Summary
このプロトコルは、マウスの脊髄にガラス窓を移植し、生体内顕微鏡による視覚化を容易にすることを説明する。
Abstract
このプロトコルは、マウス脊髄の生体内イメージングのための脊髄ラミネクトミーおよびガラス窓移植のための方法を説明する。統合されたデジタル気化器はイソロルランの低流量で麻酔の安定した平面を達成するために利用される。単一の脊椎が取り除かれ、市販のカバーガラスが薄いアガロースのベッドの上に重ね合わされる。3Dプリントされたプラスチックバックプレートは、組織接着剤と歯科セメントを使用して隣接する椎体脊椎に貼り付けられます。安定化プラットフォームは、呼吸と心拍からモーションアーティファクトを減らすために使用されます。この急速でクランプフリーの方法は急性多光子蛍光顕微鏡検査に適している。代表的なデータは、eGFPを発現するトランスジェニックマウスにおける脊髄血管系の2光子顕微鏡検査に対して、この技術を適用するために含まれる:Claudin-5 - タイトな接合タンパク質である。
Introduction
蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物モデルは、生体内顕微鏡と組み合わせることで、生物学および病態生理学に対処するための強力なプラットフォームを提供する。これらの技術を脊髄に適用するには、脊髄をイメージング用に準備するために特別なプロトコルが必要です。そのような戦略の1つは、ラミンクトミーと脊髄窓の移植を行う。顕微鏡検査のための理想的なラミネクトミープロトコルの主な特徴は、ネイティブ組織の構造と機能の保存、イメージング分野の安定性、迅速な処理時間、および結果の再現性を含みます。特に課題は、呼吸と心拍によって引き起こされる運動に対してイメージングフィールドを安定させることです。複数のex vivoとインビボ戦略は、これらの目標1、2、3、4、5を達成するために報告されています。生体内の方法のほとんどは、脊柱2、4の側面を締め付け、しばしば手術中の安定性のために堅い金属装置3、4を埋め込むことが続く。ダウンストリームイメージングアプリケーション。脊柱を締め付けると、血流を損なう可能性があり、血液脳関門(BBB)タンパク質リモデリングを誘発する可能性があります。
この方法の目的は、プロトコルの侵襲性を最小限に抑え、結果を改善しながら、生きているマウスの光学イメージングのために無傷の脊髄を利用できるようにすることです。我々は、まだ堅牢な機械的安定性を達成する最小限に侵襲的な楕円形のプラスチック3Dプリントバックプレートと組み合わせた単一のラミネクトミーとカバーガラスの注入手順を説明します。バックプレートは歯科セメントが付いている前部および後脊柱に直接付着する。バックプレートは金属の腕によって顕微鏡の段階に堅く付着するねじ穴が付いている横延長腕が装備されている。これは、無傷の前椎骨と後椎骨を顕微鏡段階に効果的に固定し、呼吸と心拍によって導入される運動アーティファクトに機械的抵抗を提供します。この方法は、胸部レベル12で単一椎骨のラミネクトミーのために最適化されており、生体内イメージング中の安定性のための代替戦略で利用されるクランプを省略する。この手順は、マウスあたり約30分を取って、迅速です。
このプロトコルは、BBBの疾患メカニズムを研究するために使用することができる。BBBは、内皮細胞、血管平滑筋、ペリサイト、および星状の足のプロセスからなる動的な微小血管系であり、中枢神経系(CNS)に高度に選択的な環境を提供します。代表的なデータは、増強された緑色蛍光タンパク質(eGFP):Claudin-5、BBBタイトジャンクションタンパク質を発現するように設計されたトランスジェニックマウスにおけるこのプロトコルの適用を示す。提供されるバックプレート印刷ファイルは、代替用途用にカスタマイズすることもできます。
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Protocol
すべての実験は、イリノイ大学、シカゴ機関動物ケアおよび使用委員会のプロトコルに従います。これは端末の手順です。
1. 試薬の調製
- 人工脳脊髄液(aCSF)を125mM NaCl、5mM KCl、10mMグルコース、10mM HEPES、2mM MgCl 2·6H2 O、2mM CaCl2·2H2O in ddH2O.滅菌フィルターおよび凍結を含む。使用前に水浴中のaCSFを39°Cに温めます。
- 暖かい低融点アガロース (2%)65°Cに設定された水浴に完全に溶解するまでaCSFで。ラミネクトミーの間に、水浴で溶かしたアガロゼアリコートを39°Cに冷却し、ステップ5.2の生理学的温度に近い温度で準備できるようにします。
注:アガロース溶液は、単一使用のアリコートで-20°Cで保存することができます。 - 静菌水中に無菌50mg/mLカルプロフェンを調剤する。4 °Cで保存します。
- 70%のエタノール、ddH2Oの3つの洗浄を備えたきれいなカバーグラス、ほこりのない容器に乾燥保存します。
2. バックプレート3Dプリンティング
- 3D CAD ソフトウェアを使用して、図 1に示す寸法に対してモデルを作成します。内部は、プリンタに対して底面で最も広い楕円であり、反対側の内面に内面を形成する小さな楕円にロフトカットでカットされています。ねじを受け入れる穴を持つ2つの突出アームは、バックプレート保持フォークに取り付けるために、横に伸びています。この 3D 構造から、三角パッチされた 3D メッシュ ファイル (。STL ファイル)。
注:図 1B\u2012Dおよび補足ファイル 1 および 2を参照してください。 - 三角パッチされた 3D メッシュ ファイルを 3D プリンターにアップロードします。
- 0.4 mm のホットエンド ノズルと 0.2 mm の層の高さを使用してバックプレートを印刷します。ノズル温度205°C、ベッド温度45°C、印刷速度45mm/sを選択します。
- 構造の完全性のために結果の3Dプリントバックプレートを視覚的に評価します(図1E)。重大な構造故障(ルーメンが存在せず、壁が崩壊した)は、印刷欠陥を示す(図1F)。
3. 外科的準備
- 加熱パッドを予熱します。
- 化学ヒュームフードで作業中に、送達シリンジに負荷が発生します。配達用注射器をイソファランユニットに取り付けます。
- 8\u201212 週齢のマウスを選択します。動物の体重を量る。誘導室で2%イソファルランを用いて麻酔を誘導する。皮下に5mg/kgでカルプロフェンを注入する。
- 鼻コーンを位置付けし、麻酔の外科面の維持のために150 mL/minの流量で2%でイソファランを提供する(図2A\u2012E)。クリーンアップを容易にするために使い捨て吸収パッドで加熱パッドをラップします。
- 外科ステーションの暖房パッドの上に動物を置き、鼻コーンを取付けます。石油ゼリーで温度計を潤滑し、直腸に5mm挿入します。安定のために温度計のプローブを尾部にテープで留めます。マウスの目に眼科のチントを適用します。
- 水分補給を維持するために、実験終了まで30分ごとに皮下注射により200μLの乳酸リンガー溶液を塗布する。
- 70%のエタノールでドーサムをスプレーし、バリカンで毛皮を取り除き、ポビドネヨウ素でサイトをきれいにします。
4. ラミネクトミー
- 耳の棒の間に動物を配置します。これらは、鼻コーンに対してマウスの頭部位置を維持します。
- 動物がデジタル間のピンチ反射と安定した呼吸パターンの欠如によって評価されたと同じように深く麻酔されていることを確認する。
- #11ブレードを使用して、下部胸部/上部腰部の中間線に1.5cmのrostral-caudal切開を行います(図2)。鈍い歯の鉗子および/または手袋の指でそれをつかむかによって皮を分ける。鉗子を使用して、皮膚の下に残っている透明な結合組織を分離し、剥離します。表面的な筋肉が露出する必要があります。泡の外科槍でこれを置き換える。
- 発泡手術槍(またはキュレット)を使用して、標的椎骨の残りの、より深い筋肉を取り除きます(胸部12)。バックプレート用の座席を作成するには、胸部11の後部態様、および胸部13の前側から筋肉を離れてもクリアする。外科槍で穏やかな圧力を加えることによって出血を制御するか、灼砲で最低の脈拍を使用する。鉗子を使用して腱から離れて残りの筋肉を削除し続ける
- 筋肉を取り除いたら、鉗子で切って腱を慎重に取り外します。この手順が完了したら、コードを視覚化して操作するための十分なスペースが必要です。椎間空間の硬膜問題、半透明の層骨、骨の下の中央表面的な血管、および前々の放射動脈がはっきりと見えるようになりました。
- 暖かいaCSFで地域を濡らします。マイクロドリルを使用して、脊髄の長軸に平行なストレートストロークを使用して層骨を繰り返し薄くします(図2、図3)。必要に応じて、グライディングステージを利用して、人間工学的の快適性を高めるために外科プラットフォームを回転させます(例えば、右利きのオペレータは、掘削ステップのために外科プラットフォームを反時計回りに回転させることができます)。
注:使用される滑空段階は固定された基盤版に対して±15 mmを滑る上のアルミニウム版から組み立てられる。 - 鉗子で表面的な脊椎プロセスをそっとつかみ、椎骨を持ち上げます。骨は容易に持ち上がるべきです。抵抗がある場合は、ドリルで骨の薄化を繰り返し、必要に応じて虹彩はさみを使用し、組織を損傷しないようにハサミ先端を上方に向けるように注意してください。
注:硬膜をそのまま維持するためには、骨を引っ張らないことが不可欠です。 - #4鉗子を使用して、骨の破片を取り除きます。あらゆる出血を制御するために穏やかな安定した圧力を加えるために外科槍を使用しなさい。温かいaCSFで組織をすすいで下す。ティッシュが乾燥しないようにしてください。
5. カバーガラス注入
- 露出したコードに3mmのホウケイ酸塩カバーガラスを優しく塗布します。
- アガロースが39°Cに冷却されていることを確認します。小さなへらを使用して、カバーガラスの端に暖かい2%アガロース/aCSFを適用し、毛細血管アクションが表面の下にそれを描画できるようにします。
注:39°C以下の温度では、アガロースがゲル化し始める場合があります。この場合は、水風呂または電子レンジを使用して再温めます。一部のオペレータは、最初にアガロースの1滴を適用し、上にカバーガラスを置くことを好みます。 - 胸部レベル11椎骨脊椎および胸部レベル13椎脊椎で無傷の隣接椎骨の露出した骨関節プロセスに組織接着剤を適用する。隣接する腱および横断プロセスの上に、ラミネクトミー部位の周りのリングに追加の組織接着剤を適用します。
注:組織接着剤は、その後のステップで歯科セメントの適切な付着のために必要とされます。関節プロセスは、バックプレートが安定して休息できる自然な座席を形成します(図3)。関節プロセスへの接着は、愛着の最も強いポイントを形成します。 - 歯科用セメントと磁器混合トレイに加速器を混ぜます。小さなへらを利用して、歯科用セメントを組織接着層に移します。歯科用セメントを使用して、窓の上に中央にバックプレートを外科分野に付着させます。歯科用セメントが硬化するまで10分かかります。
注:前後関節プロセスへのバックプレートのしっかりした接着は、インプラントの基本的な構造的安定性を提供します。 - バックプレートの内部ベースとバックプレートの下側を埋めるために追加の歯科セメントを使用してください: ティッシュインターフェイス。
注:歯科用セメントの余分な適用は付着性を改善し、顕微鏡客観的浸漬液(生理食べ物)がバックプレートの底部から漏出するリスクを減らす。 - フォークされたバックプレートホルダーをウィンドウ上の適切な位置に進めます。バックプレートをネジでバックプレートホルダーに固定します。
注: このプロトコルは、カスタムマシンのバックプレートホルダー(図2G\u2012H)を使用しました。 - バックプレートに生理生理を塗布し、漏れをテストします。流体が漏れた場合は、その面積を乾燥させ、より多くの歯科用セメントを塗布してください。
6. イメージング製剤
- 外科プラットホームの動物を光学テーブルに移す。
注:私たちの外科プラットフォーム、バックプレートホルダー、およびイソファランノーズコーンホルダーは、連続的なイソファルラン麻酔(図2D、H)を適用しながら、1つのユニットとして外科用および2フォトンイメージングステーション間で輸送することができます。同様のユニットは、フォーク、ビーム、および商業ソースから入手可能な支持柱の支柱を保持から組み立てることができます(トールラボ)。生体内顕微鏡検査では、顕微鏡の目的と光学テーブルの間に少なくとも11インチのクリアランスが必要です。 - ステンレス鋼の土台のポストおよび反退屈した締め金で止めるフォークを使用して光学テーブルに外科プラットホームを接着する。
- バックプレートの井戸に新鮮な生理生理生理を適用します。水浸レンズを井戸に下ろします。
- 透過光またはエピ蛍光光灯を使用して、対象領域と焦点領域を識別します。レーザー走査モードに切り替え、組織6に存在する蛍光体に対する適切な2光子レーザー励起波長、ダイクロイックおよびバンドパスフィルタに従って生体内イメージングを実行する。
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Representative Results
埋め込まれたガラス窓および重要な2光子顕微鏡はCNSタンパク質の動的変化を査定するための有用な用具を提供する。BBBの機能的完全性は、タイトジャンクションタンパク質7の発現、細胞内局在化、および回転率の影響を受ける。以前の研究では、タイトな接点タンパク質が定常状態8で迅速かつ動的なリモデリングを受けることが実証されています。現在記載されているラミネクトミーとガラス窓の調製は、蛍光タイトジャンクションタンパク質を有するTransgenic eGFP:Claudin-5マウス9で使用され、実験的自己免疫におけるBBBタイトジャンクションリモデリングを評価する。多発性硬化症の脳脊髄炎(EAE)モデル10.代表的なデータでは、eGFP:Claudin-5のイメージングは、920nm励起、40×赤外線目的(0.8 NA)、および緑色蛍光発光フィルタ(図4)を用いて2光子顕微鏡で達成した。光学スタックを2μm軸ステップでサンプリングし、硬膜表面の下で100μmにサンプリングした。データは、血管叢全体の蛍光標識接合部の可視化を示す。単一の光学スライスおよびZ投影イメージが含まれている(図4)。Z投影(図4B)におけるタイトな接合構造の明確な線引きは、ラミネクトミー、窓配置、バックプレート注入に成功した後に最小のX-Y画像変位が生成されたことを示しています。
図 1.カスタムプリントバックプレート安定化装置。A)直交バックプレートビュー。B-D)バックプレートの背面および腹部面の三角パッチメッシュモデル。E)正しく印刷されたバックプレート。F)バックプレートが正しく印刷されていない。補足ファイル 1および2を参照してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.ラミネクトミーの外科的ステップ。A) (i) 麻酔を制御するためのタッチスクリーンディスプレイ、(ii)制御ダイヤル、(iii)オプションのアドオン生理学モジュールの入力、(iv)麻酔濃度を含む統合デジタル気化器を利用したイソファラン麻酔送達システム調整ノブ、(v)シリンジポンププッシャーブロック、(vi)イソフラン付きシリンジ、(vii)統合デジタル気化器、(viii)インスピレーションチューブ、(ix)誘導室用インスピレーションチューブ、(x)誘導室、(xi)インスピレーションチューブ(xi)鼻コーン用インスピレーションチューブ鼻コーンのための満了管、(xiii)誘導室のための満了管。B)ラミネクトミーで使用される器具には、(i)フィードバック制御加熱ユニット、(ii)K結合直腸温度計プローブ、(iii)フレキシブルシリコーン加熱パッド、(iv)#11ブレード、(v)#5鉗子、(vi)歯チタン鉗子、(vii)チタンアイリスが含まれます。はさみ、 (viii) 骨マイクロドリル, (ix) 焼灼銃, (x) 3D プリントバックプレート, (xi) 吸収性フォーム外科槍, (xii) アクリル樹脂用セラミック混合トレイ, (xiii) アクリル樹脂および加速度剤, (xiii) 組織接着剤, (xiv) (xiv) 眼科用カバーガラス。C)立体顕微鏡および外科プラットホーム。外科の間に、外科プラットホームは滑空の段階(顕微鏡の段階の銀および黒い円形の基盤)に座る。D)マウスは、表面的な中線切開後、加熱されたベッドを備えたカスタム外科プラットフォーム上に位置する。イゾフランノセコーンホルダーは、小型および大型マウスを収容するためにY軸およびZ軸で調整可能である。イヤーバーはノセコーンに対して頭部を安定させる。直腸熱プローブは、コア温度を測定します。E)筋肉除去のステップで外科場。 F)筋肉の除去後の外科場。G)椎骨の間引き時の外科場。H)椎骨除去後の外科場。I)カバーガラスの配置中の外科場。J)カバーガラスの配置後の外科場。K)アクリルで初期コーティング中の外科場。L)バックプレートの計画の完了後の外科分野。M-N)マウスは、ミネクトミーを完了した後、外科ステーションに配置されます。真鍮のフォークは脊髄の線マインクトミーの部位の上に置くためにX、Y-およびZ軸で調節可能である。フォークは外科プラットホームに機械的に固定され、外科および2光子の生命的顕微鏡を含む下流の適用の間のイメージ投射分野の最適の安定化を提供する。外科の間に、外科プラットホームは滑空段階に取付けられる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.脊髄窓の解剖学的配置の概略図図。A)下胸椎体、脊椎プロセス、脊髄(sc)セグメントの優れたビューの概略図。点線の円は、関節プロセスの座席、バックプレート接着のための主要な支持点を示しています。B)脊髄窓の優れたビューの概略図。標的椎脊椎(ここでは、T12)が除去された。アガロースの薄い層は脊髄を覆う。カバーグラスはアガロースの上に置きます。組織接着剤は、横方向のプロセスに適用される(そして、ここでは示さない、隣接する、無傷の椎体脊椎の露出関節プロセス上に)。歯科セメントはティッシュの接着剤をオーバーレイする。バックプレートは組織セメントに付着し、横方向のプロセス(図示)および隣接する無傷の椎体脊椎の関節プロセス(このパネルには示さない)に付着する。歯科セメントの付加的な薄い層はバックプレートの縁の内部に適用される。バックプレートは、カバーガラスを視覚化するためにカットアウェイビューで描かれています。C)脊髄窓の横視野の概略図。標的椎脊椎(ここでは、T12)が除去された。アガロースの薄い層は脊髄を覆う。カバーガラスはアガロースの上に置きます。組織接着剤は、隣接する、無傷のT11およびT13椎骨脊椎の露出関節プロセスに適用される。歯科セメントはティッシュの接着剤をオーバーレイする。バックプレートは組織セメントに付着し、隣接する、無傷の椎体脊椎の横プロセスおよび関節プロセスに休息する(図示)。バックプレートは切り取りビューで表示されます。真の横のビューでは、アガロースとカバーガラスはバックプレートの横壁によって隠されます。解剖学的構造は、ハリソンと同僚によって行われたC57Bl/6脊柱の詳細な磁気共鳴イメージングに基づいている。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.eGFPによって可視化されたタイトジャンクション微細構造:マウス脊髄におけるクラウディン-5は、2光子内顕微鏡による。A)健康なeGFP:Claudin-5マウスで硬膜表面の下に30 μmで撮影された単一の光学セクション。赤い矢印はeGFPを示す:Claudin-5タイトジャンクションセグメントは、縦方向のタイトジャンクション軸に垂直に伸びています。スケールバーは5 μm.インセットを表します:スケールバーは、健康なマウス脊髄の硬膜表面の下に100 μmを伸ばす血管ネットワークのZ投影を表します。光学スタックは、2 μm軸ステップサイズでサンプリングし、パネルAからのスライスを含む。イメージの配置が実行されていません。Z 投影の接合構造のシャープな描き方は、連続するフレーム間の画像の変位を最小限に抑えます。C)得られたZスタックから10μm間隔で採取された光学スライスの代表的なサブセット。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 1.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 2.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明する方法は、ガラス窓を介してマウスにおける脊髄の安定的なイメージングを可能にする。この方法は、蛍光BBBタイトジャンクションタンパク質を発現するトランスジェニックeGFP:Claudin5+/-マウスにおけるBBBリモデリングを評価するために適用されているが、脊髄内の蛍光タンパク質または細胞の研究にも同様に適用できる。
ラミネクトミーと脊髄安定化のための複数の方法が開発されている。すべてのプロトコルは、目的の構造への視覚的なアクセスのためのイメージングとウィンドウの実装中に脊髄を安定させることに対処します。除去された椎骨の数および利用可能なプロトコルの侵襲性の程度はさまざまである(例えば、表面的な骨の表面に接着された成分は、本プロトコルのように、より深く埋め込まれるのと比較して)。ダバロスとアカソグロウ2は、脊髄を安定させるために、脊柱の両側に取り外し可能なクランプとマウスの尾部の基部に1つのクランプを使用して、ラミネクトミー法を開発した。動物を中断するこの革新的な戦略は、外科テーブルに対して拡大する肺の動きによって引き起こされる胸部変位の一部を緩和した。水浸漬顕微鏡レンズ用浸漬液を含有する井戸を作成するために、ゼラチンシール(例えばゲルシール)の縁を脊髄の周りに作り、aCSFで満たした。シールリムは、イメージング中に中断される可能性がありますが、セッションの終わりに簡単に拭き取り、創傷の閉鎖とその後の再イメージングを可能にすることもできます。この方法は、広く採用されている12,13.他のグループは、代替安定化方法を開発している。フェンリッヒら脊柱を固定する方法として4手作りの修正されたペーパークリップ。これらの修正されたペーパークリップは、シアノアクリレート接着剤を有する横椎体ペディクルで固定され、取り外し可能な外部クリップと優れた動き安定性のための外部保持フォークのための永久に埋め込まれたハンドルとして維持されました。Cupidoたちは、コード2、4、12に重ね合わされたアガローズを組み込んだ前述の方法のバリエーションを提示した。FarrarとSchaffer3は、ガラス窓を1つではなく3つの椎骨に実装できる四角形の金属安定剤を開発しました。この方法はまた、潜在的な動きを減らすために、イメージング中に大きなブリッジスタビライザーにネジで脊髄を取り付けることを可能にしました。ラミンクトミーイメージングチャンバーに直接埋め込まれた小型の1光子顕微鏡も、1光子レベルで自由に動くマウスで生体内記録するために開発されたが、ほとんどの実験室では容易に入手できない13.別のアプローチでは、Weingerら。1は脊髄全体を解剖し、それを外生画像のためにアガロースに埋め込み、卓越した運動安定性と腹部脊髄へのアクセスを可能にするが、血流を消し取る。これらの開発のいくつかの制限は、長い外科的時間4、ゼラチンシールリム2の可能な破壊、脊髄4の所望の領域に合わせてカバーガラス寸法をカスタマイズする必要性を含みます 4, マニュアルペーパークリップ4、12、比較的侵襲的な外科技術12、14、およびシリコンエラストマー3、4を使用する場合に形成される気泡の改変。
我々はいくつかの利点を提供する別の方法を開発しました。このプロトコルは外科の間に費やされる時間の量を減らすために最大限に活用された。一部の外科プロトコルは、1時間半から1時間3までの長い手順時間を必要とします。一度習得すると、このミネア切り取り方法は約30分で行うことができる。このプロトコルは、単一の椎骨を除去し、安定化装置の表面的な接着を組み込み、いくつかの同等のプロトコル4、5、12、14よりも侵襲性が低い。Figley et al.の方法と同様に、プラスチックインプラントを利用することにより、このプロトコルは音響イメージング5との互換性を提供する。
空気、水、組織の屈折率の違いによって引き起こされる可能性のある光散乱(生体内顕微鏡検査中)を避けるために、ほとんどのプロトコルは、露出した脊髄の上に光学的に透明な基板をオーバーレイします。一般的な基質は、高純度、低融解温度アガロース10、12またはシリコーンポリマー3、4、5を含む。アガロースは、最小限の気泡形成で使いやすさの利点を提供し、急性イメージングセッションに適しています。熱損傷から組織を保護するために、アガロースを融点を超えて加熱し、ラミネクトミーの間に水浴中に〜39°Cまで冷却することができるので、露出した脊髄への適用のための適切なタイミングで準備することができます。慢性イメージングのために、シリコーンポリマーは脱水に対してより抵抗力がある。現在のプロトコルの開発中のパイロット試験では、アガロース層または覆いガラスのいずれかを省略し、その結果、光散乱がイメージングの利用可能な深さを減少させることがわかりました。
このプロトコルの差別化機能は、3Dプリントバックプレートと支持バックプレートフォークホルダーの組み込みです。ラミネクトミーと窓の移植の後、準備は歯科セメントと所定の位置に固定される3D印刷された楕円形のバックプレートの付加によって安定される。バックプレートは2つの機能を果たしています:第1に、それは脊髄の構造的サポートおよび安定化を提供し、第二に、それは顕微鏡検査のための浸漬目的のための液体を保持する唇を作成する。このセットアップのプロトタイプでは、市販の柱柱、アダプター、およびホールドフォークが使用されました。最近、ここで示すようにカスタム加工部品に切り替えました。いずれの場合も、心拍と呼吸によって引き起こされる空間と時間の摂動に対してイメージングフィールドを安定させる構造的な厳密性を提供することが重要な特徴です。動物の体は暖房パッド上でゆるやかに休んでいるが、脊髄とそのイメージングフィールドは、保持フォークからわずかに懸濁され、呼吸変位も減少する。プラスチック基板は版のホールダーにねじ込むからの張力を収容するためにわずかな柔軟性を提供する。印刷に使用される黒いプラスチック色は蛍光分野への最低の光を反映する。これらの方法を用いて、ポストホックアライメント調整なしで使用できる画像スタックの生成に成功しました。さらに、本明細書に記載の3Dバックプレートは、製造する安価であり、プリンタを購入した後、各印刷物に対して材料のペニーのみを原価計算する。さらに、近年、3Dプリンターのコストは下がっています。このプロトコルで公開されている 3D プリント バックプレート構造ファイル (補足ファイル 1および2を参照) は、個々のラボのニーズに合わせて簡単に変更できます。我々は、腰部2/3脊髄セグメント11を覆う胸部12脊椎脊椎の除去によって作成された椎間板空間を収容するためにバックプレートの長い次元を設計した。この手法を別の脊椎セクションに適用するには、付属の CAD ファイルを変更できます。
このプロトコルは、従来の受動気化器の代替としてデジタル統合直接注入気化器を導入する市販の低流量麻酔システムを利用しています。低流量の単位の主な特徴はイソファランへの減らされたオペレータの露出、実質的な健康上の利点である。低流量麻酔ユニットはまた圧縮ガスの代わりにイソフランの消費および部屋の空気の利用の減少による費用節約を提供する。本研究では、150mL/minの統合デジタル気化器によって2%のイソファランを送達し、フィードバック制御熱サポートと共に、麻酔の安定した平面とコア体温の適切な維持を達成した。これと一致して、デジタル統合気化器と従来の気化器の公表された比較はまた、デジタル統合気化器は麻酔の安定した平面を生み出し、コア体温、心拍数の良好な保存を生み出し、呼吸率、およびイソファランを少なく利用しながら回復15,16.
カルプロフェンなどの非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)は、補助鎮痛薬として術前に投与することができる。数時間の間に、 NsaIDs は炎症性サイトカイン転写と間質性表腫を阻害します。複数日投与は、実験的自己免疫性脳脊髄炎を含む神経炎症性疾患の重症度を減衰させる、多発性硬化症の動物モデル17,18。特に神経炎症性疾患の研究では、カルプロフェン鎮鎮薬の有益な効果は、鎮鎮力と麻酔を決定する際に疾患修飾効果に対して慎重に検討する必要があります。適切な規制委員会。
この方法の制限は、複数日にわたってイメージング セッションを繰り返し行うには容易に適さないことです。主な理由は、バックプレート構造が大きすぎて皮膚を閉じなすぎることです。したがって、マウスが麻酔から目を覚ますとバックプレートを外す危険性がある。繰り返しイメージングが不可欠な場合は、バックプレートのサイズを小さくしたり、マウントを変更したりするなど、展開できるいくつかの戦略があります。他の外科処置と同様に、オペレータのための学習曲線がある。施設の動物ケア事業所や審査委員会との緊密な連携が必要です。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
S.E.Lutzは、グラントKL2TR002002とイリノイ大学シカゴ医科大学のスタートアップファンドの下で、翻訳科学を進める国立センター、国立衛生研究所によってサポートされています。サイモン・アルフォードはRO1 MH084874によってサポートされています。コンテンツは著者の責任のみであり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。著者らは、コロンビア大学医療センターの神経学科のドリタン・アガリューに感謝しています:Claudin-5マウス、科学的な議論、および外科的プロトコルとイメージングアプリケーションの開発に関する洞察。著者らは、カリフォルニア大学アーバイン校の神経生物学と行動学科のSunil P. Gandhiに感謝し、立体装置と動物温度コントローラの最初のプロトタイプを設計し、外科的プロトコルの議論を行い、2光子顕微鏡検査の訓練。著者らはまた、外科立体顕微鏡のカスタマイズを支援するスティーブ・ピッケンズ(W.Nuhsbaum, Inc.)と、立体部品を加工するためのロン・リピンスキー(ホエール・マニュファクチャリング)に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
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- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
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