Summary
Ce protocole décrit l'implantation d'une fenêtre en verre sur la moelle épinière d'une souris pour faciliter la visualisation par microscopie intravitale.
Abstract
Ce protocole décrit une méthode pour la laminectomy de moelle épinière et l'implantation de fenêtre en verre pour l'imagerie in vivo de la moelle épinière de souris. Un vaporisateur numérique intégré est utilisé pour obtenir un plan stable d'anesthésie à un faible débit d'isoflurane. Une seule colonne vertébrale vertébrale vertébrale est enlevée, et un verre de couverture disponible dans le commerce est recouvert sur un lit agarose mince. Une plaque arrière en plastique imprimée en 3D est ensuite apposée sur les épines vertébrales adjacentes à l'aide d'adhésif tissulaire et de ciment dentaire. Une plate-forme de stabilisation est utilisée pour réduire l'artefact de mouvement de la respiration et du rythme cardiaque. Cette méthode rapide et sans pinces est bien adaptée pour la microscopie à fluorescence multiphoton. Des données représentatives sont incluses pour une application de cette technique à la microscopie à deux photons de la vascularisation de la moelle épinière chez des souris transgéniques exprimant eGFP:Claudin-5 — une protéine de jonction serrée.
Introduction
Les modèles animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes, lorsqu'ils sont combinés avec la microscopie intravitale, fournissent une plate-forme puissante pour aborder la biologie et la pathophysiologie. Pour appliquer ces techniques à la moelle épinière, des protocoles spécialisés sont nécessaires pour préparer la moelle épinière à l'imagerie. Une telle stratégie est de mener une laminectomy et l'implantation de fenêtre de moelle épinière. Les principales caractéristiques d'un protocole idéal de laminectomy pour la microscopie incluent la conservation de la structure et de la fonction indigènes de tissu, la stabilité du champ de formation image, le temps rapide de traitement, et la reproductibilité des résultats. Un défi particulier est de stabiliser le champ d'imagerie contre le mouvement induit par la respiration et le rythme cardiaque. Plusieurs stratégies ex vivo et in vivo ont été signalées pour atteindre ces objectifs1,2,3,4,5. La plupart des méthodes in vivo impliquent le serrage des côtés de la colonne vertébrale2,4 et est souvent suivie par l'implantation d'un appareil métallique rigide3,4 pour la stabilité pendant la chirurgie et applications d'imagerie en aval. Le clampage de la colonne vertébrale peut potentiellement compromettre le flux sanguin et induire la barrière hémato-encéphalique (BBB) remodelage des protéines.
Le but de cette méthode est de rendre la moelle épinière intacte disponible pour l'imagerie optique chez la souris vivante tout en minimisant l'invasivité du protocole et en améliorant les résultats. Nous décrivons une procédure simple de laminectomy et de couverture-verre d'implantation jumelée à une plaque arrière en plastique ovale mini-invasive 3D-imprimée qui réalise toujours la stabilité mécanique robuste. La plaque arrière est directement adhérée aux épines vertébrales antérieures et postérieures avec du ciment dentaire. La plaque arrière est équipée de bras d'extension latérales avec des trous de vis qui se fixent rigidement à l'étape du microscope via un bras métallique. Ceci ancre effectivement la vertèbre antérieure et postérieure intacte au stade de microscope, fournissant la résistance mécanique à l'artefact de mouvement qui autrement serait présenté par la respiration et le battement de coeur. La méthode a été optimisée pour la laminectomy d'une seule vertèbre au niveau thoracique 12, omettant les pinces utilisées dans les stratégies alternatives pour la stabilité pendant l'imagerie in vivo. La procédure est rapide, prenant environ 30 min par souris.
Ce protocole peut être utilisé pour étudier les mécanismes de la maladie de la BBB. Le BBB est un système microvasculaire dynamique composé de cellules endothéliales, de muscles lisses vasculaires, de péricytes et de processus astrocytes qui fournissent un environnement très sélectif pour le système nerveux central (SNC). Les données représentatives décrivent l'application de ce protocole chez les souris transgéniques conçues pour exprimer la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP): Claudin-5, une protéine de jonction serrée BBB. Les fichiers d'impression backplate fournis peuvent également être personnalisés pour d'autres applications.
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Protocol
Toutes les expériences suivent les protocoles du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de l'Illinois à Chicago. Il s'agit d'une procédure terminale.
1. Préparation de réactif
- Préparer le liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) pour contenir 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2'6H2O, 2 mM CaCl2'2H 2O dans le filtre ddH2O. Sterile et congeler dans les aliquots à usage individuel. Réchauffer l'aCSF dans un bain d'eau à 39 oC avant de l'utiliser.
- Agarose chaude à faible point de fusion (2 %) dans aCSF jusqu'à dissolution complète dans un bain d'eau réglé à 65 oC. Pendant la laminectomie, refroidir l'agarose aliquot fondue à 39 oC dans un bain d'eau, de sorte qu'il peut prêt à près de la température physiologique pour l'étape 5.2.
Remarque : La solution d'agarose peut être stockée à -20 oC dans des aliquots à usage unique. - Préparer le carprofène stérile de 50 mg/mL dans de l'eau bactériostatique. Conserver à 4 oC.
- Nettoyez les verres de couverture avec 70 % d'éthanol, trois lavages de ddH2O et entreposez-les à sec dans un contenant sans poussière.
2. Impression 3D Backplate
- Utilisez le logiciel CAO 3D est utilisé pour créer un modèle aux dimensions indiquées dans la figure 1. L'intérieur est une ellipse plus large à la surface inférieure par rapport à l'imprimante et coupé avec une coupe élevée à une ellipse plus petite formant un lumen à la surface opposée. Deux bras de projection avec des trous pour accepter des vis s'étendent latéralement, pour l'attachement à la fourche de fixation de plaque arrière. À partir de cette structure 3D, créez un fichier de maillage 3D triangulé (. fichier STL).
Note: Voir La figure 1B'u2012D et les fichiers complémentaires 1 et 2. - Téléchargez le fichier de maillage 3D triangulé sur une imprimante 3D.
- Imprimez les plaques arrière à l'aide d'une buse chaude de 0,4 mm et d'une hauteur de couche de 0,2 mm. Sélectionnez la température de la buse de 205 oC, la température du lit de 45 oC et la vitesse d'impression de 45 mm/s.
- Évaluer visuellement les plaques arrière imprimées en 3D qui en résultent pour l'intégrité structurale (figure 1E); défaillance structurale brute (absence de lumen, mur effondré) indique des défauts d'impression (figure 1F).
3. Préparation chirurgicale
- Préchauffer le coussin chauffant.
- Chargez l'isoflurane dans la seringue de livraison tout en travaillant dans une hotte chimique de fumée. Fixez la seringue de livraison à l'unité isoflurane.
- Sélectionnez une souris de 8 ans et plus. Pesez l'animal. Induire l'anesthésie en utilisant 2% isoflurane dans une chambre d'induction. Injecter du carprofène à 5 mg/kg sous-cutané.
- Placez le cône nasal et livrez l'isoflurane à 2 % avec un débit de 150 ml/min pour l'entretien d'un plan chirurgical d'anesthésie (Figure 2A'u2012E). Enveloppez le coussin chauffant d'un coussin absorbant jetable pour faciliter le nettoyage.
- Placez un animal sur le coussin chauffant au poste chirurgical et installez le cône nasal. Lubrifier le thermomètre avec de la gelée de pétrole et l'insérer 5 mm dans le rectum. Tapez la sonde du thermomètre à la queue pour plus de stabilité. Appliquer l'onduleur ophtalmique sur les yeux de la souris.
- Pour maintenir l'hydratation, appliquez 200 ll de la solution de Ringer lactée par injection sous-cutanée toutes les 30 min jusqu'à la fin de l'expérience.
- Vaporiser le dorsum avec 70% d'éthanol, retirer la fourrure avec des tondeuses, et nettoyer le site avec de l'iode povidone.
4. Laminectomy
- Placer l'animal entre les barres d'oreilles; ceux-ci maintiennent la position de tête de la souris par rapport au cône de nez.
- Confirmez que l'animal est profondément anesthésié tel qu'évalué par l'absence de réflexe de pincement internumérique et de schéma respiratoire régulier.
- Faire une incision rostrale-caudale de 1,5 cm à mi-ligne au-dessus de la région lombaire thoracique/supérieure inférieure à l'aide d'#11 lame (figure 2). Séparez la peau en la saisissant avec des forceps émoussés et/ou des doigts gantés. Utilisez des forceps pour séparer et éplucher tout tissu conjonctif transparent restant sous la peau. La musculature superficielle devrait maintenant être exposée; déplacer cela avec une lance chirurgicale en mousse.
- Utilisez des lances chirurgicales en mousse (ou une curette) pour effacer la musculature restante et plus profonde de la vertèbre cible (thoracique 12). Pour créer un siège pour la plaque arrière, également effacer le muscle de l'aspect postérieur de 11 thoracique, et l'aspect antérieur de thoracic 13. Contrôlez tout saignement en appliquant une pression douce avec une lance chirurgicale ou utilisez un pouls minimal avec un pistolet de cautérisation. Continuer à enlever le muscle restant loin des tendons à l'aide de forceps
- Une fois les muscles enlevés, détachez soigneusement les tendons en coupant avec des forceps. Il devrait y avoir beaucoup d'espace pour visualiser et manipuler le cordon lorsque cette étape est terminée. Vérifiez que la matière dura de l'espace intervertébral, l'os laminaire semi-transparent, le vaisseau sanguin superficiel central sous l'os, et l'artère rayonnante antérieure sont maintenant clairement visibles.
- Mouillez la région avec un aCSF chaud. Utilisez le microdrill pour éclaircir répétitivement l'os laminaire à l'aide de traits droits parallèles à l'axe long de la moelle épinière (Figure 2, Figure 3). Si vous le souhaitez, utilisez une étape de glisse pour faire pivoter la plate-forme chirurgicale pour un confort ergonomique amélioré (par exemple, un opérateur droitier peut faire pivoter la plate-forme chirurgicale dans le sens inverse des aiguilles d'une montre pour l'étape de forage).
Remarque : L'étape de glisse utilisée est constituée d'une plaque supérieure en aluminium qui glisse de 15 mm par rapport à la plaque de base fixe. - Saisissez doucement le processus spinous superficiel avec des forceps et soulevez la vertèbre ; l'os doit s'éloigner facilement. S'il y a résistance, répétez l'amincissement des os avec la perceuse et, si nécessaire, utilisez des ciseaux à l'iris, en prenant soin de viser les pointes de ciseaux vers le haut pour éviter d'endommager le tissu.
Note: Afin de maintenir la dura intacte, il est essentiel de ne pas tirer sur l'os. - Utilisez #4 forceps pour éliminer les éclats d'os. Utilisez une lance chirurgicale pour appliquer une légère pression constante pour contrôler tout saignement. Rincer le tissu avec l'aCSF chaud. Ne laissez pas le tissu sécher.
5. Implantation de verre de couverture
- Appliquer délicatement un verre de couverture borosilicate de 3 mm sur le cordon exposé.
- Assurez-vous que l'agarose est refroidie à 39 oC. À l'aide d'une petite spatule, appliquer une aurrose chaude de 2 %/aCSF sur le bord du verre de couverture et permettre à l'action capillaire de la dessiner sous la surface.
Remarque : À des températures inférieures à 39 oC, l'agarose peut commencer à geler. Si cela se produit, réchauffement à l'aide d'un bain d'eau ou micro-ondes. Certains opérateurs préfèrent d'abord appliquer une goutte d'agarose et poser le couvercle sur le dessus. - Appliquer l'adhésif tissulaire sur les processus articulaires osseux exposés de la vertèbre adjacente intacte au niveau thoracique 11 colonne vertébrale vertébrale vertébrale vertébrale vertébrale et thoracique de niveau 13 colonne vertébrale vertébrale vertébrale. Appliquer un adhésif tissulaire supplémentaire dans un anneau autour du site de laminectomy, au-dessus du tendon adjacent et du processus transversal.
Remarque : L'adhésif tissulaire est nécessaire pour une bonne observance du ciment dentaire dans les étapes suivantes. Les procédés articulaires forment un siège naturel sur lequel la plaque arrière peut reposer de façon stable (Figure 3). L'adhérence aux processus articulaires formera les points d'attachement les plus forts. - Mélanger le ciment dentaire avec l'accélérant dans un plateau à mélanger en porcelaine. Utilisez une petite spatule pour transférer le ciment dentaire sur la couche adhésive tissulaire. Utilisez du ciment dentaire pour adhérer à la plaque arrière du champ chirurgical, centrée sur la fenêtre. Prévoyez 10 minutes pour que le ciment dentaire guérisse.
Note : L'adhérence ferme de la plaque arrière aux processus articulaires antérieurs et postérieurs fournit la stabilité structurelle fondamentale de l'implant. - Utilisez du ciment dentaire supplémentaire pour remplir la base intérieure de la plaque arrière, et le dessous de la plaque arrière : interface tissulaire.
Remarque : L'application supplémentaire de ciment dentaire améliore l'adhérence et réduit le risque de fuite de liquide d'immersion objectif au microscope (salin) au fond de la plaque arrière. - Avancez le support de plaque arrière fourchu à la position appropriée au-dessus de la fenêtre. Fixer la plaque arrière dans le support de la plaque arrière avec des vis.
Remarque : Ce protocole a utilisé un support de plaque arrière usiné sur mesure (Figure 2G'u2012H). - Appliquer saline sur la plaque arrière pour tester les fuites. En cas de fuite de liquide, séchez la zone et appliquez plus de ciment dentaire.
6. Préparation à l'imagerie
- Transférer l'animal sur la plate-forme chirurgicale à la table optique.
Note : Notre plate-forme chirurgicale, support de plaque arrière, et support de nez-cône d'isoflurane peuvent être transportés entre les stations chirurgicales et les stations d'imagerie de deux photons comme unité, tout en appliquant l'anesthésie continue d'isoflurane (figure 2D,H). Des unités similaires peuvent être assemblées à partir de fourches de retenue, de poutres et de poteaux de pilier de soutien pouvant être obtenus auprès de sources commerciales(p. ex. ThorLabs). Pour la microscopie intravitale, il devrait y avoir au moins 11 pouces de dégagement entre l'objectif du microscope et la table optique pour s'adapter à la hauteur de la plate-forme chirurgicale. - Affix la plate-forme chirurgicale à la table optique à l'aide d'un poteau de montage en acier inoxydable et d'une fourchette de serrage contre-travaillée.
- Appliquer la saline fraîche dans le puits de la plaque arrière. Abaissez une lentille d'immersion en eau dans le puits.
- Utilisez la lumière transmise ou épifluorescence pour identifier la zone d'intérêt et de concentration. Passez au mode de balayage laser et effectuez l'imagerie in vivo selon la longueur d'onde appropriée d'excitation laser de deux photons, les dichroics et les filtres de bandpass pour les fluorophores présents dans le tissu6.
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Representative Results
Les fenêtres en verre implantées et la microscopie intravitale à deux photons constituent un outil utile pour évaluer les changements dynamiques dans les protéines du SNC. L'intégrité fonctionnelle du BBB est influencée par l'expression, la localisation subcellulaire et les taux de rotation des protéines de jonction serrées7. Des études antérieures ont démontré que les protéines de jonction serrées subissent un remodelage rapide et dynamique à l'état stable8. La laminectomy et la préparation de fenêtre en verre actuellement décrites ont été employées dans l'eGFP transgénique :Claudin-5 souris9, qui portent les protéines serrées fluorescentes de jonction, pour évaluer le remodelage serré de jonction de BBB dans l'autoimmune expérimental modèle de sclérose en plaques10. Dans les données représentatives, l'imagerie de l'eGFP:Claudin-5 a été réalisée avec un microscope à deux photons avec une excitation de 920 nm, un objectif infrarouge de plus de 40 (0,8 NA) et un filtre d'émission de fluorescence verte (Figure 4). Des piles optiques ont été échantillonnées à 2 marches axiales à 100 m sous la surface dural. Les données représentent la visualisation des jonctions étiquetées fluorescentes dans un plexus vasculaire. Des tranches optiques uniques et des images de projection Z sont incluses (Figure 4). La délimitation claire des structures de jonction serrées dans la projection Z (Figure 4B) indique que le déplacement minimal de l'image X-Y est produit après une laminectomie réussie, le placement des fenêtres et l'implantation de plaque arrière.
Figure 1. Dispositif de stabilisation de plaque arrière imprimé sur mesure. A) Vues rétro-plaques orthogonales. B-D) Modèles en maille triangulée de surfaces dorsales et ventrales de la plaque arrière. E) Plaque arrière correctement imprimée. F) Plaque arrière mal imprimée. Voir les fichiers complémentaires 1 et 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Étapes chirurgicales pour lalactomie. A) Système de livraison d'anesthésie isoflurane utilisant un vaporisateur numérique intégré comprenant (i) un écran tactile pour contrôler l'anesthésie, (ii) cadrans de commande, (iii) entrées pour les modules de physiologie add-on optionnels, (iv) concentration d'anesthésie bouton d'ajustement, (v) bloc de poussoir de pompe de seringue, (vi) seringue avec isoflurane, (vii) vaporisateur numérique intégré, (viii) tube d'inspiration, (ix) tube d'inspiration pour la chambre d'induction, (x) tube d'inspiration pour le cône de nez, (xii) tube d'expiration pour cône de nez, (xiii) tube d'expiration pour chambre d'induction. B) Les instruments utilisés dans la laminectomie comprennent (i) l'unité de chauffage contrôlée par rétroaction, (ii) sonde de thermomètre rectal couplée K, (iii) coussin chauffant flexible en silicone, (iv) lame de #11, (v) #5 forceps, (vi) forceps en titane à dent, (vii) iris de titane ciseaux, (viii) microdrill os, (ix) canon de cautérisation, (x) plaque arrière imprimée en 3D, (xi) lances chirurgicales en mousse absorbante, (xii) plateau de mélange en céramique pour résine acrylique, (xiii) résine acrylique et accélérant, (xiii) tissu adhésif, (xiv) lubrifiant ophthalmique, (xv) 3 mm en verre de couverture. C) Stéréomicroscope et plate-forme chirurgicale. Pendant la chirurgie, la plate-forme chirurgicale se trouve sur une scène de glisse (base ronde argentée et noire sur la scène de microscope). D) Souris située sur la plate-forme chirurgicale personnalisée avec lit chauffé, après l'incision superficielle de ligne médiane. Le porte-nez isoflurane est réglable dans les axes Y et Z pour accueillir les petites et grandes souris. Les barres d'oreille stabilisent la tête par rapport au cône de nez. Le thermoprobe rectal mesure la température de base. E) Champ chirurgical à l'étape de l'ablation musculaire. F) Champ chirurgical après l'ablation des muscles. G) Champ chirurgical pendant l'amincissement de l'os vertébral. H) Champ chirurgical après l'ablation de l'os vertébral. I) Champ chirurgical pendant le placement de la vitre de couverture. J) Champ chirurgical après le placement de la vitre. K) Champ chirurgical pendant le revêtement initial avec l'acrylique. L) Champ chirurgical après achèvement de l'implanation de plaque arrière. M-N) Souris placée dans le poste chirurgical après lalactomie terminée. La fourche en laiton est réglable dans les axes X,, Y et Z pour le positionnement au-dessus du site de laminectomy de moelle épinière. La fourche est mécaniquement ancrée à la plate-forme chirurgicale pour assurer une stabilisation optimale du champ d'imagerie pendant la chirurgie et les applications en aval, y compris la microscopie intravitale à deux photons. Pendant la chirurgie, la plate-forme chirurgicale est montée sur une scène de glisse. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Représentation schématique du placement anatomique de la fenêtre de moelle épinière. A) Représentation schématique de la vue supérieure d'un corps vertébral thoracique inférieur, d'un processus spinous, et du segment de moelle épinière (sc). Un cercle pointillé représente le siège du processus articulaire, le principal point de soutien pour l'adhérence à la plaque arrière. B) Représentation schématique de la vue supérieure de la fenêtre de la moelle épinière. La colonne vertébrale vertébrale cible (ici, T12) a été enlevée. Une fine couche d'agarose recèle la moelle épinière. Un verre de couverture repose sur l'agarose. L'adhésif tissulaire est appliqué sur les processus transversaux (et, non montré ici, sur le processus articulaire exposé des épines vertébrales adjacentes et intactes). Le ciment dentaire recèle l'adhésif tissulaire. La plaque arrière adhère au ciment tissulaire, reposant sur les processus transversaux (montré) et le processus articulaire des épines vertébrales adjacentes et intactes (non indiquées dans ce panneau). Une fine couche supplémentaire de ciment dentaire est appliquée à l'intérieur de la jante de la plaque arrière. La plaque arrière est représentée dans une vue découpée pour visualiser le couvercle-verre. C) Représentation schématique de la vue latérale de la fenêtre de la moelle épinière. La colonne vertébrale vertébrale cible (ici, T12) a été enlevée. Une fine couche d'agarose recèle la moelle épinière. Un couvercle repose sur l'agarose. L'adhésif tissulaire est appliqué sur le processus articulaire exposé des épines vertébrales vertébrales T11 et T13 adjacentes et intactes. Le ciment dentaire recèle l'adhésif tissulaire. La plaque arrière adhère au ciment tissulaire, reposant sur les processus transversaux et le processus articulaire des épines vertébrales adjacentes et intactes (indiqué). La plaque arrière est représentée dans une vue découpée; dans une vraie vue latérale, l'agarose et le verre de couverture seraient obscurcis par la paroi latérale de la plaque arrière. Les structures anatomiques sont basées sur l'imagerie par résonance magnétique détaillée de la colonne vertébrale C57Bl/6 menée par Harrison et ses collègues 11. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Microstructure de jonction serrée visualisée par eGFP:Claudin-5 dans la moelle épinière de souris par microscopie intravitale de deux photons. A) Section optique unique prise à 30 m sous la surface dural dans une souris saine eGFP:Claudin-5. La flèche rouge représente un segment de jonction serré eGFP:Claudin-5 s'étendant perpendiculairement à l'axe longitudinal de jonction serré. La barre d'échelle représente 5 m. Enset : la barre d'échelle représente 10 m. B) Z-projection du réseau vasculaire s'étendant sur 100 m sous la surface durale de la moelle épinière saine de la souris. La pile optique a été échantillonnée à la taille de l'étape axiale de 2 m et comprend la tranche du panneau A. Aucun alignement d'image n'a été effectué. La délimitation nette des structures de jonction dans la projection Z démontre un déplacement minimal de l'image entre les images consécutives. C) Sous-ensemble représentatif de tranches optiques prises à 10 'm d'intervalles de la pile Z résultante. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Fichier supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La méthode décrite ici permet une imagerie stable de la moelle épinière chez la souris à travers une fenêtre en verre. Cette méthode a été appliquée pour évaluer le remodelage de BBB dans les souris transgéniques eGFP:Claudin5/- qui expriment une protéine fluorescente de jonction serrée de BBB, mais elle pourrait être appliquée également bien pour des études de toutes les protéines fluorescentes ou des cellules dans la moelle épinière.
Des méthodes multiples pour la laminectomy et la stabilisation de moelle épinière ont été développées. Tous les protocoles traitent de la stabilisation de la moelle épinière pendant l'imagerie et la mise en œuvre des fenêtres pour un accès visuel à la structure d'intérêt. Le nombre de vertèbres enlevées et le degré d'invasivité des protocoles disponibles varient(p. ex., composants collés à la surface de l'os superficiel, comme dans le protocole actuel, par opposition à l'enracinement plus profond). Davalos et Akassoglou2 ont développé une méthode de laminectomy utilisant des pinces amovibles de chaque côté de la colonne vertébrale et une pince à la base de la queue de la souris afin de stabiliser la moelle épinière. Cette stratégie innovante de suspension de l'animal a soulagé une partie du déplacement thoracique causé par le mouvement des poumons s'étendant contre la table chirurgicale. Pour créer un puits pour contenir le fluide d'immersion pour une lentille microscopique d'immersion d'eau, un bord de joint de gélatine(par exemple Gelseal) a été fait autour de la moelle épinière et rempli avec aCSF. La jante du joint pourrait être perturbée pendant l'imagerie, mais pourrait également être facilement essuyée à la fin de la séance pour permettre la fermeture des plaies et la réimagerie subséquente. Cette méthode a été largement adoptée12,13. D'autres groupes ont mis au point d'autres méthodes de stabilisation. Fenrich et coll. 4 trombones modifiés préparés à la main comme moyen de fixer la colonne vertébrale. Ces agrafes modifiées de papier ont été fixées dans les pédicles vertébraux latéraux avec la colle de cyanoacrylate et maintenues comme poignées implantées de façon permanente pour un clip externe amovible et une fourche extérieure de fixation pour une excellente stabilité de mouvement. Cupido et ses collègues ont présenté des variations sur les méthodes susmentionnées avec l'incorporation de l'agarose superposée sur le cordon2,4,12. Farrar et Schaffer3 ont mis au point un stabilisateur métallique quadrilatéral qui pourrait permettre la mise en place d'une fenêtre en verre sur trois vertèbres plutôt qu'une seule. Cette méthode a également permis d'attacher la moelle épinière avec des vis à un stabilisateur de pont plus grand pendant l'imagerie afin de réduire le mouvement potentiel. Un microscope monophotonal miniaturisé implanté directement sur la chambre d'imagerie de laminectomy a également été développé pour l'enregistrement in vivo chez les souris en mouvement libre au niveau d'un photon, mais n'est pas encore facilement disponible à la plupart des laboratoires13 . Dans une approche différente, Weinger et coll. 1 disséqué une moelle épinière entière et l'a incorporée dans l'agarose pour l'imagerie ex vivo, qui permet la stabilité insurpassable de mouvement et l'accès à la moelle épinière ventrale, mais abroge le flux sanguin. Certaines limitations de ces développements comprennent le temps chirurgical long4, perturbation possible de la jante de joint de gélatine2, la nécessité de personnaliser les dimensions de couverture-verre pour s'adapter à la zone désirée de la moelle épinière4, manuel modification des trombones4,12, techniques chirurgicales relativement invasives12,14, et bulles d'air formant lors de l'utilisation de l'élastomère de silicium3,4.
Nous avons développé une méthode alternative qui offre plusieurs avantages. Ce protocole a été optimisé pour réduire le temps passé pendant la chirurgie. Considérant que certains protocoles chirurgicaux nécessitent des délais d'intervention plus longs allant d'une heure et demie4 à une heure3; une fois maîtrisée, cette méthode de laminectomy peut être exécutée en approximativement 30 min. La réduction du temps passé dans la chirurgie peut diminuer le stress physiologique à la souris, et faciliter l'expérimentation plus haut-débit. Ce protocole supprime une seule vertèbre, et intègre l'adhérence superficielle du dispositif de stabilisation le rendant moins invasif que certains protocoles comparables4,5,12,14. Comme la méthode de Figley et coll.,en utilisant un implant plastique, ce protocole offre une compatibilité avec l'imagerie acoustique5.
Pour éviter la diffusion de la lumière (pendant la microscopie intravitale) qui pourrait être causée par les différences entre les indices réfractifs de l'air, de l'eau et des tissus, la plupart des protocoles superposer un substrat optiquement transparent sur la moelle épinière exposée. Les substrats communs incluent la haute pureté, la basse température de fusion agarose10,12 ou les polymères de silicone3,4,5. Agarose offre l'avantage de la facilité d'utilisation, avec une formation de bulles minimales, et est approprié pour les séances d'imagerie aigue. Pour protéger le tissu contre les dommages causés par la chaleur, il est commode de chauffer l'agarose au-delà du point de fusion, puis de lui permettre de refroidir jusqu'à 39 oC dans un bain d'eau pendant la laminectomy, de sorte qu'il peut être prêt au moment approprié pour l'application à la moelle épinière exposée. Pour l'imagerie chronique, les polymères de silicone sont plus résistants à la déshydratation. Les essais pilotes au cours de l'élaboration du protocole actuel ont omis soit la couche d'agarose, soit le verre de couverture sus-jacent, et ont constaté que la diffusion de lumière qui en résultait réduisait la profondeur d'imagerie disponible.
Une caractéristique différenciante de ce protocole est l'incorporation d'une plaque arrière imprimée en 3D et d'un support de fourche arrière de soutien. Après la laminectomy et l'implantation de fenêtre, la préparation est stabilisée par l'addition d'une plaque arrière ovale 3D-imprimée qui est fixée en place avec le ciment dentaire. La plaque arrière remplit deux fonctions : premièrement, elle fournit un soutien structurel et une stabilisation de la moelle épinière, et deuxièmement, elle crée une lèvre pour contenir le fluide pour les objectifs d'immersion pour la microscopie. Dans les prototypes de cette configuration, des poteaux de pilier, des adaptateurs et des fourches de fixation disponibles dans le commerce ont été utilisés; nous avons récemment passé à des pièces usinées comme décrit ici. Dans les deux cas, la caractéristique essentielle est de fournir une rigueur structurelle pour stabiliser le champ d'imagerie contre les perturbations dans l'espace et le temps induites par le rythme cardiaque et la respiration. Bien que le corps de l'animal repose lâchement sur le coussin chauffant, la moelle épinière et son champ d'imagerie sont légèrement suspendus à la fourche de retenue, ce qui diminue également le déplacement respiratoire. Le substrat en plastique offre une légère flexibilité pour s'adapter à la tension de vissage dans le support de plaque. La couleur plastique noire utilisée pour l'impression reflète une lumière minimale dans le champ de fluorescence. Grâce à ces méthodes, nous générons avec succès des piles d'images qui peuvent être utilisées sans ajustement d'alignement post hoc. En outre, la plaque arrière 3D décrite ci-contre est peu coûteuse à produire, ne coûtant que quelques centimes de matériel pour chaque impression, une fois l'imprimante achetée. En outre, les coûts des imprimantes 3D ont diminué ces dernières années. Les fichiers structuraux imprimés en 3D (voir les fichiers complémentaires 1 et 2) publiés avec ce protocole peuvent être facilement modifiés pour répondre aux besoins individuels des laboratoires. Nous avons conçu la longue dimension de la plaque arrière pour accueillir l'espace intervertébral créé par l'enlèvement de la colonne vertébrale thoracique 12 vertébrale vertébrale, qui recèle les segments lombaires 2/3 de la moelle épinière11. Pour appliquer cette technique à une autre section vertébrale, les fichiers CAO qui l'accompagnent peuvent être modifiés.
Ce protocole utilise un système d'anesthésie à faible débit disponible dans le commerce qui déploie un vaporisateur à injection directe intégrée numérique comme alternative au vaporisateur passif traditionnel. La principale caractéristique de l'unité à faible débit est l'exposition réduite de l'opérateur à l'isoflurane, un avantage important pour la santé. L'unité d'anesthésie à faible débit offre également des économies en raison de la consommation réduite d'isoflurane et de l'utilisation de l'air de la pièce au lieu du gaz comprimé. Dans la présente étude, 2% isoflurane livré par vaporisateur numérique intégré à 150 ml/min, avec un soutien thermique contrôlé par rétroaction, atteint un plan stable d'anesthésie et le maintien approprié de la température corporelle du cœur. Conformément à cela, les comparaisons publiées des vaporisateurs intégrés numériques et des vaporisateurs traditionnels ont également conclu que le vaporisateur intégré numérique donne un plan stable d'anesthésie et une bonne préservation de la température corporelle de base, de la fréquence cardiaque, respiratoire, et la récupération tout en utilisant moins d'isoflurane15,16.
Un anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) tel que le carprofène peut être administré pre-operatively comme analgésique supplémentaire. Au cours de quelques heures, les AINS inhibent la transcription inflammatoire de cytokine et l'oème interstitiel ; L'administration de plusieurs jours atténue la sévérité des maladies neuroinflammatoires, y compris l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal de sclérose en plaques17,18. Particulièrement dans l'étude de la maladie neuroinflammatoire, les effets bénéfiques de l'analgésie de carprofen doivent être soigneusement pesés contre des effets modifiant de la maladie en déterminant l'analgésie et l'anesthésie pour une expérience en coordination étroite avec les conseils de réglementation appropriés.
Une limitation de cette méthode est qu'elle n'est pas facilement prête aux séances d'imagerie répétées sur plusieurs jours. La raison principale est que la structure de la plaque arrière est trop grande pour fermer la peau. Par conséquent, il y a un risque qu'une souris déloge la plaque arrière au réveil de l'anesthésie. Si l'imagerie répétée était essentielle, plusieurs stratégies pourraient être déployées, y compris la réduction de la taille de la plaque arrière ou le changement de la monture. Comme pour toute intervention chirurgicale, il existe une courbe d'apprentissage pour les opérateurs. Une coordination étroite avec les bureaux de soins aux animaux et les comités d'examen des établissements est nécessaire.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
S.E. Lutz est soutenu par le National Center for Advancing Translational Sciences, les National Institutes of Health, sous Grant KL2TR002002 et les fonds de démarrage de l'Université de l'Illinois Chicago College of Medicine. Simon Alford est soutenu par RO1 MH084874. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des NIH. Les auteurs remercient Dritan Agalliu du département de neurologie du Columbia University Medical Center pour les souris Tg eGFP:Claudin-5, des discussions scientifiques et des idées sur le développement du protocole chirurgical et des applications d'imagerie. Les auteurs remercient Sunil P. Gandhi du Département de neurobiologie et de comportement de l'Université de Californie à Irvine d'avoir conçu le premier prototype de l'appareil stéréotaxique et du contrôleur de température animale, d'avoir discuté du protocole chirurgical et formation à la microscopie à deux photons. Les auteurs remercient également Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) pour son aide dans la personnalisation du stéréomicroscope chirurgical, et Ron Lipinski (Whale Manufacturing) pour l'usinage de pièces stéréotaxiques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
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