Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Cellecyklus analyse i C. elegans kønscelleoverførsel med Thymidine Analog EdU

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/58339
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 2
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

Summary

En billeddannelse-baseret metode er beskrevet som kan bruges til at identificere S-fase og analysere cellecyklus dynamics i C. elegans hermafrodit kønscelleoverførsel ved hjælp af thymidine analog EdU. Denne metode kræver ingen transgener og er kompatibel med immunfluorescent farvning.

Abstract

Cellecyklus analyse i eukaryoter udnytter ofte kromosom morfologi, udtryk og/eller lokalisering af genprodukter, der kræves til forskellige faser i cellecyklus eller indarbejdelse af nucleoside analoger. Under S-fase, DNA polymeraser indarbejde thymidine analoger såsom EdU eller BrdU kromosomale DNA, markere cellerne for analyse. For C. elegans, nucleoside analog EdU er fodret til orme under regelmæssig kultur og er kompatibel med immunfluorescent teknikker. Kønscelleoverførsel af C. elegans er en kraftfuld modelsystem for undersøgelserne af signalering stier, stamceller, meiose og cellecyklus, fordi det er gennemsigtigt, genetisk letkøbt, og meiotiske prophase og cellulære differentiering/gametogenesis sker i en lineær forsamling-lignende måde. Disse funktioner gør EdU et fantastisk værktøj til at undersøge dynamiske aspekter af mitotically cykling celler og kønscelleoverførsel udvikling. Denne protokol beskriver hvordan man med held forberede EdU bakterier, fodre dem til vilde-type C. elegans hermafroditter, dissekere den hermafrodit gonade, pletten til EdU indbygning i DNA, pletten med antistoffer til at opdage forskellige cellecyklus og udviklingsmæssige markører, billede af gonade og analysere resultaterne. Protokollen beskriver variationer i metode og analyse til måling af S-fase indeks, M-fase indeks, G2 varighed, celle cyklus varighed, rente af meiotiske post og sats af meiotiske prophase progression. Denne metode kan tilpasses for at studere cellecyklus eller celle historie i andre væv, stadier, genetiske baggrunde og fysiologiske tilstande.

Introduction

I dyrenes udvikling skal hundreder, tusinder, millioner, milliarder, eller endog trillioner af celledelinger danne den voksne organisme. Cellecyklus, cellulære begivenheder sæt sammensat af G1 (gap), S (syntese), G2 (gap), og M (mitose) definerer serien af begivenheder, der er udført hver celledeling. Cellecyklus er dynamisk og bedst værdsat i realtid, som kan være teknisk vanskeligt. De teknikker præsenteret i denne protokol tillader en at foretage målinger af faserne og timing af cellecyklus fra stillbilleder.

Mærkning med nucleoside analoger som 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) eller 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) er guldstandarden til at identificere S-fase i undersøgelserne af cellecyklus dynamics i Caenorhabditis elegans (C. elegans) voksen hermafrodit kønscelleoverførsel1,2,3,4,5. Både EdU og BrdU kan bruges i næsten alle genetiske baggrund, som de ikke stole på nogen genkonstruktion. Visualisere BrdU kræver skrappe kemiske behandling at afsløre antigener for anti-BrdU antistof farvning, der er ofte uforenelige med vurderingen af andre cellulære markører visualiseres ved farvning Co med ekstra antistoffer. Derimod visualisere EdU opstår ved klik kemi under milde forhold og er således kompatibel med antistof Co farvning6,7.

Specificiteten af etiketten er klar, da kerner kun optage thymidine (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) analoger i DNA S-fasen. Visualisering foregår i faste væv. EdU etiketten er usynlig selv indtil en indeholder-holdige farvestof eller fluorophore reagerer kovalent med alkyn i EdU af kobber-katalyseret Klik kemi8. EdU mærkning kan give øjeblikkelig information hvorpå kerner er i S-fase, med en kort puls af mærkning. EdU kan også give dynamiske oplysninger, ved hjælp af puls-chase eller kontinuerlig mærkning; for eksempel, i en pulse-chase eksperiment, etiketten er fortyndet på hver celledeling eller opformeret som nondividing celler fremskridt gennem udvikling.

C. elegans hermafrodit kønscelleoverførsel er en kraftfuld modelsystem for undersøgelserne af signalering veje, stamceller, meiose og celle cyklus. Den voksne kønscelleoverførsel er en polariseret samlebånd med stamceller fundet i den distale ende efterfulgt af post og progression gennem meiotiske prophase, koordineret med faser af gametogenesis mere proksimalt (figur 1). På den proksimale ende, oocyter modne, er ægløsning og befrugtet og begynde embryogenese i livmoderen9,10,11. ~ 20 celle-diameter lang regionen nær den distale tip celle, som indeholder mitotically cykling kønscelleoverførsel stilken, stamceller og meiotiske S-fase celler men ikke cellerne i meiotiske prophase, kaldes stamfader zone2,4 , 9 , 12. cellemembraner giver ufuldstændig adskillelse mellem kerner i den distale kønscelleoverførsel, men zone stamceller gennemgå mitotiske celle cykling stort set uafhængigt af hinanden. Median mitotiske cellecyklus varigheden af kønscelleoverførsel stamceller zone i unge voksne hermafroditter er ~6.5 h; G1 fase er kort eller fraværende, og ubevægelighed er ikke observeret1,2,13. Kønscelleoverførsel stamcelle differentiering sker gennem hovedsagelig direkte differentiering og dermed mangler uddybning af transit divisioner4. Under differentiering i pachytene fase, omkring 4 ud af 5 kerner vil ikke danne oocytter, men i stedet gennemgå apoptose, handler som sygeplejerske celler ved at donere deres cytoplasmatisk indholdet at udvikle oocyt12,14 , 15.

Ud over mærkning celler i S-fase med nucleoside analoger, kan man identificere cellerne i mitosen og meiose bruger antistoffarvning. Kerner i mitosen er immunoreaktive til anti-phospho-Histon H3 (Ser10) antistof (kaldet pH3)7,16. Kerner i meiose er immunoreaktive til anti-ham-3 antistof (en meiotiske kromosom akse protein)17. Kerner i zonen Stamform kan identificeres ved fravær af HIM-3, tilstedeværelsen af nucleoplasmic REC-818eller tilstedeværelsen af WAPL-119. WAPL-1 intensitet er højest i den somatiske gonade, høj i zonen Stamform og lav under tidlige meiotiske prophases19. Flere cellecyklus målinger er muligt med et par variationer i protokollen: Jeg) identificere kerner i S-fase og måle S-fase indeks; II) identificere kerner i M-fase og måle M-fase indeks; III) afgøre, om kerner var i mitotiske eller meiotiske S-fase; IV) måle varigheden af G2; V) måle duartion af G2 + M + G1 faser; VI) foranstaltning sats af meiotiske post; VII) skøn sats af meiotiske progression.

Man kan lave flere cellecyklus målinger fra kun et par typer af våd-lab eksperimenter. Protokollen nedenfor beskriver en 30 min puls mærkning af fodring C. elegans voksen hermafroditter med EdU mærket bakterier og co mærkning M-fase celler ved farvning med anti-pH3 antistof og stamfader zone celler ved farvning med anti-WAPL-1 antistof. Kun ændringer i varigheden af EdU feed (trin 2,5), type af antistoffer ansat (trin 5), og analyser (trin 8.3) er påkrævet for de yderligere målinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af EdU-mærket bakterier

  1. Vokse en igangsætter kultur af MG1693. Escherichia coli (E. coli) MG1693 bærer en mutation i thyA.
    1. Streak ud E. coli MG1693 fra en frossen glycerol bestand på en 120 mm lysogeny bouillon (LB) agar petriskål. Kultur ved 37 ° C natten over.
    2. Podes fra to individuelle E. coli MG1693 kolonier i to identiske 4 mL rør af flydende LB. kultur ved 37 ° C i ~ 16 h.
      Bemærk: MG1693 vokser fint i LB uden supplere med thymin eller thymidine.
  2. Vokse E. coli MG1693 i minimal media suppleret med EdU.
    1. Autoklave en 500 mL konisk kolbe.
    2. Brug steril teknik til at tilføje 5 mL af 20% glukose, 50 μl af 10 mg/mL af thiamin, 120 μL af 5 mM thymidine, 100 μL af 1 M MgSO4, 200 μl af 10 mM EdU, 100 mL af M9 buffer og 4 mL frisk dyrkes natten MG1693 kultur.
      NOTE: Den endelige koncentration af EdU er 20 μM i denne kultur1,7. Denne koncentration fører til DNA skader og celle cyklus anholdelse, hvis der anvendes direkte til pattedyrsceller i kultur20. Dog er kun en brøkdel af denne EdU indarbejdet i E. coli og dermed tilgængelig for C. elegans. Der er ingen tegn på celle cyklus anholdelse og ingen ændring i størrelsen af stamfader zone eller M-fase indekset efter EdU behandling af unge voksne hermafroditter.
    3. Kultur natten over, men ikke længere end 24 timer ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm.
  3. Koncentrere EdU-mærket E. coli og gælder for M9 petriskåle med agar.
    1. Pre-afkøle en bordplade centrifuge til 4 ° C.
    2. Brug steril teknik til at overføre kulturen i 2 – 4 steril 50 mL konisk rør.
    3. Der centrifugeres kulturer på 3.000 x g ved 4 ° C i 30 min at sammenpresse EdU-mærket E. coli.
      Bemærk: Smid EdU-holdige supernatanten ifølge lokale og institutionelle retningslinjer.
    4. Resuspend pellets med 4 mL frisk M9. Bruge en steril 1 mL pipette tip eller en steril 5 mL serologisk pipette. Resuspending pellets kan tage flere minutter.
    5. Brug den samme pipette til at anvende og sprede ~ 8 dråber af resuspenderede EdU-mærket E. coli MG1693 til midten af stuetemperatur 60 mm M9 agar petriskåle. Én batch udbytter ~ 16 retter.
    6. Tillad retter til tør i flere timer eller natten over ved stuetemperatur, og derefter forsegle hver tallerken med en stribe af laboratoriet film. Retter kan opbevares ved 15 ° C ~ 2 uger og ved 4 ° C ~ 2 måneder. Brug den samme batch af EdU retter for hvert sæt af forsøg.

2. fodring EdU C. elegans

  1. Synkronisere befolkning ved timet æg lå, basisk hypokloritiske behandling efterfulgt af rugeæg til S-medie med kolesterol, eller ved at vælge passende tidspunkt21. Vokse dyrene til ønskede fase (her, 24 h post-L4) på Nematode vækstmediet seedede med E. coli OP50 ved 20 ° C.
    Bemærk: Tilbered 50 – 100 dyr pr. eksperiment, som nogle ikke kan dissekere godt, og andre vil gå tabt ved at vaske og overførsel.
  2. Tillad EdU retter at varme til 20 ° C (eller den ønskede for eksperimentet temperatur).
  3. Vaske dyrene fra NGM retter bruger M9 eller fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ind i en 1,5 mL rør. Tillad dyr at bilægge kort af tyngdekraften eller en kort tur i en microcentrifuge.
  4. Fjern supernatanten og vaske dyrene 1 – 2 gange med ~ 1 mL af M9 eller PBS. Fjern supernatanten.
  5. Bruge et glas Pasteur pipette til at overføre dyr i en lille dråbe af M9 eller PBS på midten af EdU græsplæne. Vent et par minutter for væske til at blive absorberet, derefter inkuberes ved 20 ° C i 30 min (for direkte S-fase måling) eller længere (til at måle historie af S-fase), efter behov.
    Bemærk: EdU signal kan spores i kønscelleoverførsel kerner efter så lidt som 15 min. af EdU fodring1.
  6. Vaske EdU fadet med ~ 2 mL af M9 eller PBS i et glas, dissekere parabol orme.

3. dissektion og fiksering af C. elegans kønscelleoverførsel

Bemærk: Denne protokol til dissektion, fiksering og antistoffarvning af C. elegans hermafrodit kønscelleoverførsel er næsten identisk udgivet af Gervaise og Arur (2016)22, bortset fra at 1 mL glasrør kan være centrifugeres for at fremskynde vask skridt og en langtrukken glas Pasteur pipette kan bruges til at fjerne væsken fra 1 mL glasrør mere effektivt.

  1. Vask og dissekere C. elegans germlines.
    1. Tillader dyr at bilægge til bunden af den dissekere parabol, swirl at indsamle dyr i centrum, og bruge en lang Pasteur pipette til at fjerne PBS. Vask 1 – 2 gange med ~ 2 mL PBS.
    2. Tilsættes 2 mL PBS og 4 μL 100 mM levamisol at immobilisere dyrene. Swirl parabol igen for at indsamle dyr i midten af fadet.
      Bemærk: Immobilisering kan tage mellem et par sekunder og et par minutter. Komplet immobilisering er ikke nødvendige for vellykket dissektion. Nogle mennesker har bedre succes når dissekere ufuldstændigt immobiliseret dyr.
    3. Dissekere dyr med et par af 25G 5/8" nåle ved at skære på hovedet (ca mellem de to svælg pærer) eller halen. Passe på ikke for at skære loop af germline. Tarmen og kønscelleoverførsel skal "springe ud" af kroppen hulrum på grund af indre pres, men forbliver knyttet. Denne protokol er lig tidligere udgivne Gervaise og Arur (2016)22.
      Bemærk: Hold dissektion tid til ~ 5 min, bestemt ikke mere end 15 min. længere dissektion gange kan resultere i tab af antistof farvning signal (Sudhir Nayak, personlig meddelelse) og sult i PBS kan påvirke dyrenes fysiologi. Lære at dissekere hurtigt og præcist kan tage nogle praksis.
    4. Hvis det er nødvendigt, swirl for at indsamle de dissekerede dyr i midten, og bruge en lang Pasteur pipette til at fjerne så meget PBS som muligt.
  2. Fix og dehydrere væv
    1. Der tilsættes 2 mL 3% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS løsning. Dæk fadet løst med laboratoriet film og opbevares på en bænk eller i en skuffe i 10 min.
      Bemærk: Tø PFA løsning i et 37 ° C vand bad og derefter afkøles til stuetemperatur før dissekere germlines.
      Forsigtig: PFA løsning er moderat giftigt og en sandsynlig kræftfremkaldende og teratogent. Dampe udsender fra PARAFORMALDEHYD løsninger er brandfarlige. Nitril handsker. Fortyndes PFA fra 16% til 3% i en kemisk stinkskab. Når du arbejder uden for stinkskab, holde alle beholdere er omfattet.
    2. Overføre gonaderne omhyggeligt til en ren 5 mL glas-centrifugerør.
    3. Tilføje ~ 3 mL af PBSTw (PBS med 0,1% Tween-20) til fadet, der indeholdt gonaderne for at hente resterende gonaderne og fortyndes PFA løsning.
    4. Spin ned i en klinisk centrifuge på 870 x g for ~ 1 min. yngre eller mindre dyr kræver længere spin gange end ældre eller større dyr.
    5. Brug en lang glas pipette, overførsel supernatanten til uønsket materiale bæger for eventuel udsmid i uønsket materiale flasken i den kemiske hætte.
    6. Der tilsættes 2 mL high-grade methanol pre nedkøles til-20 ° C. Dække centrifugeglasset tæt med laboratoriet film.
      Bemærk: Brug af friske højkvalitets "guld mærkat" methanol er afgørende for korrekt morfologi med visse antistoffer.
      Forsigtig: Methanol er en meget Brandfarlig væske og damp, der er giftige ved indtagelse, indånding, eller lov til at kontakte hud. Bære handsker og passende personlige værnemidler. Brug en passende for små mængder af brandfarlige fryser.
    7. Butik i-20 ° C fryser for 1 h, selv natten eller endda flere måneder.
      Bemærk: Protokollen kan pause her.

4. Rehydrér Germlines

  1. Fyld centrifuge glasrør til toppen med PBSTw fortyndes methanol og rehydrere gonaderne. Spin ned i en klinisk centrifuge på 870 x g for ~ 1 min.
  2. Brug en lang glas Pasteur pipette, overførsel supernatanten til uønsket materiale bæger for eventuel udsmid i uønsket materiale flasken i den kemiske hætte.
  3. Vask gonaderne 3 gange ved hjælp af ~ 5 mL af PBSTw, spinning ned i en klinisk centrifuge på 870 x g for ~ 1 min. hver gang. Fjern supernatanten.
  4. Skyl et lille 1 mL borsilikatglas rør og en lang glas Pasteur pipette med PBSTw.
  5. Tilsæt ~ 700 μL af PBSTw og bruge de lange glas Pasteur pipette til at overføre gonaderne til det lille rør. Bruge et par ekstra dråber af PBSTw for at sikre, at alle gonaderne overføres.
  6. Spin ned i en klinisk centrifuge på 870 x g for ~ 1 min. ved hjælp af en langtrukken lange glas Pasteur pipette, fjerne så meget væske som muligt uden at forstyrre gonaderne. Efterlad ikke mere end 50 μL.
    Bemærk: Hvis påvisning af antistof ikke er nødvendigt, springe frem til trin 6.

5. afsløre antigener med antistoffer

  1. Fortynd de primære antistoffer i 30% serum i PBS. I det foreliggende eksempel, anti-WAPL-1 antistof er fortyndet 1:2,000 og anti-pH3 antistof er fortyndet 1: 500. Der centrifugeres frisk optøede serum i 10 min i en mikrofuge på 20.000 x g ved 4 ° C til at fjerne partikler. Bruge supernatanten, som kan opbevares ved 4 ° C i flere dage. Brug den relevante serum til at matche værtsorganisme af sekundære antistoffer (ged serum bruges her). En valgfri blokerende trin kan tilføjes før tilsætning af primære antistoffer.
  2. Anvende 100 μL fortyndet primære antistof til hvert lille glasrør. Inkuber ved stuetemperatur i 4 timer.
    Bemærk: Inkuberingstider varierer afhængigt af antistof. For nogle antistoffer er 2 timer ved stuetemperatur tilstrækkeligt. Længere inkubationer (fx., overnight) er muligt, men kan øge baggrund.
  3. Fylde rør top med PBSTw og spin ned i en klinisk centrifuge på 870 x g for ~ 1 min.
  4. Vask gonaderne 3 gange med ~ 1 mL af PBSTw. Incubate for ~ 5 min pr. vask for at tillade overskydende primære antistof til diffus i vask. Ved hjælp af en langtrukken længe glas Pasteur pipette, fjerne så meget væske som muligt uden at forstyrre gonaderne. Efterlad ikke mere end 50 μL.
  5. Fortynd de sekundære antistoffer i 30% ged serum i PBS. I det foreliggende eksempel fortyndes gede-anti-kanin-594 og gede-anti-mus-647 hver til 1: 400.
    Bemærk: Vælg sekundær antistoffer omhyggeligt for at sikre farvestoffer er adskilt fra farvestof i EdU kit. I det foreliggende eksempel indeholdt EdU kit en 488 nm excitation farvestof.
  6. Anvende 100 μL fortyndet sekundær antistof til hvert lille glasrør. Inkuber i mørke ved stuetemperatur 2 h.
    Bemærk: Inkuberingstider varierer afhængigt af antistof. For nogle sekundære antistoffer er 1 time ved stuetemperatur tilstrækkeligt. Længere inkubationer (fx., overnight) er muligt, men kan øge baggrund.
  7. Vask gonaderne 3 gange med ~ 1 mL af PBSTw. Incubate for ~ 5 min pr. vask for at tillade overskydende sekundær antistof til diffus i vask. Ved hjælp af en langtrukken længe glas Pasteur pipette, fjerne så meget væske som muligt uden at forstyrre gonaderne. Efterlad ikke mere end 50 μL.
    Bemærk: Gonaderne kan gemmes i 100 μL af PBS efter dette trin, hvis det er nødvendigt, selv om dette kan reducere signal. Fjerne PBS før proceduren.

6. udføre EdU Klik reaktion for at opdage EdU

Bemærk: Udfører EdU er Klik reaktion før antistof farvning trin (udfører trin 6 før trin 5) muligt, afhængigt af antistoffer bruges7. Men klik reagenser kan forstyrre visse antigener (fx., REC-8 antistof er følsomme over for fiksering og permeabilization). Den rækkefølge, der er præsenteret her udbytter lyse antistof farvning med REC-8, WAPL-1, HIM-3, pH3, FLAG og CYE-1 antistoffer bruges, blandt andre.

  1. Forberede Klik EdU cocktail8 frisk ved at føje følgende til en ren 1,5 mL tube. Rækkefølgen af tilføjelser er vigtigt. Beskytte mod lys og vedligeholde alle reagenser på is. Denne opskrift giver nok til én prøve (100 μL); gange opskriften efter behov.
    1. Tilsættes 2 mL i ultrarent vand til buffer tilsætningsstof. Dette gør 10 x buffer tilsætningsstof, som skal fortyndes til 1 x umiddelbart før anvendelsen.
    2. Tilføje 8,5 μl af 10 x buffer til 76,5 μL ultrarent vand. Bland godt.
    3. Tilsæt 4 μL 100 mm CuSO4 (kan være mærket som komponent E). Bland godt.
    4. Tilføje 0,25 μL af 488 nm farvestoffet indeholder. Det skal optøes ved stuetemperatur, da dens opløsningsmiddel, dimethylsulfoxid, er fast ved 4 ° C. Bland godt og beskytte mod lys.
    5. Mix 9 μL ultrarent vand med 1 μL af bufferen tilsætningsstof i hætten af røret. Med pipette overfoeres fra fælles landbrugspolitik til at tilføje til den resterende cocktail, og bland godt af pipettering op og ned.
  2. Udføre EdU Klik reaktion.
    1. Tilsæt ~ 100 μL af klik EdU cocktail til gonaderne i det lille rør. Dække med laboratoriet film og Inkuber i 30-60 min. ved stuetemperatur.
    2. Vask en gang med 100 μL af reaktion skyl buffer.
    3. Vask gonaderne 4 gange med ~ 1 mL af PBSTw. Incubate for ~ 15 min pr. vask for at tillade overskydende EdU cocktail komponenter til diffus i vask. Ved hjælp af en langtrukken længe glas Pasteur pipette, fjerne så meget væske som muligt uden at forstyrre gonaderne. Efterlad ikke mere end 50 μL.

7. plet DNA og forberede dias

  1. Tilsættes 1 dråbe (~ 25 μl) antifade montering medium med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, bruges til at visualisere DNA) til gonaderne. Vent et par minutter, så det kan bosætte sig og blandes med gonaderne.
    Bemærk: Skiftevis, en 1:1,000 fortynding af DAPI (fra en 0,1 mg/mL bestand) i PBS kan anvendes i 5 min, efterfulgt af 20 μL af 1,4-diazabicyclo [2.2.2] oktan (DABCO) i 90% glycerol, eller en anden antifade montering medium.
  2. Forberede en stor 2,5% Agarosen pad på en standard glas objektglas.
  3. Brug en ny ren støvfri lange glas Pasteur pipette til at overføre gonaderne til Agarosen pad. Holde alle væske og gonader smalle nederst i pipette til at minimere tabet af gonaderne.
    Bemærk: Gonaderne fast til lille glasrør eller i lange glas Pasteur pipette kan blive "reddet" af skylning med PBSTw, indsamle flydende i en dissekere parabol og plukke enkelte dyr i diaset med en øjenvipper.
  4. Brug en øjenvipper (eller en løkke af tyndt hår) limet til en tandstikker til at distribuere gonaderne over Agarosen pad og fjerne støvpartikler.
  5. Rektangulære glas dækglas. Lavere langsomt fra den ene side at undgå luftbobler. Bruge en væv til at fjerne overskydende løsning, hvilket forhindrer coverslip fra bevæger sig frit.
    Bemærk: Vælg coverslips, der svarer til mikroskop, der vil blive anvendt. #1 og #1.5 coverslips fungerer godt.
  6. Tillad dias til at bosætte sig og tørre lidt natten over ved stuetemperatur eller 4 ° C. Dette hjælper til lidt flade gonaderne. Dias skal opbevares ved 4 ° C.
  7. Valgfrit: Forsegle kanterne af dias med neglelak, eller et andet dias sealer. Forsegling hjørner først, derefter siderne, forhindrer coverslip fra skiftende.

8. Konfokal billedbehandling og analyse

  1. Billede den distale gonade med en roterende disk Konfokal fluorescerende mikroskop udstyret med en høj energi lyskilden, plan-apokromatiske målsætninger og en høj effektivitet mikroskop kamera. Capture billeder med 1 μm eller strammere afstanden mellem z-stakke. Læg mærke til laser power, følsomhed og eksponering tid for alle kanaler.
    1. Brug følgende: 405 nm laser linje excitation med 485 nm (W60) emission filter for DAPI, 488 nm laser linje excitation med 527 nm (W55) emission filter for EdU, 561 nm laser linje excitation med en 615 nm (W70) emission filter til WAPL-1 og en 640 nm laser linje excita tion med en 705 nm (W90) emission filter til pH3.
      Bemærk: Signal intensitet og baggrunden intensiteten vil variere. Ligeledes varierer krævede eksponering gange muligvis op til 10-fold.
  2. Brug celle Counter plug-in23 i Fiji24,25 manuelt tælle hver kerne. Label hver enkelte kernen tilstedeværelse og fravær af pH3, EdU og WAPL-1. Bruge klasser af kerner, der er beskrevet i tabel 1 og figur 2, da disse vil lette alle de beregninger, der er skitseret nedenfor.
    Bemærk: Dygtige experimentalists kan præcist tælle alle kerner i et 3D-billede uden dobbelttælling eller mangler enhver kerner. Skiftevis, man kan regne hver kerne i hver z-plan, og mærker at celler R script3 kan bruges til at fjerne mangfoldiggøre-tælles kerner.
  3. Beregne celle numre og frekvenser fra de ovennævnte tæller afhængigt af cellecyklus måling nødvendig. Typer af kerner er defineret i tabel 1 og figur 2. Beregningerne er sammenfattet i tabel 2.
    1. (Variation jeg) For at identificere kerner i S-fase, fodre dyr EdU i 30 min. Enhver kerner viser EdU etiket er S-fase kerner. For at beregne, tage summen A og C atomkerner, se tabel 1 og figur 2.
      Bemærk: I en 30 min EdU puls i wild-type voksen hermafroditter, alle EdU mærket kerner er co mærket med stamfader zone markører1.
    2. For at måle zonen stamfader, pletten med en stamfader zone markør som REC-8 eller WAPL-1 antistof. Zonen stamfader defineres her som alle nucleoplasmic REC-818 eller WAPL-1 immunoreaktive kønscelleoverførsel kerner. For at beregne, sum alle WAPL-1 immunoreaktive kerner (A + B + C + D, se tabel 1 og figur 2).
      Bemærk: WAPL-1 også etiketter DTC og somatiske gonade kerner, som ikke bør medregnes. Somatiske cellekerner er nemme at identificere ved meget intens WAPL-1 signal, holdning lidt uden for germline, og en "stegt-æg" morfologi af kerner.
    3. For at måle S-fase indeks, udføre en 30 min EdU eksperiment og co etiket med REC-8 eller WAPL-1 antistof. S-fase index er defineret som andelen af zonen stamfader, der er i S-fasen. For at beregne, tælle alle S-fase kerner, og derefter dividere med det samlede antal stamfader zone kerner (A + C / A + B + C + D, se tabel 1 og figur 2).
    4. (Variation II) For at identificere kerner i M-fase, pletten med pH3 antistof. Enhver pH3 immunoreaktive kerner er M-fase kerner. Dette virker uanset varigheden af EdU feed. For at beregne, tage summen af A og B kerner, se tabel 1 og figur 2.
      Bemærk: WAPL-1 også etiketter DTC og somatiske gonade kerner, som ikke bør medregnes. Somatiske cellekerner er nemme at identificere ved meget intens WAPL-1 signal, holdning lidt uden for germline, og en "stegt-æg" morfologi af kerner.
    5. For at måle M-fase indeks, co etiketter med pH3 og REC-8 eller WAPL-1 antistoffer. M-fase index er defineret som andelen af zonen stamfader, der er i M-fasen. For at beregne, tælle alle M-fase kerner, og derefter dividere med det samlede antal stamfader zone kerner (A + B / A + B + C + D, se tabel 1 og figur 2).
    6. (Variation III) Kerner i mitotiske og meiotiske S-fase etiket både med EdU. For at fortælle de to befolkninger fra hinanden, afgøre om S-fase blev fulgt ved mitose eller ved meiose. For at afgøre, om kerner er i mitotiske eller meiotiske S-fase, feed EdU for 4 h og co etiket for pH3 (en M-fase markør) og HIM-3 (en meiotiske kromosom akse protein) af antistoffarvning. Registrere de kerner, der viser både EdU og pH3 (type A, se tabel 1 og figur 2) som mitotiske S-fase mens kerner, der viser både EdU og HIM-3 (type E, se tabel 1 og figur 2) som meiotiske S-fase.
    7. (Variation IV) Beregne varigheden af G2 fase.
      Bemærk: G2-fase adskiller S-fase fra M-fase. Selv om ingen markør er blevet rapporteret at etiketten G2 i C. elegans kønscelleoverførsel, kan man beregne varigheden af G2 fase ved at kombinere data fra flere eksperimenter, at mærke M-fase (på tidspunktet af dissektion) og S-fase (starter ved flere h før dissektion). En celle, der viser både M-fase og S-fase markører afsluttet G2-fase i løbet af eksperimentet. En celle, der viser kun M-fase mærke og ikke S-fase markør var ikke i S-fase under eksperimentet.
      1. For at beregne varigheden af G2-fase, feed EdU for 2 h og co etiket med pH3 antistof. Undersøge eneste kerner, at mærke med pH3 (disse er i M-fase på tidspunktet af dissektion) for tilstedeværelse af EdU (disse var i S-fase under etiketten 2 h EdU før dissektion). Beregner årsbrøken, M-fase kerner, der afsluttede G2-fase (A / A + B, se tabel 1 og figur 2).
      2. Gentag dette eksperiment med en 3 h EdU etiket, og igen med en 4 h EdU etiket (og eventuelt en 5 h EdU etiket). Plot procent af pH3 positive kerner, der er EdU positive på y-aksen og varigheden af EdU etiket på x-aksen, som vist i figur 3A.
      3. Beregne G2-fase median varighed ved at forbinde punkterne på grafen og bestemme, hvor linjen krydser 50%, som vist i figur 3A.
      4. Beregne den maksimale varighed af G2-fase ved at forbinde punkterne på grafen og bestemme, hvor linjen krydser 99%, som vist i figur 3A.
    8. (Variation V) Beregn duraion af G2 + M + G1.
      Bemærk: I C. elegans kønscelleoverførsel, G1 fase er usædvanlig kort. Selvom ingen markør er blevet rapporteret at mærke G1 i C. elegans kønscelleoverførsel, kan man vurdere summen varigheden af G2, M og G1 fase og derefter sammenligne denne gang med G2-fase tid beskrevet ovenfor. Den maksimale varighed af G2 + M + G1 anslås fra den procentdel af alle stamfader zone kerner (WAPL-1 immunoreaktive), der forbliver EdU negativ (ikke undergår S-fase) efter EdU mærkning i flere timer.
      1. For at beregne varigheden af G2 + M + G1, feed EdU for 2 h og co etiket med REC-8 eller WAPL-1 antistof. Bestemme brøkdel af zonen stamfader, der gennemgik S-fase i løbet af denne tid (A + C / A + B + C + D, se tabel 1 og figur 2).
      2. Gentag dette eksperiment med en 3 h EdU etiket, og igen med en 4 h EdU etiket (og eventuelt en 5 h EdU etiket). Plot procent af REC-8 eller WAPL-1 positiv kerner, der er EdU positive på y-aksen og varigheden af EdU etiket på x-aksen, som vist på figur 3B.
      3. Beregne den maksimale varighed af G2 + M + G1 ved at forbinde punkterne på grafen og at finde, hvor linjen krydser 99%, som vist på figur 3B.
        Bemærk: Det er muligt at udføre eksperimenter for at bestemme varigheden af G2 og G2 + M + G1 som et enkelt sæt af 2, 3, 4 og 5 h EdU eksperimenter ved co mærkning med både kanin-anti-WAPL-1 og mus-anti-pH3 antistoffer.
    9. (Variation VI) For at identificere de kerner, der replikeres i zonen Stamform, men har siden trådte meiose, fodre dyr EdU for 10 h og co etiket med REC-8 eller WAPL-1 antistoffer. Enhver kerner viser EdU etiketten var i S-fase i løbet af disse 10 h. Enhver kerner, der ikke viser nucleoplasmic REC-8 eller WAPL-1 farvning var i meiose. Bare tælle kerner med EdU mærkning, der ikke viser mærkning med stamfader zone markør (E, se tabel 1).
      Bemærk: Omvendt, hvis gonaderne farves for meiotiske prophase markør HIM-3 med anti-HIM-3 antistoffer, tælle antallet af kerner med EdU mærkning, er også positiv for HIM-3.
    10. For at beregne satsen af meiotiske post, udføre ovenstående eksperimentet med en 5, 10 h, og 15 h etiket af EdU. Afbilde antallet af kerner, der angivet meiose på y-aksen og varigheden af EdU etiketten på x-aksen, som vist i figur 3 c. Brug derefter en simpel lineær regression til at beregne hældningen (kerner indtastet meiose per h) fra y = mx + b.
      Bemærk: Det er afgørende for at bruge en lineær regression til at beregne satsen af meiotiske post. Det ville være forkert at blot dividere antallet af kerner, der angivet meiose med varigheden af etiketten EdU for y-skæringspunktet ikke er nul.
    11. (Variation VII) Måle hastigheden af meiotiske progression.
      Bemærk: Da EdU er kovalent indarbejdet i DNA, det kan bruges til at spore en befolkning af celler gennem differentiering. De celler, der gennemgik S-fase i zonen stamfader bevarer EdU etiket som de indgå meiose, fremskridt gennem meiose, og gennemgå oogenesen. En puls-chase eksperiment med EdU kan bruges til at måle hastigheden af meiotiske progression.
      1. Feed EdU-mærket bakterier til dyr for 4 h ("puls"). Overføre dyrene til umærkede OP50 bakterier for 48 h ("jagt"), derefter dissekere og co etiket med en stamfader zone markør REC-8 eller WAPL-1 (eller en meiotiske prophase markør som HIM-3), hvis det ønskes.
      2. Når imaging, kigge efter holdning af den mest proksimale EdU-mærket kernen. Satsen for meiotiske progression er afstanden (i celle diametre fra slutningen af zonen stamfader) rejste med mest proksimale EdU mærket kernen under 48 h chase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Da DNA-syntese er nødvendigt at indarbejde EdU, kan man konkludere, at EdU-mærket kerner gennemgik S-fase under tidsvindue EdU-mærkning. Man kan fortolke kerner at mærke i en 30 min fodring med EdU mærket bakterier som kerner i S-fase på tidspunktet for dissektion. Kerner, at mærke i en længere sammenhængende EdU fodring eksperiment kan have mærket tidligt i tidsvinduet og siden venstre S-fase, eller kan have mærket i den sene del af vinduet EdU tid. EdU signal lokaliserer Co med DAPI signal. I nogle kerner dækker EdU signal alle kromosomer, mens i andre kerner EdU signal lokaliserer til 1 – 2 lyse puncta (figur 4). Disse puncta er sandsynligvis den x-kromosom, som replikerer sent i S-fase13.

Her, var dyr fodret med EdU uafbrudt i 30 min og dissekeret, som beskrevet ovenfor og i figur 5. Et eksempel på vellykket EdU farvning i et unge voksne dyr og et eksempel på mislykkede EdU farvning i et ældre voksne dyr (se nedenfor) er vist i figur 4. EdU signal fra en 30 min mærkning lokaliserer til ca. halvdelen af kerner i zonen stamfader (defineret af WAPL-1 antistof mærkning men tilnærmelse af DAPI morfologi26,27,28). S-fase indeks, andelen af zonen stamfader, at EdU positive, var tidligere rapporteret på 57 ±5% og så højt som 70% i unge voksne1,2,3. M-fase indeks er ca 2-3%1,29. I kontinuerlig fodring i 4 timer eller længere, alle kerner i stamfader zone etiket med EdU, og nogle kerner, der mærket i zonen stamfader er siden gået meiotiske prophase1.

Mens teknikken fungerer konsekvent i wild-type unge voksne dyr, mislykkedes en betydelig brøkdel af skytterne 5 dage gamle hermafroditter (selv dem, der indeholder sædceller) at mærke i en 30 min EdU puls (figur 4E). Dog med en 4 h EdU fodring, næsten alle disse dyr etiket. Sporadiske manglende label i genetiske hundyr med korte pulser af EdU har også været rapporteret30. Der kan være andre situationer, der resulterer i sporadiske fiasko til etiketten.

Man kan beregne varigheden af cellecyklus ved at udføre flere EdU-mærkning eksperimenter med pH3 mærkning i hver. Varigheden af G2 var anslået ved at analysere den procent af kerner i M-fase (pH3 immunoreaktive), der blev EdU positive under tidsforløb (figur 6). Denne tilgang giver median og maksimal varighed af G2 (figur 3A). Den mediane tid var interpoleret, viser en omtrentlig G2 varighed af 2,5 h i unge voksne hermafroditter. Varigheden af G2 + M + G1 blev anslået fra den procentdel af alle stamfader zone kerner (WAPL-1 immunoreaktive), der blev EdU positive (figur 6). G2 + M + G1 metode giver en maksimal varighed foranstaltning for de samlede faser (figur 3B). Den 99: e percentil tid var interpoleret, viser en omtrentlig G2 + M + G1 varighed på 3,4 h i unge voksne hermafroditter. Data fra de samme forsøg blev brugt til at beregne satsen af meiotiske post (kerner per Hansen). Prisen er hældningen af den lineære regression af antallet af kerner, der angivet meiose (EdU positiv, WAPL-1 negative eller HIM-3 positive) over varigheden af EdU etiket (figur 3 c). Værdierne for wild-type 1 dag gamle voksen hermafroditter er vist i tabel 2.

Figure 1
Figur 1: Diagram af C. elegans kønscelleoverførsel og cellecyklus. (A) den celle cyklus af kønsceller i den unge voksne hermafrodit kønscelleoverførsel. Tallene angiver den omtrentlige procentdel af tid tilbragt i hver celle cyklus scene. (B) C. elegans hermafroditter har to U-formede germlines (rød og blå). Spermatheca er vist i gul og livmoderen med udvikling af embryoner er vist i mørk grå. Den stiplede orange linje angiver, hvor dyr er dissekeret for at presse germlines. (C) Diagram af en udfoldet C. elegans kønscelleoverførsel. DAPI (blå) er en DNA-farvestof, der fremhæver nukleare morfologi. Den distale stamfader zone (fremhævet med rødt baseret på WAPL-1 antistoffarvning) indeholder mitotically cykling stamceller, stamceller og celler i meiotiske S-fase (WAPL-1 også etiketter somatiske gonade kerner). Celler i mitotiske og meiotiske S-fase mærke med en 30 min EdU puls og er angivet i grøn. To celler i M-fase mærke med pH3 antistof og er vist i sort. Den distale tip celle (DTC) giver GLP-1/hak ligand for at bevare stamceller skæbne af disse celler. Som cellerne vandrer fra DTC, de forlader zonen Stamform og Indtast meiotiske prophase. Gule celler er sædceller i spermatheca. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Venn-diagram af klasser af cellekerner. Kerner er grupperet efter tilstedeværelse og fravær af tre markører: WAPL-1 angiver stamfader zone celler (rød), EdU angiver S-fase celler (grønne) og pH3 angiver M-fase celler (blå). Celletyper er identificeret som A-G. Bemærk at i wild-type unge voksne hermafroditter celler af typen F findes ikke, og cellerne ikke Co etiket med EdU og pH3 uden for (WAPL-1 positiv) stamfader zone. Distale gonade diagrammet nedenfor viser et eksempel på A-E og G kerner. Se tabel 1 for flere detaljer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: grafisk præsentation af cellecyklus varighed og sats af meiotiske post forsøgsdata. (A) varigheden af G2 fase er interpoleret fra pH3 og EdU Co mærkning følgende varierede varighed EdU pulser grå streger angiver 50 og 99: e percentiler bruges i interpolering median og maksimale G2 varigheder, angivet med pile. (B) en celle G2, M eller G1 fase ikke indarbejde EdU. Den maksimale varighed af G2 + M + G1 fase kan således estimeres ved at måle den maksimale varighed af EdU etiket, der giver EdU-negative celler. Varigheden af G2 + M + G1 fase er interpoleret fra EdU og REC-8 Co mærkning følger varierede varighed EdU pulser. Grå linje angiver 99 percentilen bruges i interpolering maksimale G2 + M + G1 varighed, angivet med en pil. Det er ikke muligt at interpolere median G2 + M + G1 varighed. (C) satsen af meiotiske post (i kerner per Hansen – Se tabel 2) beregnes fra hældningen på regressionslinjen. Bemærk, at da y-skæringspunktet skæringspunkt ikke er nul, en regression er nødvendig for en præcis beregning af sats af meiotiske post (C). . Fejllinjer angiver standardafvigelsen. Tallene ændret og genoptrykt med tilladelse fra Fox et al. 20111. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: eksempel på vellykkede og mislykkede 30 min EdU farvning. Konfokal mikroskop billeder af en 1 dag gamle (A-D) og en 5 dage gamle (E-H) hermafrodit gonade (ikke sæd forarmet) efter en 30 min EdU mærkning eksperiment. Den stiplede hvide linje markerer slutningen af zonen stamfader. Stjernen markerer placeringen af den distale spids. Grønne mærker EdU farvning visualiseret ved klik på kemi (A). Mislykket EdU mærkning resulterer i lavt niveau baggrund farvning men ingen lyse EdU + kerner (E). Røde mærker WAPL-1 immunofluorescens (B, F). Gul angiver overlapning (C, G). Blå mærker DAPI farvning for DNA (D, H). Enkelt pilespidser angive en kerne med EdU farvning i hele kromatin. Dobbelt pilespidser angive en kerne med EdU puncta på kun et par af kromosomer. Billeder blev opnået med en 63 X mål. Skalalinjen = 10 µm (D, H). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: eksperimenterende arbejdsproces. Et resumé af forsøgsplan at vokse (A), dissekere EdU etiket (B), (C), antistof pletten (D), udføre Klik reaktion at vedhæfte et farvestof til EdU (E), pletten DNA (F), image germlines (G), og kvantificere EdU mærket og antistof farves kerner (H). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: eksempel på vellykket 4 h EdU farvning. Konfokal mikroskop billeder af en 1 dag gamle voksen hermafrodit gonade efter en 4 h EdU mærkning eksperimenter. Den stiplede hvide linje markerer slutningen af zonen stamfader. Stjernen markerer placeringen af den distale spids. Magenta markerer pH3 immunofluorescens (A, C). Grønne mærker EdU farvning visualiseret ved klik på kemi (B, C). Røde mærker WAPL-1 immunofluorescens (D). Gul angiver overlapning af EdU og WAPL-1 (E). Blå mærker DAPI farvning for DNA (F). Enkelt pilespidser angive kerner Co mærket med EdU og pH3. Dobbelt pilespids markerer en pH3 + EdU-kernen - en sjælden forekomst i en 4 h EdU mærkning. Pilene mærket EdU + WAPL-1 - kerner, som har indtastet meiose. Billeder blev opnået med en 63 X mål. En 10 µm skalalinjen er vist (F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Markør: pH3 EdU * WAPL-1 eller REC-8 HAM-3
Fortolkning: Mitose S-fase * Stamfader Zone Meiose
Klasse: Kombinerede fortolkning:
A Symbol 1 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 i M-fase, var stamfader zone, i mitotiske S-fase under EdU etiket (udfyldte G2)
B Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 i M-fase, var i stamfader zone, ikke i S-fase under EdU etiket
C Symbol 2 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 i interfase, i stamfader zone, var i S-fase under EdU etiket
D Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 i interfase, i stamfader zone, var ikke i S-fase under EdU etiket
E Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 meiose, var i meiotiske S-fase under EdU etiket (meiotiske post kerner)
F Symbol 1 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 vende tilbage til mitosen (fundet i nogle mutanter) eller meiotiske divisioner (i spermatogenesen)
G Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 meiose, var ikke i S-fase under EdU etiket
summen samlede pH3 positiv; alle celler i M-fase summen samlede EdU positiv; alle celler i S-fase summen samlede WAPL-1 positiv;  alle celler i stamfader zone summen samlede HIM-3 positive; alle celler i meiotiske prophase

Tabel 1: klasser af cellekerner. * Bemærk at 30 min og 4 h EdU eksperimenter forskellig fortolkning. I længerevarende EdU eksperimenter, celler er sandsynligvis nået ud over S-fase. Se introduktion og trin 8 for varigheden af EdU mærkning for relevante eksperiment.

Cellecyklus del Operationelle Definition Beregning * Værdi **
Stamfader Zone kerner alle WAPL-1 (eller REC-8) positive, HIM-3 negative kerner A + B + C + D 231 ± 23 kerner
S-fase kerner kerner EdU positiv efter 30 min EdU etiket og WAPL-1 positiv A + C 133 ± 20 kerner
M-fase kerner pH3 og WAPL-1 co-positive kerner A + B 5.2 ± 2.3 kerner
S-fase indeks S-fase kerner / stamfader Zone kerner A + C / A + B + C + D 57% af cellecyklus
M-fase indeks M-fase kerner / stamfader Zone kerner A + B / A + B + C + D 2% af cellecyklus
Meiotiske indtastning celler EdU mærket kerner i meiose E varierer afhængigt af varigheden af EdU etiket
Meiotiske post sats Meiotiske post kerner per Hansen af EdU etiket Hældning fra figur 4 C *** 20.3 kerner per Hansen
G2 varighed (median) 50% skæring fra Figure4A 2,5 h
G2 varighed (højst) 99% skæring fra figur 4A 3,5 h
G2 + M + G1 varighed (højst) 99% skæring fra figur 4B 3,5 h
Celle cyklus varighed (median) Median G2 varighed / G2-indeks *** 6,5 h
Celle cyklus varighed (højst) maksimale G2 varighed / G2-indeks *** 8.1 h

Tabel 2: cellecyklus beregninger. * Bogstaver repræsenterer klasserne af kerner, der er defineret i tabel 1 og figur 3. Beregninger er ændret fra Fox et al. 20111. **-Værdier (± standardafvigelse) for vildtype hermafroditter rejst ved 20 ° C i alderen 24 h post midt-L4 fase. Bemærk, at da y-skæringspunktet skæringspunkt ikke er nul, en regression er nødvendig for en præcis beregning af sats af meiotiske post. G2-indekset bestemmes ved at fratrække S-fase indeks, M-fase indeks og omtrentlige G1-indeks (2%) fra 100%, som beskrevet af Fox et al. 20111.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forberedelse af EdU-mærket bakterier (trin 1) er afgørende for denne protokol, og det første punkt i forbindelse med fejlfinding. Wild-type unge voksne hermafroditter etiket meget pålideligt i en 4 h EdU-puls, hvilket gør dette en nyttig kontrol for hver ny batch af EdU-mærket bakterier. Derudover vil intakt EdU-mærket bakterier, som angiver tarmen (i ældre dyr eller visse svælget/kværn defekte mutanter) etiket med klik kemi og fremstår som lyse aflange puncta i tarmen. En alternativ teknik for mærkning hermafroditter bruger en "blød" i en høj koncentration (1 mM) af EdU3. Denne teknik sulter dyr for varigheden af mærkning, men giver en nyttig måde at omgå gør EdU-mærket bakterier, når fejlfinding fiksering og klik på kemi. Hvis en EdU "sættetid" eksperiment er vellykket, mens en EdU foder ikke, derefter forberede frisk EdU-mærket bakterier. For at nå en tilstrækkelig bakteriel tæthed samtidig også opnå en høj EdU indhold, man kan være nødvendigt at justere koncentrationerne af EdU og thymidine.

Den største begrænsning af denne teknik for mærkning af S-fase er nødvendigt at fodre EdU-mærket bakterier til dyr. Dyr, der ikke kan fodre (på grund af genotype eller fase) kan ikke være mærket med denne teknik. Ikke desto mindre nucleoside analoger er i øjeblikket den eneste metode til at identificere S-fase kerner i C. elegans genom, og deres anvendelse kræver ikke, at nogen transgener være til stede i dyr. Derudover når indarbejdet, EdU resterne i kerner selv som de afslutter S-fase, fremskridt gennem cellecyklus, opdele eller differentiere. Signalet svækker halve med hver celledeling. Dette gør EdU perfekt til sporing af en celle historie selv gennem et par celledelinger.

Stabiliteten af EdU gør pulse-chase eksperimenter ligetil; blot skylle overskydende EdU bakterier fra dyr efter den ønskede varighed puls er færdig og overføre dyrene til umærkede bakterier. EdU forbliver i DNA og forbliver synlig selv efter flere celledelinger. Forsøgene er dog begrænset til en enkelt type af S-fase mærke (en enkelt puls af EdU). Co mærkning med EdU og BrdU er muligt i pattedyrceller31 men er ikke blevet rapporteret i C. elegans. Co mærkning af IdU og CldU bruges i pattedyr32 men også er ikke blevet rapporteret i C. elegans.

De vigtigste fordele ved EdU mærkning er at metoden kræver ingen transgener, EdU kan fodres til C. elegans under regelmæssig kultur, kemien er kompatibel med immunfluorescent teknikker og EdU vedvarer i DNA i lang tid efter fodring har stoppet. Disse funktioner gør EdU et fantastisk værktøj til at studere mange aspekter af cellecyklus og kønscelle dynamikken.

Cellecyklus og kønscelle dynamics analyse med EdU kan anvendes til en lang række forskningsspørgsmål. Bare et par eksempler på yderligere anvendelser af denne metode: Hvordan ændrer dynamikken i celle cyklus i dyrene med cellecyklus genmutationer? Hvordan påvirker fysiologiske tilstande cellecyklus i stamceller, sats kønscelle indgangstoldsted meiotiske prophase og hastigheden af kønscelle progression gennem meiotiske prophase? Hvordan ændrer cellecyklus under larve udvikling? Hvordan påvirker store signaling pathway forstyrrelser cellecyklus, ud over ændringer i celle skæbne (som ektopisk spredning)? Dette system kan ændres for at studere, hvad cellerne laver i mange forskellige forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for E. coli stock center MG1693; Wormbase; Byens Caenorhabditis genetik, som er finansieret af de nationale institutter for sundhed Office af forskning infrastruktur programmer (P40OD010440) til stammer; Zach Pincus for statistisk råd; Aiping Feng for reagenser; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar og John Brenner til uddannelse, rådgivning, støtte og nyttig diskussion; og Kornfeld og Schedl labs for feedback på dette håndskrift. Dette arbejde blev støttet i en del af National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 til KK, R01 GM100756 til TS] og en National Science Foundation predoctoral fellowship [DGE-1143954 og DGE-1745038 til ZK]. Hverken National Institutes of Health eller National Science Foundation havde nogen rolle i udformningen af undersøgelsen, indsamling, analyse og fortolkning af data, og heller ikke i at skrive manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli MG1693 Coli Genetic Stock Center 6411 grows fine in standard unsupplemented LB
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10337
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine Sigma 900584-50MG or use EdU provided in kit
Glucose Sigma D9434-500G D-(+)-Dextrose
Thiamine (Vitamin B1) Sigma T4625-5G Reagent Grade
Thymidine Sigma T1895-1G BioReagent
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M1880-1KG MgSO4, Reagent Grade
Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous Fisher BP332-500G Na2HPO4
Potassium Phosphate, monobasic Sigma P5379-500G KH2PO4
Ammonium Chloride Sigma A4514-500G NH4Cl, Reagent Plus
Bacteriological Agar US Biological C13071058
Calcium Chloride dihydrate Sigma C3881-500G CaCl
LB Broth (Miller) Sigma L3522-1KG Used at 25g/L
Levamisole Sigma L9756-5G 0.241g/10ml
Phosphate buffered saline Calbiochem Omnipur 6506 homemade PBS works just as well
Tween-20 Sigma P1379-500ML
16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules Electron Microscopy Sciences 15710 10ml ampules
100% methanol Thermo Fisher Scientific A454-1L Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies
Goat Serum Gibco 16210-072 Lot 1671330
rabbit-anti-WAPL-1 Novus biologicals 49300002 Lot G3048-179A02, used at 1:2000
mouse-anti-pH3 clone 3H10 Millipore 05-806 Lot#2680533, used at 1:500
goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 Lot 1256147, used at 1:400
goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Lot 1511347, used at 1:400
Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Vector Laboratories H-1200 mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation
nail polish Wet n Wild DTC450B any clear nail polish should work
S-medium various see wormbook.org for protocol
M9 buffer various see wormbook.org for protocol
M9 agar various same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar
Nematode Growth Medium various see wormbook.org for protocol
dissecting watch glass Carolina Biological 42300
Parafilm laboratory film Pechiney Plastic Packaging PM-996 4 inch wide laboratory film
petri dishes 60 mm diameter
Long glass Pasteur pipettes
1ml centrifuge tubes MidSci Avant 2926
Tips
Serological pipettes
500 mL Erlenmyer flask
Aluminum foil
25G 5/8” needles BD PrecisionGlide  305122
5ml glass centrifuge tube Pyrex 
Borosilicate glass tubes 1ml
glass slides
no 1 coverslips 22 x 40 mm no 1.5 may work, also
37 °C Shaker incubator
Tabletop Centrifuge
Clinical Centrifuge IEC 428 with 6 swinging bucket rotor
Mini Centrifuge
20 °C incubator
4 °C refrigerator
-20 °C freezer
Observer Z1 microscope Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens Zeiss
Ultraview Vox spinning disc confocal system PerkinElmer  Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).
  2. Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
  3. Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
  4. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
  5. Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
  6. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  7. vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
  8. ThermoFisher. Click-iT EdU Imaging Kits. , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10338.pdf (2011).
  9. Pazdernik, N., Schedl, T. Germ Cell Development in C. elegans. , Springer. 1-16 (2013).
  10. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  11. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  12. Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
  13. Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
  14. Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
  15. Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), Cambridge, England. 1011-1022 (1999).
  16. Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
  17. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC317003/pdf/x8.pdf 2258-2270 (1999).
  18. Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
  19. Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
  20. Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
  23. Vos, K. De Cell Counter Plugin. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2015).
  24. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Rasband, W. ImageJ. , http://imagej.nih.gov/ij/> (2016).
  26. Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), Cambridge, England. 671-680 (2010).
  27. Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
  28. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
  29. Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
  30. Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
  31. Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10044.pdf 1-7 (2010).
  32. Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmål 140 C. elegans EdU S-fase celle cyklus genom meiotiske S-fase M-fase G2-fase
Cellecyklus analyse i <em>C. elegans</em> kønscelleoverførsel med Thymidine Analog EdU
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kocsisova, Z., Mohammad, A.,… More

Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU. J. Vis. Exp. (140), e58339, doi:10.3791/58339 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter