक्षीय चरणों पर नमूना थे। डेटा एक संवहनी जाल भर में फ्लोरोसेंट लेबल जंक्शनों के दृश्य को दर्शाती है. एकल ऑप्टिकल स्लाइस और जेड-प्रक्षेप छवियों को शामिल किया गया है (चित्र 4)। जेड-प्रक्षेप (चित्र 4ख) में तंग जंक्शन संरचनाओं का स्पष्ट चित्रण इंगित करता है कि कम से कम एक्स-वाई छवि विस्थापन सफल लेमिनेक्टॉमी, विंडो प्लेसमेंट, और बैकप्लेट इम्प्लांटेशन के बाद उत्पन्न होता है।
चित्र 1. कस्टम मुद्रित बैकप्लेट स्थिरीकरण डिवाइस। क) ओर्थोगोनल बैकप्लेट विचार। बी-डी) बैकप्लेट के पृष्ठीय और अधर सतहों के triangulated जाल मॉडल। ई) सही ढंग से मुद्रित बैकप्लेट. एफ) गलत ढंग से मुद्रित बैकप्लेट. अनुपूरक फ़ाइलें 1 और 2देखें . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2. लेमिनेक्टॉमी के लिए सर्जिकल कदम। ए) Isoflurane संज्ञाहरण संज्ञाहरण वितरण प्रणाली सहित एक एकीकृत डिजिटल vaporizer का उपयोग (i) संज्ञाहरण को नियंत्रित करने के लिए एक टच स्क्रीन प्रदर्शन, (ii) नियंत्रण नंबर डायल करता है, (iii) वैकल्पिक ऐड-ऑन शरीर क्रिया विज्ञान मॉड्यूल के लिए आदानों, (iv) संज्ञाहरण एकाग्रता समायोजन घुंडी, (v) सिरिंज पंप ढकेलनेवाला ब्लॉक, (vi) isoflurane के साथ सिरिंज, (vii) एकीकृत डिजिटल vaporizer, (viii) प्रेरणा टयूबिंग, (ix) प्रेरण कक्ष के लिए प्रेरणा टयूबिंग, (x) प्रेरण कक्ष, (xi) नाक-कोन के लिए प्रेरणा टयूबिंग, (xii) नाक-कोन के लिए समाप्ति ट्यूबिंग, (xiii) प्रेरण कक्ष के लिए समाप्ति ट्यूबिंग. ख) लेमिनेक्टॉमी में प्रयुक्त उपकरणों में (i) प्रतिक्रिया नियंत्रित तापन इकाई, (ii) के-युग्मित मलाशय थर्मामीटर जांच, (पपप) लचीली सिलिकॉन हीटिंग पैड, (iv) #11 ब्लेड, (vi) #5 संद, (vi) दांतेदार टाइटनियम संदंश, (vii) टाइटेन आईरिस कैंची, (viii) हड्डी microdrill, (ix) cautery बंदूक, (x) 3 डी मुद्रित बैकप्लेट, (xi) शोषक फोम सर्जिकल भाले, (xii) एक्रिलिक रेजिन के लिए सिरेमिक मिश्रण ट्रे, (xiii) एक्रिलिक रेजिन और accelerant, (xiii) ऊतक चिपकने वाला, (xiv) नेत्र स्नेहक, (xiv) मिमी कवर ग्लास. सी) स्टीरियोमाइक्रोस्कोप और शल्य चिकित्सा मंच। सर्जरी के दौरान, सर्जिकल मंच एक ग्लाइडिंग चरण (माइक्रोस्कोप चरण पर चांदी और काले दौर आधार) पर बैठता है। डी) गर्म बिस्तर के साथ कस्टम सर्जिकल मंच पर स्थित माउस, सतही midline चीरा के बाद. छोटे और बड़े चूहों को समायोजित करने के लिए वाई- और जेड-एक्समेंस में सिसोफ्लुरेन नोज़कोन धारक समायोज्य है। कान की सलाखों नाक कोन के संबंध में सिर को स्थिर. गुदा तापप्रोब कोर तापमान को मापता है। ई) मांसपेशियों को हटाने के कदम पर सर्जिकल क्षेत्र. एफ) मांसपेशियों को हटाने के बाद सर्जिकल क्षेत्र. जी) कशेरुकी हड्डी के thinning के दौरान सर्जिकल क्षेत्र. ज) कशेरुकी हड्डी को हटाने के बाद सर्जिकल क्षेत्र. I) कवरग्लास की नियुक्ति के दौरान सर्जिकल क्षेत्र। जम्मू) कवरग्लास की नियुक्ति के बाद सर्जिकल क्षेत्र। कश्मीर) एक्रिलिक के साथ प्रारंभिक कोटिंग के दौरान सर्जिकल क्षेत्र. L) बैकप्लेट implanation के पूरा होने के बाद सर्जिकल क्षेत्र. एम-एन) पूरा laminectomy के बाद शल्य चिकित्सा स्टेशन में तैनात माउस. पीतल कांटा एक्स में समायोज्य है-, वाई,, और रीढ़ की हड्डी laminectomy साइट पर स्थिति के लिए जेड-अक्ष. कांटा यंत्रवत् शल्य मंच के लिए लंगर डाले है दो-फोटोन intravital माइक्रोस्कोपी सहित सर्जरी और बहाव अनुप्रयोगों के दौरान इमेजिंग क्षेत्र के इष्टतम स्थिरीकरण प्रदान करने के लिए। सर्जरी के दौरान, सर्जिकल प्लेटफॉर्म एक ग्लाइडिंग चरण पर रखा जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3. रीढ़ की हड्डी की खिड़की के एक परमाणु प्रतिस्थापन के योजनाबद्ध चित्रण. क) एक कम वक्ष कशेरुकी शरीर, spinous प्रक्रिया, और रीढ़ की हड्डी (एससी) खंड के बेहतर दृश्य का योजनाबद्ध चित्रण. एक डॉटेड सर्कल आर्टिकुलर प्रक्रिया की सीट को दर्शाता है, बैकप्लेट आसंजन के लिए मुख्य समर्थन बिंदु। बी) रीढ़ की हड्डी की खिड़की के बेहतर दृश्य का योजनाबद्ध चित्रण. लक्ष्य कशेरुकी रीढ़ (यहाँ, T12) हटा दिया गया है. ऐग्रोस की एक पतली परत रीढ़ की हड्डी को ओवरले देती है। एक आवरण का चश्मा अगारोस के शीर्ष पर टिका हुआ है। ऊतक चिपकने वाला अनुप्रस्थ प्रक्रियाओं पर लागू किया जाता है (और, यहाँ नहीं दिखाया, आसन्न, बरकरार कशेरुक रीढ़ की धमनी प्रक्रिया पर).। दंत सीमेंट ऊतक चिपकने वाला ओवरले. बैकप्लेट ऊतक सीमेंट का पालन करता है, अनुप्रस्थ प्रक्रियाओं (दिखाया गया) और आसन्न, बरकरार कशेरुक रीढ़ (इस पैनल में नहीं दिखाया गया) की संधि प्रक्रिया पर आराम करता है। दंत सीमेंट की एक अतिरिक्त पतली परत backplate रिम के इंटीरियर पर लागू किया जाता है. बैकप्लेट को कवर-ग्लास की कल्पना करने के लिए एक कटवे दृश्य में दर्शाया गया है। सी) रीढ़ की हड्डी की खिड़की के पार्श्व दृश्य का योजनाबद्ध चित्रण. लक्ष्य कशेरुकी रीढ़ (यहाँ, T12) हटा दिया गया है. ऐग्रोस की एक पतली परत रीढ़ की हड्डी को ओवरले देती है। एक कवर ग्लास agarose के शीर्ष पर टिकी हुई है। ऊतक चिपकने वाला आसन्न, बरकरार T11 और T13 कशेरुक रीढ़ की धमनी प्रक्रिया पर लागू किया जाता है। दंत सीमेंट ऊतक चिपकने वाला ओवरले. बैकप्लेट ऊतक सीमेंट का पालन करता है, अनुप्रस्थ प्रक्रियाओं और आसन्न, बरकरार कशेरुक रीढ़ (दिखाया गया) की संधि प्रक्रिया पर आराम करता है। बैकप्लेट को कटवे दृश्य में दर्शाया गया है; एक सच्चे पार्श्व दृश्य में agarose और कवर ग्लास backplate के पार्श्व दीवार से अस्पष्ट हो जाएगा. परमाणु संरचनाओं हैरिसन और उनके सहयोगियों द्वारा आयोजित C57Bl/6 रीढ़ की हड्डी स्तंभ के विस्तृत चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग पर आधारित हैं 11. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4. तंग जंक्शन microstructure eGFP द्वारा कल्पना:Claudin-5 माउस रीढ़ की हड्डी में intravital दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी द्वारा. ए) एकल ऑप्टिकल अनुभाग एक स्वस्थ eGFP में dural सतह के नीचे 30 डिग्री मीटर पर लिया:Claudin-5 माउस. लाल तीर एक eGFP दर्शाया गया है:Claudin-5 तंग जंक्शन खंड अनुदैर्घ्य तंग जंक्शन अक्ष के सीधा विस्तार. स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है 5 m. इनसेट: स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है 10 [m. B) - संवहनी नेटवर्क का प्रक्षेपण स्वस्थ माउस रीढ़ की हड्डी की dural सतह के नीचे 100 m का विस्तार. ऑप्टिकल स्टैक 2 मीटर अक्षीय कदम आकार में नमूना था और पैनल ए से टुकड़ा भी शामिल है. कोई छवि संरेखण नहीं किया गया है. $ प्रक्षेपण में जंक्शनसंरचनाओं के तीव्र चित्रण लगातार फ्रेम के बीच न्यूनतम छवि विस्थापन को दर्शाता है। सी) ऑप्टिकल स्लाइस के प्रतिनिधि सबसेट परिणामी जेड-स्टैक से 10 डिग्री मीटर के अंतराल पर लिया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक फ़ाइल 1. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
पूरक फ़ाइल 2. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
विधि यहाँ वर्णित एक गिलास खिड़की के माध्यम से चूहों में रीढ़ की हड्डी के स्थिर इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. इस विधि transgenic eGFP में BBB remodeling का आकलन करने के लिए लागू किया गया है:Claudin5 +/- चूहों कि एक फ्लोरोसेंट BBB तंग जंक्शन प्रोटीन व्यक्त, लेकिन यह समान रूप से अच्छी तरह से किसी भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन या रीढ़ की हड्डी में कोशिकाओं के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है.
laminectomy और रीढ़ की हड्डी स्थिरीकरण के लिए कई तरीकों को विकसित किया गया है. सभी प्रोटोकॉल ब्याज की संरचना के लिए दृश्य का उपयोग करने के लिए इमेजिंग और खिड़की के कार्यान्वयन के दौरान रीढ़ की हड्डी को स्थिर पता. कशेरुक की संख्या को हटा दिया और उपलब्ध प्रोटोकॉल के आक्रामकता की डिग्री भिन्न(जैसे, सतही हड्डी की सतह पर चिपके घटकों, वर्तमान प्रोटोकॉल में के रूप में, बनाम अधिक गहराई से एम्बेडेड). Davalos और Akassoglou2 रीढ़ की हड्डी को स्थिर करने के क्रम में रीढ़ की हड्डी को स्थिर करने के क्रम में रीढ़ की हड्डी के प्रत्येक पक्ष पर हटाने योग्य clamps और माउस की पूंछ के आधार पर एक दबाना का उपयोग कर एक laminectomy विधि विकसित की है। पशु को निलंबित करने के लिए इस अभिनव रणनीति शल्य मेज के खिलाफ विस्तार फेफड़ों के आंदोलन की वजह से वक्ष विस्थापन के कुछ राहत मिली. एक पानी विसर्जन सूक्ष्म लेंस के लिए विसर्जन तरल पदार्थ युक्त के लिए एक अच्छी तरह से बनाने के लिए, जिलेटिन सील का एक रिम(उदाहरण के लिए Gelseal) रीढ़ की हड्डी के आसपास बनाया गया था और aCSF से भरा. सील रिम इमेजिंग के दौरान बाधित किया जा सकता है, लेकिन यह भी आसानी से घाव बंद करने और बाद में reimaging सक्षम करने के लिए सत्र के अंत में दूर नष्ट किया जा सकता है. इस विधि को व्यापक रूप से अपनाया गया है12,13. अन्य समूहों वैकल्पिक स्थिरीकरण विधियाँ विकसित की है। Fenrich एट अल. रीढ़ की हड्डी स्तंभ को सुरक्षित करने के लिए एक तरह के रूप में 4 हाथ से तैयार संशोधित कागज क्लिप। इन संशोधित कागज क्लिप cyanoacrylate गोंद के साथ पार्श्व कशेरुक pedicles में सुरक्षित थे और स्थायी रूप से एक हटाने योग्य बाहरी क्लिप और उत्कृष्ट गति स्थिरता के लिए बाहरी पकड़े कांटा के लिए प्रत्यारोपित संभालती के रूप में बनाए रखा. कपीडो और उनके सहयोगियों ने उपर्युक्त विधियों पर भिन्नता प्रस्तुत की है , जिसमें गर्भनाल2,4,12पर अधिमित अगारोस को शामिल किया गया है . Farrar और Schaffer3 एक चतुर्भुज धातु स्टेबलाइजर है कि तीन कशेरुकी पर एक गिलास खिड़की के कार्यान्वयन के बजाय केवल एक के लिए अनुमति दे सकता है विकसित की है. इस विधि भी संभावित गति को कम करने के लिए इमेजिंग के दौरान एक बड़ा पुल स्टेबलाइजर के लिए शिकंजा के साथ संलग्न करने के लिए रीढ़ की हड्डी की अनुमति दी. एक miniaturized एक photon माइक्रोस्कोप सीधे laminectomy इमेजिंग कक्ष पर प्रत्यारोपित भी एक-फोटोन स्तर पर स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में vivo रिकॉर्डिंग के लिए विकसित किया गया है, लेकिन अभी तक आसानी से सबसे प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध नहीं है13 . एक अलग दृष्टिकोण में, Weinger एट अल. 1 एक पूरी रीढ़ की हड्डी विच्छेदन और यह पूर्व vivo इमेजिंग के लिए agarose में एम्बेडेड है, जो नायाब गति स्थिरता और अधर रीढ़ की हड्डी के लिए उपयोग के लिए अनुमति देता है, लेकिन रक्त के प्रवाह को समाप्त. इन घटनाओं की कुछ सीमाओं में लंबा शल्य चिकित्सा समय4, जिलेटिन सील रिम2के संभावित विघटन , रीढ़ की हड्डी4के वांछित क्षेत्र को फिट करने के लिए कवर ग्लास आयामों को अनुकूलित करने की आवश्यकता शामिल है, मैनुअल कागज क्लिपकेसंशोधन 4,12, अपेक्षाकृत आक्रामक शल्य चिकित्सा तकनीक12,14, और हवा बुलबुले बनाने जब सिलिकॉन elastomer3,4का उपयोग कर .
हम एक वैकल्पिक तरीका है कि कई फायदे प्रदान करता है विकसित किया है. इस प्रोटोकॉल सर्जरी के दौरान बिताए समय की मात्रा को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया है. जबकि कुछ सर्जिकल प्रोटोकॉल को एक घंटे और आधेसे 4 घंटे 3 तक लंबे समय तक प्रक्रिया समय की आवश्यकता होतीहै; एक बार महारत हासिल करने के बाद, इस लेमिनेक्टॉमी विधि लगभग 30 मिनट में किया जा सकता है। सर्जरी में बिताए गए समय को कम करने से माउस के लिए शारीरिक तनाव कम हो सकता है, और उच्च-थ्रूपुट प्रयोग की सुविधा हो सकती है। यह प्रोटोकॉल एक कशेरुक को हटा देता है , और स्थिरीकरण उपकरण के सतही आसंजन को शामिल करता है जो इसे कुछ तुलनीय प्रोटोकॉल4,5,12,14की तुलना में कम आक्रामक बना देता है . अंजीरी आदिकी विधि की तरह , एक प्लास्टिक प्रत्यारोपण का उपयोग करके इस प्रोटोकॉल ध्वनिक इमेजिंग 5 के साथ संगतता प्रदान करताहै.
प्रकाश प्रकीर्णन से बचने के लिए (इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी के दौरान) जो हवा, पानी, और ऊतक के अपवर्तक सूचकांकों के बीच अंतर के कारण हो सकता है, अधिकांश प्रोटोकॉल उजागर रीढ़ की हड्डी पर ऑप्टिकली पारदर्शी सब्सट्रेट ओवरले। सामान्य सब्स्ट्ररेट्स में उच्च शुद्धता , कम पिघलने वाला तापमान10,12 या सिलिकॉन पॉलिमर3,4,5शामिल हैं . Agarose कम से कम बुलबुला गठन के साथ, उपयोग में आसानी का लाभ प्रदान करता है, और तीव्र इमेजिंग सत्र के लिए उपयुक्त है। गर्मी क्षति से ऊतक की रक्षा करने के लिए, यह पिघलने बिंदु से परे agarose गर्मी करने के लिए सुविधाजनक है और फिर यह laminectomy के दौरान एक पानी के स्नान में $ 39 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं, तो यह उजागर रीढ़ की हड्डी के लिए आवेदन के लिए उपयुक्त समय पर तैयार किया जा सकता है। पुरानी इमेजिंग के लिए, सिलिकॉन पॉलिमर निर्जलीकरण के लिए अधिक प्रतिरोधी हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल के विकास के दौरान पायलट परीक्षण या तो agarose परत या overlying कवर ग्लास छोड़ दिया, और पाया कि परिणामी प्रकाश तितर बितर इमेजिंग की उपलब्ध गहराई कम.
इस प्रोटोकॉल की एक अलग विशेषता एक 3 डी मुद्रित backplate और सहायक backplate कांटा धारक का समावेश है. laminectomy और खिड़की प्रत्यारोपण के बाद, तैयारी एक 3 डी मुद्रित अंडाकार backplate कि दंत सीमेंट के साथ जगह में तय हो गई है के अलावा द्वारा स्थिर है. backplate दो कार्यों में कार्य करता है: पहले, यह संरचनात्मक समर्थन और रीढ़ की हड्डी के स्थिरीकरण प्रदान करता है, और दूसरा, यह माइक्रोस्कोपी के लिए विसर्जन उद्देश्यों के लिए तरल पदार्थ धारण करने के लिए एक होंठ बनाता है. इस सेटअप के प्रोटोटाइप में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्तंभ पदों, एडेप्टर, और होल्डिंग कांटे का इस्तेमाल किया गया; हम हाल ही में कस्टम machined भागों के लिए बंद कर दिया है के रूप में यहाँ चित्रित. या तो मामले में, आवश्यक विशेषता दिल की धड़कन और श्वसन द्वारा प्रेरित अंतरिक्ष और समय में क्षोभ के खिलाफ इमेजिंग क्षेत्र को स्थिर करने के लिए संरचनात्मक कठोरता प्रदान करना है। हालांकि जानवर के शरीर हीटिंग पैड पर ढीला आराम कर रहा है, रीढ़ की हड्डी और उसके इमेजिंग क्षेत्र थोड़ा होल्डिंग कांटा है, जो भी श्वसन विस्थापन कम हो जाती है से निलंबित कर रहे हैं. प्लास्टिक सब्सट्रेट प्लेट धारक में पेंच से तनाव को समायोजित करने के लिए थोड़ा लचीलापन प्रदान करता है। मुद्रण के लिए इस्तेमाल किया काले प्लास्टिक रंग फ्लोरोसेंट क्षेत्र में कम से कम प्रकाश को दर्शाता है। इन विधियों के माध्यम से, हम सफलतापूर्वक छवि स्टैक उत्पन्न करते हैं जिनका उपयोग पोस्ट हॉक संरेखण समायोजन के बिना किया जा सकता है. इसके अलावा, 3 डी backplate यहाँ वर्णित उत्पादन करने के लिए सस्ती है, प्रत्येक प्रिंट के लिए सामग्री में केवल pennies लागत, एक बार प्रिंटर खरीदा है. इसके अलावा, 3 डी प्रिंटर की लागत हाल के वर्षों में गिर गया है. 3 डी मुद्रित backplate संरचनात्मक फ़ाइलें (देखें अनुपूरक फ़ाइलें 1 और 2) इस प्रोटोकॉल के साथ प्रकाशित आसानी से व्यक्तिगत प्रयोगशाला की जरूरत को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. हमने वक्ष 12 कशेरुकी रीढ़ की हड्डी को हटाने के द्वारा बनाए गए इंटरकशेरुक ीय स्थान को समायोजित करने के लिए बैकप्लेट के लंबे आयाम को डिजाइन किया है, जो काठ का 2/3 रीढ़ की हड्डी के खंड11को उलट देता है। एक अलग कशेरुक अनुभाग के लिए इस तकनीक को लागू करने के लिए, साथ सीएडी फ़ाइलों को संशोधित किया जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल पारंपरिक निष्क्रिय vaporizer के लिए एक विकल्प के रूप में एक डिजिटल एकीकृत प्रत्यक्ष इंजेक्शन vaporizer तैनात है कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कम प्रवाह संज्ञाहरण प्रणाली का इस्तेमाल करता है. कम प्रवाह इकाई की प्रमुख विशेषता isoflurane, एक पर्याप्त स्वास्थ्य लाभ के लिए कम ऑपरेटर जोखिम है. कम प्रवाह संज्ञाहरण इकाई भी isoflurane की कम खपत और संकुचित गैस के बजाय कमरे हवा के उपयोग के कारण लागत बचत प्रदान करता है. वर्तमान अध्ययन में, प्रतिक्रिया नियंत्रित तापीय सहायता के साथ 150 एमएल/मिनट पर एकीकृत डिजिटल वाष्पित्र द्वारा वितरित 2% आइसोफ्लुरेन ने संज्ञाहरण का एक स्थिर तल और कोर शरीर के तापमान के उचित रखरखाव को प्राप्त किया। इस के अनुरूप, डिजिटल एकीकृत vaporizers और पारंपरिक vaporizers के प्रकाशित तुलना भी निष्कर्ष निकाला है कि डिजिटल एकीकृत vaporizer एक संज्ञाहरण और कोर शरीर के तापमान, दिल की दर का अच्छा संरक्षण के एक स्थिर विमान पैदावार, श्वसन दर, और वसूली जबकि कम isoflurane15,16का उपयोग .
एक गैर-स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवा (NSAID) जैसे कारप्रोफेन को एक अनुपूरक एनाल्जेसिक के रूप में पूर्व-ऑपरेटिव रूप से प्रशासित किया जा सकता है। कुछ घंटों के दौरान, एनएसएआईडी सूजन साइटोकीन ट्रांसक्रिप्शन और इंटरस्टिशियल एडीमा को रोकते हैं; बहु-दिवसीय प्रशासन तंत्रिका-भड़काऊ रोगों की गंभीरता को कम करता है जिसमें प्रयोगात्मक ऑटोम्यून्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस, मल्टीपल स्क्लेरोसिस का एक पशु मॉडल17,18. विशेष रूप से न्यूरो भड़काऊ रोग के अध्ययन में, carprofen analgesia के लाभकारी प्रभाव ध्यान से रोग को संशोधित करने के प्रभाव के खिलाफ तौला जाना चाहिए जब के साथ निकट समन्वय में एक प्रयोग के लिए analgesia और संज्ञाहरण का निर्धारण उपयुक्त नियामक बोर्डों.
इस विधि की एक सीमा यह है कि यह आसानी से कई दिनों में दोहराया इमेजिंग सत्र के लिए सक्षम नहीं है. मुख्य कारण यह है कि backplate संरचना पर त्वचा को बंद करने के लिए बहुत बड़ा है. इसलिए, वहाँ एक जोखिम है कि एक माउस संज्ञाहरण से जागने पर backplate उखाड़ना होगा. यदि दोहराया इमेजिंग आवश्यक था, वहाँ कई रणनीतियों है कि तैनात किया जा सकता है, backplate के आकार को कम करने, या माउंट बदलने सहित. किसी भी शल्य प्रक्रिया के साथ के रूप में, वहाँ ऑपरेटरों के लिए एक सीखने की अवस्था है. संस्थागत पशु देखभाल कार्यालयों और समीक्षा बोर्डों के साथ निकट समन्वय की आवश्यकता है।
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
एस.ई. Lutz अनुदान KL2TR002002 और इलिनोइस शिकागो कॉलेज ऑफ मेडिसिन स्टार्ट-अप फंड के तहत, अनुवाद विज्ञान, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के लिए राष्ट्रीय केंद्र द्वारा समर्थित है। साइमन Alford RO1 MH084874 द्वारा समर्थित है. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी NIH के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है. लेखकों Tg eGFP के लिए कोलंबिया विश्वविद्यालय के चिकित्सा केंद्र में न्यूरोलॉजी विभाग में Dritan Agalliu धन्यवाद:Claudin-5 चूहों, वैज्ञानिक विचार विमर्श, और शल्य प्रोटोकॉल और इमेजिंग अनुप्रयोगों के विकास में अंतर्दृष्टि. लेखकों ने कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में न्यूरोबायोलॉजी और व्यवहार विभाग में सुनील पी. दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी में प्रशिक्षण। लेखकों को भी शल्य स्टीरियोमाइक्रोस्कोप को अनुकूलित करने में सहायता के लिए स्टीव Pickens (डब्ल्यू Nuhsbaum, इंक) धन्यवाद, और रॉन Lipinski (Whale विनिर्माण) stereotactic भागों मशीनिंग के लिए.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
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