Summary
Este protocolo describe la implantación de una ventana de vidrio en la médula espinal de un ratón para facilitar la visualización mediante microscopía intravital.
Abstract
Este protocolo describe un método para la laminectomía de la médula espinal y la implantación de ventanas de vidrio para la toma de imágenes in vivo de la médula espinal del ratón. Un vaporizador digital integrado se utiliza para lograr un plano estable de anestesia a una velocidad de bajo flujo de isoflurano. Se retira una sola columna vertebral, y se superpone un vidrio de cubierta disponible comercialmente en un lecho de agarosa delgada. A continuación, se fija una placa posterior de plástico impresa en 3D a las espinas vertebrales adyacentes utilizando adhesivo tisular y cemento dental. Se utiliza una plataforma de estabilización para reducir el artefacto de movimiento de la respiración y los latidos del corazón. Este método rápido y libre de abrazaderas es adecuado para la microscopía aguda de fluorescencia multifotón. Se incluyen datos representativos para la aplicación de esta técnica a la microscopía de dos fotones de la vasculatura de la médula espinal en ratones transgénicos que expresan eGFP:Claudin-5 — una proteína de unión apretada.
Introduction
Los modelos animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes, cuando se combinan con la microscopía intravital, proporcionan una potente plataforma para abordar la biología y la fisiopatología. Para aplicar estas técnicas a la médula espinal, se requieren protocolos especializados para preparar la médula espinal para la toma de imágenes. Una de esas estrategias es llevar a cabo una laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal. Las características clave de un protocolo de laminectomía ideal para la microscopía incluyen la preservación de la estructura y función del tejido nativo, la estabilidad del campo de la imagen, el tiempo de procesamiento rápido y la reproducibilidad de los resultados. Un desafío particular es estabilizar el campo de imagen contra el movimiento inducido por la respiración y los latidos del corazón. Múltiples estrategias ex vivo e in vivo han sido reportadas para alcanzar estos objetivos1,2,3,4,5. La mayoría de los métodos in vivo implican sujetar los lados de la columna vertebral2,4 y a menudo es seguido por la implantación de un aparato metálico rígido3,4 para la estabilidad durante la cirugía y aplicaciones de imágenes posteriores. Sujetar la columna vertebral puede comprometer potencialmente el flujo sanguíneo e inducir la remodelación de proteínas de barrera hematoencefálica (BBB).
El propósito de este método es hacer que la médula espinal intacta esté disponible para imágenes ópticas en el ratón vivo, minimizando al mismo tiempo la invasividad del protocolo y mejorando los resultados. Describimos una sola laminectomía y un procedimiento de implantación de vidrio de cubierta combinado con una placa posterior impresa en 3D de plástico ovalada mínimamente invasiva que todavía logra una estabilidad mecánica robusta. La placa posterior se adhiere directamente a las espinas vertebrales anteriores y posteriores con cemento dental. La placa posterior está equipada con brazos de extensión lateral con orificios de tornillo que se fijan rígidamente a la etapa del microscopio a través de un brazo metálico. Esto ancla eficazmente la vértebra anterior y posterior intacta a la etapa del microscopio, proporcionando resistencia mecánica al artefacto de movimiento que de otro modo sería introducido por la respiración y los latidos del corazón. El método ha sido optimizado para la laminectomía de una sola vértebra a nivel torácico 12, omitiendo las abrazaderas utilizadas en estrategias alternativas de estabilidad durante la imagen in vivo. El procedimiento es rápido, tardando aproximadamente 30 minutos por ratón.
Este protocolo se puede utilizar para estudiar los mecanismos de la enfermedad de la BBB. El BBB es un sistema microvascular dinámico compuesto por células endoteliales, músculo liso vascular, pericitos y procesos de pie astrocito que proporcionan un ambiente altamente selectivo para el sistema nervioso central (SNC). Los datos representativos describen la aplicación de este protocolo en ratones transgénicos diseñados para expresar proteína fluorescente verde mejorada (eGFP):Claudin-5, una proteína de unión estrecha BBB. Los archivos de impresión de placa posterior proporcionados también se pueden personalizar para aplicaciones alternativas.
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Protocol
Todos los experimentos siguen los protocolos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Illinois, Chicago. Este es un procedimiento terminal.
1. Preparación de reactivos
- Preparar el líquido cefalorraquídeo cerebral artificial (aCSF) para que contenga 125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de glucosa, 10 mM de HEPES, 2 mM MgCl2s6H2O, 2 mM de CaCl2x 2HendDH2O. Filtro estéril y congelar en alícuotas de uso individual. Caliente el aCSF en un baño de agua a 39 oC antes de su uso.
- Agarosa cálida de bajo punto de fusión (2%) en aCSF hasta que se disuelva completamente en un baño de agua ajustado a 65 oC. Durante la laminectomía, enfríe la alícuota de agarosa derretida a 39 oC en un baño de agua, para que pueda estar lista cerca de la temperatura fisiológica para el paso 5.2.
Nota: La solución de agarosa se puede almacenar a -20 oC en alícuotas de un solo uso. - Preparar 50 mg/ml de carprofeno estéril en agua bacteriostática. Conservar a 4oC.
- Limpie los anteojos con 70% de etanol, tres lavados de ddH2O y guárdelos secos en un recipiente libre de polvo.
2. Impresión 3D de placa posterior
- El software CAD 3D de uso se utiliza para crear un modelo a las dimensiones que se muestran en la Figura 1. El interior es una elipse más ancha en la superficie inferior con respecto a la impresora y cortada con un corte recubierto a una elipse más pequeña formando un lumen en la superficie opuesta. Dos brazos de proyección con orificios para aceptar tornillos se extienden lateralmente, para la fijación a la horquilla de sujeción de la placa posterior. A partir de esta estructura 3D, cree un archivo de malla 3D triangulado (. STL).
Nota: Vea la figura 1B-u2012D y los archivos suplementarios 1 y 2. - Cargue el archivo de malla 3D triangulado en una impresora 3D.
- Imprima placas posteriores utilizando una boquilla de extremo caliente de 0,4 mm y una altura de capa de 0,2 mm. Seleccione la temperatura de la boquilla de 205 oC, la temperatura de la cama de 45 oC y la velocidad de impresión de 45 mm/s.
- Evaluar visualmente las placas posteriores impresas en 3D resultantes para la integridad estructural(Figura 1E); fallo estructural bruto (ausente lumen, pared colapsada) indica defectos de impresión(Figura 1F).
3. Preparación quirúrgica
- Precalienta la almohadilla de calentamiento.
- Cargue el isoflurano en la jeringa de entrega mientras trabaja en una campana de humo sordo químico. Coloque la jeringa de administración en la unidad de isoflurano.
- Seleccione un ratón de 8 u201212 semanas. Pesa el animal. Inducir la anestesia usando 2% de isoflurano en una cámara de inducción. Inyectar carprofeno a 5 mg/kg por vía subcutánea.
- Coloque el cono nasal y entregue isoflurano al 2% con un caudal de 150 ml/min para el mantenimiento de un plano quirúrgico de anestesia(Figura 2A.u2012E). Envuelva la almohadilla de calentamiento con una almohadilla absorbente desechable para facilitar la limpieza.
- Coloque un animal en la almohadilla de calentamiento en la estación quirúrgica e instale el cono nasal. Lubricar el termómetro con vaselina e insertarlo 5 mm en el recto. Pegue la sonda del termómetro a la cola para la estabilidad. Aplique pomada oftálmica a los ojos del ratón.
- Para mantener la hidratación, aplique 200 ml de solución de Ringer lactada por inyección subcutánea cada 30 minutos hasta la terminación del experimento.
- Rocíe el dorso con 70% de etanol, retire el pelaje con cortadoras y limpie el sitio con povidona-yodo.
4. Laminectomía
- Coloque el animal entre las barras de los oídos; estos mantienen la posición de la cabeza del ratón con respecto al cono nasal.
- Confirme que el animal está profundamente anestesiado según lo evaluado por la falta de reflejo de pellizco interdigital y patrón respiratorio constante.
- Hacer una incisión rostral-caudal de 1,5 cm en la línea media sobre la región torácica/lumbar superior inferior usando #11 cuchilla(Figura 2). Separa la piel agarrándola con fórceps dentados contundentes y/o dedos enguantados. Use fórceps para separar y pelar cualquier tejido conectivo transparente restante debajo de la piel. La musculatura superficial ahora debe ser expuesta; desplazar esto con una lanza quirúrgica de espuma.
- Utilice lanzas quirúrgicas de espuma (o una cureta) para eliminar la musculatura más profunda y restante de la vértebra diana (torácica 12). Para crear un asiento para la placa posterior, también despeje el músculo del aspecto posterior del torácico 11, y el aspecto anterior del torácico 13. Controle cualquier sangrado aplicando una presión suave con una lanza quirúrgica o use un pulso mínimo con una pistola de cauterización. Continúe retirando el músculo restante de los tendones usando fórceps
- Una vez que se retiran los músculos, separa cuidadosamente los tendones cortando con fórceps. Debe haber mucho espacio para visualizar y manipular el cable cuando este paso se haya completado. Compruebe que la duración del espacio intervertebral, el hueso laminar semitransparente, el vaso sanguíneo superficial central debajo del hueso y la arteria radiante anterior son ahora claramente visibles.
- Humedezca la región con aCSF caliente. Utilice el microrretaparacropara adelgazar repetitivamente el hueso laminar utilizando trazos rectos paralelos al eje largo de la médula espinal(Figura 2, Figura 3). Si lo desea, utilice una etapa de deslizamiento para girar la plataforma quirúrgica para una mayor comodidad ergonómica (por ejemplo, un operador diestro puede girar la plataforma quirúrgica en sentido antihorario para el paso de perforación).
Nota: La etapa de deslizamiento utilizada está construida con una placa de aluminio superior que se desliza de 15 mm con respecto a la placa base fija. - Agarre suavemente el proceso espinoso superficial con fórceps y levante la vértebra; el hueso debe levantarse fácilmente. Si hay resistencia, repita el adelgazamiento del hueso con el taladro y, si es necesario, utilice tijeras de iris, teniendo cuidado de apuntar las puntas de las tijeras hacia arriba para evitar dañar el tejido.
Nota: Para mantener la dura intacta, es esencial no tirón del hueso. - Usa #4 fórceps para eliminar cualquier fragmento óseo. Use una lanza quirúrgica para aplicar una presión constante suave para controlar cualquier sangrado. Enjuague el tejido con aCSF caliente. No permita que el tejido se seque.
5. Implantación de vidrio de cubierta
- Aplique suavemente un vidrio de cubierta de borosilicato de 3 mm en el cable expuesto.
- Asegúrese de que la agarosa se enfríe a 39 oC. Usando una pequeña espátula, aplica un 2% caliente de agarosa/aCSF en el borde de la cubierta de vidrio y permite que la acción capilar la dibuje debajo de la superficie.
Nota: A temperaturas por debajo de 39 oC, la agarosa puede comenzar a gelificarse. Si esto ocurre, vuelva a calentar con un baño de agua o un microondas. Algunos operadores prefieren aplicar primero una gota de agarosa y poner el vidrio de la cubierta en la parte superior. - Aplicar adhesivo tisular a los procesos articulares óseos expuestos de la vértebra adyacente intacta a nivel torácico 11 espina vertebral y columna vertebral de nivel torácico 13. Aplique adhesivo de tejido adicional en un anillo alrededor del sitio de la laminectomía, sobre el tendón adyacente y el proceso transversal.
Nota: Se requiere adhesivo tisular para la correcta adherencia del cemento dental en los pasos posteriores. Los procesos articulares forman un asiento natural sobre el cual la placa posterior puede descansar de forma estable(Figura 3). La adhesión a los procesos articulares formará los puntos más fuertes de unión. - Mezclar cemento dental con acelerador en una bandeja de mezcla de porcelana. Utilice una pequeña espátula para transferir cemento dental a la capa adhesiva de tejido. Utilice cemento dental para adherir la placa posterior al campo quirúrgico, centrado sobre la ventana. Espere 10 minutos para que el cemento dental se cure.
Nota: La adhesión firme de la placa posterior a los procesos articulares anteriores y posteriores proporciona la estabilidad estructural fundamental del implante. - Utilice cemento dental adicional para rellenar la base interior de la placa posterior, y la parte inferior de la placa posterior: interfaz de tejido.
Nota: La aplicación adicional de cemento dental mejora la adherencia y reduce el riesgo de fuga del fluido de inmersión objetivo del microscopio (salina) en la parte inferior de la placa posterior. - Avance el soporte de la placa posterior bifurcada a la posición adecuada sobre la ventana. Fije la placa posterior en el soporte de la placa posterior con tornillos.
Nota: Este protocolo utilizaba un soporte de placa posterior mecanizado a medida(Figura 2G.u2012H). - Aplique salina a la placa posterior para comprobar si hay fugas. Si hay fugas de líquido, seque el área y aplique más cemento dental.
6. Preparación de imágenes
- Transfiera el animal de la plataforma quirúrgica a la mesa óptica.
Nota: Nuestra plataforma quirúrgica, soporte de placa posterior, y soporte de nariz-cono de isoflurano se pueden transportar entre estaciones de imágenes quirúrgicas y de dos fotones como una unidad, mientras se aplica anestesia isoflurano continua(Figura 2D,H). Unidades similares se pueden ensamblar a partir de horquillas de sujeción, vigas y postes de pilares de apoyo que se pueden obtener de fuentes comerciales(por ejemplo,. ThorLabs). Para la microscopía intravital, debe haber al menos 11 pulgadas de espacio libre entre el objetivo del microscopio y la mesa óptica para acomodar la altura de la plataforma quirúrgica. - Fije la plataforma quirúrgica a la mesa óptica utilizando un poste de montaje de acero inoxidable y una horquilla de sujeción contraborde.
- Aplique salina fresca en el pozo de la placa posterior. Baje una lente de inmersión en agua en el pozo.
- Utilice la luz transmitida o epifluorescencia para identificar el área de interés y enfoque. Cambie al modo de escaneo láser y realice imágenes in vivo de acuerdo con la longitud de onda de excitación láser de dos fotones adecuada, dicroics y filtros de paso de banda para los fluoróforos presentes en el tejido6.
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Representative Results
Las ventanas de vidrio implantadas y la microscopía intravital de dos fotones proporcionan una herramienta útil para evaluar los cambios dinámicos en las proteínas del SNC. La integridad funcional del BBB está influenciada por la expresión, la localización subcelular y las tasas de rotación de proteínas de uniónestrecha7. Estudios anteriores han demostrado que las proteínas de unión estrecha sufren una remodelación rápida y dinámica en estado estacionario8. La actualmente descrita laminectomía y la preparación de la ventana de vidrio se ha utilizado en ratones transgénicos eGFP:Claudin-59, que llevan proteínas fluorescentes de unión hermética, para evaluar la remodelación de unión estrecha BBB en el sistema autoinmune experimental encefalomielitis (EAE) modelo de esclerosis múltiple10. En los datos representativos, se logró la toma de imágenes de eGFP:Claudin-5 con un microscopio de dos fotones con excitación de 920 nm, un objetivo infrarrojo de 40o (0,8 NA) y un filtro de emisión de fluorescencia verde(Figura 4). Las pilas ópticas se muestrearon a pasos axiales de 2 m a 100 m debajo de la superficie dura. Los datos representan la visualización de las uniones etiquetadas fluorescentemente a lo largo de un plexo vascular. Se incluyen rebanadas ópticas únicas e imágenes de proyección Z(Figura 4). La delineación clara de las estructuras de unión estrecha en la proyección Z(Figura 4B)indica que el desplazamiento mínimo de la imagen X-Y se produce después de la laminectomía exitosa, la colocación de la ventana y la implantación de la placa posterior.
Figura 1. Dispositivo de estabilización de placa posterior impreso personalizado. A) Vistas ortogonales de placa satrás. B-D) Modelos de malla triangulada de superficies dorsales y ventrales de la placa posterior. E) Placa posterior impresa correctamente. F) Placa posterior impresa incorrectamente. Consulte Archivos suplementarios 1 y 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Pasos quirúrgicos para la laminectomía. A) Sistema de administración de anestesia de isoflurano que utiliza un vaporizador digital integrado que incluye (i) una pantalla táctil para controlar la anestesia, (ii) diales de control, (iii) entradas para módulos opcionales de fisiología adicionales, (iv) concentración de anestesia perilla de ajuste, (v) bloque de empuje de la bomba de jeringa, (vi) jeringa con isoflurano, (vii) vaporizador digital integrado, (viii) tubo de inspiración, (ix) tubo de inspiración para cámara de inducción, (x) cámara de inducción, (xi) tubo de inspiración para cono nasal, (xii) tubo de caducidad para el cono nasal, (xiii) tubos de expiración para la cámara de inducción. B) Los instrumentos utilizados en la laminectomía incluyen (i) unidad de calentamiento controlado por retroalimentación, (ii) sonda termómetro rectal acoplada K, (iii) almohadilla de calentamiento flexible de silicona, (iv) cuchilla de #11, (v) #5 fórceps, (vi) fórceps de titanio dentados, (vii) iris de titanio tijeras, (viii) microtaladro óseo, (ix) pistola de cauterio, (x) placa posterior impresa en 3D, (xi) lanzas quirúrgicas de espuma absorbente, (xii) bandeja de mezcla de cerámica para resina acrílica, (xiii) resina acrílica y acelerador, (xiii) adhesivo de tejido, (xiv) lubricante oftálmico, (xv) 3 mm vidrio de cubierta. C) Estereomicroscopio y plataforma quirúrgica. Durante la cirugía, la plataforma quirúrgica se encuentra en una etapa de deslizamiento (base redonda plateada y negra en la etapa del microscopio). D) Ratón situado en la plataforma quirúrgica personalizada con cama calentada, después de la incisión superficial de línea media. El soporte de nosecono de isoflurano es ajustable en los ejes Y y Z para acomodar ratones pequeños y grandes. Las barras de los oídos estabilizan la cabeza con respecto al nosecono. El terótesis rectal mide la temperatura del núcleo. E) Campo quirúrgico en el paso de la extracción muscular. F) Campo quirúrgico después de la extracción del músculo. G) Campo quirúrgico durante el adelgazamiento del hueso vertebral. H) Campo quirúrgico después de la extracción del hueso vertebral. I) Campo quirúrgico durante la colocación de la cubierta de vidrio. J) Campo quirúrgico después de la colocación de la cubierta de vidrio. K) Campo quirúrgico durante el recubrimiento inicial con acrílico. L) Campo quirúrgico después de la finalización de la implanación de la placa posterior. M-N) Ratón colocado en la estación quirúrgica después de la laminectomía completada. La horquilla de latón es ajustable en los ejes X, Y y Z para su posicionamiento sobre el sitio de laminectomía de la médula espinal. La horquilla está anclada mecánicamente a la plataforma quirúrgica para proporcionar una estabilización óptima del campo de la imagen durante la cirugía y aplicaciones posteriores, incluida la microscopía intravital de dos fotones. Durante la cirugía, la plataforma quirúrgica se monta en una etapa de deslizamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Representación esquemática de la colocación anatómica de la ventana de la médula espinal. A) Representación esquemática de la vista superior de un cuerpo vertebral torácico inferior, proceso espinoso y segmento de la médula espinal (sc). Un círculo punteado representa el asiento del proceso articular, el principal punto de apoyo para la adhesión de la placa posterior. B) Representación esquemática de la vista superior de la ventana de la médula espinal. Se ha eliminado la columna vertebral objetivo (aquí, T12). Una fina capa de agarosa se superpone a la médula espinal. Una cubierta descansa sobre la agarosa. El adhesivo tisular se aplica sobre los procesos transversales (y, no se muestra aquí, sobre el proceso articular expuesto de las espinas vertebrales adyacentes intactas). El cemento dental superpone el adhesivo tisular. La placa posterior se adhiere al cemento tisular, descansando sobre los procesos transversales (mostrados) y el proceso articular de las espinas vertebrales adyacentes intactas (no se muestran en este panel). Una capa delgada adicional de cemento dental se aplica en el interior de la llanta de la placa posterior. La placa posterior se representa en una vista de corte para visualizar el vidrio de la cubierta. C) Representación esquemática de la vista lateral de la ventana de la médula espinal. Se ha eliminado la columna vertebral objetivo (aquí, T12). Una fina capa de agarosa se superpone a la médula espinal. Un vidrio de cubierta descansa en la parte superior de la agarosa. El adhesivo tisular se aplica sobre el proceso articular expuesto de las espinas vertebrales adyacentes, intactas T11 y T13. El cemento dental superpone el adhesivo tisular. La placa posterior se adhiere al cemento tisular, descansando sobre los procesos transversales y el proceso articular de las espinas vertebrales adyacentes intactas (mostradas). La placa posterior se representa en una vista recortada; en una verdadera vista lateral la agarosa y el vidrio de la cubierta estarían oscurecidos por la pared lateral de la placa posterior. Las estructuras anatómicas se basan en imágenes de resonancia magnética detalladas de la columna vertebral C57Bl/6 realizadas por Harrison y sus colegas 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Microestructura de unión estrecha visualizada por eGFP:Claudin-5 en la médula espinal del ratón mediante microscopía intravital de dos fotones. A) Sección óptica única tomada a 30 m debajo de la superficie dura en un ratón eGFP:Claudin-5 saludable. La flecha roja representa un segmento de unión estrecha eGFP:Claudin-5 que se extiende perpendicularmente al eje de unión estrecha longitudinal. La barra de escala representa 5 m. Inset: la barra de escala representa 10 m. B) de proyección Z de la red vascular que se extiende 100 m por debajo de la superficie dura de la médula espinal del ratón sano. La pila óptica se muestreó a un tamaño de paso axial de 2 m e incluye la rebanada del panel A. No se ha realizado ninguna alineación de imagen. La delineación nítida de las estructuras de unión en la proyección Z muestra un desplazamiento mínimo de la imagen entre fotogramas consecutivos. C) Subconjunto representativo de sectores ópticos tomados a intervalos de 10 m de la pila Z resultante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo Suplementario 1. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo suplementario 2. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El método descrito aquí permite imágenes estables de la médula espinal en ratones a través de una ventana de vidrio. Este método se ha aplicado para evaluar la remodelación de BBB en ratones transgénicos eGFP:Claudin5+/- que expresan una proteína fluorescente de unión estrecha BBB, pero podría aplicarse igualmente bien para estudios de cualquier proteína fluorescente o células en la médula espinal.
Se han desarrollado múltiples métodos para la laminectomía y estabilización de la médula espinal. Todos los protocolos abordan la estabilización de la médula espinal durante la toma de imágenes y la implementación de ventanas para el acceso visual a la estructura de interés. El número de vértebras eliminadas y el grado de invasividad de los protocolos disponibles varían (porejemplo, componentes pegados en la superficie del hueso superficial, como en el protocolo actual, frente a incrustados más profundamente). Davalos y Akassoglou2 desarrollaron un método de laminectomía utilizando abrazaderas extraíbles a cada lado de la columna vertebral y una abrazadera en la base de la cola del ratón para estabilizar la médula espinal. Esta innovadora estrategia para suspender al animal alivia parte del desplazamiento torácico causado por el movimiento de los pulmones que se expanden contra la mesa quirúrgica. Para crear un pozo para contener líquido de inmersión para una lente microscópica de inmersión en agua, se hizo un borde de sello de gelatina(por ejemplo, Gelseal) alrededor de la médula espinal y se llenó con aCSF. La llanta del sello podría interrumpirse durante la toma de imágenes, pero también podría limpiarse fácilmente al final de la sesión para permitir el cierre de la herida y la posterior reimagen. Este método ha sido ampliamente adoptado12,13. Otros grupos han desarrollado métodos alternativos de estabilización. Fenrich et al. 4 clips de papel modificados preparados a mano como una forma de asegurar la columna vertebral. Estos clips de papel modificados se fijaron en los pediculos vertebrales laterales con pegamento de cianoacrilato y se mantuvieron como asas implantadas permanentemente para un clip externo extraíble y una horquilla de sujeción externa para una excelente estabilidad del movimiento. Cupido y sus colegas han presentado variaciones en los métodos antes mencionados con la incorporación de agarosa superpuesta en el cordón2,4,12. Farrar y Schaffer3 desarrollaron un estabilizador de metal cuadrilátero que podría permitir la implementación de una ventana de vidrio en tres vértebras en lugar de una sola. Este método también permitió que la médula espinal se conectara con tornillos a un estabilizador de puente más grande durante la toma de imágenes para reducir el movimiento potencial. También se ha desarrollado un microscopio miniaturizado de un fotón implantado directamente en la cámara de imágenes de laminectomía para la grabación in vivo en ratones que se mueven libremente a nivel de un fotón, pero aún no está disponible para la mayoría de los laboratorios13 . En un enfoque diferente, Weinger et al. 1 diseccionó toda una médula espinal y la incrustó en agarosa para obtener imágenes ex vivo, lo que permite una estabilidad de movimiento y acceso insuperables a la médula espinal ventral, pero abroga el flujo sanguíneo. Algunas limitaciones de estos desarrollos incluyen el tiempo quirúrgico prolongado4, posible interrupción de la llanta de sello de gelatina2, la necesidad de personalizar las dimensiones de vidrio de la cubierta para adaptarse al área deseada de la médula espinal4, manual modificación de clips de papel4,12, técnicas quirúrgicas relativamente invasivas12,14, y burbujas de aire que se forman cuando se utiliza el elastómero de silicio3,4.
Hemos desarrollado un método alternativo que ofrece varias ventajas. Este protocolo se ha optimizado para reducir la cantidad de tiempo invertido durante la cirugía. Considerando que algunos protocolos quirúrgicos requieren tiempos de procedimiento más largos que van desde una hora y media4 a una hora3; una vez masterizado, este método de laminectomía se puede realizar en aproximadamente 30 minutos. Reducir el tiempo que pasa en la cirugía puede disminuir el estrés fisiológico al ratón, y facilitar la experimentación de mayor rendimiento. Este protocolo elimina una sola vértebra, e incorpora la adhesión superficial del dispositivo de estabilización haciéndolo menos invasivo que algunos protocolos comparables4,5,12,14. Al igual que el método de Figley et al., mediante la utilización de un implante de plástico este protocolo ofrece compatibilidad con imágenes acústicas5.
Para evitar la dispersión de la luz (durante la microscopía intravital) que podría ser causada por las diferencias entre los índices de refracción de aire, agua y tejido, la mayoría de los protocolos superponen un sustrato ópticamente transparente sobre la médula espinal expuesta. Los sustratos comunes incluyen alta pureza, baja temperatura de fusión agarosa10,12 o polímeros de silicona3,4,5. Agarose ofrece la ventaja de la facilidad de uso, con una formación mínima de burbujas, y es adecuada para sesiones de imágenes agudas. Para proteger el tejido del daño por calor, es conveniente calentar la agarosa más allá del punto de fusión y luego permitir que se enfríe a 39 oC en un baño de agua durante la laminectomía, por lo que puede estar listo en el momento adecuado para la aplicación a la médula espinal expuesta. Para las imágenes crónicas, los polímeros de silicona son más resistentes a la deshidratación. Los ensayos piloto durante el desarrollo del protocolo actual omitieron la capa de agarosa o el vidrio de cubierta que se encontraba, y encontraron que la dispersión de luz consecuente reducía la profundidad disponible de la imagen.
Una característica diferenciadora de este protocolo es la incorporación de una placa posterior impresa en 3D y un soporte de horquilla de placa posterior de apoyo. Después de la laminectomía y la implantación de la ventana, la preparación se estabiliza mediante la adición de una placa posterior ovalada impresa en 3D que se fija en su lugar con cemento dental. La placa posterior cumple dos funciones: en primer lugar, proporciona soporte estructural y estabilización de la médula espinal, y en segundo lugar, crea un labio para sostener el líquido para los objetivos de inmersión para la microscopía. En los prototipos de esta configuración, se utilizaron postes de pilares, adaptadores y horquillas de sujeción disponibles comercialmente; recientemente hemos cambiado a piezas mecanizadas personalizadas como se muestra aquí. En cualquier caso, la característica esencial es proporcionar rigor estructural para estabilizar el campo de imagen contra las perturbaciones en el espacio y el tiempo inducidos por los latidos del corazón y la respiración. Aunque el cuerpo del animal está descansando libremente sobre la almohadilla de calentamiento, la médula espinal y su campo de imágenes están ligeramente suspendidos de la horquilla de retención, lo que también disminuye el desplazamiento respiratorio. El sustrato de plástico ofrece una ligera flexibilidad para acomodar la tensión de atornillar en el soporte de la placa. El color plástico negro utilizado para la impresión refleja una luz mínima en el campo de la fluorescencia. A través de estos métodos, generamos con éxito pilas de imágenes que se pueden utilizar sin ajuste de alineación post hoc. Además, la placa posterior 3D descrita en este documento es económica de producir, lo que cuesta sólo centavos de material para cada impresión, una vez que se compra la impresora. Además, los costes de las impresoras 3D han disminuido en los últimos años. Los archivos estructurales de placa posterior impresos en 3D (consulte archivos suplementarios 1 y 2)publicados con este protocolo se pueden modificar fácilmente para adaptarse a las necesidades individuales del laboratorio. Diseñamos la dimensión larga de la placa posterior para acomodar el espacio intervertebral creado por la extirpación de la columna vertebral torácica 12, que sobrealimenta los segmentos de la médula espinal lumbar 2/311. Para aplicar esta técnica a una sección vertebral diferente, se pueden modificar los archivos CAD que lo acompañan.
Este protocolo utiliza un sistema de anestesia de bajo flujo disponible comercialmente que despliega un vaporizador de inyección directa integrado digital como alternativa al vaporizador pasivo tradicional. La característica principal de la unidad de bajo flujo es la menor exposición del operador al isoflurano, un beneficio para la salud sustancial. La unidad de anestesia de bajo flujo también ofrece ahorros de costos debido al menor consumo de isoflurano y la utilización del aire de la habitación en lugar del gas comprimido. En el presente estudio, el 2% de isoflurano entregado por vaporizador digital integrado a 150 ml/min, junto con un soporte térmico controlado por retroalimentación, logró un plano estable de anestesia y un mantenimiento adecuado de la temperatura corporal central. En consonancia con esto, las comparaciones publicadas de vaporizadores integrados digitales y vaporizadores tradicionales también han concluido que el vaporizador integrado digital produce un plano estable de anestesia y una buena preservación de la temperatura corporal central, la frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria, y la recuperación utilizando menos isoflurano15,16.
Un medicamento antiinflamatorio no esteroideo (AINE) como el carprofeno se puede administrar preoperatoriamente como analgésico suplementario. En el transcurso de unas pocas horas, los AINE inhiben la transcripción inflamatoria de citoquinas y el edema intersticial; administración de varios días atenúa la gravedad de las enfermedades neuroinflamatorias incluyendo la encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo animal de esclerosis múltiple17,18. Particularmente en el estudio de la enfermedad neuroinflamatoria, los efectos beneficiosos de la analgesia de carprofeno deben sopesarse cuidadosamente contra los efectos modificadores de la enfermedad al determinar la analgesia y la anestesia para un experimento en estrecha coordinación con juntas reguladoras apropiadas.
Una limitación de este método es que no es fácilmente susceptible de sesiones de imágenes repetidas a lo largo de varios días. La razón principal es que la estructura de la placa posterior es demasiado grande para cerrar la piel. Por lo tanto, existe el riesgo de que un ratón desaloje la placa posterior al despertar de la anestesia. Si las imágenes repetidas eran esenciales, hay varias estrategias que podrían implementarse, incluida la reducción del tamaño de la placa posterior o el cambio del soporte. Al igual que con cualquier procedimiento quirúrgico, hay una curva de aprendizaje para los operadores. Se requiere una estrecha coordinación con las oficinas institucionales de cuidado de animales y las juntas de revisión.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
S.E. Lutz cuenta con el apoyo del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales, los Institutos Nacionales de Salud, bajo los fondos de inicio de Grant KL2TR002002 y University of Illinois Chicago College of Medicine. Simon Alford es compatible con RO1 MH084874. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH. Los autores agradecen a Dritan Agalliu en el Departamento de Neurología del Centro Médico de la Universidad de Columbia por los ratones Tg eGFP:Claudin-5, discusiones científicas e ideas sobre el desarrollo del protocolo quirúrgico y las aplicaciones de imagen. Los autores agradecen a Sunil P. Gandhi en el Departamento de Neurobiología y Comportamiento de la Universidad de California, Irvine por diseñar el primer prototipo del aparato estereotáctico y controlador de temperatura animal, la discusión del protocolo quirúrgico, y formación en microscopía de dos fotones. Los autores también agradecen a Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) por su ayuda en la personalización del estereomicroscopio quirúrgico, y a Ron Lipinski (Whale Manufacturing) por el mecanizado de piezas estereotácticas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
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- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
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