Summary
Dit protocol beschrijft implantatie van een glas venster op het ruggenmerg van een muis om visualisatie te vergemakkelijken door intravital microscopie.
Abstract
Dit protocol beschrijft een methode voor de implantatie van het ruggenmerg en de glazen ruit voor in vivo beeldvorming van het ruggenmerg van de muis. Een geïntegreerde digitale vaporizer wordt gebruikt om een stabiel vlak van anesthesie te bereiken bij een laag debiet van isoflurane. Er wordt een enkele wervel wervelkolom verwijderd en een in de handel verkrijgbare afdekglas wordt op een dun agarose bed gelegd. Een 3D-gedrukte kunststof achterplaat wordt vervolgens aangebracht op de aangrenzende wervel stekels met behulp van weefsellijm en tand cement. Een stabilisatie platform wordt gebruikt om bewegings artefact te verminderen van ademhaling en hartslag. Deze snelle en Clamp-Free methode is zeer geschikt voor acute multi-photon fluorescentiemicroscopie. Representatieve gegevens zijn opgenomen voor een toepassing van deze techniek op twee-Fobe microscopie van de ruggenmerg-vasculatuur in transgene muizen die eGFP uitdrukken: Claudin-5 — een strak koppelings eiwit.
Introduction
Transgene diermodellen die fluorescerende eiwitten uitdrukken, in combinatie met intravital microscopie, bieden een krachtig platform voor het aanpakken van biologie en pathofysiologie. Om deze technieken toe te passen op het ruggenmerg zijn gespecialiseerde protocollen vereist om het ruggenmerg voor te bereiden op beeldvorming. Een dergelijke strategie is het uitvoeren van een laminectomie en de implantatie van het ruggenmerg venster. De belangrijkste kenmerken van een ideaal laminectomie protocol voor microscopie omvatten behoud van native weefselstructuur en functie, stabiliteit van het beeldvormings veld, snelle verwerkingstijd en reproduceerbaarheid van resultaten. Een bijzondere uitdaging is om het beeldvormings veld te stabiliseren tegen de beweging geïnduceerd door ademhaling en hartslag. Er zijn meerdere ex vivo -en in vivo -strategieën gerapporteerd om deze doelen te bereiken1,2,3,4,5. De meeste in vivo -methoden omvatten het klemmen van de zijkanten van de wervelkolom2,4 en wordt vaak gevolgd door het implanteren van een rigide metalen apparaat3,4 voor stabiliteit tijdens chirurgie en downstreambeeldverwerkings toepassingen. Klemmen van de wervelkolom kan potentieel compromitteren bloedstroom en induceren bloed-hersen barrière (BBB) eiwit remodelleren.
Het doel van deze methode is om het intacte ruggenmerg beschikbaar te maken voor optische beeldvorming in de levende muis, terwijl de invasiviteit van het protocol wordt geminimaliseerd en de resultaten worden verbeterd. We beschrijven een enkele laminectomie en Cover-Glass implantatie procedure gecombineerd met een minimaal invasieve ovale kunststof 3D-gedrukte achterplaat die nog steeds robuuste mechanische stabiliteit bereikt. De achterplaat wordt direct aan de voorste en achterste wervel stekels met tand cement gehecht. De achterplaat is uitgerust met laterale verlengarmen met schroefgaten die stevig aan de Microscoop worden bevestigd via een metalen arm. Dit verankert effectief de intact voorste en posterieure wervel tot de Microscoop fase, het verstrekken van mechanische weerstand tegen het bewegings artefact dat anders zou worden geïntroduceerd door de ademhaling en hartslag. De methode is geoptimaliseerd voor laminectomie van een enkele wervel op thoracische niveau 12, weglaten van de klemmen gebruikt in alternatieve strategieën voor stabiliteit tijdens in vivo beeldvorming. De procedure is snel, met ongeveer 30 minuten per muis.
Dit protocol kan worden gebruikt voor het bestuderen van de ziekte-mechanismen van de BBB. De BBB is een dynamisch microvasculaire systeem bestaande uit endotheel cellen, vasculaire gladde spieren, pericytes, en astrociet voet processen die zorgen voor een zeer selectieve omgeving voor het centrale zenuwstelsel (CNS). Representatieve gegevens beschrijven de toepassing van dit protocol in transgene muizen die zijn ontwikkeld om verbeterde groene fluorescerende eiwitten (eGFP) uit te drukken: Claudin-5, een BBB-strakke Junction-proteïne. De geleverde achterplaat print bestanden kunnen ook worden aangepast voor alternatieve toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten volgen de protocollen van de Universiteit van Illinois, de instellingen van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van Chicago. Dit is een terminale procedure.
1. bereiding van het reagens
- Maak kunstmatige cerebrale spinale vloeistof (aCSF) voor het bevatten van 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2· 6h2o, 2 mm CACL2· 2H2o in DDH2o. steriel filter en Vries in individuele-gebruik aliquots. Warme aCSF in een waterbad tot 39 °C voor gebruik.
- Warm laag smeltpunt agarose (2%) in aCSF tot volledig opgelost in een waterbad ingesteld op 65 °C. Tijdens de laminectomie, koelen de gesmolten agarose aliquot tot 39 ° c in een waterbad, zodat het kan worden bereid in de nabijheid van de fysiologische temperatuur voor stap 5,2.
Opmerking: de agarose-oplossing kan bij-20 °C worden opgeslagen in aliquots voor eenmalig gebruik. - Bereid steriel 50 mg/mL carprofen in bacteriostatisch water. Bewaren bij 4 °C.
- Reinig de afdek glazen met 70% ethanol, drie wassen van ddH2O en bewaar droog in een stofvrije verpakking.
2. backplate 3D printen
- 3D CAD-software gebruiken wordt gebruikt om een model te maken voor de in Figuur 1getoonde afmetingen. Het interieur is een ellips breedste op het bodemoppervlak met betrekking tot de printer en knippen met een geknipte snede naar een kleinere ellips die een lumen vormt op het tegenoverliggende oppervlak. Twee projecterende armen met gaten om schroeven te accepteren strekken zich lateraal uit, voor bevestiging aan de achterplaat voorvork. Maak vanuit deze 3D-structuur een triangkorrelig 3D-mesh-bestand (. STL bestand).
Opmerking: Zie afbeelding 1B\u2012D en aanvullende bestanden 1 en 2. - Upload het trianguleerde 3D-mesh-bestand naar een 3D-printer.
- Print back plates met een 0,4 mm Hot-end nozzle en een 0,2 mm laag hoogte. Selecteer de nozzle-temperatuur van 205 °C, de bedtemperatuur van 45 °C en de afdruksnelheid van 45 mm/s.
- De resulterende 3D bedrukte achterplaten visueel te beoordelen op de structurele integriteit (Figuur 1e); bruto structureel falen (afwezig lumen, ingeklapte wand) duidt op druk defecten (Figuur 1f).
3. chirurgische voorbereiding
- Verwarm het verwarmingspaneel voor.
- Laad Isofluraan in de doseerspuit terwijl u in een chemische rook afzuigkap werkt. Bevestig de doseerspuit aan de Isofluraan unit.
- Selecteer een 8 \ u201212-week-oude muis. Weeg het dier af. Induceren van anesthesie met behulp van 2% Isofluraan in een inductie kamer. Injecteer carprofen subcutaan bij 5 mg/kg.
- Plaats de nose-cone en lever Isofluraan op 2% met een debiet van 150 ml/min voor onderhoud van een chirurgisch vlak van anesthesie (Figuur 2a\u2012E). Wikkel de verwarmingskussen met een wegwerp absorberend kussentje voor eenvoudig opruimen.
- Plaats een dier op het verwarmingskussen op het chirurgische station en installeer de neuskegel. Smeer de thermometer met petroleum gelei en plaats deze 5 mm in het rectum. Plak de thermometer-probe op de staart voor stabiliteit. Breng oftalmische zalf aan op de ogen van de muis.
- Om de hydratatie te behouden, breng je 200 μL lactaat Ringer oplossing aan met subcutane injectie om de 30 minuten tot aan het einde van het experiment.
- Spray de dorsum met 70% ethanol, verwijder de vacht met de Clippers en reinig de site met Povidon-jodium.
4. laminectomie
- Plaats het dier tussen de gehoor stangen; Deze houden de hoofdpositie van de muis met betrekking tot de neus-kegel.
- Bevestig dat het dier diep verdoofd is zoals beoordeeld door gebrek aan interdigitale knijp reflex en een stabiel ademhalingspatroon.
- Maak een 1,5 cm rostral-caudal incisie op de middenlijn over de onderste thoracale/bovenste lumbale regio met behulp van #11 mes (Figuur 2). Scheid de huid door het te grijpen met stompe getande Tang en/of gehandschoende vingers. Gebruik de tang om het resterende transparante bindweefsel onder de huid te scheiden en te schillen. De oppervlakkige musculatuur moet nu worden blootgesteld; Verplaats dit met een schuim chirurgische speer.
- Gebruik schuim chirurgische speren (of een curette) om de resterende, diepere spier massa van de doel wervel (Thoracic 12) weg te ruimen. Om een zitplaats te creëren voor de achterplaat, ook de spier uit het achterste deel van thoracale 11, en het voorste aspect van thoracale 13. Controle elke bloeding door het aanbrengen van zachte druk met een chirurgische speer of gebruik een minimale puls met een cauterie pistool. Doorgaan met het verwijderen van de resterende spier uit de buurt van de pezen met behulp van Tang
- Zodra de spieren zijn verwijderd, maak voorzichtig de pezen los door te snijden met de Tang. Er moet voldoende ruimte zijn om het snoer te visualiseren en te manipuleren wanneer deze stap is voltooid. Controleer of de Dura materie van de Inter-Vertebrale ruimte, het semi-transparante laminaire bot, het centrale oppervlakkige bloedvat onder het bot, en anterieure stralings slagader nu duidelijk zichtbaar zijn.
- Bevochtig de regio met warme aCSF. Gebruik de microdrill om het laminaire bot herhaaldelijk te verdunnen met rechte lijnen parallel aan de lange as van het ruggenmerg (Figuur 2, Figuur 3). Indien gewenst, gebruik maken van een glijdende fase om het chirurgische platform te roteren voor verbeterd ergonomisch comfort (bijvoorbeeld een rechtshandige operator kan het chirurgische platform linksom draaien voor de boor stap).
Opmerking: de gebruikte glijdende fase is opgebouwd uit een bovenste aluminium plaat die ± 15 mm schuift ten opzichte van de vaste basisplaat. - Pak voorzichtig het oppervlakkige stekelige proces met een tang en til de wervel; het bot moet gemakkelijk weg te tillen. Als er weerstand, herhaal bot verdunnen met de boor en indien nodig gebruik Iris schaar, voorzichtig te richten de schaar tips naar boven om beschadiging van het weefsel te voorkomen.
Opmerking: om de Dura intact te houden, is het essentieel om niet op het bot te trekken. - Gebruik #4 tang om eventuele botshards weg te wissen. Gebruik een chirurgische speer om zachte gestage druk toe te passen om eventuele bloedingen te beheersen. Spoel het weefsel met warme aCSF. Laat het weefsel niet uitdrogen.
5. afdekking-glas implantatie
- Breng een 3 mm borosilicaatkap-glas voorzichtig aan op het blootgestelde snoer.
- Zorg ervoor dat agarose wordt gekoeld tot 39 °C. Gebruik een kleine spatel, Breng warme 2% agarose/aCSF aan de rand van het afdekglas en laat capillaire actie om het onder het oppervlak te trekken.
Let op: bij temperaturen onder de 39 °C kan de agarose beginnen te gel. Als dit gebeurt, opwarmen met behulp van een waterbad of magnetron. Sommige operators verkiezen om eerst een druppel agarose toe te passen en leg het deksel-glas bovenop. - Breng weefsellijm op de blootgestelde Bony articulaire processen van de intact aangrenzende wervel op thoracale niveau 11 wervelkolom en thoracale niveau 13 wervelkolom. Breng extra weefsellijm in een ring rond de laminectomie site, over de aangrenzende pees en dwars proces.
Opmerking: weefsellijm is nodig voor de juiste hechting van het tandheelkundige cement in de daaropvolgende stappen. De articulaire processen vormen een natuurlijk zitje waarop de achterplaat stabiel kan rusten (Figuur 3). Hechting aan de articulaire processen vormen de sterkste punten van gehechtheid. - Meng dentale cement met katalysator in een porseleinen Meng bakje. Gebruik een kleine spatel om dentale cement over te brengen op de weefselzelfklevende laag. Gebruik dentale cement om de achterplaat aan het chirurgische veld te hechten, gecentreerd over het raam. Laat 10 minuten voor het tandheelkundige cement te genezen.
NB: de stevige hechting van de achterplaat aan de voorste en posterieure articulaire processen zorgt voor de fundamentele structurele stabiliteit van het implantaat. - Gebruik extra tand cement om de binnenbasis van de achterplaat te vullen, en de onderzijde van de achterplaat: weefsel interface.
Opmerking: de extra toepassing van tand cement verbetert de hechting en vermindert het risico op lekkage van Microscoop objectieve Dompel vloeistof (zoutoplossing) uit de bodem van de achterplaat. - Vooruit de gevorkte achterplaat houder naar de juiste positie over het raam. Bevestig de achterplaat in de achterplaat houder met schroeven.
Opmerking: dit protocol gebruikt een Custom-bewerkte achterplaat houder (figuur 2g\u2012H). - Breng een zoutoplossing aan op de achterplaat om te testen op lekkage. Als er vloeistof lekt, droog het gebied en breng meer tandheelkundige cement.
6. voorbereiding van Imaging
- Breng het dier op het chirurgische platform over naar de optische tafel.
Opmerking: ons chirurgische platform, achterplaat houder en Isofluraan nose-cone-houder kunnen worden vervoerd tussen chirurgische en twee-Fobe beeldvormings stations als één eenheid, terwijl ze continue Isofluraan anesthesie toepassen (figuur 2D,H). Vergelijkbare units kunnen worden geassembleerd van vorken, balken en ondersteunende pijler posten die verkrijgbaar zijn bij commerciële bronnen (bijv. ThorLabs). Voor intravital microscopie moet er ten minste 11 centimeter speling zijn tussen de Microscoop doelstelling en de optische tabel om de hoogte van het chirurgische platform te kunnen opvangen. - Breng het chirurgische platform aan op de optische tafel met behulp van een roestvrijstalen montage paal en een verveelde klem vork.
- Breng verse zoutoplossing aan op de put van de achterplaat. Verlaag een water-Dompel lens in de put.
- Gebruik verzonden of epifluorescentie licht om het interessegebied en de focus te bepalen. Overschakelen naar Laser scanmodus en uitvoeren in vivo beeldvorming volgens de juiste twee-Photon Laser excitatie golflengte, dichroics en band pass filters voor de fluoroforen aanwezig in het weefsel6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geïmplanteerde glasramen en intravital Two-photon microscopie biedt een nuttig instrument voor het beoordelen van dynamische veranderingen in CNS eiwitten. De functionele integriteit van de BBB wordt beïnvloed door de expressie, subcellulaire lokalisatie, en de omzet van nauwe Junction eiwitten7. Uit eerdere studies is gebleken dat nauwe junctie eiwitten snel en dynamisch remodelleren bij steady state8. De momenteel beschreven laminectomie en glas ruit preparaat is gebruikt in transgene eGFP: Claudin-5 muizen9, die fluorescerende nauwe Junction eiwitten dragen, om te beoordelen BBB strakke Junction remodeling in de experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) model van multiple sclerose10. In de representatieve gegevens werd de beeldvorming van eGFP: Claudin-5 bereikt met een twee-Fobe Microscoop met 920 nm excitatie, een 40 × infrarood doelstelling (0,8 NA) en een groen fluorescentie-emissie filter (Figuur 4). Optische stapels werden bemonsterd bij 2 μm axiale stappen tot 100 μm onder het durale oppervlak. Gegevens tonen visualisatie van de fluorescentiet gelabelde knooppunten doorheen een vasculaire plexus. Enkele optische segmenten en Z-projectie beelden zijn opgenomen (Figuur 4). De duidelijke afbakening van nauwe junctie structuren in de Z-projectie (figuur 4b) geeft aan dat er minimaal X-Y beeld verplaatsing wordt geproduceerd na succesvolle laminectomie, raam plaatsing en achterplaat implantatie.
Figuur 1. Aangepaste gedrukte achterplaat stabilisatie apparaat. A) orthogonale achterplaat weergaven. B-D) getrianguleerde mesh modellen van rugvlak en ventrale oppervlakken van de achterplaat. E) correct bedrukte achterplaat. F) verkeerd bedrukte achterplaat. Zie aanvullende bestanden 1 en 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Chirurgische stappen voor laminectomie. A) isoflurane anesthesie levering systeem met behulp van een geïntegreerde digitale vaporizer met inbegrip van (i) een touchscreen scherm voor het beheersen van anesthesie, (II) controle wijzerplaten, (III) ingangen voor optionele add-on fysiologie modules, (IV) anesthesie concentratie instelknop, (v) spuitpomp Pusher blok, (VI) spuit met Isofluraan, (VII) geïntegreerde digitale vaporizer, (VIII) inspiratie slang, (IX) inspiratie slang voor inductie kamer, (x) inductie kamer, (XI) inspiratie slang voor neus-kegel, (XII) verloop slang voor neus-kegel, (XIII) expiratie slang voor inductie kamer. B) instrumenten die worden gebruikt in de laminectomie omvatten (i) teruggestuurde verwarmingseenheid, (II) K-gekoppelde rectale thermometer-sonde, (III) flexibel silicone verwarmingskussen, (iv) #11 blad, (v) #5 Tang, (VI) tand Titanium Tang, (VII) Titanium Iris schaar, (VIII) bot microdrill, (IX) cauterie Gun, (x) 3D gedrukte achterplaat, (XI) absorberend schuim chirurgische Spears, (XII) keramische Meng lade voor acryl hars, (XIII) acryl hars en accelerant, (XIII) weefsellijm, (XIV) oftalmisch smeermiddel, (XV) 3 mm Cover-glas. C) stereomicroscoop en chirurgisch platform. Tijdens de operatie, het chirurgische platform zit op een Zweef podium (zilver en zwart ronde basis op de Microscoop fase). D) muis gelegen op het aangepaste chirurgische platform met verwarmd bed, na oppervlakkige middellijn incisie. De Isofluraan neuskegel Holder is verstelbaar in de Y-en Z-assen voor kleine en grote muizen. Oor staven stabiliseren het hoofd met betrekking tot de nosecone. De rectale thermoprobe meet de kerntemperatuur. E) chirurgische veld bij de stap van spier verwijdering. F) chirurgische veld na verwijdering van de spier. G) chirurgische veld tijdens het verdunnen van het wervel been. H) chirurgische veld na verwijdering van het wervel been. I) chirurgische veld tijdens de plaatsing van dekglade. J) chirurgische veld na plaatsing van dekglade. K) chirurgische veld tijdens de eerste coating met acryl. L) chirurgische veld na voltooiing van de implantatie van de achterplaat. M-N) Muis geplaatst in het chirurgische station na voltooide laminectomie. De messing vork is verstelbaar in X-, Y-en Z-assen voor positionering over het ruggenmerg laminectomie site. De vork is mechanisch verankerd aan het chirurgische platform om optimale stabilisatie van het beeldvormings veld te bieden tijdens operaties en downstreamtoepassingen, waaronder Two-photon intravital microscopie. Tijdens de operatie wordt het chirurgische platform op een glijdend podium gemonteerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Schematische weergave van anatomische plaatsing van het ruggenmerg venster. A) schematische voorstelling van de superieure weergave van een lager thoracale wervellichaam, stekelige proces, en ruggenmerg (SC) segment. Een gestippelde cirkel toont de zitting van het articulaire proces, het belangrijkste steunpunt voor de hechting van de achterplaat. B) schematische weergave van het superieure aanzicht van het ruggenmerg venster. De doel wervel wervelkolom (hier, T12) is verwijderd. Een dun laagje agarose overlays het ruggenmerg. Een dekglaasje rust bovenop de agarose. Weefsellijm wordt aangebracht over de dwars processen (en, niet hier weergegeven, op het blootgestelde articulaire proces van de aangrenzende, intact Vertebrale stekels). Tand cement overlays de weefsellijm. De achterplaat hecht zich aan het weefsel cement, rust op de dwarse processen (afgebeeld) en het articulaire proces van de aangrenzende, intact Vertebrale stekels (niet weergegeven in dit paneel). Een extra dun laagje tand cement wordt aangebracht op het inwendige van de achterplaat rand. De achterplaat wordt in een cutaway View afgebeeld om het afdekglas te visualiseren. C) schematische voorstelling van de laterale weergave van het ruggenmerg venster. De doel wervel wervelkolom (hier, T12) is verwijderd. Een dun laagje agarose overlays het ruggenmerg. Een afdekglas rust bovenop de agarose. Weefsellijm wordt aangebracht over het blootgestelde articulaire proces van de aangrenzende, intact T11 en T13 Vertebrale stekels. Tand cement overlays de weefsellijm. De achterplaat houdt zich aan het weefsel cement, rust op de dwarse processen en het articulaire proces van de aangrenzende, intact Vertebrale stekels (afgebeeld). De achterplaat wordt afgebeeld in een cutaway View; in een ware zijaanzicht zou de agarose en het afdekglas worden verduisterd door de zijwand van de achterplaat. Anatomische structuren zijn gebaseerd op gedetailleerde magnetische resonantie beeldvorming van de C57Bl/6 wervelkolom onder leiding van Harrison en collega's 11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Strakke Junction microstructuur gevisualiseerd door eGFP: Claudin-5 in de muis ruggenmerg door intravital Two-photon microscopie. A) enkele optische sectie genomen bij 30 μm onder het durale oppervlak in een gezonde EGFP: Claudin-5 muis. Rode pijl toont een eGFP: Claudin-5 strak Junction segment dat loodrecht op de longitudinale nauwe Junction as wordt verlengd. Schaalbalk vertegenwoordigt 5 μm. inset: schaalbalk vertegenwoordigt 10 μm. B) Z-projectie van het vasculaire netwerk dat 100 μm onder het durale oppervlak van het gezonde muis ruggenmerg uitbreidt. De optische stack werd bemonsterd bij 2 μm axiale stapgrootte en bevat het segment van panel A. Er is geen uitlijning van de afbeelding uitgevoerd. Scherpe afbakening van de junctieve structuren in de Z-projectie toont minimale verschuiving van de afbeelding tussen opeenvolgende frames. C) representatieve subset van optische segmenten genomen met intervallen van 10 μm uit de resulterende Z-stack. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend bestand 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode zorgt voor een stabiele beeldvorming van het ruggenmerg bij muizen door middel van een glazen ruit. Deze methode is toegepast om BBB-remodellering in transgene eGFP te beoordelen: Claudin5 +/-muizen die een fluorescerende BBB-nauwe Junction-eiwit uitdrukken, maar het zou even goed kunnen worden toegepast voor studies van fluorescerende eiwitten of cellen in het ruggenmerg.
Er zijn meerdere methoden ontwikkeld voor het stabiliseren van laminectomie en ruggenmerg. Alle protocollen adres stabiliseren van het ruggenmerg tijdens Imaging en Window-implementatie voor visuele toegang tot de structuur van belang. Het aantal verwijderde wervel en de mate van invasiviteit van de beschikbare protocollen variëren (bijv. componenten gelijmd op het oppervlak van het oppervlakkige bot, zoals in het huidige protocol, versus ingebed dieper). Davalos en Akassoglou2 ontwikkelden een laminectomie methode met behulp van verwijderbare klemmen aan elke kant van de wervelkolom en één klem aan de basis van de staart van de muis om het ruggenmerg te stabiliseren. Deze innovatieve strategie om het dier op te schorten, ontlast een deel van de thoracische verplaatsing veroorzaakt door de beweging van de longen die zich uitbreidt tegen de chirurgische tafel. Om een put te creëren voor het bevatten van Dompel vloeistof voor een water onderdompeling microscopische lens, werd een rand van gelatine zegel (bv. gelseal) rond het ruggenmerg gemaakt en gevuld met acsf. De afdichtings rand kan worden verstoord tijdens beeldvorming, maar kan ook gemakkelijk worden weggevaagd aan het einde van de sessie om wondsluiting en daaropvolgende reimaging mogelijk te maken. Deze methode is op grote schaal aangenomen op12,13. Andere groepen hebben alternatieve stabilisatie methodes ontwikkeld. Fenrich et al. 4 handgemaakte gemodificeerde paperclips als een manier om de wervelkolom te beveiligen. Deze gemodificeerde paperclips werden vastgezet in de laterale wervelkolom met Cyanoacrylaat lijm en gehandhaafd als permanent geïmplanteerde handvatten voor een afneembare externe clip en externe vasthoud vork voor uitstekende bewegings stabiliteit. Cupido en collega's hebben variaties op de bovengenoemde methodes gepresenteerd met de opname van agarose overlegde op het koord2,4,12. Farrar en Schaffer3 ontwikkelden een vierhoek metalen stabilisator die het mogelijk zou maken om een glazen ruit op drie wervels te laten uitvoeren in plaats van slechts één. Met deze methode kon ook het ruggenmerg worden bevestigd met schroeven aan een grotere brug stabilisator tijdens beeldvorming om potentiële beweging te verminderen. Een miniatuur One-photon Microscoop die rechtstreeks op de laminectomie Imaging Chamber is geïmplanteerd, is ook ontwikkeld voor in vivo opname in vrij bewegende muizen op het One-photon-niveau, maar is nog niet direct beschikbaar voor de meeste laboratoria13 . In een andere benadering, Weinger et al. 1 ontleed een volledig ruggenmerg en ingebed het in agarose voor ex vivo beeldvorming, wat zorgt voor onsurpassbare bewegings stabiliteit en toegang tot het ventrale ruggenmerg, maar abrogates bloedstroom. Enkele beperkingen van deze ontwikkelingen omvatten langdurige chirurgische tijd4, mogelijke verstoring van de gelatine Seal RIM2, de noodzaak om de afmetingen van het afdekglas aan te passen aan het gewenste oppervlak van het ruggenmerg4, handmatig modificatie van paperclips4,12, relatief invasieve chirurgische technieken12,14en luchtbellen vormen bij gebruik van het silicium elastomeer3,4.
We hebben een alternatieve methode ontwikkeld die verschillende voordelen biedt. Dit protocol is geoptimaliseerd om de hoeveelheid tijd die tijdens de operatie wordt doorgebracht te verminderen. Overwegende dat sommige chirurgische protocollen langere procedure tijden vereisen, variërendvan anderhalf uur tot een uur3; eenmaal onder de knie, deze laminectomie methode kan worden uitgevoerd in ongeveer 30 min. het verminderen van de tijd besteed aan chirurgie kan het verminderen van fysiologische stress aan de muis, en het vergemakkelijken van experimenten met een hogere doorvoer. Dit protocol verwijdert een enkele wervel, en bevat een oppervlakkige hechting van het stabilisatie apparaat waardoor het minder invasief is dan sommige vergelijkbare protocollen4,5,12,14. Net als de methode van Figley et al., door gebruik te maken van een kunststof implantaat dit protocol biedt compatibiliteit met akoestische beeldvorming5.
Om te voorkomen dat lichtverstrooiing (tijdens intravital microscopie) die kan worden veroorzaakt door de verschillen tussen de refractieve indices van lucht, water, en weefsel, de meeste protocollen overlay een optisch transparant substraat over het blootgestelde ruggenmerg. Veelgebruikte substraten zijn hoge zuiverheid, lage smelttemperatuur agarose10,12 of silicone polymeren3,4,5. Agarose biedt het voordeel van gebruiksgemak, met minimale bubbel vorming, en is geschikt voor acute beeldvormings sessies. Om het weefsel tegen hitteschade te beschermen, is het handig om de agarose te verwarmen tot voorbij het smeltpunt en laat het vervolgens afkoelen tot ~ 39 °C in een waterbad tijdens de laminectomie, zodat het op het juiste moment klaar kan zijn voor toepassing op het blootgestelde ruggenmerg. Voor chronische beeldvorming zijn siliconen polymeren beter bestand tegen uitdroging. Proef proeven tijdens de ontwikkeling van het huidige protocol weggelaten ofwel de agarose laag of de bovenliggende cover-glas, en vond dat de daaruit voortvloeiende lichtspreiding verminderde beschikbare diepte van beeldvorming.
Een differentiërende eigenschap van dit protocol is de opname van een 3D gedrukte achterplaat en ondersteunende achterplaat vork houder. Na de laminectomie en venster implantatie wordt het preparaat gestabiliseerd door de toevoeging van een 3D-gedrukte ovale achterplaat die op zijn plaats wordt bevestigd met tandheelkundige cement. De achterplaat dient twee functies: ten eerste, het biedt structurele ondersteuning en stabilisatie van het ruggenmerg, en ten tweede, het creëert een lip om vocht vast te houden voor onderdompeling doelstellingen voor microscopie. In prototypen van deze opstelling werden in de handel verkrijgbare pijler posten, adapters en vasthoud vorken gebruikt; We zijn onlangs overgeschakeld naar aangepaste bewerkte onderdelen zoals hier afgebeeld. In beide gevallen, de essentiële functie is om structurele strengheid te stabiliseren van het beeldveld tegen de verstoringen in de ruimte en de tijd geïnduceerd door hartslag en ademhaling. Hoewel het lichaam van het dier losjes op het verwarmingskussen rust, zijn het ruggenmerg en het beeldvormings veld enigszins opgehangen aan de voorvork, wat ook de luchtwegen verdringing vermindert. Het kunststof substraat biedt een lichte flexibiliteit om de spanning van het schroeven in de plaathouder te kunnen opvangen. De zwarte kunststof kleur die wordt gebruikt voor het printen reflecteert het minimale licht in het fluorescentie veld. Via deze methoden genereren we met succes afbeeldingsstapels die kunnen worden gebruikt zonder aanpassing van de uitlijning van de post-hoc . Bovendien is de 3D-achterplaat die hierin wordt beschreven goedkoop om te produceren, waarbij alleen centen voor elke afdruk worden kost, zodra de printer is aangeschaft. Bovendien zijn de kosten van 3D-printers de afgelopen jaren gedaald. De 3D gedrukte achterplaat structurele bestanden (Zie aanvullende bestanden 1 en 2) gepubliceerd met dit protocol kunnen gemakkelijk worden aangepast om tegemoet te komen aan individuele laboratorium behoeften. We ontwierpen de lange afmeting van de achterplaat om de tussen wervel ruimte te accommoderen die werd gecreëerd door het verwijderen van thoracale 12 wervel wervelkolom, die de lumbale 2/3 ruggenmerg segmenten overligt11. Om deze techniek toe te passen op een andere wervel sectie, kunnen de bijbehorende CAD-bestanden worden gewijzigd.
Dit protocol maakt gebruik van een commercieel beschikbaar low-flow anesthesie systeem dat een digitale geïntegreerde directe injectie vaporizer implementeert als alternatief voor de traditionele passieve vaporizer. Het belangrijkste kenmerk van de lage-stroom eenheid is de verminderde blootstelling van de machinist aan isoflurane, een aanzienlijk gezondheidsvoordeel. De low-flow anesthesie Unit biedt ook kostenbesparingen als gevolg van het verminderde verbruik van Isofluraan en het gebruik van kamerlucht in plaats van samengeperst gas. In de huidige studie, 2% Isofluraan geleverd door geïntegreerde digitale vaporizer op 150 ml/min, samen met feedback-gecontroleerde thermische ondersteuning, bereikte een stabiel vlak van anesthesie en passend onderhoud van de lichaamstemperatuur. Consistent met deze, gepubliceerde vergelijkingen van digitale geïntegreerde vaporizers en traditionele vaporizers hebben ook geconcludeerd dat de digitale geïntegreerde vaporizer levert een stabiel vlak van anesthesie en goed behoud van de lichaamstemperatuur, hartslag, ademhalingsfrequentie en herstel tijdens het gebruik van minder Isofluraan15,16.
Een niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddel (NSAID) zoals carprofen kan pre-operatief worden toegediend als een aanvullend analgeticum. In de loop van enkele uren, Nsaid's remmen inflammatoire cytokine transcriptie en interstitiële oedeem; Meerdaags beheer verzwakt de ernst van neuroinflammatoire ziekten, waaronder experimentele auto-immune encefalomyelitis, een diermodel van multiple sclerose17,18. Vooral in de studie van neuroinflammatoire ziekte moeten de gunstige effecten van carprofen analgesie zorgvuldig worden afgewogen tegen ziektemodificerende effecten bij het bepalen van analgesie en anesthesie voor een experiment in nauwe coördinatie met passende regelgevende raden.
Een beperking van deze methode is dat het niet gemakkelijk kan worden herhaald Imaging sessies over meerdere dagen. De belangrijkste reden is dat de achterplaat structuur te groot is om de huid te sluiten. Daarom is er een risico dat een muis de achterplaat zou ontwen bij het ontwaken van de anesthesie. Als herhaalde beeldvorming essentieel was, zijn er verschillende strategieën die kunnen worden ingezet, waaronder het verkleinen van de achterplaat of het verwisselen van de steun. Zoals bij elke chirurgische ingreep is er een leercurve voor operators. Nauwe afstemming met institutionele Dierenzorg bureaus en Review boards is vereist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het nationaal centrum voor de bevordering van translationele wetenschappen, National Institutes of Health, onder Grant KL2TR002002 en University of Illinois Chicago College of Medicine start-up fondsen Simon Alford wordt ondersteund door RO1 MH084874. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de NIH. De auteurs bedanken Dritan Agalliu in het departement Neurology van Columbia University Medical Center voor de TG eGFP: Claudin-5 muizen, wetenschappelijke discussies, en inzichten in de ontwikkeling van de chirurgische protocol en imaging toepassingen. De auteurs bedanken Sunil P. Gandhi in het departement neurobiologie en gedrag aan de Universiteit van Californië, Irvine voor het ontwerpen van het eerste prototype van het stereo-apparaat en de controller voor dier temperatuur, bespreking van het chirurgische protocol, en training in Two-photon microscopie. De auteurs bedanken ook Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) voor hulp bij het aanpassen van de chirurgische stereomicroscoop, en Ron Lipinski (walvis productie) voor het bewerken van stereotactische onderdelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F. Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. Bakota, L., Brandt, R. , Springer. New York. 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
