Summary
Este protocolo descreve a implantação de uma janela de vidro na medula espinal de um rato para facilitar o visualização pela microscopia intravital.
Abstract
Este protocolo descreve um método para o laminectomy da medula espinal e a implantação da janela de vidro para in vivo Imaging da medula espinal do rato. Um vaporizador digital integrado é utilizado para alcançar um plano estável de anestesia a uma taxa de baixo fluxo de isoflurano. Uma única espinha vertebral é removida, e um tampa-vidro comercialmente disponível é sobreposto em uma cama fina do agarose. Um backplate plástico 3D-Printed é afixado então às espinhas vertebrais adjacentes usando o adesivo do tecido e o cimento dental. Uma plataforma de estabilização é usada para reduzir o artefato de movimento da respiração e do batimento cardíaco. Este método rápido e braçadeira-livre é poço-serido para a microscopia de fluorescência aguda do multi-fóton. Os dados representativos são incluídos para uma aplicação desta técnica à microscopia do dois-fotão da vasculatura da medula espinal em ratos transgênicas que expressam EGFP: Claudin-5 — uma proteína apertada da junção.
Introduction
Modelos animais transgênicos expressando proteínas fluorescentes, quando combinados com microscopia intravital, proporcionam uma plataforma poderosa para abordar a biologia e a fisiopatologia. Para aplicar estas técnicas à medula espinal, os protocolos especializados são exigidos para preparar a medula espinal para a imagem latente. Uma tal estratégia é conduzir um implante da janela do laminectomy e da medula espinal. As características chaves de um protocolo ideal do laminectomy para a microscopia incluem a preservação da estrutura e da função nativas do tecido, a estabilidade do campo da imagem latente, o tempo de processamento rápido, e a reprodutibilidade dos resultados. Um desafio particular é estabilizar o campo de imagem contra o movimento induzido pela respiração e batimento cardíaco. Várias estratégias ex vivo e in vivo têm sido relatadas para atingir esses objetivos1,2,3,4,5. A maioria dos métodos in vivo envolve o aperto dos lados dacoluna vertebral2,4e é freqüentemente seguido pelaimplantação de um aparelho metálico rígido3,4para estabilidade durante a cirurgia e aplicações de imagem a jusante. Apertar a coluna vertebral pode potencialmente comprometer o fluxo sanguíneo e induzir a remodelação da proteína da barreira hematoencefálica (BBB).
A finalidade deste método é fazer a medula espinal intacta disponível para a imagem latente ótica no rato vivo ao minimizar a invasividade do protocolo e de melhorar resultados. Nós descrevemos um único procedimento do implante do laminectomy e da tampa-vidro emparelhado com um backplate 3D-impresso plástico oval minimamente invasor que ainda consiga a estabilidade mecânica robusta. A placa traseira é diretamente aderida às espinhas vertebrais anterior e posterior com cimento dentário. O backplate é equipado com os braços laterais da extensão com os furos do parafuso que fixam rigidamente ao estágio do microscópio através de um braço do metal. Isto Ancora eficazmente a vértebra anterior e posterior intacta ao estágio do microscópio, fornecendo a resistência mecânica ao artefato do movimento que seria introduzido de outra maneira pela respiração e pelo batimento cardíaco. O método foi otimizado para laminectomia de uma única vértebra no nível torácico 12, omitindo as braçadeiras utilizadas em estratégias alternativas de estabilidade durante a imagiologia in vivo . O procedimento é rápido, levando aproximadamente 30 min por mouse.
Este protocolo pode ser usado para estudar os mecanismos da doença do BBB. O BBB é um sistema microvascular dinâmico composto por células endoteliais, músculo liso vascular, pericytes e processos de pé astrocícito que proporcionam um ambiente altamente seletivo para o sistema nervoso central (SNC). Os dados representativos descrevem a aplicação deste protocolo em camundongos transgênicos projetados para expressar proteína verde fluorescente reforçada (eGFP): Claudin-5, uma proteína de junção apertada BBB. Os arquivos de impressão de backplate fornecidos também podem ser personalizados para aplicativos alternativos.
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Protocol
Todos os experimentos seguem a Universidade de Illinois, Chicago institucional cuidados com animais e protocolos de uso do Comitê. Este é um procedimento terminal.
1. preparação do reagente
- Prepare o fluido espinhal cerebral artificial (aCSF) para conter 125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de glicose, 10 mM de HEPES, 2 mM MgCl2· 6h2o, 2 mm CAcl2· 2h2o em DDH2o. filtro estéril e congelamento em alíquotas de uso individual. ACSF morno em um banho de água a 39 ° c antes de usar.
- Agarose de ponto de fusão baixa quente (2%) em aCSF até dissolver-se inteiramente em um banho de água ajustado a 65 ° c. Durante o laminectomy, esfrie a alíquota derretida do agarose a 39 ° c em um banho de água, de modo que possa pronto em perto da temperatura fisiológica para a etapa 5,2.
Nota: a solução de agarose pode ser armazenada a-20 ° c em alíquotas de uso único. - Prepare estéril 50 mg/mL de carprofeno em água bacteriostática. Conservar a 4 ° c.
- Limpe os óculos de proteção com 70% de etanol, três lavas de ddH2O e guarde-O em um recipiente sem poeira.
2. backplate impressão 3D
- Use o software CAD 3D é usado para criar um modelo para as dimensões mostradas na Figura 1. O interior é uma elipse mais larga na superfície inferior com relação à impressora e cortada com um corte elevado a uma elipse menor formando um lúmen na superfície oposta. Dois braços de projeção com furos para aceitar os parafusos estendem lateralmente, para o acessório à forquilha da terra arrendada da placa traseira. A partir desta estrutura 3D, crie um arquivo de malha 3D triangulado (. STL arquivo).
Nota: consulte a Figura 1b\u2012D e os arquivos complementares 1 e 2. - Carregue o arquivo de malha 3D triangulado em uma impressora 3D.
- Imprima placas traseiras usando um bocal de extremidade quente de 0,4 mm e uma altura de camada de 0,2 mm. Selecione a temperatura do bocal de 205 ° c, temperatura da cama de 45 ° c, e velocidade de impressão de 45 milímetros/s.
- Avalie os backplates impressos 3D resultantes visualmente para a integridade estrutural (Figura 1e); falha estrutural bruta (lúmen ausente, parede colapsado) indica defeitos de impressão (Figura 1F).
3. Preparação cirúrgica
- Pré-aqueça a almofada de aquecimento.
- Coloque o isoflurano na seringa de parto enquanto trabalha em uma capa de fumaça química. Prenda a seringa de entrega à unidade de isoflurano.
- Selecione um mouse 8 \ u201212-week-old. Pesar o animal. Induzir anestesia utilizando isoflurano a 2% em câmara de indução. Injetar carprofeno a 5 mg/kg por via subcutânea.
- Posicionar o nariz-cone e entregar isoflurano a 2% com vazão de 150 mL/min para manutenção de um plano cirúrgico de anestesia (Figura 2a\u2012e). Enrole a almofada de aquecimento com uma almofada absorvente descartável para a facilidade da limpeza.
- Posicione um animal na almofada de aquecimento na estação cirúrgica e instale o cone do nariz. Lubrificar o termómetro com vaselina e inseri-lo 5 mm no recto. Tape a sonda termômetro para a cauda para a estabilidade. Aplique pomada oftálmico aos olhos do rato.
- Para manter a hidratação, aplique 200 μL de solução de Ringer Ringer por injeção subcutânea a cada 30 min até a terminação do experimento.
- Pulverize o dorso com 70% de etanol, retire a pele com Clippers, e limpe o local com povidona-iodo.
4. laminectomia
- Posicione o animal entre as barras de orelha; estes mantêm a posição da cabeça do rato com respeito ao nariz-cone.
- Confirme que o animal está profundamente anestesiado como avaliado pela falta de reflexo interdigital de pinça e padrão respiratório constante.
- Faça uma incisão rostral-caudal de 1,5 cm na linha média sobre a região lombar torácica/superior, utilizando #11 lâmina (Figura 2). Separe a pele agarrando-a com o fórceps dentado sem corte e/ou os dedos gloved. Use o fórceps para separar e descascar para trás todo o tecido conjuntivo transparente restante abaixo da pele. A musculatura superficial deve agora ser exposta; deslocar isto com uma lança cirúrgica de espuma.
- Use as lanças cirúrgicas da espuma (ou um cutrette) para cancelar afastado o musculatura restante, mais profundo da vértebra do alvo (torácico 12). Para criar um assento para o backplate, também limpe afastado o músculo do aspecto do posterior de torácico 11, e o aspecto anterior do torácico 13. Controle toda a hemorragia aplicando a pressão delicada com uma lança cirúrgica ou use um pulso mínimo com uma arma cauttery. Continue a remover o músculo remanescente longe dos tendões usando fórceps
- Uma vez que os músculos são removidos, Retire cuidadosamente os tendões cortando com fórceps. Deve haver uma abundância do espaço para visualizar e manipular o cabo quando esta etapa é completa. Verifique se a dura-máter do espaço intervertebral, o osso laminar semitransparente, o vaso sanguíneo superficial central embaixo do osso e a artéria irradiante anterior são agora claramente visíveis.
- Molhe a região com aCSF quente. Use a microbroca para repetitivamente diluir o osso laminar usando traços retos paralelos ao longo eixo da medula espinhal (Figura 2, Figura 3). Se desejado, utilize um estágio de deslizamento para girar a plataforma cirúrgica para o conforto ergonómico realçado (por exemplo, um operador destro pode girar a plataforma cirúrgica no sentido anti-horário para a etapa da perfuração).
Nota: o estágio de deslizamento usado é construído de uma placa de alumínio superior que deslize ± 15 milímetros com respeito à placa baixa fixa. - Agarre delicadamente o processo espinhoso superficial com fórceps e levante a vértebra; o osso deve levantar afastado facilmente. Se houver resistência, repita o desbaste do osso com a broca e, se necessário, use a tesoura de íris, tendo o cuidado de apontar as pontas de tesoura para cima para evitar danificar o tecido.
Nota: a fim de manter a dura intacta, é essencial não puxar o osso. - Use #4 pinça para limpar qualquer estilhaços de osso. Use uma lança cirúrgica para aplicar a pressão constante suave para controlar qualquer sangramento. Enxágüe o tecido com aCSF morno. Não deixe o tecido secar.
5. implante de vidro de cobertura
- Aplique delicadamente uma tampa-vidro do borosilicato de 3 milímetros ao cabo exposto.
- Assegure-se de que o agarose esfrie 39 ° c. Usando uma espátula pequena, aplique o agarose/aCSF morno de 2% à borda da tampa-vidro e permita que a ação capilar a desenhe a superfície.
Nota: em temperaturas abaixo de 39 ° c, o agarose pode começar a gel. Se isso ocorrer, Reaqueça usando um banho de água ou microondas. Alguns operadores preferem primeiro aplicar uma gota de agarose e colocar a tampa de vidro em cima. - Aplique o adesivo do tecido aos processos articulados ósseos expostos da vértebra adjacente intata na espinha vertebral do nível torácico 11 e na espinha vertebral do nível torácico 13. Aplique o adesivo adicional do tecido em um anel em torno do local do laminectomy, sobre o tendão adjacente e o processo transversal.
Nota: o adesivo do tecido é exigido para a aderência apropriada do cimento dental nas etapas subseqüentes. Os processos articulares formam um assento natural no qual a placa traseira pode descansar estavelmente (Figura 3). A adesão aos processos articulares formarão os pontos mais fortes do apego. - Misture o cimento dental com o acelerante em uma bandeja de mistura da porcelana. Utilize uma espátula pequena para transferir o cimento dental na camada adesiva do tecido. Use o cimento dental para aderir o backplate ao campo cirúrgico, centrado sobre a janela. Aguarde 10 minutos para o cimento dental para curar.
Nota: a aderência firme da placa traseira aos processos articulares anteriores e posteriores proporciona a estabilidade estrutural fundamental do implante. - Use o cimento dental adicional para encher a base interior da placa traseira, e a parte inferior da placa traseira: relação do tecido.
Nota: a aplicação extra do cimento dental melhora a aderência e reduz o risco de vazamento de fluido de imersão objetiva microscópio (soro fisiológico) para fora do fundo da placa traseira. - Avance o suporte da placa traseira bifurcada para a posição apropriada sobre a janela. Fixe o backplate no suporte do backplate com parafusos.
Nota: Este protocolo utilizou um suporte de backplate feito à máquina (Figura 2G\u2012H). - Aplique soro fisiológico na placa traseira para testar o vazamento. Se qualquer vazamento de fluido, secar a área e aplicar mais cimento dental.
6. preparação de imagens
- Transfira o animal na plataforma cirúrgica para a mesa óptica.
Nota: nossa plataforma cirúrgica, suporte do backplate, e o suporte do nariz-cone do isoflurano podem ser transportados entre estações cirúrgicas e do dois-fotão da imagem latente como uma unidade, ao aplicar a anestesia contínua do isoflurano (Figura 2D,H). As unidades similares podem ser montadas das forquilhas, dos feixes, e dos bornes de suporte da coluna que são obtidas das fontes comerciais (por exemplo ThorLabs). Para microscopia intravital, deve haver pelo menos 11 polegadas de folga entre o objetivo do microscópio e a tabela óptica para acomodar a altura da plataforma cirúrgica. - Afixe a plataforma cirúrgica à tabela ótica usando um borne de montagem do aço inoxidável e uma forquilha de aperto rebaixada.
- Aplique salina fresca no poço da placa traseira. Abaixe uma lente da água-imersão no poço.
- Use luz transmitida ou epifluorescência para identificar a área de interesse e foco. Mude para o modo de digitalização a laser e realize imagens in vivo de acordo com o comprimento de onda de excitação a laser de dois fótons adequado, dicrónicos e filtros de bandpass para os fluoróforos presentes no tecido6.
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Representative Results
As janelas de vidro implantadas e a microscopia intravital do dois-fotão fornecem uma ferramenta útil para avaliar mudanças dinâmicas em proteínas do CNS. A integridade funcional do BBB é influenciada pela expressão, localização subcelular e taxas de rotatividade de proteínas de junção apertadas7. Estudos prévios demonstraram que as proteínas de junção apertada passam por remodelações rápidas e dinâmicas no estado estacionário8. O laminectomy e a preparação atualmente descritos da janela de vidro foram usados no EGFP transgênicas: os ratos9de Claudin-5, que carregam proteínas apertadas fluorescentes da junção, para avaliar a remodelação apertada da junção de BBB no experimental auto-imune modelo da encefalomielite (EAE) da esclerose múltipla10. Nos dados representativos, a imagem latente de eGFP: Claudin-5 foi conseguida com um microscópio do dois-fotão com excitação de 920 nanômetro, um objetivo do infravermelho de 40 × (0,8 NA), e um filtro verde da emissão da fluorescência (Figura 4). As pilhas ópticas foram amostradas em etapas axiais de 2 μm a 100 μm abaixo da superfície dural. Os dados descrevem a visualização das junções cDNAs etiquetadas durante todo um plexo vascular. São incluídas fatias ópticas únicas e imagens de projeção Z (Figura 4). A delineação clara de estruturas de junção apertadas na projeção Z (Figura 4B) indica que o deslocamento mínimo da imagem X-Y é produzido após laminectomia bem-sucedida, colocação de janela e implante de placa traseira.
Figura 1. Personalizado impresso backplate dispositivo de estabilização. A) vistas ortogonais da placa traseira. B-D) modelos de malha triangulados de superfícies dorsal e ventral da placa traseira. E) backplate corretamente impresso. F) backplate incorretamente impresso. Consulte arquivos suplementares 1 e 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Etapas cirúrgicas para laminectomy. A) sistema de entrega da anestesia do Isoflurane que utiliza um vaporizador digital integrado que inclui (i) uma exposição da tela de toque para controlar a anestesia, (II) mostradores do controle, (III) entradas para módulos opcionais da fisiologia do complemento, (IV) concentração da anestesia botão de ajuste, (v) bloco do empurrador da bomba da seringa, (vi) seringa com Isoflurane, (VII) atomizador digital integrado, (VIII) tubulação da inspiração, (IX) tubulação da inspiração para a câmara da indução, (x) câmara da indução, (XI) tubulação da inspiração para o nariz-cone, (XII) tubulação da expiração para o nariz-cone, (XIII) tubulação da expiração para a câmara da indução. B) instrumentos utilizados na laminectomia incluem (i) feedback controlado unidade de aquecimento, (II) K-acoplado sonda termômetro retal, (III) silicone flexível almofada de aquecimento, (iv) #11 lâmina, (v) #5 fórceps, (vi) pinça de titânio dentado, (VII) íris de titânio tesoura, (VIII) microbroca óssea, (IX) pistola de cauterização, (x) placa traseira impressa em 3D, (XI) lanças cirúrgicas de espuma absorvente, (XII) bandeja de mistura cerâmica para resina acrílica, (XIII) resina acrílica e acelerante, (XIII) adesivo tecidual, (XIV) lubrificante oftálmico, (XV) 3 mm tampa de vidro. C) estereomicroscópio e plataforma cirúrgica. Durante a cirurgia, a plataforma cirúrgica senta-se em um estágio de deslizamento (base redonda de prata e preta no estágio do microscópio). D) rato situado na plataforma cirúrgica feita encomenda com cama aquecida, após a incisão superficial do midline. O suporte do cone de nariz do isoflurano é ajustável nos Y-e Z-machados para acomodar ratos pequenos e grandes. As barras da orelha estabilizam a cabeça com respeito ao nosecone. A Termosonda retal mede a temperatura do núcleo. E) campo cirúrgico na etapa da remoção do músculo. F) campo cirúrgico após a remoção do músculo. G) campo cirúrgico durante o desbaste do osso vertebral. H) campo cirúrgico após remoção do osso vertebral. I) campo cirúrgico durante a colocação do vidro de cobertura. J) campo cirúrgico após colocação de vidro de cobertura. K) campo cirúrgico durante o revestimento inicial com acrílico. L) campo cirúrgico após a conclusão da implanação do backplate. M-N) Rato posicionado na estação cirúrgica após laminectomy terminado. A forquilha de bronze é ajustável em X-, Y-, e Z-machados para posicionar sobre o local da laminectomia da medula espinal. A forquilha é ancorada mecanicamente à plataforma cirúrgica para fornecer a estabilização óptima do campo da imagem latente durante a cirurgia e as aplicações a jusante que incluem a microscopia intravital do dois-fóton. Durante a cirurgia, a plataforma cirúrgica é montada em um estágio de deslizamento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Descrição esquemática da colocação anatômica da janela da medula espinal. A ) descrição esquemática da visão superior de um corpo vertebral torácico inferior, processo espácuo e segmento da medula espinhal (SC). Um círculo pontilhado retrata o assento do processo articular, o ponto principal da sustentação para a adesão da placa traseira. B) descrição esquemática da vista superior da janela da medula espinhal. A coluna vertebral alvo (aqui, T12) foi removida. Uma camada fina de agarose sobrepõe a medula espinhal. Um coverglass descansa sobre o agarose. O adesivo tecidual é aplicado sobre os processos transversais (e, não mostrados aqui, sobre o processo articular exposto das espinhas vertebrais adjacentes, intactas). O cimento dental sobrepõe o adesivo do tecido. A placa traseira adere ao cimento tecidual, descansando sobre os processos transversais (mostrados) e o processo articular das espinhas vertebrais adjacentes, intactas (não mostradas neste painel). Uma camada fina adicional de cimento dental é aplicada no interior da borda do backplate. A placa traseira é descrita em uma vista cortantes para visualizar o vidro de cobertura. C) descrição esquemática da vista lateral da janela da medula espinhal. A coluna vertebral alvo (aqui, T12) foi removida. Uma camada fina de agarose sobrepõe a medula espinhal. Um vidro de cobertura repousa em cima do agarose. O adesivo tecidual é aplicado sobre o processo articular exposto das espinhas vertebrais adjacentes, intactas de T11 e T13. O cimento dental sobrepõe o adesivo do tecido. A placa traseira adere ao cimento tecidual, descansando sobre os processos transversais e o processo articular das espinhas vertebrais adjacentes, intactas (mostradas). O backplate é representado em uma vista cortantes; em uma vista lateral verdadeira o agarose e o tampa-vidro seriam obscurecidos pela parede lateral do backplate. As estruturas anatômicas são baseadas na imagem latente de ressonância magnética detalhada da coluna espinal de C57Bl/6 conduzida por Harrison e por colegas 11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Microestrutura apertada da junção visualizada por eGFP: Claudin-5 na medula espinal do rato pela microscopia intravital do dois-fotão. A) única seção ótica tomada em 30 μm abaixo da superfície dural em um EGFP saudável: rato de Claudin-5. A seta vermelha descreve um eGFP: segmento apertado da junção de Claudin-5 que estende perpendicular ao eixo apertado longitudinal da junção. A barra de escala representa 5 μm. Inset: a barra de escala representa 10 μm. B) Z-projeção da rede vascular que estende 100 μm abaixo da superfície dural da medula espinal saudável do rato. A pilha óptica foi amostrada a 2 μm de tamanho de degrau axial e inclui a fatia do painel A. Nenhum alinhamento de imagem foi executado. Delineação acentuada das estruturas juncionais na projeção Z demonstra deslocamento de imagem mínima entre quadros consecutivos. C) subconjunto representativo de fatias ópticas tomadas a intervalos de 10 μm a partir da pilha Z resultante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Arquivo suplementar 2. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O método descrito aqui permite a imagem latente estável da medula espinal nos ratos através de uma janela de vidro. Este método foi aplicado para avaliar o remodelamento de BBB no EGFP transgênicas: Claudin5 +/-camundongos que expressam uma proteína de junção apertada fluorescente de BBB, mas poderia ser aplicada ingualmente bem para estudos de todas as proteínas ou pilhas fluorescentes na medula espinal.
Os métodos múltiplos para a estabilização do laminectomy e da medula espinal foram desenvolvidos. Todo o endereço dos protocolos que estabiliza a medula espinal durante a imagem latente e a aplicação da janela para o acesso visual à estrutura do interesse. O número de vértebras removidas e o grau de invasividade dos protocolos disponíveis variam (por exemplo, componentes colados na superfície do osso superficial, como no presente protocolo, versus incorporado mais profundamente). Davalos e Akassoglou2 desenvolveram um método de laminectomia usando grampos removíveis em cada lado da coluna vertebral e uma braçadeira na base da cauda do mouse, a fim de estabilizar a medula espinhal. Esta estratégia inovadora para suspender o animal aliviou alguns dos deslocamentos torácicos causados pelo movimento dos pulmões em expansão contra a mesa cirúrgica. Para criar um poço para conter fluido de imersão para uma lente microscópica de imersão em água, uma borda de vedação de gelatina (por exemplo , gelseal) foi feita em torno da medula espinhal e preenchida com ACSF. A borda do selo poderia ser interrompida durante a imagem latente, mas poderia igualmente facilmente ser limpada afastado no fim da sessão para permitir o fechamento da ferida e o reimaging subseqüente. Este método tem sido amplamente adotado12,13. Outros grupos desenvolveram métodos alternativos de estabilização. Fenrich et al. 4 grampos de papel modificados mão-preparados como uma maneira de fixar a coluna espinal. Estes grampos de papel modificados foram fixados nos pedículos vertebrais laterais com colagem do cianoacrilato e mantidos como punhos permanentemente implantados para um grampo externo removível e uma forquilha externa da terra arrendada para a estabilidade excelente do movimento. Cupido e colegas apresentaram variações nos métodos supracitados com incorporação de agarose sobreposta no cordão2,4,12. Farrar e Schaffer3 desenvolveram um estabilizador do metal do quadrilátero que poderia permitir a aplicação de uma janela de vidro em três vértebras um pouco do que somente um. Este método igualmente permitiu que a medula espinal fosse unida com os parafusos a um estabilizador maior da ponte durante a imagem latente para reduzir o movimento potencial. Um microscópio miniaturizado do um-fóton implantado diretamente na câmara da imagem latente do laminectomy foi desenvolvido igualmente para in vivo a gravação em ratos livremente moventes no nível do um-fotão, mas não é ainda prontamente-disponível à maioria de laboratórios13 . Em uma abordagem diferente, Weinger et al. 1 dissecou uma medula espinal inteira e encaixou-a no agarose para a imagem latente ex vivo , que permite a estabilidade do movimento e o acesso insuperável à medula espinal ventral, mas AB roga a circulação sanguínea. Algumas limitações destes desenvolvimentos incluem o tempo cirúrgico longo4, ruptura possível da borda2do selo de gelatina, a necessidade de personalizar as dimensões da tampa-vidro para caber a área desejada da medula espinal4, manual modificação de clipes depapel 4,12, técnicas cirúrgicas relativamente invasivas12,14e bolhas de ar formando ao usar o elastômerode silício3,4.
Desenvolvemos um método alternativo que oferece várias vantagens. Este protocolo foi otimizado para reduzir a quantidade de tempo gasto durante a cirurgia. Considerando que alguns protocolos cirúrgicos exigem tempos de procedimento mais longos que variam de uma hora e meia4 a uma hora3; uma vez dominado, este método de laminectomia pode ser realizado em aproximadamente 30 min. reduzindo o tempo gasto na cirurgia pode diminuir o stress fisiológico para o mouse, e facilitar a experimentação de maior rendimento. Este protocolo remove uma única vértebra, e incorpora a aderência superficial do dispositivo da estabilização que faz o menos invasor do que alguns protocolos comparáveis4,5,12,14. Como o método de Figley et al., utilizando um implante de plástico este protocolo oferece compatibilidade com imagem acústica5.
Para evitar a dispersão de luz (durante a microscopia intravital) que pode ser causada pelas diferenças entre os índices refrativos de ar, água e tecido, a maioria dos protocolos sobrepõem um substrato opticamente transparente sobre a medula espinhal exposta. Substratos comuns incluem alta pureza, baixa temperatura de fusão agarose10,12 ou polímeros de silicone3,4,5. O agarose oferece a vantagem da facilidade de uso, com formação mínima da bolha, e é apropriado para sessões agudas da imagem latente. Para proteger o tecido dos danos do calor, é conveniente aquecer o agarose para além do ponto de derretimento e para permitir então que esfrie a ~ 39 ° c em um banho de água durante o laminectomy, assim que pode estar pronto no momento apropriado para a aplicação à medula espinal expor. Para a imagem latente crônica, os polímeros do silicone são mais resistentes à desidratação. Os testes piloto durante o desenvolvimento do protocolo atual omitiram a camada do Agarose ou a tampa-vidro sobrejacente, e encontraram que a dispersão clara consequente reduziu a profundidade disponível da imagem latente.
Uma característica diferenciadora deste protocolo é a incorporação de uma placa traseira impressa em 3D e suporte de forquilha de suporte da placa traseira. Após o laminectomy e a implantação da janela, a preparação é estabilizada pela adição de uma placa traseira oval 3D-Printed que seja fixada no lugar com cimento dental. O backplate sere duas funções: primeiramente, fornece a sustentação estrutural e a estabilização da medula espinal, e segundo, cria um bordo para prender o líquido para objetivos da imersão para a microscopia. Em protótipos dessa configuração, foram utilizados postes de pilar, adaptadores e garfos de fixação comercialmente disponíveis; recentemente mudamos para peças usinadas personalizadas como descrito aqui. Em ambos os casos, a característica essencial é fornecer o rigor estrutural para estabilizar o campo da imagem latente de encontro às perturbações no espaço e no tempo induzidos pelo batimento cardíaco e pela respiração. Embora o corpo do animal esteja descansando frouxamente na almofada de aquecimento, a medula espinal e seu campo da imagem latente são suspendidas ligeiramente da forquilha da terra arrendada, que igualmente diminui o deslocamento respiratório. A carcaça plástica oferece a flexibilidade ligeira para acomodar a tensão de parafusar no suporte da placa. A cor plástica preta usada para a impressão reflete a luz mínima no campo da fluorescência. Através desses métodos, geramos com êxito pilhas de imagens que podem ser usadas sem ajuste de alinhamento post hoc . Além disso, a placa traseira 3D descrita neste documento é barata para produzir, custando apenas moedas de um centavo no material para cada impressão, uma vez que a impressora é comprada. Além disso, os custos das impressoras 3D caíram nos últimos anos. Os arquivos estruturais da placa traseira impressa em 3D (consulte arquivos suplementares 1 e 2) publicados com este protocolo podem ser prontamente modificados para acomodar necessidades individuais de laboratório. Nós projetamos a dimensão longa do backplate para acomodar o espaço intervertebral criado pela remoção da espinha vertebral 12 torácica, que overlies os segmentos 2/3 lombares da medula espinal11. Para aplicar essa técnica a uma seção vertebral diferente, os arquivos CAD que acompanham podem ser modificados.
Este protocolo utiliza um sistema de anestesia de baixo fluxo comercialmente disponível que implanta um vaporizador de injeção direta integrado digital como uma alternativa ao vaporizador passivo tradicional. A característica principal da unidade do baixo-fluxo é a exposição reduzida do operador ao Isoflurane, um benefício de saúde substancial. A unidade da anestesia do baixo-fluxo igualmente oferece economias de custo devido ao consumo reduzido do isoflurano e à utilização do ar do quarto em vez do gás comprimido. No presente estudo, 2% de isoflurano entregues por vaporizador digital integrado a 150 mL/min, juntamente com suporte térmico controlado por feedback, alcançaram um plano estável de anestesia e manutenção adequada da temperatura corporal central. Consistente com isso, as comparações publicadas de vaporizadores integrados digitais e vaporizadores tradicionais também concluíram que o vaporizador integrado digital produz um plano estável de anestesia e boa preservação da temperatura corporal central, frequência cardíaca, frequência respiratória e recuperação ao utilizar menos isoflurano15,16.
Um fármaco anti-inflamatório não esteroidal (AINE) como o carprofeno pode ser administrado no pré-operatório como um analgésico suplementar. Ao longo de poucas horas, os AINEs inibem a transcrição inflamatória da citocinas e o edema intersticial; a administração de vários dias atenua a gravidade das doenças neuroinflamatórias, incluindo a encefalomielite autoimune experimental, um modelo animal de esclerose múltipla17,18. Particularmente no estudo da doença neuroinflamatória, os efeitos benéficos da analgesia do carprofeno devem com cuidado ser pesados de encontro aos efeitos modificando da doença ao determinar a analgesia e a anestesia para um experimento na coordenação estreita com conselhos regulamentares adequados.
Uma limitação deste método é que ele não é prontamente capaz de repetidas sessões de imagem em vários dias. A principal razão é que a estrutura backplate é muito grande para fechar a pele. Conseqüentemente, há um risco que um rato desalojar a placa traseira em cima de acordar da anestesia. Se a imagem latente repetida era essencial, há diversas estratégias que poderiam ser implantadas, incluindo a redução do tamanho do backplate, ou a mudança da montagem. Como em qualquer procedimento cirúrgico, há uma curva de aprendizado para os operadores. É necessária uma estreita coordenação com gabinetes institucionais de cuidados com animais e conselhos de revisão.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
S.E. Lutz é apoiado pelo centro nacional para o avanço das Ciências translacionais, institutos nacionais de saúde, Grant KL2TR002002 e da Universidade de Illinois Chicago College of Medicine start-up fundos. Simon Alford é apoiado por RO1 MH084874. O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais da NIH. Os autores agradecem Dritan Agalliu no departamento de Neurologia do centro médico da Universidade de Columbia para o TG eGFP: Claudin-5 camundongos, discussões científicas, e insights sobre o desenvolvimento do protocolo cirúrgico e aplicações de imagem. Os autores agradecem a Sunil P. Gandhi no departamento de neurobiologia e comportamento da Universidade da Califórnia, Irvine para projetar o primeiro protótipo do aparelho estereotáxica e controlador de temperatura animal, discussão do protocolo cirúrgico, e formação em microscopia de dois fótons. Os autores também agradecem Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) para o auxílio na personalização do estereomicroscópio cirúrgico, e Ron Lipinski (Whale Manufacturing) para usinagem de peças estereotáticas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
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