Summary
Denne protokollen beskriver implantation av et glass vindu på ryggmargen på en mus for å lette visualisering av intravital mikroskopi.
Abstract
Denne protokollen beskriver en metode for ryggmargen laminectomy og glass vindu implantation for in vivo Imaging av musen ryggmargen. En integrert Digital fordamper er benyttet for å oppnå et stabilt fly av anestesi på en lav-flow rate av isoflurane. En enkelt vertebrale ryggraden er fjernet, og en kommersielt tilgjengelig cover-glass er kledde på en tynn agarose seng. En 3D-trykt plast bakplate er deretter festet til tilstøtende vertebrale pigger ved hjelp av vev lim og Dental sement. En stabiliserings plattform brukes til å redusere bevegelses gjenstanden fra åndedrett og hjerterytme. Denne raske og klemme-fri metoden er velegnet for akutt multi-Foton fluorescens mikroskopi. Representative data er inkludert for bruk av denne teknikken til to-Foton mikroskopi i ryggmargen blodkar i transgene mus som uttrykker eGFP: Claudin-5-et stramt knutepunkt protein.
Introduction
Transgene dyremodeller som uttrykker fluorescerende proteiner, kombinert med intravital mikroskopi, gir en kraftig plattform for adressering av biologi og patofysiologi. For å bruke disse teknikkene i ryggmargen, er spesialiserte protokoller som kreves for å forberede ryggmargen for Imaging. En slik strategi er å gjennomføre en laminectomy og en rygg mARGs implantat. De viktigste funksjonene i en ideell laminectomy protokoll for mikroskopi inkluderer bevaring av Native vev struktur og funksjon, stabilitet av tenkelig feltet, rask behandlingstid, og reproduserbarhet av resultater. En spesiell utfordring er å stabilisere bildefeltet mot bevegelsen indusert av åndedrett og hjerterytme. Flere ex vivo - og in vivo -strategier er rapportert for å oppnå disse målene1,2,3,4,5. De fleste in vivo metoder innebære klemme sidene av ryggsøylen2,4 og blir ofte etterfulgt av implanting et stivt metall apparat3,4 for stabilitet under kirurgi og nedstrøms bildebehandlingsprogrammer. Klemme på ryggsøylen kan potensielt kompromittere blodstrømmen og indusere blod-hjerne barriere (BBB) protein remodeling.
Hensikten med denne metoden er å gjøre intakt ryggmargen tilgjengelig for optisk tenkelig i levende mus samtidig minimere invasiveness av protokollen og forbedre utfall. Vi beskriver én enkelt laminectomy og en implantat prosedyre for dekkglass som er koblet sammen med en minimalt invasiv oval plast 3D-trykt bakplate som fortsatt oppnår robust mekanisk stabilitet. Bakplaten er direkte overholdt de fremre og bakre vertebrale pigger med Dental sement. Bakplaten er utstyrt med lateral forlengelsesarmer med skrue hull som strengt festes til mikroskopet scenen via en metall arm. Dette forankrer effektivt intakt fremre og bakre vertebra til mikroskopet scenen, noe som gir mekanisk motstand mot bevegelse gjenstand som ellers ville bli innført av åndedrett og hjerterytme. Metoden er optimalisert for laminectomy av en enkelt vertebra på bryst nivå 12, og utelater klemmene benyttet i alternative strategier for stabilitet under in vivo Imaging. Prosedyren er rask, tar ca 30 min per mus.
Denne protokollen kan brukes til å studere sykdoms mekanismer av BBB. Den BBB er en dynamisk mikrovaskulær system bestående av endothelial celler, vaskulær glatt muskel, pericytes, og astrocytt foten prosesser som gir et svært selektivt miljø for sentralnervesystemet (CNS). Representative data avbilder anvendelsen av denne protokollen i transgene mus konstruert for å uttrykke forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP): Claudin-5, en BBB stramt veikryss protein. De med følgende utskrifts filene for bakplate kan også tilpasses for alternative bruksområder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter følger University of Illinois, Chicago institusjonelle Animal Care og use Committee protokoller. Dette er en Terminal prosedyre.
1. forberedelse av reagens
- Forbered kunstig cerebral spinalvæske (aCSF) for å inneholde 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukose, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2· 6h2o, 2 mm CaCl2· 2h2o i ddH2o. sterilt filter og fryse i individuelle bruk alikvoter. Varm aCSF i et vannbad til 39 ° c før bruk.
- Varm lav Smeltepunkt agarose (2%) i aCSF til det er helt oppløst i et vannbad satt til 65 ° c. Under laminectomy, Avkjøl smeltet agarose alikvot til 39 ° c i et vannbad, slik at den kan klare på nær fysiologiske temperatur for trinn 5,2.
Merk: den agarose løsningen kan oppbevares ved-20 ° c i en gangs alikvoter. - Klargjør steril 50 mg/mL karprofen i bakteriostatisk vann. Oppbevares ved 4 ° c.
- Rengjør deksel-briller med 70% etanol, tre vasker av ddH2O, og oppbevares tørt i en støvfri beholder.
2. bakplate 3D-utskrift
- Bruk 3D CAD-programvare brukes til å lage en modell til dimensjonene som vises i figur 1. Interiøret er en ellipse bredest på bunnen overflaten med hensyn til skriveren og kuttet med en lofted kutt til en mindre ellipse danner en lumen på motsatt overflate. To prosjektering armer med hull for å akseptere skruer forlenge sidelengs, for festing til bakplate holde gaffel. Fra denne 3D-strukturen, opprette en triangulated 3D mesh-fil (. STL-fil.
Merk: se figur 1B\u2012D og tilleggsfiler 1 og 2. - Last opp den triangulated 3D-mesh-filen til en 3D-skriver.
- Skriv ut bak plater med et 0,4 mm Hot-end munnstykke og en 0,2 mm lag høyde. Velg dyse temperatur på 205 ° c, seng temperatur på 45 ° c, og utskriftshastighet på 45 mm/s.
- Vurder den resulterende 3D-trykte bak plater visuelt for strukturell integritet (figur 1e). grov strukturell svikt (fraværende lumen, kollapset veggen) indikerer utskrift defekter (figur 1F).
3. kirurgisk forberedelse
- Varm opp varmeputen.
- Legg isoflurane i doseringssprøyten mens du arbeider i en kjemisk avtrekks hette. Fest leverings sprøyten til isoflurane enheten.
- Velge en 8 \ u201212-uke-gamle musen. Veie dyret. Indusere anestesi med 2% isoflurane i en induksjon kammer. Injiser karprofen ved 5 mg/kg subkutant.
- Plasser nese membranen og lever isoflurane på 2% med en strømningshastighet på 150 mL/min for vedlikehold av et kirurgisk fly av anestesi (fig.2a\u2012E). Pakk varmeputen med en en gangs absorberende pad for enkel opprydding.
- Plasser et dyr på varmeputen på operasjons stasjonen og Monter nese membranen. Smør termometeret med vaselin og sett den 5 mm inn i endetarmen. Tape termometeret sonden til halen for stabilitet. Påfør øye salve på øynene til musen.
- For å opprettholde hydrering, Påfør 200 μL av lactated ringe løsning med subkutan injeksjon hver 30 min til avslutningen av eksperimentet.
- Spray antecubital med 70% etanol, Fjern pels med Clippers, og rengjør området med povidon-jod.
4. laminectomy
- Plasser dyret mellom øre stolpene; disse opprettholde hodet posisjon av musen med hensyn til nesen-kjegle.
- Bekreft at dyret er dypt anesthetized som vurdert av mangel på Inter klype refleks og jevn åndedretts mønster.
- Lag en 1,5 cm rostral-caudal snitt ved midtlinjen over nedre bryst/øvre korsrygg område ved hjelp av #11 blad (figur 2). Skill huden ved å fatte den med butt tann tang og/eller hansker fingre. Bruk tang for å skille og skrelle tilbake eventuelle gjenværende gjennomsiktig bindevev under huden. Den overfladiske muskulaturen skal nå utsettes; fortrenge dette med et skum kirurgisk spyd.
- Bruk skum kirurgiske spyd (eller en curette) for å fjerne de resterende, dypere muskulaturen av målet vertebra (bryst 12). For å lage et sete for bakplaten, også fjerne muskler fra bakre aspekt av bryst 11, og den fremre aspekt av bryst 13. Kontroller eventuelle blødninger ved å påføre forsiktig trykk med et kirurgisk spyd eller bruk en minimal puls med en cauterization pistol. Fortsett å fjerne de resterende muskelen bort fra sener ved hjelp av Tang
- Når musklene er fjernet, forsiktig løsne sener ved å kutte med tang. Det bør være god plass til å visualisere og manipulere ledningen når dette trinnet er fullført. Sjekk at Dura spørsmål om Inter-vertebrale plass, semi-transparent laminær bein, den sentrale overfladisk blodkar under benet, og fremre stråler arterien er nå godt synlig.
- Fukt regionen med varme aCSF. Bruk microdrill til å full av gjentagelser tynne laminær benet med rette streker parallelt med den lange aksen i ryggmargen (figur 2, Figur 3). Hvis du ønsker det, kan du bruke et gli trinn for å rotere den kirurgiske plattformen for økt ergonomisk komfort (for eksempel, en høyre hånds operatør roterer kanskje den kirurgiske plattformen mot klokken for bore trinnet).
Merk: gliding scenen som brukes er konstruert av en øvre aluminiumsplate som glir ± 15 mm med hensyn til den faste bunnplaten. - Forsiktig gripe den overfladiske spinous prosessen med pinsett og løft vertebra; benet skal løfte bort lett. Hvis det er motstand, gjentar bein tynning med bore og om nødvendig bruke Iris saks, være forsiktig med å sikte saks tips oppover for å unngå å skade vevet.
Merk: for å opprettholde Dura intakt, er det viktig å ikke slepe på benet. - Bruk #4 tang for å fjerne eventuelle bein skår. Bruk et kirurgisk spyd til å påføre forsiktig jevnt Trykk for å kontrollere blødning. Skyll vevet med varmt aCSF. Ikke la vevet tørke ut.
5. dekk-glass-implantat
- Påfør en 3 mm Borosilikatglass deksel-glass til den eksponerte ledningen.
- Sørg for at agarose er avkjølt til 39 ° c. Bruk en liten slikkepott, Påfør varm 2% agarose/aCSF til kanten av dekselet-glass og la kapillær aksjon for å trekke den under overflaten.
Merk: ved temperaturer under 39 ° c kan agarose begynne å gel. Hvis dette skjer, rewarm ved hjelp av et vannbad eller mikrobølgeovn. Noen operatører foretrekker å først bruke en dråpe agarose og legge dekselet-glass på toppen. - Påfør vev klebemiddel på de eksponerte Ben ledd prosessene i intakt tilstøtende vertebra på bryst nivå 11 vertebrale ryggrad og bryst Level 13 vertebrale ryggraden. Påfør ekstra vev lim i en ring rundt laminectomy området, over tilstøtende sene og tverrgående prosess.
Merk: vev limet er nødvendig for forsvarlig overholdelse av Dental sement i de påfølgende trinnene. Ledd prosessene danner et naturlig sete der bakplaten kan hvile stabilt (Figur 3). Vedheft til ledd prosessene vil danne de sterkeste punktene i vedlegget. - Bland Dental sement med Accelerant i et porselen blande brett. Bruk en liten slikkepott til å overføre Dental sement på vevet limet lag. Bruk Dental sement til å feste bakplaten til operasjonsfeltet, sentrert over vinduet. Tillat 10 minutter for dental sement å kurere.
Merk: fast vedheft av bakplate til de fremre og bakre ledd prosessene gir implantatet grunnleggende strukturell stabilitet. - Bruk ekstra Dental sement å fylle i den innvendige bunnen av bakplaten, og undersiden av bakplaten: vev grensesnitt.
Merk: den ekstra anvendelsen av Dental sement forbedrer overholdelse og reduserer risikoen for lekkasje av mikroskop objektiv nedsenking væske (saltvann) ut i bunnen av bakplaten. - Før den Forked bakplate holde ren til riktig posisjon over vinduet. Fest festeplaten til bakplate holde ren med skruer.
Merk: denne protokollen benyttet en egendefinert bearbeidet bakplate holder (figur 2g\u2012H). - Påfør saltvann på bakplaten for å teste for lekkasje. Hvis noen væske lekkasjer, tørk området og bruke mer Dental sement.
6. klargjøring av avbildning
- Overfør dyret på den kirurgiske plattformen til det optiske bordet.
Merk: vår kirurgiske plattform, bakplate holder, og isoflurane nese-kjegle holderen kan transporteres mellom kirurgiske og to-Foton bilde stasjoner som en enhet, mens du søker kontinuerlig isoflurane anestesi (figur 2D,H). Lignende enheter kan monteres fra å holde gafler, bjelker og støttende søyle innlegg skaffes fra kommersielle kilder (f. eks ThorLabs). For intravital mikroskopi, bør det være minst 11 inches klaring mellom mikroskopet objektiv og den optiske tabellen for å imøtekomme høyden på den kirurgiske plattformen. - Fest kirurgisk plattform til den optiske tabellen ved hjelp av en rustfritt stål montering stolpe og counterbored klemme gaffel.
- Påfør fersk saltvann i brønnen på bakplaten. Senk en vann-nedsenking linse i brønnen.
- Bruk overført eller epifluorescence lys for å identifisere området av interesse og fokus. Skru av å laserskanning måte og utføre inne vivo tenkelig alt etter det passende to-Foton laser eksitasjon bølgelengde, dichroics og bånd pass filterene for det fluorophores gave inne vevet6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vinduer med implantat glass og intravital to-Foton-mikroskopi gir et nyttig verktøy for å vurdere dynamiske endringer i CNS-proteiner. Den funksjonelle integriteten til BBB er påvirket av uttrykket, subcellulære lokalisering, og omløpshastighet på trange veikryss proteiner7. Tidligere studier har vist at stramme veikryss proteiner gjennomgår rask og dynamisk remodeling ved steady state8. Den beskrevne laminectomy og glass vindu preparatet har blitt brukt i transgene eGFP: Claudin-5 mus9, som bærer fluorescerende tette veikryss proteiner, for å vurdere BBB stramt knutepunkt remodeling i eksperimentell autoimmune encefalomyelitt (EAE) modell av multippel sklerose10. I representative data, Imaging av eGFP: Claudin-5 ble oppnådd med en to-Foton mikroskop med 920 NM eksitasjon, en 40 × infrarød objektiv (0,8 NA), og en grønn fluorescens utslipps filter (Figur 4). Optiske stabler ble samplet ved 2 μm aksial trinn til 100 μm under dural overflaten. Data skildrer visualisering av fluorescensmerkete merket veikryss gjennom en vaskulær plexus. Enkle optiske skiver og Z-projeksjons bilder er inkludert (Figur 4). Den klare avgrensning av trange knutepunkt strukturer i Z-projeksjon (figur 4b) indikerer at minimal X-Y bilde forskyvning er produsert etter vellykket laminectomy, vindu plassering, og bakplate implantation.
Figur 1. Tilpasset trykt bakplate stabilisering enhet. A) ortogonale bakplate visninger. B-D) triangulated mesh modeller av rygg og ventrale overflater på bakplaten. E) riktig trykt bakplate. F) feil trykt bakplate. Se utfyllende filer 1 og 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kirurgiske trinn for laminectomy. A) isoflurane anestesi levering system utnytte en integrert Digital fordamper inkludert (i) en berøringsskjerm for å kontrollere anestesi, (II) kontroll ringer, (III) innganger for valgfri add-on fysiologi moduler, (IV) anestesi konsentrasjon justerings knott, (v) sprøyte pumpe pusher kloss, (vi) sprøyte med isoflurane, (VII) integrerte digitale fordamper, (VIII) inspirasjons slange, (IX) inspirasjons slange for induksjon kammer, (x) induksjon kammer, (XI) inspirasjons slange for nese-kjegle, (XII) utløps slangen for nese-kjegle, (XIII) utløps slangen for induksjon kammer. B) instrumenter som brukes i laminectomy inkluderer (i) feedback kontrollert oppvarming enhet, (II) K-kombinert rektal termometer sonde, (III) fleksibel silikon oppvarming pad, (iv) #11 blad, (v) #5 tang, (vi) tenner Titan tang, (VII) Titan Iris saks, (VIII) bein microdrill, (IX) cauterization pistol, (x) 3D trykt bakplate, (XI) absorberende skum kirurgiske spyd, (XII) keramiske blande brett for akryl harpiks, (XIII) akryl harpiks og Accelerant, (XIII) vev lim, (XIV) smøremiddel, (XV) 3 mm deksel-glass. C) stereomikroskopet og kirurgisk plattform. Under operasjonen, sitter den kirurgiske plattformen på en gli scene (sølv og svart rund base på mikroskop scenen). D) mus ligger på tilpasset kirurgisk plattform med oppvarmet seng, etter overfladisk midtlinjen snitt. Den isoflurane nosecone holderen er justerbar i Y-og Z-aksene for å imøtekomme små og store mus. Ear barer stabilisere hodet med hensyn til nosecone. Rektal thermoprobe måler kjernetemperatur. E) kirurgisk felt på trinnet av muskel fjerning. F) kirurgisk felt etter fjerning av muskel. G) kirurgisk felt under fortynning av vertebrale benet. H) kirurgisk felt etter fjerning av det vertebrale benet. I) kirurgisk felt under plassering av dekkglass. J) kirurgisk felt etter plassering av dekkglass. K) kirurgisk felt under første belegg med akryl. L) kirurgisk felt etter endt bakplate implanation. M-N) Mus plassert i kirurgisk stasjon etter fullført laminectomy. Messing gaffelen er justerbar i X-, Y-og Z-akser for posisjonering over ryggmargen laminectomy området. Gaffelen er mekanisk forankret til den kirurgiske plattformen for å gi optimal stabilisering av bildefeltet under operasjon og nedstrøms applikasjoner, inkludert to-Foton intravital mikroskopi. Under operasjonen er den kirurgiske plattformen montert på en gli scene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Skjematisk fremstilling av anatomisk plassering av ryggmargen vinduet. A) skjematisk fremstilling av den overlegne syn på en lavere bryst vertebrale kropp, spinous prosess, og ryggmargen (SC) segmentet. En prikket sirkel viser setet i ledd prosessen, det viktigste støttepunktet for feste av bakplate. B) skjematisk fremstilling av den overlegne visningen av vinduet for ryggmargen. Målet vertebrale ryggraden (her, T12) har blitt fjernet. Et tynt lag med agarose overlegg ryggmargen. En dekkglass hviler på toppen av agarose. Vev limet påføres over tverrgående prosesser (og, ikke vist her, på den eksponerte ledd prosessen av tilstøtende, intakt vertebrale pigger). Dental sement overlegg vevet limet. Bakplaten fester til vevet sement, hviler på de tverrgående prosesser (vist) og ledd prosessen av tilstøtende, intakt vertebrale pigger (ikke vist i dette panelet). Et ekstra tynt lag av Dental sement påføres på innsiden av bakplate felgen. Bakplaten er avbildet i en cutaway visning for å visualisere dekkglass. C) skjematisk fremstilling av lateral visning av ryggmargen vinduet. Målet vertebrale ryggraden (her, T12) har blitt fjernet. Et tynt lag med agarose overlegg ryggmargen. En cover-glass hviler på toppen av agarose. Vev limet påføres over eksponert ledd prosessen av tilstøtende, intakt t11 og T13 vertebrale pigger. Dental sement overlegg vevet limet. Bakplaten fester til vevet sement, hviler på de tverrgående prosesser og ledd prosessen av tilstøtende, intakt vertebrale pigger (vist). Bakplaten er avbildet i en cutaway visning; i en ekte lateral vise agarose og dekk-glass ville være skjult av den laterale veggen av bakplaten. Anatomiske strukturer er basert på detaljert magnetisk resonans imaging av C57Bl/6 ryggsøylen utført av Harrison og kolleger 11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Tight Junction mikrostruktur visualisere av eGFP: Claudin-5 i musen ryggmargen ved intravital to-Foton mikroskopi. A) enkelt optisk seksjon tatt ved 30 μm under dural overflate i en sunn EGFP: Claudin-5 mus. Rød pil viser en eGFP: Claudin-5 stramt knutepunkt segment som strekker seg vinkelrett på den langsgående stramme koblings aksen. Skala bar representerer 5 μm. innfelt: skala bar representerer 10 μm. B) Z-projeksjon av det vaskulære nettverket som strekker 100 μm under dural overflate av den sunne muse ryggmargen. Den optiske stakken ble samplet ved 2 μm aksial trinn størrelse og inkluderer stykket fra panel A. Ingen Bildejustering er utført. Skarp avgrensning av junctional strukturer i Z-projeksjon demonstrerer minimal bilde forskyvning mellom etterfølgende rammer. C) representativ delsett av optiske skiver tatt med 10 μm intervaller fra den resulterende Z-stakken. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil 1. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet her gir mulighet for stabil avbildning av ryggmargen i mus gjennom et glass vindu. Denne metoden har blitt brukt for å vurdere BBB remodeling i transgene eGFP: Claudin5 +/-mus som uttrykker et fluorescerende BBB stramt knutepunkt protein, men det kan brukes like godt for studier av noen fluorescerende proteiner eller celler i ryggmargen.
Flere metoder for laminectomy og rygg mARGs stabilisering er utviklet. Alle protokoller adresse stabilisere ryggmargen under Imaging og vindu gjennomføring for visuell tilgang til strukturen av interesse. Antall vertebra fjernet og graden av invasiveness av de tilgjengelige protokollene varierer (f. eks, komponenter limt på overflaten av overfladisk bein, som i den nåværende protokollen, versus embedded dypere). Davalos og Akassoglou2 utviklet en laminectomy metode som bruker flyttbare klemmer på hver side av ryggsøylen og en klemme på undersiden av halen av musen for å stabilisere ryggmargen. Denne innovative strategien for å suspendere dyret lettet noen av bryst forskyvningen forårsaket av bevegelsen av lungene som ekspanderte mot operasjonsbordet. For å skape en brønn som inneholder nedsenking væske for en vann-nedsenking mikroskopisk linse, en kant av gelatin segl (f. eks Gelseal) ble gjort rundt ryggmargen og fylt med aCSF. Forseglingen felgen kan bli forstyrret under Imaging, men kan også være lett tørkes bort på slutten av økten for å aktivere såret nedleggelse og påfølgende reimaging. Denne metoden har vært allment vedtatt12,13. Andre grupper har utviklet alternative stabiliserings metoder. Fenrich et al. 4 hånd-forberedt modifisert papirklipp som en måte å sikre ryggsøylen. Disse modifiserte binders ble sikret i lateral vertebrale pedicles med Cyanoacrylate lim og opprettholdt som permanent implantert håndtak for en flyttbar ekstern klips og ekstern holde gaffel for utmerket bevegelses stabilitet. Cupido og kolleger har presentert variasjoner over de nevnte metoder med inkorporering av agarose kledde på ledningen2,4,12. Farrar og Schaffer3 utviklet en firkant metall stabilisator som kunne tillate gjennomføringen av et glass vindu på tre virvler i stedet for bare én. Denne metoden tillot også at ryggmargen festes med skruer til en større bro stabilisator under bildebehandling for å redusere potensiell bevegelse. En miniatyriserte ett-Foton mikroskop implantert direkte på laminectomy Imaging kammeret har også blitt utviklet for in vivo Recording i fritt bevegelige mus på ett Foton nivå, men er ennå ikke lett tilgjengelig for de fleste laboratorier13 . I en annen tilnærming, Weinger et al. 1 dissekert en hel ryggmarg og innebygd i agarose for ex vivo Imaging, som tillater uovertruffen bevegelses stabilitet og tilgang til ventrale ryggmargen, men opphever blodstrøm. Noen begrensninger av denne utviklingen inkluderer lang kirurgisk tid4, mulig forstyrrelse av gelatin tetningen rim2, behovet for å tilpasse dekselet glass dimensjoner for å passe ønsket område av ryggmargen4, manuell modifisering av papirklipp4,12, relativt invasive kirurgiske teknikker12,14og luftbobler forming ved bruk av silisium elastomer3,4.
Vi har utviklet en alternativ metode som tilbyr flere fordeler. Denne protokollen er optimalisert for å redusere mengden tid som brukes under operasjonen. Mens noen kirurgiske protokoller krever lengre prosedyre ganger fra en og en halv time4 til en time3; en gang mestret, kan denne laminectomy metoden utføres i ca 30 min. redusere tiden som brukes i kirurgi kan redusere fysiologiske stress til musen, og tilrettelegge for høyere gjennomstrømming eksperimentering. Denne protokollen fjerner en enkelt vertebra, og inkorporerer overfladisk vedheft av stabilisering enheten gjør det mindre invasiv enn noen sammenlignbare protokoller4,5,12,14. I likhet med metoden for Figley et al., ved å benytte et plast implantat, tilbyr denne protokollen kompatibilitet med akustisk bildebehandling5.
For å unngå lysspredning (under intravital mikroskopi) som kan være forårsaket av forskjellene mellom brytnings indeksene til luft, vann og vev, overlapper de fleste protokollene et optisk, gjennomsiktig substrat over den eksponerte ryggmargen. Felles underlag inkluderer høy renhet, lav smeltetemperatur agarose eller silikon polymerer3,4,5. Agarose tilbyr fordelen av brukervennlighet, med minimal boble formasjon, og er egnet for akutt bildebehandling økter. For å beskytte vevet mot varmeskader, er det praktisk å varme opp agarose til utenfor smeltepunktet og deretter la det avkjøles til ~ 39 ° c i et vannbad under laminectomy, slik at den kan være klar til riktig tid for påføring på den eksponerte ryggmargen. For kronisk Imaging, silikon polymerer er mer motstandsdyktig mot dehydrering. Pilot forsøk under utviklingen av den nåværende protokollen utelatt enten agarose lag eller overliggende cover-glass, og fant at den påfølgende lys scatter redusert tilgjengelig dybde av Imaging.
En differensiering funksjon i denne protokollen er inkorporering av en 3D trykt bakplate og støttende bakplate gaffel holderen. Etter laminectomy og vindus implantat, er preparatet stabilisert ved tilsetning av en 3D-trykt oval bakplate som er festet på plass med Dental sement. Bakplaten serverer to funksjoner: først, det gir strukturell støtte og stabilisering av ryggmargen, og andre, skaper det en leppe å holde væske for nedsenking mål for mikroskopi. I prototyper av dette oppsettet ble det brukt kommersielt tilgjengelige søyle stolper, adaptere og holde gafler. Vi har nylig byttet til tilpassede bearbeidet deler som avbildet her. I begge tilfeller er den essensielle funksjonen for å gi strukturelle rigor å stabilisere bildefeltet mot forstyrrelser i rom og tid indusert av hjerterytme og åndedrett. Selv om kroppen av dyret hviler løst på varmeputen, ryggmargen og bildefeltet er litt suspendert fra å holde gaffel, som også reduserer åndedretts forskyvning. Plasten underlaget gir liten fleksibilitet til å imøtekomme spenningen fra å skru inn i plate holderen. Den svarte plast fargen som brukes for utskrift reflekterer minimalt lys inn i fluorescens feltet. Gjennom disse metodene, vi lykkes generere bilde stabler som kan brukes uten post hoc justering justering. Videre er det 3D bakplate beskrevet her er billig å produsere, koster bare pennies i materiale for hver utskrift, når skriveren er kjøpt. Videre har kostnadene ved 3D-skrivere falt i de siste årene. Den 3D trykt bakplate strukturelle filer (se utfyllende filer 1 og 2) publisert med denne protokollen kan lett endres for å imøtekomme individuelle laboratorie behov. Vi designet den lange dimensjonen av bakplaten for å imøtekomme den intervertebral plassen skapt ved fjerning av bryst 12 vertebrale ryggrad, som overlies korsrygg 2/3 i ryggmargen11. Hvis du vil bruke denne teknikken på en annen vertebrale-del, kan de tilhørende CAD-filene endres.
Denne protokollen benytter en kommersielt tilgjengelig lav-flow anestesi system som distribuerer en digital integrert direkte injeksjon fordamper som et alternativ til den tradisjonelle passive fordamper. Den viktigste funksjonen i lav-flow enheten er redusert operatør eksponering for isoflurane, en betydelig helsegevinst. Den lav-flow anestesi enhet tilbyr også kostnadsbesparelser på grunn av redusert forbruk av isoflurane og utnyttelse av rom luft i stedet for komprimert gass. I denne studien, 2% isoflurane levert av integrerte digitale fordamper på 150 mL/min, sammen med feedback-kontrollerte termisk støtte, oppnådde et stabilt fly av anestesi og hensiktsmessig vedlikehold av kjernen kroppstemperatur. I samsvar med dette, publiserte sammenligninger av digitale integrerte vaporizers og tradisjonelle vaporizers har også konkludert med at den digitale integrerte fordamper gir et stabilt fly av anestesi og god bevaring av kjernen kroppstemperatur, hjertefrekvens, respirasjonsfrekvens, og utvinning mens utnytte mindre isoflurane15,16.
En ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAID) som karprofen kan administreres pre-operativt som en supplerende smertestillende. I løpet av få timer, NSAIDs hemme inflammatorisk cytokin transkripsjon og interstitiell ødem; multi-dagers administrasjon attenuates alvorlighetsgrad av neuroinflammatory sykdommer, inkludert eksperimentell autoimmune encefalomyelitt, et dyr modell av multippel sklerose17,18. Spesielt i studiet av neuroinflammatory sykdom, de gunstige virkningene av karprofen analgesi må nøye veies mot sykdom endre effekter ved fastsettelse analgesi og anestesi for et eksperiment i tett koordinering med egnede regulatoriske styrene.
En begrensning av denne metoden er at det ikke er lett mottagelig for gjentatte tenkelig økter over flere dager. Hovedårsaken er at bakplate strukturen er for stor til å lukke huden over. Derfor er det en risiko for at en mus ville løsne bakplaten når du våkner fra anestesi. Hvis gjentatt Imaging var viktig, er det flere strategier som kan distribueres, inkludert redusere størrelsen på bakplaten, eller endre montere. Som med alle kirurgiske prosedyrer, er det en læringskurve for operatørene. Nær koordinering med institusjonelle dyr omsorg kontorer og gjennomgang styrene er nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
S.E. Lutz er støttet av National Center for fremmarsj translational Sciences, National Institutes of Health, under Grant KL2TR002002 og University of Illinois Chicago College of Medicine oppstart midler. Simon Alford er støttet av RO1 MH084874. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle utsikten over NIH. Forfatterne takker Dritan Agalliu ved Institutt for Nevrologi ved Columbia University Medical Center for TG eGFP: Claudin-5 mus, vitenskapelige diskusjoner, og innsikt i utviklingen av kirurgisk protokoll og tenkelig applikasjoner. Forfatterne takker Sunil P. Gandhi i Department of nevrobiologi and Behavior ved University of California, Irvine for å designe den første prototypen av stereotactic apparater og dyr temperatur kontroller, diskusjon av kirurgisk protokoll, og opplæring i to-Foton mikroskopi. Forfatterne takker også Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) for å få hjelp til å tilpasse kirurgiske stereomikroskopet, og Ron Sandbech (Whale Manufacturing) for maskinering stereotactic deler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F. Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. Bakota, L., Brandt, R. , Springer. New York. 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
