Summary
يصف هذا البروتوكول غرس نافذه زجاجيه علي الحبل الشوكي للماوس لتسهيل التصور بواسطة المجهر الانترافيتال.
Abstract
يصف هذا البروتوكول طريقه لاستئصال صفيحه الحبل الشوكي وغرس النوافذ الزجاجية لتصوير الحبل الشوكي للماوس في الجسم المجري . ويستخدم المبخر الرقمي المتكامل لتحقيق مستوي مستقر من التخدير بمعدل تدفق منخفض من الايزوفلواني. يتم أزاله عمود فقري واحد ، ويتم تراكب الغطاء الزجاجي المتاح تجاريا علي سرير رفيع. ثم تلصق الصفيحة الخلفية البلاستيكية المطبوعة ثلاثية الابعاد بالأشواك الفقرية المجاورة باستخدام لاصق الانسجه والاسمنت السني. يتم استخدام منصة التثبيت للحد من الحركة الملموسة من التنفس وضربات القلب. هذه الطريقة السريعة والخالية من المشبك مناسبه تماما لمجهر متعدد الفوتونات الحاد. يتم تضمين البيانات التمثيلية لتطبيق هذه التقنية علي اثنين من الفوتون المجهري من الاوعيه الدموية في الحبل الشوكي في الفئران المحورة وراثيا التعبير عن eGFP: العرج-5-بروتين تقاطع ضيق.
Introduction
النماذج الحيوانية المحورة وراثيا التعبير عن البروتينات الفلورية ، عندما يقترن مع المجهر الانترافيتال ، توفر منصة قويه لمعالجه علم الاحياء والفيزيولوجيا المرضية. لتطبيق هذه التقنيات علي الحبل الشوكي ، والبروتوكولات المتخصصة مطلوبه لاعداد الحبل الشوكي للتصوير. وتتمثل أحدي هذه الاستراتيجيات في اجراء عمليه استئصال الصفيحة الفقرية وغرس الحبل الشوكي. وتشمل الميزات الرئيسية للبروتوكول المثالي لاستئصال الصفيحة المجهرية الحفاظ علي بنيه الانسجه الاصليه ووظيفتها ، واستقرار حقل التصوير ، ووقت المعالجة السريع ، واستنساخ النتائج. ويتمثل أحد التحديات الخاصة في تحقيق الاستقرار في مجال التصوير مقابل الحركة المستحثة بالتنفس ونبض القلب. وقد تم الإبلاغ عن استراتيجيات متعددة السابقين وفي الجسم الفيفو لتحقيق هذه الأهداف1,2,3,4,5. معظم في الأساليب المجرية تنطوي علي لقط الجانبين من العمود الفقري2,4 وغالبا ما يعقبه زرع جهاز معدني جامد3,4 للاستقرار اثناء الجراحة تطبيقات التصوير النهائي. لقط العمود الفقري يمكن ان يضر بتدفق الدم والحث علي أعاده عرض البروتين حاجز الدم في الدماغ (BBB).
والغرض من هذا الأسلوب هو جعل الحبل الشوكي سليمه متاحه للتصوير البصري في الماوس الحية مع التقليل من غزو البروتوكول وتحسين النتائج. ونحن وصف استئصال الصفيحة واحده والغطاء الزجاجي الاجراء غرس يقترن البيضاوي الحد الأدنى من البلاستيك 3D-مطبوعه الخلفية التي لا تزال تحقق الاستقرار الميكانيكية القوية. يتم التزام باللوحة الخلفية مباشره بالعمود الفقري الامامي والخلفي مع الاسمنت السني. وقد تم تجهيز اللوحة الخلفية مع أذرع التمديد الجانبية مع ثقوب المسمار التي نعلق بشكل صارم علي مرحله المجهر عن طريق ذراع معدنيه. هذا المراسي بشكل فعال الفقرة الاماميه والخلفية السليمة إلى مرحله المجهر ، وتوفير المقاومة الميكانيكية للقطع المصنوعة الحركة التي لولا ذلك سيتم إدخالها عن طريق التنفس وضربات القلب. وقد تم تحسين هذه الطريقة لاستئصال الصفيحة الفقرية لفقره واحده في المستوي الصدري 12 ، وحذف المشابك المستخدمة في استراتيجيات بديله للاستقرار اثناء التصوير في الجسم المجري . الاجراء سريع ، أخذ ما يقرب من 30 دقيقه لكل ماوس.
ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة أليات الامراض من BBB. و BBB هو نظام الاوعيه الدقيقة الديناميكية التي تتالف من الخلايا البطانية, العضلات الملساء الاوعيه الدموية, pericytes, وعمليات القدم تموت التي توفر بيئة انتقائية للغاية للجهاز العصبي المركزي (CNS). البيانات التمثيلية تصور تطبيق هذا البروتوكول في الفئران المحورة وراثيا المهندسة للتعبير عن البروتين الفلوري الأخضر المعزز (eGFP): العرج-5 ، وهو البروتين تقاطع الضيق BBB. يمكن أيضا تخصيص ملفات الطباعة الخلفية المتوفرة للتطبيقات البديلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب تتبع جامعه إلينوي ، شيكاغو المؤسسية الرعاية الحيوانية والبروتوكولات لجنه الاستخدام. هذا هو اجراء المحطة الطرفية.
1. اعداد كاشف
- اعداد السائل النخاعي الدماغي الاصطناعي (aCSF) لاحتواء 125 mM كلوريد الصوديوم ، 5 ملم KCl ، 10 ملم الجلوكوز ، 10 مم HEPES ، 2 مم MgCl2· 6h2o ، 2 مم cacl2· 2H2س في ddh 2س. فلتر معقم وتجميد في الاستخدامات الفردية. الدافئة aCSF في حمام المياه إلى 39 درجه مئوية قبل الاستخدام.
- الدافئة انخفاض ذوبان نقطه الانصهار (2 ٪) في aCSF حتى يذوب تماما في حمام المياه تعيين إلى 65 درجه مئوية. خلال استئصال الصفيحة الفقرية ، تبرد المحارة المذابة إلى 39 درجه مئوية في حمام مائي ، بحيث يمكن ان تكون جاهزه علي مقربه من درجه الحرارة الفسيولوجية للخطوة 5.2.
ملاحظه: يمكن تخزين المحلول المركب عند-20 درجه مئوية في الارصفه الاحاديه الاستخدام. - اعداد معقم 50 ملغ/مل كاربروفين في المياه الجرثومية. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية.
- غطاء نظيف-نظارات مع 70 ٪ الايثانول ، وثلاثه يغسل من ddH2O ، وتخزين الجافة في حاويه خاليه من الغبار.
2. لوحه الخلفية 3D الطباعة
- استخدام برنامج 3D CAD يستخدم لإنشاء نموذج للابعاد المبينة في الشكل 1. الداخلية هو القطع الناقص علي أوسع نطاق في السطح السفلي فيما يتعلق الطابعة وقص مع قطع الاسمية للقطع ناقص أصغر تشكيل تجويف علي السطح المعاكس. اثنين من إسقاط الاسلحه مع ثقوب لقبول مسامير تمتد أفقيا ، لتعلق علي اللوحة الخلفية عقد شوكه. من هذا الهيكل ثلاثي الابعاد ، أنشئ ملف شبكه ثلاثي الابعاد (. STL).
ملاحظه: انظر الشكل 1B-D والملفين التكميليين 1 و 2. - تحميل ملف الشبكة ثلاثية الابعاد المثلثة إلى طابعه ثلاثية الابعاد.
- طباعه اللوحات الخلفية باستخدام فوهه 0.4 mm الساخنة نهاية وارتفاع طبقه 0.2 مم. حدد درجه حرارة فوهه 205 درجه مئوية ، درجه حرارة السرير من 45 درجه مئوية ، وسرعه الطباعة من 45 ملم/ثانيه.
- تقييم اللوحات الخلفية المطبوعة ثلاثية الابعاد الناتجة بصريا للسلامة الهيكلية (الشكل 1E) ؛ الفشل الهيكلي الإجمالي (التجويف الغائب ، الجدار المنهار) يشير إلى عيوب الطباعة (الشكل 1F).
3. التحضير الجراحي
- سخني وساده التسخين.
- تحميل ايزوفلوراني في حقنه التسليم اثناء العمل في غطاء الدخان الكيميائية. إرفاق حقنه التسليم إلى وحده ايزوفلونان.
- حدد الماوس 8 \ u201212-العمر الأسبوع. تزن الحيوانية. الحث علي التخدير باستخدام 2 ٪ ايزوفلواني في غرفه الحث. حقن كاربروفين في 5 مغ/كغ جلد.
- وضع الأنف مخروط وتقديم ايزوفلونان في 2 ٪ مع معدل تدفق 150 مل/دقيقه لصيانة الطائرة الجراحية من التخدير (الشكل 2A-E). التفاف وساده التدفئة مع وساده ماصه القابل للتصرف لسهوله تنظيف.
- وضع الحيوانية علي وساده التدفئة في محطه الجراحية وتثبيت مخروط الأنف. تليين ميزان الحرارة مع هلام البترول وادراجه 5 ملم في المستقيم. الشريط التحقيق ميزان الحرارة إلى الذيل للاستقرار. تطبيق مرهم العيون علي عيني الماوس.
- للحفاظ علي الترطيب ، وتطبيق 200 μL من الحل اللاكتيتي الرنين عن طريق الحقن تحت الجلد كل 30 دقيقه حتى إنهاء التجربة.
- رش دورسوم مع الايثانول 70 ٪ ، وأزاله الفراء مع المقص ، وتنظيف الموقع مع povidone-اليود.
4. استئصال الصفيحة الفقرية
- وضع الحيوانية بين قضبان الاذن. هذه المحافظة علي موقف رئيس الماوس فيما يتعلق الأنف مخروط.
- تاكد من ان الحيوانية تخدير عميق كما تقييمها بسبب عدم وجود منعكس قرصه بين الرقمية ونمط التنفس ثابت.
- جعل 1.5 سم rostral-caudal شق في الخط الأوسط علي المنطقة السفلية الصدرية/العلوية القطنية باستخدام شفره #11 (الشكل 2). فصل الجلد عن طريق استيعاب ذلك مع ملقط مسننه حاده و/أو أصابع القفازات. استخدام ملقط لفصل وقشر الظهر اي الانسجه الضامة الشفافة المتبقية تحت الجلد. وينبغي الآن كشف العضلات السطحية; أزاحه هذا مع الرمح الجراحية رغوة.
- استخدام الرماح الجراحية رغوة (أو curette) لمسح بعيدا المتبقية ، أعمق العضلات من الفقرة المستهدفة (الصدرية 12). لإنشاء مقعد للوحه الخلفية ، وأيضا مسح بعيدا العضلات من الجانب الخلفي من الصدر 11 ، والجانب الامامي من الصدر 13. السيطرة علي اي نزيف عن طريق تطبيق ضغط لطيف مع الرمح الجراحية أو استخدام الحد الأدنى من النبض مع بندقية الحذر. الاستمرار في أزاله العضلات المتبقية بعيدا عن الأوتار باستخدام ملقط
- بمجرد أزاله العضلات ، افصل الأوتار بعناية عن طريق القص بالملقط. يجب ان يكون هناك الكثير من المساحة لتصور والتلاعب الحبل عند اكتمال هذه الخطوة. تاكد من ان المادة الجافية للمساحة بين الفقرية ، والعظم الرقائقي شبه الشفاف ، والاوعيه الدموية السطحية المركزية تحت العظم ، والشريان المشع الامامي أصبحت الآن مرئية بوضوح.
- الرطب في المنطقة مع aCSF الدافئة. استخدام microdrill لرقيقه بشكل متكرر العظم الصفائي باستخدام السكتات الدماغية المستقيمة موازيه للمحور الطويل من الحبل الشوكي (الشكل 2، الشكل 3). إذا رغبت في ذلك ، والاستفادة من مرحله مزلق لتدوير منصة الجراحية لراحة مريحه محسنه (علي سبيل المثال ، يمكن للمشغل اليمني تدوير المنصة الجراحية عكس عقارب الدقيقة لخطوه الحفر).
ملاحظه: يتم بناء المرحلة مزلق المستخدمة من لوحه ألمنيوم العلوي الذي الشرائح ± 15 ملم فيما يتعلق لوحه قاعده ثابته. - فهم برفق عمليه سبينوس سطحيه مع ملقط ورفع الفقرة. يجب ان ترفع العظم بعيدا بسهوله. إذا كان هناك مقاومه ، وتكرار ترقق العظام مع الحفر وإذا لزم الأمر استخدام مقص القزحية ، وتوخي الحذر لهدف نصائح مقص التصاعدي لتجنب اتلاف الانسجه.
ملاحظه: من أجل الحفاظ علي الجافية سليمه ، فمن الضروري عدم الشد علي العظم. - استخدام ملقط #4 لمسح بعيدا اي شظايا العظام. استخدام الرمح الجراحية لتطبيق ضغط ثابت لطيف للسيطرة علي اي نزيف. شطف الانسجه مع aCSF الدافئة. لا تسمح للانسجه بالجفاف.
5. الغطاء-زرع الزجاج
- ضعي برفق 3 مم غطاء البوسيليكات-الزجاج علي الحبل المكشوف.
- تاكد من ان يتم تبريد اجنشا إلى 39 درجه مئوية. باستخدام ملعقة صغيره ، وتطبيق الحارة 2 ٪ اجنشا/aCSF إلى حافه الغطاء الزجاج والسماح العمل الشعرية لرسمه تحت السطح.
ملاحظه: عند درجات حرارة اقل من 39 درجه مئوية ، قد تبدا الاغثار بالهلام. في حاله حدوث ذلك ، يسخن باستخدام حمام مائي أو ميكروويف. بعض المشغلين يفضلون أولا تطبيق قطره واحده من اجنشا ووضع غطاء الزجاج علي القمه. - ضعي لاصق الانسجه علي العمليات المفصلية العظمية المكشوفة للفقرة المجاورة السليمة علي المستوي الصدري 11 في العمود الفقري ومستوي الصدر 13 العمود الفقري. تطبيق لاصق الانسجه اضافيه في حلقه حول موقع استئصال الصفيحة الفقرية ، علي وتر المجاورة وعمليه عرضيه.
ملاحظه: مطلوب لاصق الانسجه للالتزام السليم للاسمنت الأسنان في الخطوات اللاحقة. تشكل العمليات المفصلية مقعدا طبيعيا يمكن ان تستريح عليه الصفيحة الخلفية (الشكل 3). التصاق بالعمليات المفصلية سيشكل اقوي نقاط التعلق. - خلط الاسمنت الأسنان مع تسارع في صينية خلط الخزف. استخدام ملعقة صغيره لنقل الاسمنت الأسنان علي طبقه لاصقه الانسجه. استخدام الاسمنت الأسنان للالتزام حامي إلى المجال الجراحي ، تركزت علي النافذة. السماح 10 دقيقه للاسمنت الأسنان لعلاج.
ملاحظه: ان التصاق اللوحة الخلفية بالعمليات المفصلية الاماميه والخلفية يوفر الاستقرار الهيكلي الأساسي للزرع. - استخدام الاسمنت الأسنان اضافيه لملء القاعدة الداخلية من اللوحة الخلفية ، والسفلي من اللوحة الخلفية: واجهه الانسجه.
ملاحظه: التطبيق الإضافي للاسمنت الأسنان يحسن التزام ويقلل من خطر تسرب السائل الغمر الهدف المجهر (المالحة) من أسفل اللوحة الخلفية. - تقدم حامل اللوحة الخلفية المتشعب إلى الموضع المناسب عبر النافذة. تامين اللوحة الخلفية في حامل اللوحة الخلفية مع مسامير.
ملاحظه: استخدم هذا البروتوكول حامل اللوحة الخلفية المخصصة (الشكل 2G\U2012H). - ضع المحلول الملحي علي اللوحة الخلفية لاختبار التسرب. إذا كان اي تسرب السوائل ، وتجفيف المنطقة وتطبيق المزيد من الاسمنت الأسنان.
6. اعداد التصوير
- نقل الحيوانية علي منصة الجراحية إلى الجدول البصري.
ملاحظه: يمكن نقل منصتنا الجراحية ، حامل اللوحة الخلفية ، وحامل مخروط الأنف ايزوفلونان بين محطتي التصوير الجراحية والفوتون كوحدة واحده ، مع تطبيق التخدير الايزوفلواني المستمر (الشكل 2D،H). ويمكن تجميع وحدات مماثله من الشوك والحزم والدعامات الداعمة التي يمكن الحصول عليها من المصادر التجارية (مثل ثورلاب). لانترافيتال المجهري ، يجب ان يكون هناك ما لا يقل عن 11 بوصه من أزاله بين هدف المجهر والجدول البصري لاستيعاب ارتفاع منصة الجراحية. - Affix المنصة الجراحية إلى الجدول البصري باستخدام الفولاذ المقاوم للصدا تصاعد آخر الملل لقط شوكه.
- تطبيق المالحة الطازجة في بئر الصفيحة الخلفية. خفض عدسه الغمر بالماء في البئر.
- استخدم الضوء المرسل أو الضوئي لتحديد مجال الاهتمام والتركيز. التبديل إلى وضع المسح الضوئي بالليزر وأداء في الصور المجرية وفقا لطول الموجات الليزر الاثاره المناسبة اثنين من الفوتون ، والمرشحات الثنائية والممرات للفلوبورس الموجودة في الانسجه6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توفر النوافذ الزجاجية المزروعة والانترافيتال المجهري ثنائي الفوتون أداه مفيده لتقييم التغيرات الديناميكية في بروتينات الجهاز العصبي العام. تتاثر السلامة الوظيفية لل BBB بالتعبير ، والتعريب تحت الخلوي ، ومعدلات دوران البروتينات المفرقة الضيقة7. وقد أظهرت الدراسات السابقة ان البروتينات تقاطع ضيق الخضوع لأعاده عرض سريعة وديناميكية في حاله مستقره8. وقد استخدمت في الوقت الراهن لاستئصال الصفيحة الفقرية والزجاج اعداد النافذة في eGFP المحورة وراثيا: الفئران العرج-59، التي تحمل البروتينات تقاطع ضيق الفلورسنت ، لتقييم BBB تقاطع ضيق أعاده عرض في المناعة الذاتية التجريبية النخاع الدماغي (EAE) نموذج التصلب المتعدد10. في البيانات التمثيلية ، تم تحقيق التصوير من eGFP: العرج-5 مع المجهر اثنين من الفوتون مع 920 nm الاثاره ، 40 × الهدف الاشعه تحت الحمراء (0.8 NA) ، وفلتر الانبعاثات الأخضر فلوري (الشكل 4). تم أخذ عينات المكدسات البصرية في خطوات محوريه 2 μm إلى 100 μm تحت سطح الأورال. بيانات تصور التصور من التقاطعات المسمية فلوريسسينتلي في جميع انحاء الضفيرة الوعائية. يتم تضمين الشرائح البصرية واحده والصور الإسقاط Z (الشكل 4). يشير الترسيم الواضح للهياكل المفرقة الضيقة في الإسقاط Z (الشكل 4 ب) إلى ان الحد الأدنى من أزاحه الصورة X-Y ينتج بعد استئصال الصفيحة بنجاح ، ووضع النوافذ ، وغرس الصفيحة الخلفية.
الشكل 1 مخصص المطبوعة اللوحة الخلفية الاستقرار. ا) اللوحات الخلفية المتعامدة . [ ب-د]) [تثليث] شبكه نماذج من ظهريه وسطوح بطنيه من اللوح خلفي. E) مطبوعه بشكل صحيح backplate. F) اللوحة الخلفية المطبوعة بشكل غير صحيح. راجع الملفات الاضافيه 1 و 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 الخطوات الجراحية لاستئصال الصفيحة. A) ايزوفلواني التخدير نظام التسليم باستخدام المبخر الرقمية المتكاملة بما في ذلك (ط) شاشه تعمل باللمس للسيطرة علي التخدير ، ' 2 ' بطلب التحكم ، ' 3 ' المدخلات لاختياري أضافه علي وحدات فسيولوجيا ، ' 4 ' تركيز التخدير تعديل مقبض الباب ، (v) حقنه مضخة انتهازي كتله ، (6) حقنه مع ايزوفلوان ، (7) المبخر الرقمية المتكاملة ، (viii) الأنابيب الهام ، (9) أنابيب الهام لغرفه التعريفي ، (خ) غرفه التعريفي ، (xi) الأنابيب الهام لمخروط الأنف ، (xii) أنابيب انتهاء الصلاحية لمخروط الأنف ، (xiii) أنابيب انتهاء الصلاحية للغرفة التعريفي. ب) وتشمل الاداات المستخدمة في استئصال الصفيحة (ط) تغذيه مرتده وحده التدفئة التي تسيطر عليها ، ' 2 ' المسبار ترمومتر المستقيم المقترن ك ، ' 3 ' مرنه وساده التدفئة سيليكون ، ' 4 ' #11 شفره ، ' 5 ' #5 ملقط ، ' 6 ' ملقط التيتانيوم مسننه ، ' 7 ' قزحية التيتانيوم مقص ، (viii) العظام المجهرية ، (ix) بندقية الحذر ، (x) 3D المطبوعة backplate ، (xi) الرماح الجراحية رغوة ماصه ، (xii) صينية خلط السيراميك لراتنج الأكريليك ، (xiii) الراتنج الأكريليك ومسرعة ، (xiii) لاصق الانسجه ، (xiv) مواد تشحيم العيون ، (xv) 3 مم تغطيه الزجاج. ج) المجسم والمنصة الجراحية. اثناء الجراحة ، ومنصة الجراحية يجلس علي مرحله مزلق (الفضة والأسود جولة قاعده علي مرحله المجهر). د) الماوس تقع علي منصة الجراحية المخصصة مع سرير ساخن ، بعد شق منتصف الخط السطحي. الحامل الايزوفلواني الأنفي قابل للتعديل في المحورين Y و Z لاستيعاب الفئران الصغيرة والكبيرة. قضبان الاذن تستقر الراس بالنسبة لل nosecone. يقيس المسبار الحراري المستقيم درجه الحرارة الاساسيه. ه) المجال الجراحي في خطوه لأزاله العضلات. F) المجال الجراحي بعد أزاله العضلات. ز) المجال الجراحي خلال ترقق العظم الفقري. ح) المجال الجراحي بعد أزاله العظم الفقري. I) المجال الجراحي اثناء وضع زجاج الغلاف. ي) المجال الجراحي بعد وضع زجاج الغلاف. K) المجال الجراحي خلال طلاء الاوليه مع الأكريليك. L) المجال الجراحي بعد الانتهاء من زرع الصفيحة الخلفية. M-N) الماوس المتمركزة في المحطة الجراحية بعد الانتهاء من استئصال الصفيحة. شوكه النحاس هو قابل للتعديل في X-، Y-، و Z-محاور لتحديد المواقع علي موقع النخاع الشوكي لاستئصال الصفيحة الفقرية. وترتكز الشوكة ميكانيكيا إلى المنصة الجراحية لتوفير الاستقرار الأمثل لمجال التصوير اثناء الجراحة والتطبيقات النهائية بما في ذلك المجهر الانترافيتال ثنائي الفوتون. اثناء الجراحة ، يتم تركيب المنصة الجراحية علي مرحله مزلقه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 تصوير تخطيطي لوضع تشريحي لنافذه الحبل الشوكي. ا) التصوير التخطيطي للراي المتفوق للجسم الفقري الصدري السفلي ، والعملية الشائكة ، وجزء الحبل الشوكي (sc). وتصور الدائرة المنقطة مقعد العملية المفصلية ، وهي نقطه الدعم الرئيسية للتصاق الصفيحة الخلفية. ب) التصوير التخطيطي لرؤية متفوقة من نافذه الحبل الشوكي. تمت أزاله العمود الفقري المستهدف (هنا ، T12). طبقه رقيقه من اجنشا تراكب الحبل الشوكي. والغطاء الزجاجي يقع علي قمة الاجثار. يتم تطبيق لاصق الانسجه علي العمليات العرضية (ولا يظهر هنا ، علي العملية المفصلية المكشوفة للعمود الفقري الفقاري المجاور والسليم). الاسمنت الأسنان تراكبات لاصقه الانسجه. تلتصق اللوحة الخلفية بالاسمنت النسيجي ، وتستقر علي العمليات العرضية (المعروضة) والعملية المفصلية للعمود الفقري الفقاري السليم (غير الظاهر في هذه اللوحة). يتم تطبيق طبقه رقيقه اضافيه من الاسمنت الأسنان علي المناطق الداخلية من حافه اللوحة الخلفية. ويصور اللوحة الخلفية في عرض كوتاواي لتصور الغطاء الزجاج. ج) تصوير تخطيطي للراي الجانبي لنافذه الحبل الشوكي. تمت أزاله العمود الفقري المستهدف (هنا ، T12). طبقه رقيقه من اجنشا تراكب الحبل الشوكي. غطاء الزجاج تقع علي راس الاجثار. يتم تطبيق لاصق الانسجه علي العملية المفصلية المكشوفة للعمود الفقري المجاور والسليم T11 و T13. الاسمنت الأسنان تراكبات لاصقه الانسجه. تلتصق الصفيحة الخلفية بالاسمنت النسيجي ، وتستقر علي العمليات العرضية والمعالجة المفصلية لأشواك العمود الفقري السليمة المجاورة (المعروضة). ويصور اللوحة الخلفية في عرض القطع. في وجهه نظر الجانبية الحقيقية والتي تم حجبها وتغطيه الزجاج من قبل الجدار الجانبي للوحه الخلفية. تستند الهياكل التشريحية علي التصوير بالرنين المغناطيسي المفصل للعمود الفقري C57Bl/6 الذي أجراه هاريسون وزملاءه 11. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 ضيق تقاطع الهيكل المجهري تصورها eGFP: العرج-5 في الحبل الشوكي الماوس بواسطة انترافيتال المجهر اثنين من الفوتون. ا) قسم البصرية واحده اتخذت في 30 ميكرومتر تحت السطح الوضعي في egfp صحية: الماوس العرج-5. السهم الأحمر يصور الجزء الموصل الضيق الذي يمتد علي شكل متعامد مع محور التقاطع الطولي الضيق. شريط مقياس يمثل 5 μm. أقحم: شريط مقياس يمثل 10 μm. B) Z-الإسقاط من شبكه الاوعيه الدموية تمديد 100 μm تحت سطح العصب من الحبل الشوكي الماوس صحية. تم أخذ عينات من المكدس البصري في حجم الخطوة المحورية 2 μm ويتضمن شريحة من لوحه A. لم يتم تنفيذ اي محاذاة للصورة. يوضح الترسيم الحاد للهياكل المتعاقبة في الإسقاط Z الحد الأدنى من أزاحه الصورة بين الإطارات المتتابعة. ج) مجموعه فرعيه تمثيليه من الشرائح البصرية التي اتخذت في فواصل 10 ميكرومتر من الناتجة Z-المكدس. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 2. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الموصوفة هنا تسمح للتصوير مستقره من الحبل الشوكي في الفئران من خلال نافذه زجاجيه. وقد تم تطبيق هذه الطريقة لتقييم BBB أعاده عرض في eGFP المحورة وراثيا: Claudin5 +/-الفئران التي تعبر عن الفلورية BBB البروتين مفرق ضيق ، ولكن يمكن تطبيقها بشكل جيد علي قدم المساواة للدراسات من اي البروتينات الفلورية أو الخلايا في الحبل الشوكي.
وقد تم تطوير طرق متعددة لاستئصال الصفيحة الفقرية وتثبيت الحبل الشوكي. جميع البروتوكولات عنوان تثبيت الحبل الشوكي اثناء التصوير وتنفيذ النافذة للوصول البصري إلى بنيه الفائدة. ويختلف عدد الفقرات المزالة ودرجه غزو البروتوكولات المتاحة (عليسبيل المثال ، المكونات اللاصقة علي سطح العظم السطحي ، كما هو الشان في البروتوكول الحالي ، مقابل الجزء الأكبر). دافالوس و Akassoglou2 وضعت طريقه استئصال الصفيحة باستخدام المشابك القابلة للازاله علي كل جانب من العمود الفقري والمشبك واحد في قاعده ذيل الماوس من أجل تحقيق الاستقرار في الحبل الشوكي. هذه الاستراتيجية المبتكرة لتعليق الحيوانية بالارتياح بعض من النزوح الصدري الناجم عن حركه الرئتين التوسع ضد الجدول الجراحي. لخلق بئر لاحتواء السائل الغمر لعدسه الغمر المياه المجهرية ، وقدمت حافه من ختم الجيلاتين (مثل الصقر) حول الحبل الشوكي ومليئه acsf. يمكن ان تتعطل حافه الختم اثناء التصوير ، ولكن يمكن أيضا ان تمحي بسهوله في نهاية الدورة لتمكين إغلاق الجرح وأعاده الاعمار اللاحقة. وقد اعتمدت هذه الطريقة علي نطاق واسع في12و13. ووضعت مجموعات أخرى أساليب بديله لتحقيق الاستقرار. Fenrich et al. 4 مقاطع الورق المعدلة المعدة يدويا كوسيلة لتامين العمود الفقري. تم تامين هذه القصاصات الورقية المعدلة في الدعامات الفقرية الجانبية مع صمغ السيانولات والحفاظ عليها كمقابض مزروعة بشكل دائم لمقطع خارجي قابل للازاله وشوكه قابضه خارجيه لثبات الحركة الممتاز. وقد قدمت cupido والزملاء الاختلافات علي الطرق المذكورة أعلاه مع ادراج الاغثار علي الحبل2,4,12. طور فارار و شيفر3 مثبت معدني رباعي الأضلاع يمكن ان يسمح بتنفيذ نافذه زجاجيه علي ثلاث فقرات بدلا من واحده فقط. هذا الأسلوب يسمح أيضا الحبل الشوكي ان تعلق مع مسامير لاستقرار جسر أكبر اثناء التصوير للحد من الحركة المحتملة. وقد تم تطوير مجهر فوتون واحد المصغرة مزروعة مباشره علي غرفه التصوير استئصال الصفيحة لفي الجسم المتحرك تسجيل في الفئران تتحرك بحريه علي مستوي فوتون واحد ، ولكن ليست متاحه بعد بسهوله لمعظم المختبرات13 . في نهج مختلف ، Weinger et al. 1 تشريح الحبل الشوكي بأكمله وجزءا لا يتجزا منه في اجنشا للتصوير الجسم الحي السابق ، والذي يسمح لاستقرار الحركة غير قابل للوصول والوصول إلى الحبل الشوكي البطني ، ولكن يلغي تدفق الدم. وتشمل بعض القيود المفروضة علي هذه التطورات وقتا طويلا الجراحية4, ممكن تعطيل الجيلاتين حافه الختم2, الحاجة إلى تخصيص ابعاد الغطاء الزجاجي لتناسب المنطقة المطلوبة من الحبل الشوكي4, دليل تعديل القصاصات الورقية4،12، تقنيات الجراحية الغازية نسبيا12،14، والهواء فقاعات تشكيل عند استخدام السيليكون الاستومر3،4.
لقد وضعنا طريقه بديله التي توفر العديد من المزايا. تم تحسين هذا البروتوكول لتقليل مقدار الوقت المستغرق اثناء الجراحة. في حين ان بعض البروتوكولات الجراحية تتطلب وقتا أطول الاجراء تتراوح بين ساعة ونصف4 إلى ساعة3; يتقن مره واحده ، ويمكن اجراء هذه الطريقة لاستئصال الصفيحة في حوالي 30 دقيقه. تقليل الوقت المستغرق في الجراحة يمكن ان يقلل من الإجهاد الفسيولوجي للماوس ، وتسهيل التجارب العالية الانتاجيه. يزيل هذا البروتوكول فقره واحده ، ويدمج التصاق السطحي لجهاز التثبيت مما يجعله اقل توغلا من بعض البروتوكولات القابلة للمقارنة4،5،12،14. مثل طريقه فيدلي وآخرون، من خلال استخدام زرع البلاستيك هذا البروتوكول يوفر التوافق مع التصوير الصوتي5.
لتجنب تشتت الضوء (اثناء المجهر الانترافيتال) الذي يمكن ان يكون ناجما عن الاختلافات بين المؤشرات الانكسارية للهواء والماء والانسجه ، فان معظم البروتوكولات تراكب طبقه تحتية شفافة بصريا فوق الحبل الشوكي المكشوف. وتشمل ركائز المشتركة عاليه النقاء ، وانخفاض ذوبان درجه الحرارة الاغاروز10،12 أو سيليكون البوليمرات3،4،5. تقدم اجبرز ميزه سهوله الاستخدام ، مع الحد الأدنى من تشكيل فقاعه ، وهو مناسب لجلسات التصوير الحاده. لحماية الانسجه من تلف الحرارة ، فانه من المريح لتسخين اجنشا إلى ما بعد ذوبان نقطه ومن ثم السماح لها لتبرد إلى ~ 39 درجه مئوية في حمام مائي اثناء استئصال الصفيحة ، لذلك يمكن ان تكون جاهزه في الوقت المناسب للتطبيق علي الحبل الشوكي المكشوف. بالنسبة للتصوير المزمن ، فان بوليمرات السيليكون أكثر مقاومه للجفاف. وقد أغفلت التجارب التجريبية اثناء وضع البروتوكول الحالي اما الطبقة التي نشات أو الغطاء المغطي بالزجاج ، ووجدت ان تشتت الضوء الناجم عن ذلك يقلل من عمق التصوير المتاح.
ومن السمات المميزة لهذا البروتوكول دمج اللوحة الخلفية المطبوعة ثلاثية الابعاد وحامل شوكه الخلفية الداعمة. بعد استئصال الصفيحة وغرس النوافذ ، يتم تثبيت الاعداد باضافه لوحه بيضاوية مطبوعه ثلاثية الابعاد يتم إصلاحها في مكانها مع الاسمنت السني. اللوحة الخلفية يخدم وظيفتين: أولا ، فانه يوفر الدعم الهيكلي وتثبيت الحبل الشوكي ، والثانية ، فانه يخلق شفه لعقد السوائل لأغراض الغمر لمجهر. وفي النماذج الاوليه لهذا الاعداد ، استخدمت وظائف الدعامات المتاحة تجاريا والمحولات والشوك القابضة ؛ لقد تحولت مؤخرا إلى أجزاء العرف تشكيله كما هو موضح هنا. في كلتا الحالتين ، فان الميزة الاساسيه هي توفير الصرامة الهيكلية لتحقيق الاستقرار في مجال التصوير ضد الاضطرابات في الفضاء والوقت الناجم عن نبضات القلب والتنفس. علي الرغم من ان الجسم من الحيوانية يستريح فضفاضة علي وساده التدفئة ، يتم تعليق الحبل الشوكي ومجال التصوير الخاص به قليلا من شوكه القابضة ، والتي تقلل أيضا من نزوح الجهاز التنفسي. الركيزة البلاستيك يوفر مرونة طفيفه لاستيعاب التوتر من الشد في حامل لوحه. لون البلاستيك الأسود المستخدمة للطباعة يعكس الحد الأدنى من الضوء في حقل مضان. من خلال هذه الطرق ، ونحن بنجاح إنشاء مكدسات الصور التي يمكن استخدامها دون تعديل المحاذاة المخصصة بعد . وعلاوة علي ذلك ، فان اللوحة الخلفية الثلاثية الابعاد الموصوفة هنا غير مكلفه لإنتاجها ، وتكلف فقط بنسات في المواد لكل طباعه ، بمجرد شراء الطابعة. وعلاوة علي ذلك ، انخفضت تكاليف الطابعات الثلاثية الابعاد في السنوات الاخيره. يمكن تعديل الملفات الهيكلية المطبوعة باللوحة الخلفية ثلاثية الابعاد (انظر الملفين الإضافيين 1 و 2) المنشورينمع هذا البروتوكول بسهوله لتلبيه احتياجات المختبرات الفردية. قمنا بتصميم البعد الطويل من اللوحة الخلفية لاستيعاب المساحة الفقرية التي تم إنشاؤها عن طريق أزاله العمود الفقري الصدري 12 ، الذي يبالغ في الجزء القطني 2/3 الحبل الشوكي11. لتطبيق هذه التقنية علي قسم فقري مختلف ، يمكن تعديل ملفات CAD المصاحبة.
يستخدم هذا البروتوكول نظام تخدير منخفض التدفق متاح تجاريا والذي ينشر المبخر الرقمي المتكامل للحقن المباشر كبديل عن المبخر السلبي التقليدي. والسمة الرئيسية للوحدة المنخفضة التدفق هي انخفاض التعرض للمشغل إلى ايزوفلواني ، وهي فائده صحية كبيره. كما توفر وحده التخدير منخفضه التدفق وفورات في التكاليف بسبب انخفاض استهلاك الايزوفلونان واستخدام هواء الغرفة بدلا من الغاز المضغوط. في هذه الدراسة ، 2 ٪ ايزوفلونان التي ألقاها المبخر الرقمية المتكاملة في 150 mL/min ، مع الدعم الحراري التي تسيطر عليها التغذية المرتدة ، حققت مستوي مستقر من التخدير والصيانة المناسبة لدرجه حرارة الجسم الاساسيه. وتماشيا مع هذا ، فان المقارنات المنشورة لأجهزه التبخير الرقمية المتكاملة والمبخرات التقليدية قد خلصت أيضا إلى ان المبخر الرقمي المتكامل يعطي مستوي مستقرا من التخدير والحفاظ علي درجه حرارة الجسم الاساسيه ، ومعدل ضربات القلب ، معدل التنفس ، والانتعاش في حين استخدام اقل ايزوفلواني15،16.
دواء غير الستيرويديه المضادة للالتهابات (NSAID) مثل كاربروفين يمكن ان تدار قبل الجراحة كمسكن التكميلية. علي مدي ساعات قليله ، مضادات التهاب غير الستيروئيديه تمنع النسخ السايسيسيني التهابيه وذمه الخلالي. الاداره المتعددة الأيام يخفف من شده الامراض التهابيه العصبية بما في ذلك التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي ، وهو نموذج حيواني من التصلب المتعدد17،18. لا سيما في دراسة مرض التهاب العصبي ، يجب ان تكون الآثار المفيدة لكاربروفين تسكين وزنها بعناية ضد الامراض تعديل الآثار عند تحديد التسكين والتخدير لتجربه في التنسيق الوثيق مع مجالس التنظيمية المناسبة.
والحد من هذه الطريقة هو انها ليست قابله بسهوله لجلسات التصوير المتكررة عبر عده أيام. والسبب الرئيسي هو ان هيكل حامي كبير جدا لإغلاق الجلد أكثر. ولذلك ، هناك خطر ان الماوس سيتم أزاحه اللوحة الخلفية عند الاستيقاظ من التخدير. إذا كان التصوير المتكرر ضروريا ، فهناك العديد من الاستراتيجيات التي يمكن نشرها ، بما في ذلك تقليل حجم اللوحة الخلفية ، أو تغيير التركيب. كما هو الأمر مع اي عمليه جراحيه ، هناك منحني التعلم للمشغلين. ويلزم التنسيق الوثيق مع المكاتب المؤسسية لرعاية الماشية ومجالس المراجعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويدعم S.E. لوتس من قبل المركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية, المعاهد الوطنية للصحة, تحت منحه KL2TR002002 وجامعه إلينوي شيكاغو كليه الطب بدء الأموال. ويدعم سيمون الفورد من قبل RO1 MH084874. المحتوي هو فقط مسؤوليه المؤلفين ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية لمعاهد القومية للصحة. ويشكر المؤلفان دراتان اغاليو في قسم علم الأعصاب في المركز الطبي بجامعه كولومبيا لأجهزه الفئران التي تعمل بالرنين العصبي الليفي: كلوبين-5 ، والمناقشات العلمية ، والرؤى في تطوير البروتوكول الجراحي وتطبيقات التصوير. ويشكر المؤلفون سونيل ب. غاندي في قسم بيولوجيا الأعصاب والسلوك في جامعه كاليفورنيا ، ايرفين لتصميم النموذج الاولي للجهاز المجسم ووحده تحكم درجه الحرارة الحيوانية ، ومناقشه البروتوكول الجراحي ، التدريب في المجهر الثنائي الفوتون. ويشكر المؤلفون أيضا ستيف بيكنز (w. Nuhsbaum, Inc.) للحصول علي المساعدة في تخصيص المجسم الفراغي الجراحي ، و Ron Lipinski (صناعه الحيتان) للأجزاء المجسمة بالقطع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F. Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. Bakota, L., Brandt, R. , Springer. New York. 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
