Summary
Bu protokol, intravital mikroskopi ile görselleştirmeyi kolaylaştırmak için bir farenin omuriliğine cam pencere nin yerleştirilmesini açıklar.
Abstract
Bu protokol, fare omuriliğinin in vivo görüntülemesi için spinal kord laminektomi ve cam pencere implantasyonu için bir yöntem tanımlanmaktadır. Entegre bir dijital buharlaştırıcı isoflurane düşük akış hızında anestezi istikrarlı bir düzlem elde etmek için kullanılır. Tek bir vertebral omurga kaldırılır, ve ticari olarak kullanılabilir bir kapak-cam ince bir agarose yatak üzerine kaplanmış. 3D baskılı plastik bir arka plaka daha sonra doku yapıştırıcı ve diş çimentosu kullanılarak komşu vertebral dikenlere yapıştırılır. Bir sabitleme platformu solunum ve kalp atışı hareket artifakı azaltmak için kullanılır. Bu hızlı ve kelepçesiz yöntem akut multi-foton floresan mikroskopi için uygundur. Bu tekniğin transgenik farelerde spinal kord vaskülatürünün iki foton mikroskobuna uygulanması için temsili veriler eklenmiştir: Claudin-5 — sıkı bir kavşak proteini.
Introduction
Floresan proteinleri ifade eden transgenik hayvan modelleri, intravital mikroskopi ile birleştirildiğinde, biyoloji ve patofizyolojiye yönelik güçlü bir platform sağlar. Omurilik bu teknikleri uygulamak için, görüntüleme için omurilik hazırlamak için özel protokoller gereklidir. Böyle bir strateji bir laminektomi ve omurilik penceresi implantasyonu yapmaktır. Mikroskopi için ideal bir laminektomi protokolünün temel özellikleri arasında doğal doku yapısı nın ve fonksiyonunun korunması, görüntüleme alanının stabilitesi, hızlı işlem süresi ve sonuçların tekrarlanabilirliği sayılabilir. Belirli bir sorun solunum ve kalp atışı tarafından indüklenen harekete karşı görüntüleme alanı stabilize etmektir. Birden fazla ex vivo ve in vivo stratejileri bu hedeflere ulaşmak için bildirilmiştir1,2,3,4,5. En in vivo yöntemleri spinal kolonun kenarlarına kenetleme içerir2,4 ve genellikle sert bir metalcihazimplante takip 3,4 ameliyat sırasında istikrar için ve downstream görüntüleme uygulamaları. Omurilik kıskaç potansiyel kan akışını tehlikeye ve kan-beyin bariyerini neden olabilir (BBB) protein remodeling.
Bu yöntemin amacı, protokolün invazivliğini en aza indirirken ve sonuçları iyileştirirken, omurganın canlı farede optik görüntüleme için kullanılabilir hale getirilmesidir. Biz hala sağlam mekanik kararlılık elde minimal invaziv oval plastik 3D baskılı arka plaka ile eşleştirilmiş tek bir laminektomi ve kapak cam implantasyon prosedürü açıklar. Arka plaka doğrudan diş çimentosu ile anterior ve posterior vertebral dikenler yapıştırılır. Arka plaka sert bir metal kol ile mikroskop aşamasına eklemek vida delikleri ile yanal uzatma kolları ile donatılmıştır. Bu etkili mikroskop aşamasına bozulmamış anterior ve posterior vertebra demirler, aksi takdirde solunum ve kalp atışı ile tanıtılacak hareket artifakı mekanik direnç sağlayan. Yöntem, torasik düzey 12'de tek bir vertebranın laminektomi için optimize edilmiş ve in vivo görüntüleme sırasında stabilite için alternatif stratejilerde kullanılan kıskaçlar atlanmıştır. İşlem hızlıdır ve fare başına yaklaşık 30 dakika süredilir.
Bu protokol BBB'nin hastalık mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir. BBB, merkezi sinir sistemi (CNS) için son derece seçici bir ortam sağlayan endotel hücreleri, vasküler düz kas, perisitler ve astrosit ayak süreçlerinden oluşan dinamik bir mikrovasküler sistemdir. Temsili veriler, gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP): BBB sıkı kavşak proteini Claudin-5'i ifade etmek üzere tasarlanmış transgenik farelerde bu protokolün uygulanmasını betimlemelidir. Sağlanan arka plaka yazdırma dosyaları da alternatif uygulamalar için özelleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler Illinois Üniversitesi, Chicago Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi protokollerine uyar. Bu ölümcül bir prosedür.
1. Reaktif Hazırlama
- DdH 2 O. Steril filtrede 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glukoz, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2·6H2O, 2 mM CaCl2·2H2O ddH2O. Steril filtre içerecek şekilde suni serebral spinal sıvı (aCSF) hazırlayın ve bireysel kullanımda dondurulun. Kullanmadan önce 39 °C'ye kadar bir su banyosunda aCSF'yi ısıtın.
- Sıcak düşük erime noktası agarose (%2) 65 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda tamamen eriyene kadar aCSF'de Laminektomi sırasında, erimiş agarose aliquot'u bir su banyosunda 39 °C'ye kadar soğutun, böylece 5.2 adım için fizyolojik sıcaklığa yakın bir sıcaklıkta hazırolsun.
Not: Agarose çözeltisi -20 °C'de tek kullanımlık aliquotlarda saklanabilir. - Bakteriyostatik suda steril 50 mg/mL karprofen hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
- % 70 etanol, ddH2O üç yıkıntı ile temiz kapak camları, ve tozsuz bir kapta kuru saklayın.
2. Backplate 3D Baskı
- 3DCAD yazılımı kullanarak Şekil 1'de gösterilen boyutlara bir model oluşturmak için kullanılır. İç yazıcı ile ilgili olarak alt yüzeyinde bir elips geniş ve karşı yüzeyde bir lümen oluşturan daha küçük bir elips için loft kesim ile kesilir. Vidaları kabul etmek için delikli iki projektör kolu, arka plaka tutan çatala bağlanmak için yanal olarak uzar. Bu 3B yapıdan üçgenleştirilmiş bir 3B kafes dosyası oluşturun (. STL dosyası).
Not: Bkz. Şekil 1B\u2012D ve Ek Dosyalar 1 ve 2. - Üçgenleştirilmiş 3D örgü dosyasını bir 3B yazıcıya yükleyin.
- 0,4 mm hot-end nozul ve 0,2 mm katman yüksekliği kullanarak arka plakaları yazdırın. 205 °C'lik nozul sıcaklığını, 45 °C yatak sıcaklığını ve 45 mm/s yazdırma hızını seçin.
- Ortaya çıkan 3B baskılı arka plakaları yapısal bütünlük için görsel olarak değerlendirin (Şekil 1E); brüt yapısal arıza (lümen yok, çökmüş duvar) baskı kusurlarını gösterir (Şekil 1F).
3. Cerrahi Hazırlık
- Isıtma yastığını önceden ısıtın.
- Kimyasal bir duman kaputunda çalışırken teslimat şırıngasına yüklenir. Teslimat şırıngını isoflurane ünitesine takın.
- 8\u201212 haftalık bir fare seçin. Hayvanı tart. İndüksiyon odasında %2 isofluran kullanarak anestezi edin. 5 mg/kg deri altı karprofen enjekte edin.
- Burun konisini yerleştirin ve anestezinin cerrahi düzleminin bakımı için 150 mL/dk akış hızı yla %2 oranında isofluran teslim edin(Şekil 2A\u2012E). Temizleme kolaylığı için ısıtma yastığını tek kullanımlık emici pedile sarın.
- Cerrahi istasyonunda ısıtma yastığı üzerinde bir hayvan yerleştirin ve burun konisi yükleyin. Termometreyi petrol jölesi ile yağlayıp rektuma 5 mm takın. Stabilite için termometre sondasını kuyruğuna bantlayın. Farenin gözlerine oftalmik merhem uygulayın.
- Hidrasyonu korumak için, deney sonlanana kadar her 30 dakikada bir deri altı enjeksiyonla 200 μL laktasyonlu Ringer çözeltisini uygulayın.
- Sprey dorsum ile 70% etanol, makas ile kürk kaldırmak ve povidon-iyot ile site temizleyin.
4. Laminektomi
- Hayvanı kulak çubukları arasına yerleştirin; bunlar, burun konisi ile ilgili olarak farenin baş konumunu korur.
- Bu hayvan derinden interdigital çimdik refleks ve sürekli solunum düzeni eksikliği tarafından değerlendirildiği gibi anestezi olduğunu onaylayın.
- #11 bıçak kullanarak alt torasik/üst lomber bölge üzerinde orta hatta 1,5 cm rostral-kaudal insizyon yapın (Şekil 2). Künt dişli püzeler ve/veya eldivenli parmaklarla tutarak deriyi ayırın. Cildin altında kalan saydam bağ dokusunu ayırmak ve soymak için forceps kullanın. Yüzeysel kas şimdi maruz olmalıdır; bir köpük cerrahi mızrak ile yerinden.
- Hedef vertebranın kalan, daha derin kaslarını temizlemek için köpük cerrahi mızraklar (veya bir curette) kullanın (torasik 12). Arka plaka için bir koltuk oluşturmak için, ayrıca torasik 11 arka yönü kas temizlemek, ve torasik 13 ön yönü. Cerrahi bir mızrakla hafif basınç uygulayarak kanamayı kontrol edin veya bir çeker tabancası ile minimum darbe kullanın. Forceps kullanarak tendondan uzak kalan kas çıkarmaya devam edin
- Kaslar çıkarıldıktan sonra, dikkatle forceps ile keserek tendonları ayırmak. Bu adım tamamlandığında kabloyu görselleştirmek ve işlemek için bol miktarda alan olmalıdır. Inter-vertebral uzayın dura madde kontrol edin, yarı saydam laminar kemik, kemik altında merkezi yüzeysel kan damarı, ve anterior yayılan arter artık açıkça görülebilir.
- Sıcak aCSF ile bölgeyi ısla. Mikromatkap kullanarak omuriliğin uzun eksenine paralel düz vuruşlar kullanarak laminar kemiği tekrar tekrar inceltin(Şekil 2, Şekil 3). İstenirse, gelişmiş ergonomik konfor için cerrahi platformu döndürmek için bir kayma aşaması kullanın (örneğin, sağ elini kullanan bir operatör sondaj adımı için cerrahi platformu saat yönünün tersine döndürebilir).
Not: Kullanılan kayma aşaması, sabit taban plakasına göre ±15 mm kaydıran üst alüminyum plakadan yapılmıştır. - Hafifçe forseps ile yüzeysel spinous süreci kavramak ve vertebra kaldırın; kemik kolayca kaldırılmalıdır. Direnç varsa, matkap la kemik inceltme tekrarlayın ve gerekirse iris makas kullanın, doku zarar önlemek için makas uçları yukarı nişan dikkatli olmak.
Not: Durayı sağlam tutmak için kemiğe çekmemek gerekir. - Herhangi bir kemik kırıkları temizlemek için #4 forceps kullanın. Herhangi bir kanamayı kontrol etmek için hafif çetrene basınç uygulamak için cerrahi bir mızrak kullanın. Sıcak aCSF ile durula. Dokunun kurumasını izin vermeyin.
5. Kapak-cam İmplantasyonu
- 3 mm'lik borosilikat kapak camı açıktaki kabloya hafifçe uygulayın.
- Agarose'un 39 °C'ye soğutulmasını sağlayın. Küçük bir spatula kullanarak, kapak cam Kenarına sıcak% 2 agarose / aCSF uygulayın ve kılcal eylem yüzeyin altına çizmek için izin.
Not: 39 °C'nin altındaki sıcaklıklarda agarose jel olmaya başlayabilir. Bu durumda, bir su banyosu veya mikrodalga kullanarak yeniden ısınmak. Bazı operatörler ilk agarose bir damla uygulamak ve üstüne kapak cam koymak tercih ederim. - Torasik düzey 11 vertebra ve torasik düzey 13 vertebra omurga bozulmamış komşu vertebra maruz kemik eklem süreçlerine doku yapıştırıcı uygulayın. Laminaektomi bölgesinin etrafındaki halkaya, bitişik tendon ve enine proses üzerine ek doku yapıştırıcısı uygulayın.
Not: Sonraki adımlarda diş çimentosu uygun yapıştırıcı için doku yapıştırıcı gereklidir. Eklem süreçleri, arka plakanın rahat edebileceği doğal bir koltuk oluşturur (Şekil 3). Eklem süreçlerine yapışma eki güçlü noktaları oluşturacaktır. - Bir porselen karıştırma tepsisinde hızlandırıcı ile karıştırın diş çimentosu. Doku yapışkan tabakası üzerine diş çimentosu aktarmak için küçük bir spatula yararlanın. Arka plakayı pencerenin üzerine ortalanmış cerrahi alana yapıştırmak için diş çimentosu kullanın. Diş çimentosu tedavi için 10 dakika bekleyin.
Not: Arka plakanın ön ve posterior eklem proseslerine sıkı yapışması implantın temel yapısal stabilitesini sağlar. - Arka plakaiç tabanı doldurmak için ek diş çimentosu kullanın, ve arka plakanın alt : doku arayüzü.
Not: Diş çimentosu ekstra uygulama yapışmayı artırır ve mikroskop objektif daldırma sıvısı (tuzlu) arka plaka nın alt dışarı sızıntı riskini azaltır. - Çatallı arka plaka tutucuyu pencere üzerinde uygun konuma getirin. Arka plakayı vidalarla arka plaka tutucuya sabitle.
Not: Bu protokolde özel olarak işlenmiş bir arka plaka tutucu kullanılmıştır (Şekil 2G\u2012H). - Sızıntıyı test etmek için arka plakaya tuzlu su uygulayın. Herhangi bir sıvı sızıntısı durumunda, alanı kuru ve daha fazla diş çimentosu uygulayın.
6. Görüntüleme Hazırlığı
- Cerrahi platformdaki hayvanı optik masaya aktarın.
Not: Cerrahi platformumuz, arka plaka tutucumuz ve isofluran etek tutucumuz, sürekli isofluran anestezi uygularken cerrahi ve iki foton görüntüleme istasyonları arasında tek ünite olarak taşınabilir (Şekil 2D,H). Benzer birimler, ticari kaynaklardan elde edilebilen çatal, kiriş ve destekleyici sütun direklerinden(örn. ThorLabs). İntravital mikroskopi için, cerrahi platformun yüksekliğini karşılamak için mikroskop hedefi ile optik tablo arasında en az 11 inç açıklık olmalıdır. - Cerrahi platformu, paslanmaz çelik montaj direğine ve counterbored sıkma çatalını kullanarak optik masaya yapıştırın.
- Arka plakanın kuyuiçine taze tuzlu uygulayın. Kuyuya bir su daldırma lens indirin.
- İlgi ve odak alanını belirlemek için iletilen veya epifloresan ışığı kullanın. Lazer tarama moduna geçin ve uygun iki foton lazer uyarma dalga boyu, dikroics ve bandpass filtrelerdoku6mevcut floropores için göre vivo görüntüleme gerçekleştirmek .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İmplante cam pencereler ve intravital iki foton mikroskopi CNS proteinlerinde dinamik değişiklikleri değerlendirmek için yararlı bir araç sağlar. BBB'nin fonksiyonel bütünlüğü, sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyonu, hücre altı lokalizasyonu ve ciro oranlarından etkilenir7. Önceki çalışmalar, sıkı kavşak proteinlerinin sabit durumda hızlı ve dinamik remodeling geçmesi olduğunu göstermiştir8. Şu anda açıklanan laminektomi ve cam pencere hazırlığı transgenik eGFP kullanılmıştır:Claudin-5 fareler9, floresan sıkı kavşak proteinleri taşıyan, Deneysel otoimmün BBB sıkı kavşak remodeling değerlendirmek için multipl skleroz ensefalomiyelit (EAE) modeli10. Temsili verilerde, eGFP:Claudin-5'in görüntülemesi 920 nm uyarma ile iki foton mikroskobu, 40× kızılötesi nesnel (0.8 NA) ve yeşil floresan emisyon filtresi ile elde edilmiştir (Şekil 4). Optik yığınlar dural yüzeyin in altında 100 μm 2 μm eksenel adımlarda örneklendi. Veriler, bir vasküler pleksus boyunca floresan etiketli kavşakların görselleştirilmesini göstermektedir. Tek optik dilimler ve Z-projeksiyon görüntüleri dahildir (Şekil 4). Z-projeksiyonundaki(Şekil 4B)sıkı kavşak yapılarının net bir şekilde tanımlaması, başarılı laminektomi, pencere yerleşimi ve arka plaka implantasyonu ndan sonra minimal X-Y görüntü deplasmanının üretildiğini gösterir.
Şekil 1. Özel baskılı arka plaka sabitleme cihazı. A) Ortogonal arka plaka görünümleri. B-D) Arka plakanın dorsal ve ventral yüzeylerinin üçgen örgü modelleri. E) Doğru basılmış arka plaka. F) Yanlış basılmış arka plaka. Bkz. Ek Dosyalar 1 ve 2. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Laminektomi için cerrahi adımlar. A) (i) anestezikontrol için dokunmatik ekran, (ii) kontrol kadranları, (iii) isteğe bağlı eklenti fizyoloji modülleri için girişler, (iv) anestezi konsantrasyonu dahil olmak üzere entegre bir dijital buharlaştırıcı kullanan isoflurananestezi dağıtım sistemi ayar tonlaması, (v) şırınga pompası itici bloğu, (vi) isoflurane ile şırınga, (vii) entegre dijital buharlaştırıcı, (viii) ilham tüpü, (ix) indüksiyon odası için ilham tüpü, (x) indüksiyon odası, (xi) burun konisi için ilham tüpü, (xii) burun konisi için son kullanma borusu, (xiii) indüksiyon odası için son kullanma borusu. B) Laminektomide kullanılan aletler arasında (i) geri besleme kontrollü ısıtma ünitesi, (ii) K-coupled rektal termometre prob, (iii) esnek silikon ısıtma yastığı, (iv) #11 bıçak, (v) #5 koplar, (vi) dişli titanyum koçeler, (vii) titanyum iris makas, (viii) kemik mikromatkap, (ix) katutery silah, (x) 3D baskılı arka plaka, (xi) emici köpük cerrahi mızrak, (xii) akrilik resin için seramik karıştırma tepsisi, (xiii) akrilik reçine ve hızlandırıcı, (xiii) doku yapıştırıcısı, (xiv) oftalmik yağ, (xv) 3 mm kapak-cam. C) Stereomikroskop ve cerrahi platform. Ameliyat sırasında, cerrahi platform bir kayma aşamasında oturur (mikroskop aşamasında gümüş ve siyah yuvarlak taban). D) Fare, yüzeysel orta hat kesisi sonrası, ısıtmalı yataklı özel cerrahi platform da yer almaktadır. Isoflurane nosecone tutucu, küçük ve büyük fareleri barındıracak şekilde Y ve Z eksenlerinde ayarlanabilir. Kulak çubukları nosecone göre baş stabilize. Rektal termoprob çekirdek sıcaklığını ölçer. E) Kas çıkarma aşamasında cerrahi alan. F) Kas alındıktan sonra cerrahi alan. G) Vertebra kemiğinin incelmesi sırasında cerrahi alan. H) Vertebra kemiğinin çıkarılmasından sonra cerrahi alan. I) Kapak camı yerleştirme sırasında cerrahi alan. J) Kapak camı yerleştirildikten sonra cerrahi alan. K) Akrilik ile ilk kaplama sırasında cerrahi alan. L) Arka plaka implanasyonu tamamlandıktan sonra cerrahi alan. M-N) Fare laminektomi tamamlandıktan sonra cerrahi istasyonda konumlandırılır. Pirinç çatal, omurilik laminektomi bölgesi neresinde konumlandırılmak için X-, Y-ve Z-eksenlerinde ayarlanabilir. Çatal, ameliyat sırasında görüntüleme alanının optimum stabilizasyonu ve iki foton intravital mikroskopi dahil downstream uygulamaları için cerrahi platforma mekanik olarak sabitlenmiştir. Ameliyat sırasında cerrahi platform süzülme aşamasına monte edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Omurilik penceresinin anatomik yerleşiminin şematik tasviri. A) Daha düşük torasik vertebral vücut üstün görünümü şematik tasviri, spinous süreci, ve omurilik (sc) segment. Noktalı bir daire eklem sürecinin koltuk, arka plaka yapışma için ana destek noktası tasvir eder. B) Omurilik penceresinin üstün görünümünün şematik tasviri. Hedef vertebraomurgası (burada, T12) çıkarılmıştır. Agarose ince bir tabaka omurilik blaylar. Bir coverglass agarose üstüne dayanıyor. Doku yapıştırıcısı enine prosesler üzerine uygulanır (ve burada gösterilmez, bitişik, sağlam vertebraik dikenlerin maruz kalan eklem prosesiüzerinde). Diş çimentosu doku yapıştırıcısını büstü eder. Arka plaka doku çimentosu yapışır, enine süreçler (gösterilen) ve bitişik eklem süreci üzerinde dinlenme, bozulmamış vertebral dikenler (bu panelde gösterilmez). Arka plaka jantının iç kesimine ek ince bir diş çimentosu tabakası uygulanır. Arka plaka, kapak camı görselleştirmek için kesit görünümünde betimlenmiştir. C) Omurilik penceresinin yanal görünümünün şematik tasviri. Hedef vertebraomurgası (burada, T12) çıkarılmıştır. Agarose ince bir tabaka omurilik blaylar. Bir kapak-cam agarose üstüne dayanıyor. Doku yapıştırıcısı bitişik, sağlam T11 ve T13 vertebraik dikenlerin maruz kalan eklem prosesi üzerine uygulanır. Diş çimentosu doku yapıştırıcısını büstü eder. Arka plaka doku çimentosu yapışır, enine süreçler ve bitişik eklem süreci üzerinde dinlenme, bozulmamış vertebral dikenler (gösterilmiştir). Arka plaka bir kesit görünümünde tasvir edilmiştir; gerçek bir yanal görünümünde agarose ve kapak-cam arka plaka lateral duvar tarafından gizlenmiş olacaktır. Anatomik yapılar Harrison ve meslektaşları tarafından yürütülen C57Bl/6 spinal kolon ayrıntılı manyetik rezonans görüntüleme dayanmaktadır 11. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Sıkı kavşak mikroyapısı eGFP ile görselleştirilmiş:Claudin-5 fare omuriliğinde intravital iki foton mikroskopi ile. A) Sağlıklı bir eGFP:Claudin-5 farede dural yüzeyinin 30 μm altında alınan tek optik bölüm. Kırmızı ok, uzunlamasına sıkı kavşak eksenine dik uzanan bir eGFP:Claudin-5 sıkı kavşak segmentini betimleer. Ölçek çubuğu 5 μm. Inset temsil eder: ölçek çubuğu temsil eder 10 μm. B) Sağlıklı fare omurilik dural yüzeyinin altında 100 μm uzanan vasküler ağ Z-projeksiyon. Optik yığın 2 μm eksenel adım boyutunda örneklendi ve A panelinden dilim içerir. Görüntü hizalaması gerçekleştirilmemiştir. Z projeksiyonundaki kavşak yapılarının keskin bir şekilde tasviredilmesi, ardışık kareler arasında en az görüntü yer değiştirmesini gösterir. C) Ortaya çıkan Z-yığınından 10 μm aralıklarla alınan optik dilimlerin temsili alt kümesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Dosya 2. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yöntem, cam pencereden farelerdeki omuriliğin kararlı bir şekilde görüntülenmesine olanak sağlar. Bu yöntem transgenik eGFP BBB remodeling değerlendirmek için uygulanmıştır:Claudin5 +/- bir floresan BBB sıkı kavşak proteinifade fareler, ancak omurilik herhangi bir floresan protein veya hücrelerin çalışmaları için eşit derecede iyi uygulanabilir.
Laminektomi ve omurilik stabilizasyonu için birden fazla yöntem geliştirilmiştir. Tüm protokoller, ilgi çekici yapıya görsel erişim için görüntüleme ve pencere uygulaması sırasında omuriliğin dengelenmesini ele adamaktadır. Çıkarılan vertebra sayısı ve mevcut protokollerin invazivlik derecesi değişir(örneğin, yüzeysel kemik yüzeyine yapıştırılmış bileşenler, mevcut protokolde olduğu gibi, daha deringömülü karşı). Davalos ve Akassoglou2, omuriliği stabilize etmek için omuriliğin her iki tarafında çıkarılabilir kelepçeler ve farenin kuyruğunun tabanında bir kelepçe kullanarak bir laminektomi yöntemi geliştirdiler. Hayvanı askıya almak için bu yenilikçi strateji, cerrahi tabloya karşı genişleyen akciğerlerin hareketinin neden olduğu göğüs salkı larının bir kısmını hafiflettin. Bir su daldırma mikroskobik lens için daldırma sıvısı içeren bir kuyu oluşturmak için, jelatin mühür bir jant(örneğin Gelseal) omurilik etrafında yapılmış ve aCSF ile doldurulmuş. Sızdırmazlık jantı görüntüleme sırasında bozulabilir, ancak yara kapanması ve daha sonra tekrar görüntüleme sağlamak için seans Sonunda kolayca silinebilir. Bu yöntem yaygın olarak kabul edilmiştir12,13. Diğer gruplar alternatif stabilizasyon yöntemleri geliştirmişlerdir. Fenrich ve ark. Omurilik güvenliğini sağlamak için bir yol olarak 4 el yapımı modifiye ataş. Bu modifiye ataşsiyatlar siyanoakrilat tutkal ile lateral vertebral pediküller güvenli ve mükemmel hareket stabilitesi için çıkarılabilir bir dış klips ve dış tutma çatal için kalıcı implante kolları olarak muhafaza edildi. Cupido ve meslektaşları kordon 2,4,12üzerine overlaid agarose dahil ile yukarıda belirtilen yöntemler üzerinde varyasyonlar sunduk. Farrar ve Schaffer3, sadece bir omur yerine üç omur üzerine cam pencere uygulanmasına izin verebilecek bir dörtlü metal dengeleyici geliştirdi. Bu yöntem aynı zamanda potansiyel hareketi azaltmak için görüntüleme sırasında daha büyük bir köprü dengeleyicisine vidaile bağlı omurilik izin verdi. Doğrudan laminektomi görüntüleme odasına yerleştirilen minyatür leştirilmiş tek foton mikroskobu, tek foton seviyesinde serbestçe hareket eden farelerde in vivo kayıt için geliştirilmiştir, ancak henüz çoğu laboratuvar için hazır değildir13 . Farklı bir yaklaşımla, Weinger ve ark. 1 bütün bir omurilik diseksiyon ve ex vivo görüntüleme için agarose gömülü, hangi aşılamaz hareket stabilitesi ve ventral omurilik erişim sağlar, ama kan akışını abrogates. Bu gelişmelerin bazı sınırlamalar uzun cerrahi zamaniçerir 4, jelatin mühür jant olası bozulma2, omurilik istenilen alana uyacak şekilde kapak cam boyutları özelleştirmek için ihtiyaç4, manuel ataşmodifikasyonu 4,12, nispeten invaziv cerrahi teknikler12,14, ve hava kabarcıkları silikon elastomer kullanırken şekillendirme3,4.
Çeşitli avantajlar sunan alternatif bir yöntem geliştirdik. Bu protokol, ameliyat sırasında harcanan süreyi azaltmak için optimize edilmiştir. Bazı cerrahi protokoller bir saat ve yarım4 ile bir saat arasında değişen daha uzun işlem süreleri gerektirir3; bir kez hakim, Bu laminektomi yöntemi yaklaşık 30 dakika içinde yapılabilir. Bu protokol, tek bir omur kaldırır ve bazı karşılaştırılabilir protokolleri4,5,12,14daha az invaziv hale stabilizasyon cihazının yüzeysel yapışma içerir. Figley ve ark.yöntemi gibi, plastik bir implant kullanarak bu protokol akustik görüntüleme5ile uyumluluk sunuyor.
Hava, su ve doku kırılma ideksleri arasındaki farklardan kaynaklanabilecek ışık saçılımından (intravital mikroskopi sırasında) önlemek için, çoğu protokol açıkta kalan omurilik üzerine optik olarak saydam bir substrat yerle bir eder. Ortak substratlar yüksek saflıkta, düşük erime sıcaklığı agarose10,12 veya silikon polimerler3,4,5içerir. Agarose, minimal kabarcık oluşumu ile kullanım kolaylığı avantajı sunar ve akut görüntüleme seansları için uygundur. Isı hasarından doku korumak için, erime noktası ötesine agarose ısıtmak ve daha sonra laminektomi sırasında bir su banyosu ~ 39 °C soğumasını sağlamak için uygundur, böylece maruz omurilik uygulama için uygun zamanda hazır olabilir. Kronik görüntüleme için, silikon polimerler dehidratasyona karşı daha dayanıklıdır. Mevcut protokolün geliştirilmesi sırasında pilot denemeler ya agarose tabakası veya üstteki kapak-cam atladı ve bunun sonucu ışık saçılımı görüntüleme mevcut derinliği azaltılmış bulundu.
Bu protokolün ayırt edici özelliği, 3D baskılı bir arka plaka ve destekleyici arka plaka çatal tutucunun eklenmesidir. Laminektomi ve pencere implantasyonundan sonra, diş çimentosu ile yerinde sabitlenmiş 3D baskılı oval bir arka plaka ilave edilerek preparat stabilize edilir. Arka plaka iki fonksiyona hizmet eder: birincisi, omuriliğin yapısal destek ve stabilizasyonu sağlar, ikincisi ise mikroskopik için daldırma hedefleri için sıvı tutmak için bir dudak oluşturur. Bu kurulumun prototiplerinde, ticari olarak mevcut sütun direkleri, adaptörler ve tutucu çatallar kullanılmıştır; biz son zamanlarda burada tasvir gibi özel işlenmiş parçalar ageçti. Her iki durumda da, temel özelliği kalp atışı ve solunum tarafından indüklenen uzay ve zaman pertürbations karşı görüntüleme alanı stabilize etmek için yapısal titizlik sağlamaktır. Hayvanın vücudu ısıtma yastığı üzerinde gevşek istirahat olmasına rağmen, omurilik ve görüntüleme alanı biraz tutma çatal askıya alınır, aynı zamanda solunum deplasman azalır. Plastik substrat, plaka tutucuya vidalama gerilimini karşılamak için hafif esneklik sağlar. Yazdırmaiçin kullanılan siyah plastik renk floresan alanına en az ışığı yansıtır. Bu yöntemler le, post hoc hizalama olmadan kullanılabilecek görüntü yığınları başarıyla oluştururuz. Ayrıca, burada açıklanan 3D arka plaka üretmek için ucuz, yazıcı satın alındıktan sonra, her baskı için malzeme sadece pennies maliyet. Ayrıca, 3D yazıcıların maliyetleri son yıllarda düşmüştür. Bu protokolle yayınlanan 3B baskılı arka plaka yapısal dosyaları (Bkz. Ek Dosyalar 1 ve 2)tek tek laboratuvar gereksinimlerini karşılamak üzere kolayca değiştirilebilir. Biz bel den2 / 3 omurilik segmentleri overlies torasik 12 vertebral omurga, kaldırılması ile oluşturulan intervertebral alanı karşılamak için arka plaka uzun boyut tasarlanmıştır11. Bu tekniği farklı bir vertebral bölüme uygulamak için, beraberindeki CAD dosyaları değiştirilebilir.
Bu protokol, geleneksel pasif buharlaştırıcıya alternatif olarak dijital entegre doğrudan enjeksiyon buharlaştırıcısını devreye alan, ticari olarak kullanılabilen düşük akışlı anestezi sistemini kullanmaktadır. Düşük akış lı ünitenin en önemli özelliği, önemli bir sağlık yararı olan isoflurane azaltılmış operatör maruziyetidir. Düşük akışlı anestezi ünitesi, isofluran tüketiminin azalması ve basınçlı gaz yerine oda havasının kullanımı nedeniyle maliyet tasarrufu sağlar. Bu çalışmada, 150 mL/dk'da entegre dijital buharlaştırıcı tarafından teslim edilen %2 izofluran, geri besleme kontrollü termal destek ile birlikte, stabil bir anestezi düzlemi ve çekirdek vücut ısısının uygun şekilde sürdürülmesi sağlanmıştır. Bununla tutarlı olarak, dijital entegre buharlaştırıcılar ve geleneksel buharlaştırıcıların yayınlanmış karşılaştırmaları da dijital entegre buharlaştırıcının istikrarlı bir anestezi düzlemi ve çekirdek vücut ısısının, kalp hızının iyi korunması, solunum hızı, ve daha az isofluran kullanırken kurtarma15,16.
Bir non-steroid anti-inflamatuar ilaç (NSAID) karprofen gibi pre-operatif ek analjezik olarak uygulanabilir. Birkaç saat boyunca, NSAID inflamatuar sitokin transkripsiyon ve interstisyel ödem inhibe; multi-gün uygulama deneysel otoimmün ensefalomiyelit, multipl skleroz bir hayvan modeli de dahil olmak üzere nöroinflamatuar hastalıkların şiddetini zayıflatır17,18. Özellikle nöroinflamatuar hastalık çalışmalarında, karprofen analjezisinin yararlı etkileri, analjezi ve anesteziyi belirlerken hastalık modifiye edici etkilere karşı dikkatle tartılmalıdır. uygun düzenleyici kurullar.
Bu yöntemin bir sınırlama, birden çok gün boyunca tekrarlanan görüntüleme oturumları için kolayca amenable olmamasıdır. Ana nedeni, arka plaka yapısı üzerinde cilt kapatmak için çok büyük olmasıdır. Bu nedenle, bir fare anestezi uyanma üzerine arka plaka çıkarmak bir risk vardır. Tekrarlanan görüntüleme gerekliyse, arka plakanın boyutunu küçültmek veya montajı değiştirmek de dahil olmak üzere konuşlandırılabilecek çeşitli stratejiler vardır. Herhangi bir cerrahi işlemde olduğu gibi, operatörler için bir öğrenme eğrisi vardır. Kurumsal hayvan bakım ofisleri ve inceleme kurulları ile yakın koordinasyon gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
S.E. Lutz, Grant KL2TR002002 ve University of Illinois Chicago College of Medicine başlangıç fonları altında Ulusal Çeviri Bilimleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Geliştirme Merkezi tarafından desteklenir. Simon Alford RO1 MH084874 tarafından desteklenir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Yazarlar Tg eGFP için Columbia Üniversitesi Tıp Merkezi Nöroloji Bölümü'nde Dritan Agalliu teşekkür:Claudin-5 fareler, bilimsel tartışmalar, ve cerrahi protokol ve görüntüleme uygulamalarının geliştirilmesi içine anlayışlar. Yazarlar California Üniversitesi Nörobiyoloji ve Davranış Bölümü Sunil P. Gandhi teşekkür, Irvine stereotaktik cihaz ve hayvan sıcaklık kontrolörü ilk prototip tasarımı için, cerrahi protokol tartışma, ve iki foton lu mikroskopi eğitimi. Yazarlar ayrıca Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc) cerrahi stereomikroskop özelleştirme de yardım için teşekkür ve Ron Lipinski (Balina İmalat) stereotaktik parçaları işleme için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F. Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. Bakota, L., Brandt, R. , Springer. New York. 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
