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Genetics

संवर्धन और हेरफेर के O9-1 तंत्रिका शिखा कोशिकाओं

Published: October 9, 2018 doi: 10.3791/58346
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern California

ERRATUM NOTICE

Summary

O9-1 एक multipotent माउस तंत्रिका शिखा सेल लाइन है । यहाँ हम संवर्धन O9-1 कोशिकाओं के लिए विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन, विशिष्ट कोशिका प्रकार में O9-1 कोशिकाओं में अंतर, और आनुवंशिक रूप से सिरना-मध्यस्थता पछाड़ना या CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन का उपयोग करके O9-1 कोशिकाओं को जोड़ तोड़.

Abstract

तंत्रिका शिखा कोशिकाओं (NCCs) multipotent स्टेम कोशिकाओं है कि विभिंन प्रकार के सेल में अंतर कर सकते है और कई ऊतकों और अंगों को जंम दे पलायन कर रहे हैं । O9-1 कक्ष लाइन अंतर्जात माउस भ्रूण NCCs से व्युत्पंन है और इसके multipotency बनाए रखता है । हालांकि, विशिष्ट संस्कृति शर्तों के तहत, O9-1 कोशिकाओं को विभिंन प्रकार के सेल में अंतर कर सकते है और अनुसंधान अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोग किया जाएगा । हाल ही में, माउस अध्ययन और O9-1 सेल अध्ययन के संयोजन के साथ, हमें पता चला है कि मार्ग प्रभाव याप और Taz संकेत हिप्पो तंत्रिका शिखा में महत्वपूर्ण भूमिका निभा-craniofacial विकास व्युत्पंन । हालांकि O9-1 कोशिकाओं के लिए संवर्धन प्रक्रिया अन्य सेल लाइनों के लिए इस्तेमाल की तुलना में अधिक जटिल है, O9-1 सेल लाइन इन विट्रो मेंNCCs की जांच के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है । यहां, हम संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत O9-1 सेल लाइन अपनी उपजी को बनाए रखने के लिए, साथ ही साथ O9-1 कोशिकाओं में अंतर करने के लिए प्रोटोकॉल के रूप में विभिंन कोशिका प्रकार, जैसे चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और osteoblasts । इसके अलावा, प्रोटोकॉल CRISPR-Cas9 विलोपन और छोटे हस्तक्षेप आरएनए-मध्यस्थता पछाड़ना का उपयोग करके O9-1 कोशिकाओं में जीन हानि का समारोह अध्ययन प्रदर्शन के लिए वर्णित हैं ।

Introduction

तंत्रिका शिखा कोशिकाओं (NCCs) multipotent भ्रूण के विकास के दौरान एक उल्लेखनीय प्रवासी क्षमता और क्षणिक अस्तित्व के साथ स्टेम की तरह कोशिकाओं रहे हैं । NCCs सतह बाह्य त्वक स्तर और तंत्रिका ट्यूब के बीच उत्पन्न और भ्रूण के विकास के दौरान अन्य के अन्य भागों के लिए पलायन1. उनके कार्यात्मक डोमेन के आधार पर, NCCs कई विभिंन प्रकार में वर्गीकृत किया जा सकता है, कपाल सहित, ट्रंक, वागल, त्रिक, और हृदय NCCs । इसके अलावा, NCCs चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं, अस्थि कोशिकाओं, और न्यूरॉन्स के रूप में कई कोशिका वंश, में अंतर कर सकते हैं, और विभिन्न ऊतकों को जन्म दे2,3. NCCs के विकास morphogenetic घटनाओं है कि ठीक कर रहे है की एक जटिल श्रृंखला की विशेषता है विभिंन आणविक संकेतों से देखते । NCCs और उनके कई संरचनाओं के लिए महत्वपूर्ण योगदान के जटिल विनियमन को देखते हुए, एन सी सी विकास के dysregulation सामांयतः जंमजात जंम दोष है, जो सभी मानव जंमजात जंम दोष के लगभग 30% के लिए खाते में ले सकते हैं । तंत्रिका शिखा विकास के दौरान विषमता फांक होंठ/तालु के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, दोषपूर्ण नाक गठन, सिंड्रोम, एक दोषपूर्ण हृदय बहिर्वाह पथ के रूप में दोष, या यहां तक कि शिशु मृत्यु दर1,4,5, 6 , 7. एनसीसी विकास के आणविक तंत्र को समझना एनसीसी विकास में दोषों की वजह से रोगों के लिए उपचार के विकास के लिए महत्वपूर्ण है । इन विट्रो में विभिन्न के उपयोग के साथ और vivo दृष्टिकोण में 8,9,10,11,12,13,14 ,15, एनसीसी अनुसंधान में काफी प्रगति हुई है । vivo में, मुर्गी, उभयचर, zebrafish और चूहों सहित एनिमल मॉडल्स को NCCs1की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है । इसके अलावा, मानव भ्रूण के लिए जल्दी मानव भ्रूण विकास16में एनसीसी प्रवास की प्रक्रिया का अध्ययन किया गया है । इन विट्रो में, NCCs के लिए सेल मॉडल, जैसे कि रोगी के चमड़े के नीचे वसा से उत्पन्न मानव NCCs, पार्किंसंस रोग की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है17. O9-1 एनसीसी लाइन है, जो मूल रूप से अंतर्जात NCCs के जन संस्कृतियों से व्युत्पंन ई 8.5 माउस भ्रूण18से अलग किया गया था, NCCs अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली सेल मॉडल है । महत्वपूर्ण, गैर विभेदन संस्कृति की स्थिति के तहत, O9-1 कोशिकाओं रहे है multipotent तने-जैसे NCCs । हालांकि, संस्कृति की बदलती परिस्थितियों के तहत, O9-1 कक्षों को विशिष्ट कक्ष प्रकारों में विभेदित किया जा सकता है, जैसे कि चिकनी मांसपेशी कक्ष, osteoblasts, chondrocytes, और glial कक्ष18। इन संपत्तियों को देखते हुए O9-1 कक्षों का मोटे तौर पर एनसीसी से संबंधित अध्ययनों के लिए इस्तेमाल किया गया है, जैसे कपाल-चेहरे के दोषों की आणविक व्यवस्था की जाँच१९,२०.

यहां, विस्तृत प्रोटोकॉल O9-1 कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए प्रदान की जाती हैं, O9-1 कोशिकाओं अलग सेल प्रकार में अंतर है, और O9-1 कोशिकाओं से छेड़छाड़ जीन हानि-समारोह का प्रदर्शन CRISPR के साथ अध्ययन-Cas9 जीनोम संपादन और छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना)- मध्यस्थता पछाड़ना टेक्नोलॉजीज । एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, O9-1 कोशिकाओं के उपयोग के लिए अध्ययन करने के लिए याप और Taz नुक्सानः-समारोह का वर्णन किया है । याप और Taz हिप्पो संकेतन मार्ग है, जो सेल प्रसार, भेदभाव, और apoptosis में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता के बहाव के प्रभाव हैं । हिप्पो मार्ग के विकास में महत्वपूर्ण होने के लिए भी दिखाया गया है और कई विभिन्न ऊतकों और अंगों के homeostasis, साथ ही विभिन्न रोगों के रोगजनन में20,21,22,23 ,24,25,26,27,28। संकेत हिप्पो के मुख्य घटक ट्यूमर शमन करने वाले बाँझ 20 की तरह kinases Mst1/2, WW डोमेन-साल्वाडोर पाड़ प्रोटीन युक्त, और बड़े ट्यूमर शमन homolog (Lats1/2) kinases शामिल हैं । हिप्पो संकेतन याप और Taz गतिविधि को रोकता है और कोशिका द्रव्य में उनके क्षरण को बढ़ावा देता है । हिप्पो, याप और Taz से दमन के बिना transcriptional सह उत्प्रेरक के रूप में नाभिक और समारोह में translocate कर सकते हैं । हम हाल ही में पता चला है कि विशेष रूप से सक्रिय करने हिप्पो याप और माउस NCCs में Taz संकेत Wnt1cre और Wnt1 Cre2SOR ड्राइवरों का उपयोग करके के द्वारा भ्रूण की मृत्यु दर के परिणामस्वरूप में 10.5 के साथ गंभीर craniofacial दोष20. हम भी NCCs में याप और Taz की भूमिका की जांच करने के लिए O9-1 कोशिकाओं का उपयोग कर अध्ययन किया है । एनसीसी प्रसार और विभेदन में याप और Taz फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए पछाड़ना का उपयोग करके O9-1 कोशिकाओं में याप और Taz सिरना कोशिकाओं को उत्पन्न किया गया था, और याप-CRISPR जीनोम संपादन का उपयोग करते हुए एक-दूसरे को पीटकर कोशिकाओं को उत्पन्न किया गया. एक ही जीन हानि-समारोह रणनीतियों अंय रास्ते में अलग लक्ष्य जीन के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, लाभ के समारोह अध्ययन और अभिकर्मक परख भी O9-1 कोशिकाओं को जीन समारोह और विनियमन अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । प्रोटोकॉल यहां वर्णित जांचकर्ताओं द्वारा संवर्धन O9-1 कोशिकाओं के लिए गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए multipotent स्टेम बनाए रखने के लिए, विभिंन संस्कृति की स्थिति के तहत अंय प्रकार के सेल में O9-1 कोशिकाओं अंतर के लिए इरादा कर रहे हैं, और जीन समारोह के अध्ययन के लिए और NCCs का आणविक तंत्र.

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Protocol

1. O9 से पहले तैयारी-1 सेल संस्कृति

नोट: बेसल मीडिया O9-1 सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया गया है संदो द्वारा वातानुकूलित किया गया है चाहिए चूहों thioguanine/ouabain-प्रतिरोधी (STO) माउस fibroblast कोशिकाओं; इसलिए, STO कोशिकाओं को प्राप्त करने की जरूरत है और O9-1 सेल संस्कृति शुरू करने से पहले नीचे वर्णित के रूप में तैयार ।

  1. एक्टिव STO सेल कल्चर
    1. संवर्धन सक्रिय STO कोशिकाओं को पूरा Dulbecco के संशोधित ईगल मीडिया (DMEM) 7% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) (भ्रूण स्टेम सेल संस्कृति ग्रेड), १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin, और 2 मिमी एल-glutamine (अंतिम सांद्रता के साथ बना कर के लिए मीडिया तैयार संकेत कर रहे हैं) ।
      नोट: STO मध्यम सक्रिय STO फीडर कोशिकाओं की खेती के लिए प्रयोग किया जाता है । पेनिसिलिन, streptomycin, और L-glutamine भंडारण में वर्षण के रूप में हो सकता है; उपयोग करने से पहले pipetting द्वारा पूरी तरह से भंग.
    2. कोट कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ०.१% जिलेटिन के साथ एक मानक १०० mm सेल संस्कृति प्लेट । मशीन अवधि के बाद, महाप्राण अतिरिक्त जिलेटिन । कोटिंग के तुरंत बाद प्लेट का प्रयोग करें ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, STO मीडिया के साथ थाली कवर और थाली के सुखाने से बचने के लिए एक humidified मशीन में थाली छोड़ (यह केवल अल्पकालिक भंडारण के लिए और नहीं कोट प्लेटें भंडारण के लिए मतलब है) ।
    3. एक ३७ ° c पानी स्नान में तेजी से STO कोशिकाओं गल; खोलने से पहले ७०% इथेनॉल के साथ cryovial पोंछ, और तुरंत एक केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं की पूरी शीशी हस्तांतरण ।
    4. STO मीडिया dropwise ट्यूब के लिए जोड़ें; मीडिया के लिए कक्षों की मात्रा द्वारा अनुपात 1:10 है ।
    5. आरटी में 3 मिनट के लिए १८० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
    6. कोमल pipetting और जिलेटिन लेपित प्लेट को हस्तांतरण कोशिकाओं से मिश्रण ।
    7. STO कोशिकाओं को एक मानक मशीन में 24 घंटे के लिए विकसित करने की अनुमति दें (३७ ° c, 5% CO2) ।
    8. मध्यम बदलें (केवल कोशिकाओं का पालन करने के बाद) 24 एच बोने के बाद और पुराने माध्यम को त्यागें ।
    9. एक खुर्दबीन और ८०% पर पारित होने के तहत हर दिन STO कोशिकाओं को प्रभावित करने की जांच करें ।
      1. STO सेल passaging, ०.१% जिलेटिन (जिलेटिन की मात्रा के साथ कोट प्लेटें शुरू करने से पहले उस पोत के लिए वृद्धि मीडिया मात्रा के आधे के बराबर) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ।
      2. STO कोशिकाओं बीतने के लिए, महाप्राण विकास मीडिया और फॉस्फेट के साथ धो कोशिकाओं-बफर खारा (पंजाब) दो बार (विकास मीडिया के एक बराबर मात्रा में पंजाबियों को जोड़ने) ।
      3. महाप्राण पंजाब और जोड़ें ०.२५% trypsin-EDTA (पोत आकार के अनुसार मात्रा समायोजित करें); फिर, 5 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
        नोट: एक १०० mm प्लेट के लिए, विकास मीडिया के 10 मिलीलीटर और trypsin समाधान के 3 मिलीलीटर का उपयोग करें । एक १५० मिमी प्लेट के लिए, विकास मीडिया के 20 मिलीलीटर और trypsin समाधान के 8 मिलीलीटर का उपयोग करें । उपयोग की जाने वाली वाश बफ़र की वॉल्यूम ग्रोथ मीडिया की मात्रा के बराबर है ।
      4. STO मीडिया के बराबर वॉल्यूम के साथ trypsin को निष्क्रिय करें । बीज STO कोशिकाओं को 1:3 से 1:10 के अनुपात के साथ नई प्लेटों के लिए ।
        नोट: एक आम विस्तार योजना १ १०० mm प्लेट में एक cryovial से विस्तार करने के लिए है, तो १ १५० mm प्लेट के लिए, फिर ४ १५० mm प्लेट्स के लिए, और अंत में १६ १५० mm प्लेट्स के लिए ।
  2. STO कोशिकाओं की निष्क्रियता और ठंड
    1. 2x ठंड मीडिया की तैयारी के लिए, STO मीडिया के लिए निंनलिखित जोड़ें (अंतिम सांद्रता संकेत कर रहे हैं): 20% FBS, 20% dimethyl sulfoxide (DMSO) ।
    2. मिश्रण के बाद, फिल्टर 2x ठंड मीडिया (ताकना आकार ०.२२ µm) निष्फल और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग तक की दुकान । 2x ठंड मीडिया उपयोग के एक ही दिन बनाओ और अप्रयुक्त ठंड मीडिया को छोड़ दें ।
    3. ०.५ मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर पंजाब में मीतोमयसीं सी समाधान तैयार करें । पंजाब में मीतोमयसीं सी भंग करने के लिए, एक भंवर और भंवर पर लगभग ४५ मिनट के लिए एक कम सेटिंग पर बोतल टेप पूरी तरह से कणों को भंग करने के लिए ।
      नोट: मीतोमयसीं सी प्रकाश संवेदनशील और भंग करने के लिए कठिन है ।
      चेतावनी: मीतोमयसीं सी तीव्र विषाक्त है और कैंसर का कारण हो सकता है । केवल उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ संभाल ।
    4. मौजूदा मीडिया के लिए ०.०१ मिलीग्राम/एमएल मीतोमयसीं सी की अंतिम एकाग्रता जोड़कर STO कोशिकाओं को निष्क्रिय । एक मानक मशीन के अंदर 2 एच के लिए मशीन (३७ ° c, 5% सह2) ।
    5. मीतोमयसीं सी के साथ निष्क्रियता के बाद दो बार 20 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ प्लेटें (१५० मिमी) धो लें
    6. महाप्राण पंजाबियों समाधान, ०.२५% trypsin-EDTA के 8 मिलीलीटर का उपयोग करके अलग कर देना कोशिकाओं, और एक मानक humidified मशीन के अंदर 5 मिनट के लिए मशीन (३७ ° c, 5% सह2) ।
    7. STO मीडिया के 8 मिलीलीटर के साथ trypsin निष्क्रिय ।
    8. एक केंद्रापसारक ट्यूब के लिए सेल समाधान स्थानांतरण । समय बचाने के लिए एक केंद्रापसारक ट्यूब में एक से अधिक थाली गठबंधन । १८० x gपर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक
    9. महाप्राण ने supernatant और 5 एमएल के पंजाबियों में सेल की गोली को रिसस्पेंड कर दि या ।
    10. किसी hemocytometer का उपयोग कर कक्षों की गणना करने के लिए कक्ष समाधान के 10 µ l का उपयोग करें । केंद्रीय gridded वर्ग में कोशिकाओं की गणना और 1 मिलीलीटर प्रति कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए 104 द्वारा प्राप्त संख्या गुणा । प्रति milliliter कक्षों की संख्या के अंतिम अनुमान को प्राप्त करने के लिए दो संख्याओं का औसत गणना करें ।
    11. 5 मिनट के लिए १८० x gपर कोशिकाओं के केंद्रापसारक
    12. महाप्राण पंजाबियों और 1:1 जोड़ें (मात्रा से) STO मीडिया और सेल गोली के लिए 2x ठंड मीडिया । एक अंतिम सेल एकाग्रता के लिए मात्रा समायोजित करें 4 x 106 सेल/एमएल (यह राशि १ १०० एमएम प्लेट के लिए अच्छी है) ।
      नोट: उदाहरण के लिए, ४ १५०-मिमी प्लेटों से ६० x 106 कोशिकाओं की कुल उपज, cryovial प्रति 4 x 106 कोशिकाओं, प्रत्येक cryovial के साथ 1 मिलीलीटर सेल समाधान के साथ फ्रीज । चार प्लेटें लगभग 15 cryovials (60/ STO मीडिया और सेल गोली, resuspend करने के लिए 2x ठंड मीडिया के ७.५ मिलीलीटर के ७.५ मिलीलीटर जोड़ें, और प्रत्येक cryovial में aliquot 1 मिलीलीटर ।
    13. धीरे से सेल गोली के साथ pipetting ठंड मीडिया द्वारा resuspend । प्रत्येक cryovial के लिए सेल समाधान के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण और तदनुसार लेबल ।
    14. एक lidded polystyrene बॉक्स के अंदर cryovials प्लेस (यह एक धीमी गति से ठंडा करने की दर है, जो कोशिका अस्तित्व में सुधार प्रदान करता है) । एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर करने के लिए cryovial तरल नाइट्रोजन के लिए स्थानांतरित करने से पहले न्यूनतम 24 घंटे के लिए बॉक्स स्थानांतरण ।
      नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, सेल समय की गिनती, साथ ही कोशिकाओं को 2x ठंड मीडिया जोड़ने और शीशियों को स्थानांतरित करने के लिए-८० डिग्री सेल्सियस के बीच के समय को कम ।

2. O9-1 सेल संस्कृति

  1. O9-1 सेल संस्कृति के लिए बेसल मीडिया DMEM में निंनलिखित जोड़कर तैयार (अंतिम सांद्रता संकेत कर रहे हैं): 15% FBS, ०.१ मिमी न्यूनतम आवश्यक मीडिया (मेम) गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, ५५ मिमी बीटा-mercaptoethanol, १०० u/एमएल पेनिसिलिन, १०० u/एमएल streptomycin, 2 मिमी एल-glutamine, 103 इकाइयों/एमएल ल्यूकेमिया निरोधात्मक फैक्टर (लिफ; तुरंत उपयोग करने से पहले जोड़ा, स्टॉक बोतल में जोड़ने के लिए नहीं), और 25 एनजी/एमएल fibroblast वृद्धि फैक्टर-बेसिक (bFGF; तुरंत उपयोग करने से पहले जोड़ा, स्टॉक बोतल में नहीं जोड़ें) ।
  2. फ़िल्टर बेसल मीडिया (ताकना आकार ०.२२ µm) और पंनी में लपेटो प्रकाश से बचाने के लिए निष्फल ।
  3. निष्क्रिय STO कोशिकाओं से वातानुकूलित बेसल मीडिया ले लीजिए ।
    नोट: निष्क्रिय STO कक्षों को प्राप्त करने के बाद ही आगे बढ़ें । O9-1 बेसल मीडिया STO सेल प्लेट से एकत्र की है इसके बाद वातानुकूलित बेसल मीडिया के रूप में संदर्भित किया जाता है ।
    1. गल निष्क्रिय STO कोशिकाओं को तेजी से ऊपर वर्णित के रूप में (एक cryovial 4 x 106 कोशिकाओं से युक्त १ १०० mm प्लेट और पैदावार के लिए अच्छा है लगभग १०० एमएल वातानुकूलित बेसल मीडिया संग्रह के 10 दिनों के बाद) । बीज STO मीडिया का उपयोग करके जिलेटिन लेपित प्लेट को STO कोशिकाओं निष्क्रिय । कक्षों को एक मानक humidified मशीन (३७ ° c, 5% CO2) में रातोंरात अनुलग्न करने की अनुमति दें ।
    2. 24 ज गल STO कोशिकाओं के बाद, मौजूदा STO मीडिया को त्यागें और बेसल मीडिया से प्रतिस्थापित करें ।
      नोट: लिफ और bFGF को निष्क्रिय STO सेल कल्चर व्यंजन में न डालें; केवल O9-1 सेल संस्कृति व्यंजन में जोड़ें ।
    3. हर 24 एच, O9-1 बेसल मीडिया का उपयोग करके मीडिया को बदलने और एक बोतल में STO सेल प्लेट से बेसल मीडिया इकट्ठा । पंनी में वातानुकूलित बेसल मीडिया युक्त बोतल लपेटें प्रकाश से बचाने के लिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी एकत्र मीडिया स्टोर ।
      नोट: क्योंकि कक्ष निष्क्रिय थे, वे संग्रह के कई दिनों के बाद किया गया के रूप में स्वस्थ के रूप में प्रकट नहीं हो सकता है; यह उंमीद की जानी है ।
    4. वैकल्पिक रूप से संदूषण के लिए जांच करने के लिए, अलग ट्यूबों में प्रत्येक संग्रह दिन के लिए बेसल मीडिया इकट्ठा (बजाय एक बोतल) पंनी में लिपटे । एक 24 अच्छी तरह से थाली का उपयोग करना, प्रत्येक दिन से एक अच्छी तरह से और एक मानक मशीन में रात भर के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे जीवाणु संदूषण के लिए जांच में 1 मिलीलीटर मीडिया की जगह ।
      नोट: यदि जीवाणु संदूषण मौजूद है तो मीडिया एक लाल रंग का होता है अगर इसमें कोई संदूषण नहीं है लेकिन पीली में परिवर्तन होता है ।
    5. 10 दिनों के लिए वातानुकूलित बेसल मीडिया का संग्रह करने के बाद, STO कोशिकाओं को त्यागें । गठबंधन (यदि लागू हो) सभी एकत्र सशर्त बेसल मीडिया और फिल्टर एक बाँझ बोतल में (ताकना आकार ०.२२ µm) निष्फल । प्रकाश से बचाने के लिए पन्ना में बोतल लपेटें । फ़िल्टर दिनांक से एक महीने की अधिकतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फ़िल्टर वातानुकूलित बेसल मीडिया रखें ।

3. O9-1 कोशिकाओं को बनाए रखना

नोट: कार्य O9-1 बेसल मीडिया फिल्टर है निष्फल वातानुकूलित बेसल मीडिया, जो लिफ (अंतिम एकाग्रता 103 इकाइयों/एमएल) और bFGF (अंतिम एकाग्रता 25 एनजी/एमएल) सेल संस्कृति डिश के लिए तुरंत उपयोग से पहले जोड़ रहे हैं । इस मीडिया को प्रकाश से सुरक्षित और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित करने की जरूरत है ।

  1. O9-1 कोशिकाओं की वसूली
    1. धीरे aliquots तैयार करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (जैसे, Matrigel) के शेयर बोतल गल ।
    2. शेयर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स झिल्ली के 5 मिलीलीटर के लिए 10% FBS के साथ DMEM के 5 मिलीलीटर जोड़ें । -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित कोल्ड पिपेट टिप्स के साथ pipetting से अच्छी तरह मिलाएं । मूल बोतल और बर्फ पर aliquot ट्यूबों रखें । विभिंन खंडों में aliquots फ्रीज (०.५ मिलीलीटर या 1 मिलीलीटर aliquots) प्रयोग की जरूरत के आधार पर । कई बार फ्रीज-गल तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स से बचें ।
      नोट: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स polymerizes तेजी से कमरे के तापमान पर; ठंड पिपेट सुझावों का प्रयोग करें और जब अनैच्छिक बहुलकीकरण से बचने के लिए काम कर ट्यूबों ठंडा रखें ।
    3. प्रयोग शुरू करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर या बर्फ 2 ज पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का एक aliquot गल । एक विस्तारित समय के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मैट्रिक्स की दुकान नहीं है ।
    4. 10% FBS के साथ फ़िल्टर-निष्फल DMEM का उपयोग करने के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को पतला करने के लिए ०.५ मिलीग्राम/एमएल के एक अंतिम एकाग्रता को कोट प्लेटें । कोट प्लेटें तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ (०.५ मिलीग्राम/एमएल) के लिए कमरे के तापमान पर 1 ज. सुनिश्चित करें कि यह पूरी तरह से प्लेट को कवर (जैसा चित्र 1में दिखाया गया है) ।
    5. प्लेट झुकाव जब aspirating तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित सतह को छूने से बचने के लिए; 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर सूखी प्लेटें अधिक सूखी लेपित प्लेटें मत करो ।
      नोट: सभी मीडिया और रिएजेंट का उपयोग करने के लिए तैयार है जब केवल आगे बढ़ें (वातानुकूलित बेसल मीडिया, बाँझ-फ़िल्टर्ड 10% FBS में DMEM, लिफ, और bFGF).
    6. एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में cryovial रखकर तेजी से O9-1 कोशिकाओं को ठीक; धीरे से जब तक घोल को पूरी तरह से तरल करने के लिए बदल जाता है और अगले कदम के लिए तुरंत आगे की शीशी घूमता है ।
    7. cryovial से सभी सेल समाधान स्थानांतरण (लगभग 1 मिलीलीटर) एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए । 10% FBS के साथ DMEM के 5 संस्करणों जोड़ें (फिल्टर ०.२२ µm के एक फिल्टर ताकना आकार के साथ निष्फल) और resuspend ।
    8. १८० एक्स जीमें 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक महाप्राण सेल गोली परेशान बिना supernatant । लिफ और bFGF के साथ पूरक वातानुकूलित बेसल मीडिया में (दोहन द्वारा) सेल गोली resuspend । किसी hemocytometer का उपयोग करके कक्षों की गणना करना.
      नोट: वातानुकूलित बेसल मीडिया लिफ और bFGF के साथ पूरक O9-1 सेल लाइन के multipotency बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । सही मीडिया को अनैच्छिक सेल विभेद से बचने के लिए जोड़ने के लिए देखभाल का उपयोग करें ।
    9. बीज कोशिकाओं को १०,००० से १५,००० सेल के लिए एक 6-अच्छी थाली से2 सेमी/ एक मानक सेल संस्कृति मशीन (३७ ° c, 5% सह2) रातोंरात मीडिया बदलने से पहले कोशिकाओं को संलग्न और बढ़ने की अनुमति दें ।
    10. सुनिश्चित करें कि मीडिया को बदलने के लिए आगे बढ़ने से पहले कोशिकाओं संलग्न है (स्वस्थ संलग्न कोशिकाओं चित्रा 2में दिखाया गया है उन लोगों की तरह दिखते हैं) ।
    11. हमेशा संस्कृति मीडिया O9-1 कोशिकाओं की वसूली के बाद अगले दिन बदल (वातानुकूलित बेसल लिफ और bFGF के साथ पूरक मीडिया का उपयोग करें) ।
  2. O9-1 कोशिकाओं के बीतने
    1. जब O9-1 कोशिकाओं तक पहुंच ८०% प्रवाह, गल तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित प्लेट के रूप में ऊपर वर्णित तैयार करते हैं । शर्त बेसल मीडिया लिफ और पोत के लिए bFGF के साथ पूरक जोड़ें । वैकल्पिक रूप से, FBS बिना DMEM जोड़ने के लिए सुखाने और कोई अधिक से अधिक 3 दिनों के लिए एक मानक humidified मशीन के अंदर की दुकान से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स रखने के लिए ।
    2. कुल्ला O9-1-कुओं (6 अच्छी तरह से प्लेट) Dulbecco के फास्फेट के 2 मिलीलीटर के साथ-बफर खारा (DPBS) दो बार और धीरे कोशिकाओं को खोने से बचने के पिपेट ।
    3. अलग कर देना कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर के साथ ०.०५% trypsin-EDTA पर ३७ ° c के लिए 3 min. trypsin के साथ DMEM की एक बराबर राशि के साथ बेअसर 10% FBS. अच्छी तरह से पिपेट की पूरी सतह पर तरल को अलग कर देना के रूप में संभव के रूप में प्लेट से कई कोशिकाओं के रूप में ।
      नोट: Trypsin एकाग्रता ०.०५% के बजाय ०.२५% है । शेयर बॉटल से पतला करने के लिए DPBS का इस्तेमाल करें ।
    4. प्लेट से dissociating कोशिकाओं जब बुलबुले पैदा करने से बचें ।
    5. स्थानांतरण सभी सेल समाधान एक केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए और १८० x gपर 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक महाप्राण सेल गोली परेशान बिना supernatant । लिफ और bFGF के साथ पूरक वातानुकूलित बेसल मीडिया में कोमल pipetting द्वारा केंद्रापसारक ट्यूब में सेल गोली resuspend ।
    6. ऊपर बताए गए अनुसार कुल कक्ष संख्या की गणना करने के लिए hemocytometer का उपयोग करें । बीज कोशिकाओं (१०,००० to १५,००० cells/cm2) लेपित थाली के रूप में तैयार करने के लिए चरणों में वर्णित 3.1.4 3.1.8 । एक अच्छी तरह से एक 6 प्लेट के बीज के लिए १००,००० कोशिकाओं की आवश्यकता होगी ।
    7. एक मानक सेल संस्कृति मशीन (३७ ° c, 5% CO2) में कक्षों को अनुलग्न और विकसित करने की अनुमति दें । passaging O9-1 कक्षों के बाद अगले दिन हमेशा कल्चर मीडिया बदलें ।
  3. O9-1 कोशिकाओं की ठंड
    1. O9-1 कोशिकाओं के लिए 2x ठंड मीडिया तैयार करने के लिए, DMEM में निंनलिखित पतला (अंतिम सांद्रता संकेत मिले हैं): ४०% FBS और 20% DMSO ।
    2. फ़िल्टर करें 2x ठंड मीडिया निष्फल और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं । 2x ठंड मीडिया दिन यह प्रयोग किया जाता है पर किया जाना चाहिए । सभी अनुपयोगी ठंड मीडिया छोड़ें ।
      नोट: ८०% पर O9-1 कोशिकाओं स्थिर प्रवाह ।
    3. DPBS के साथ दो बार कुल्ला कुओं; पिपेट धीरे कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए ।
    4. 3 मिनट के लिए ३७ ° c पर ०.०५% trypsin-EDTA के साथ अलग कर देना कोशिकाओं, तो FBS में 10% DMEM की एक बराबर राशि के साथ trypsin बेअसर । अच्छी तरह से पिपेट की पूरी सतह पर तरल को अलग कर देना के रूप में संभव के रूप में प्लेट से कई कोशिकाओं के रूप में ।
    5. स्थानांतरण सभी प्लेट सामग्री एक केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए और १८० x gपर 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक महाप्राण supernatant और पंजाब के 2 मिलीलीटर जोड़ें और दोहन से resuspend ।
    6. ऊपर बताए अनुसार किसी hemocytometer का उपयोग करके कक्षों की गणना करने के लिए कक्ष समाधान के 10 µ l का उपयोग करें.
    7. १८० एक्स जीमें 3 मिनट के लिए सेल समाधान केंद्रापसारक महाप्राण supernatant और जरूरत बेसल मीडिया की राशि को समायोजित; फिर, 2x ठंड मीडिया की एक बराबर राशि जोड़ें ।
      नोट: कोशिकाओं 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल (cryovial प्रति 1 मिलीलीटर) की एकाग्रता पर जमे हुए हैं ।
    8. तदनुसार cryovials और लेबल करने के लिए कक्षों को स्थानांतरित करें । एक धीमी गति से ठंडा करने की दर के लिए एक lidded polystyrene बॉक्स के अंदर cryovials प्लेस-८० ° c के लिए तरल नाइट्रोजन को स्थानांतरित करने से पहले ंयूनतम 24 h ।
      नोट: सबसे अच्छा परिणाम के लिए, समय और 2x ठंड मीडिया जोड़ने और-८० डिग्री सेल्सियस के लिए शीशियों को स्थानांतरित करने के बीच समय की गिनती सेल को कम ।

4. O9-1 कोशिकाओं का हेरफेर

  1. O9-1 कक्षों में सिरना पछाड़ना का प्रदर्शन करना
    1. गल और कोट एक 24-अच्छी प्लेट तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ के रूप में प्रयोग शुरू करने से पहले (कदम 3.1.4-3.1.8) ऊपर वर्णित है । ठीक है और बीज O9-1 कोशिकाओं, उंहें ६०% करने के लिए ८०% प्रवाह को विकसित करने की अनुमति ।
    2. उपयुक्त अच्छी तरह से मात्रा के अनुसार सीरम मुक्त मीडिया में liposomes पतला । सीरम मुक्त मीडिया में सिरना पतला अंतिम करने के लिए । निर्माता द्वारा अनुशंसित अनुपात में पतला liposomes को पतला सिरना जोड़ें । pipetting और गर्मी से अच्छी तरह से मिलाएं ।
      नोट: इस्तेमाल किया मात्रा पर निर्माता के गाइड का पालन करें, समय और गर्मी के तापमान ।
    3. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार कक्षों में सिरना-लिपिड जटिल की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें ।
    4. एक मानक सेल संस्कृति मशीन (३७ ° c, 5% सह2) में 24 ज के लिए कोशिकाओं की मशीन । उपयुक्त के रूप में बहाव चरणों प्रदर्शन (निकालने आरएनए, निकालने प्रोटीन, धुंधला, आदि)
      ध्यान दें: सिरना पछाड़ना बार और सांद्रता व्यक्तिगत प्रयोग के आधार पर भिंन हो सकते हैं ।
  2. CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन का उपयोग करके O9-1 कोशिकाओं में जीन नॉकआउट प्रदर्शन
    नोट: स्तनधारी कक्ष पंक्तियाँ29में CRISPR-Cas9 का उपयोग करने के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल को देखें । यहां प्रदान की CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन और संबंधित कदम का एक सरलीकृत वर्णन है ।
    1. sgRNA डिज़ाइन उपकरण का उपयोग कर sgRNA अनुक्रम प्राप्त करें ।
    2. Ligate को sgRNA को pSpCas9 (bb)-2a-GFP वेक्टर30.
    3. Transfect O9-1 कक्षों के साथ वेक्टर निर्माता की सिफारिशों के अनुसार एक मानक lipofection प्रोटोकॉल का उपयोग कर ।
    4. एक मानक सेल संस्कृति मशीन में ३७ ° c के साथ 5% सह2 के लिए 24 एच के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
    5. GFP/7-AAD पर आधारित प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) निष्पादित करें । बीज GFP + ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में एकल कोशिकाओं ।
    6. एक अतिरिक्त 4 दिनों के लिए मशीन में कोशिकाओं को बढ़ने । उन सभी कुओं को त्याग दें जिनमें एक से अधिक कॉलोनियां हैं ।
    7. हटाने का पता लगाने के लिए डिजाइन प्राइमरों के साथ पीसीआर प्रदर्शन । पीसीआर के बाद, बैंड आकार का मूल्यांकन करने के लिए एक agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद चलाते हैं । CRISPR-Cas9 editingby प्रदर्शन पश्चिमी सोख्ता ( याप नॉकआउट परिणाम का एक उदाहरण चित्रा 3में दिखाया गया है) का उपयोग करके हासिल पीटकर दक्षता को मांय करें ।

5. O9-1 सेल विभेद

  1. osteoblasts में O9-1 कोशिकाओं का भेदभाव
    1. osteogenic भेदभाव मीडिया तैयार करने के लिए, अल्फा में निंनलिखित पतला-मेम (अंतिम सांद्रता संकेत कर रहे हैं): ०.१ mm डेक्समेतएसॉनी, १०० एनजी/एमएल बोन morphogenetic प्रोटीन 2 (BMP2), ५० µ जी/एमएल ascorbic एसिड, 10 मिमी बी-glycerophosphate, 10% FBS, १०० यू/ पेनिसिलिन और १०० मिलीग्राम/एमएल streptomycin ।
    2. immunostaining द्वारा विभेदित osteoblasts में osteoblast मार्कर, osteocalcin, का पता लगाने के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया है.
      नोट: Osteogenic विभेद भी osteoblasts के अंय मार्करों या Alizarin लाल धुंधला या alkaline फॉस्फेट धुंधला के साथ का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है ।
  2. chondrocytes में O9-1 कोशिकाओं का भेदभाव
    1. chondrocyte भेदभाव मीडिया तैयार करने के लिए, अल्फा में निंनलिखित पतला-मेम (अंतिम सांद्रता संकेत कर रहे हैं): 5% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), 1% इंसुलिन-कैल्सीटोनिन-सेलेनियम (इसके), १०० U/एमएल पेनिसिलिन, १०० मिलीग्राम/एमएल streptomycin, 10 एनजी/ वृद्धि कारक बीटा (TGF-b3), ५० मिलीग्राम/एमएल ascorbic एसिड, 10 एनजी/एमएल BMP2, ०.१ mm डेक्समेतएसॉनी, और 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट ।
    2. पहली संस्कृति O9 के एक monolayer-3 दिनों के लिए osteogenic मीडिया के साथ 1 कोशिकाओं और फिर trypsinize और एक अतिरिक्त 7 दिनों के लिए micromass भेदभाव मीडिया में एक chondrocyte प्रारूप के रूप में संस्कृति ।
    3. Alcian नीले दाग या chondrocytes के मार्कर के साथ chondrogenic भेदभाव गधों ।
  3. चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में O9-1 कोशिकाओं का भेदभाव
    1. चिकनी मांसपेशी सेल भेदभाव मीडिया तैयार करने के लिए, DMEM में निंनलिखित पतला (अंतिम सांद्रता संकेत कर रहे हैं): १०० U/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin, और 10% FBS ।
    2. इस तरह चिकनी मांसपेशी actin (SMA), चित्रा 5में एक उदाहरण के रूप में दिखाया चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके धुंधला इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ चिकनी मांसपेशी कोशिका भेदभाव का आकलन करें ।
  4. glial कोशिकाओं में O9-1 कोशिकाओं का भेदभाव
    1. glial सेल विभेद मीडिया तैयार करने के लिए, DMEM/F12 में निंनलिखित पतला (अंतिम सांद्रता संकेत कर रहे हैं): 1x बी-27 अनुपूरक, 2 मिमी एल-glutamine, ५० एनजी/एमएल BMP2, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, १०० मिलीग्राम/एमएल streptomycin, ५० एनजी/एमएल लिफ, और 1% हीट-निष्क्रिय FBS ।
    2. ऐसे फैटी एसिड बाध्यकारी प्रोटीन 7 (FABP7) के रूप में glial सेल मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रदर्शन करके glial सेल भेदभाव का मूल्यांकन करें ।

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Representative Results

हमारे पछाड़ना और नॉकआउट प्रयोगों का लक्ष्य O9-१ कक्षों में याप और Taz हानि-की-फ़ंक्शन के प्रभावों का अध्ययन करना था. पछाड़ना और नॉकआउट प्रयोगों से पहले, हमें यह सुनिश्चित करना है कि बेसल मीडिया और संस्कृति O9-1 कोशिकाओं के लिए तैयार करें जैसा कि ऊपर वर्णित है (उदाहरण के लिए, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की जरूरत है 1 चित्रमें दिखाए गए के रूप में पूरी थाली को कवर करने के लिए, और O9-1 कोशिकाओं बरामद चित्रा 2में दिखाया गया के रूप में तरल नाइट्रोजन से). हम ऊपर वर्णित के रूप में पछाड़ना प्रयोगों का प्रदर्शन किया जिसमें याप और Taz एक साथ नीचे खटखटाया गया । याप सिरना और Taz सिरना की बराबर मात्रा के निर्माता द्वारा अनुशंसित अंतिम मात्रा में जोड़ा गया । नियंत्रण प्लेट के लिए, एक समान वॉल्यूम के लिए untargeting सिरना जोड़ा गया था ।

एक याप-null O9-1 सेल लाइन CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन, के रूप में वांग एट अल द्वारा वर्णित का उपयोग करके याप के एक्सॉन 3 को हटाने के द्वारा उत्पंन किया गया था । 20. हम ऊपर और वैंग एट अल में वर्णित के रूप में CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन का उपयोग करके नॉकआउट प्रयोगों प्रदर्शन किया । 20. हम निंनलिखित sgRNA दृश्यों का इस्तेमाल किया, जो याप के 3 एक्सॉन: 5 ′-caccgtggattacgtgggtatgtt-3 ′ (sgRNA1-आगे), 5 '-aaacaacatacccacgtaatccac-3 ′ (sgRNA1-रिवर्स), 5 ′-caccgagatggtctaatgtagtga-3 ′ (sgRNA2-आगे), 5 '- aaactcactacattagaccatctc-3 ′ (sgRNA2-रिवर्स)

CACC आगे किनारा करने के लिए जोड़ा गया था, और AAAC रिवर्स किनारा करने के लिए जोड़ा गया था । जी आगे किनारा के 5 ' अंत में जोड़ा गया है क्योंकि oligo जी के साथ शुरू नहीं किया था, और सी रिवर्स कतरा के 3 ' अंत में जोड़ा गया था । CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन कदम के दौरान ऊपर और वांग एट अल में वर्णित है । 20, कोशिकाओं O9 के लिए वातानुकूलित बेसल मीडिया में थे-1 लिफ और bFGF के साथ पूरक कोशिकाओं अवांछित भेदभाव से बचने के लिए । निंनलिखित पीसीआर प्राइमरों याप विलोपन: 5 '-AAAACAGTCTCCACTACCCCTT-3 ′ (फॉरवर्ड) और 5 '-GGCCATCATAGATCCTGGACG-3 ′ (रिवर्स) का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया । sgRNAs की स्थिति आधार #7973399 से माउस गुणसूत्र 9 पर #7974433 है । गुणसूत्र पर पीसीआर प्राइमर स्थिति बेस #7973306 से #7974478 के लिए है । पीसीआर के बाद एक्सॉन 3 याप के साथ नॉकआउट के लिए पीसीआर बैंड एक agarose जेल पर एक १३८-बीपी बैंड के रूप में दिखाई दिया; जंगली प्रकार याप एक ११७३-बीपी बैंड के रूप में दिखाई दिया । CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन का उपयोग करके याप नॉकआउट की दक्षता पश्चिमी सोख्ता के साथ मांय किया गया था, जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है ।

जैसा कि ऊपर वर्णित है, O9-1 कोशिकाओं विशिष्ट अंतर में प्रसंस्कृत किया जा सकता है-उत्प्रेरण मीडिया विशेष रूप से कोशिका प्रकार में भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए । विभेद का मूल्यांकन विभिंन दृष्टिकोणों का उपयोग करके किया जा सकता है, जैसे मात्रात्मक पीसीआर या विशिष्ट सेल मार्कर के immunostaining । एक उदाहरण के रूप में, चित्रा 4 O9-1 कोशिकाओं है कि osteoblast-उत्प्रेरण मीडिया में थे और osteoblasts, जो एंटीबॉडी के खिलाफ osteocalcin (Ocn, एक osteoblast मार्कर) के साथ immunostaining कोशिकाओं द्वारा मूल्यांकन किया गया में विभेदित थे दिखाता है । जीन पछाड़ना और नॉकआउट प्रयोगों के साथ संयुक्त ऊपर वर्णित है, O9-1 कोशिकाओं को मोटे तौर पर जीन समारोह अध्ययन और phenotypic विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक उदाहरण के रूप में, दोनों जंगली प्रकार और याप-null O9-1 कोशिकाओं चिकनी मांसपेशी सेल भेदभाव मीडिया में और immunostaining कोशिकाओं द्वारा मूल्यांकन चिकनी मांसपेशी actin (SMA, एक चिकनी मांसपेशी सेल मार्कर) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ किया गया । सबसे जंगली प्रकार O9-1 कोशिकाओं sma-सकारात्मक चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (चित्रा 5), जबकि, याप-नल O9-1 कोशिकाओं sma-सकारात्मक चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (चित्रा 5B), जो संकेत दिया है कि याप एक महत्वपूर्ण नाटकों में अंतर करने में विफल करने के लिए वृद्धि दी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में NCCs के भेदभाव में भूमिका ।

Figure 1
चित्रा 1: Matrigel पूरी तरह से एक ३५ mm प्लेट को कवर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: O9-1 कोशिकाओं तरल नाइट्रोजन से वसूली के बाद 24 एच. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: पश्चिमी दाग CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन का उपयोग करके O9-1 कोशिकाओं में याप के कुशल नॉकआउट (ko) दिखा डेटा । wt: वंय-प्रकार । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: osteoblast मार्कर osteocalcin (Ocn) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला संकेत है कि O9-1 कोशिकाओं osteoblast भेदभाव की स्थिति के तहत osteogenic कोशिकाओं को जंम दिया । कोशिकाओं osteoblast मार्कर Ocn एंटीबॉडी (हरा) के साथ दाग रहे थे, और नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग थे । तीर Ocn-धनात्मक कक्षों का संकेत देते हैं । Osteocalcin (Ocn, एक osteoblast मार्कर); DAPI (′, ६-diamidino-२-phenylindole). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. चिकनी मांसपेशी actin (SMA) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला यह दर्शाता है कि, चिकनी मांसपेशी सेल भेदभाव की स्थिति के तहत, सबसे जंगली प्रकार O9-1 कोशिकाओं चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं को जंम दिया (A), जबकि याप-null O9-1 कोशिकाओं को विफल चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में अंतर (ख) । कोशिकाओं SMA एंटीबॉडी (लाल) के साथ दाग रहे थे, और नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग थे । तीर SMA-धनात्मक कक्षों का संकेत देते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एन सी सी एक बहुमुखी और विभिंन ऊतकों और भ्रूण morphogenesis के दौरान अंगों के लिए महत्वपूर्ण योगदानकर्ता है । O9-1 सेल लाइन अपनी क्षमता के लिए कई विभिंन प्रकार के सेल में अंतर रखता है और NCCs की vivo विशेषताओं में नकल, यह एक इन विट्रो में उपयोगी बनाने के लिए जीन समारोह और NCCs में आणविक विनियमन अध्ययन के लिए उपकरण । O9-1 कोशिकाओं की अलग स्थिति O9-1 कोशिकाओं की संस्कृति की स्थिति पर निर्भर करता है, vivo मेंअलग तंत्रिका शिखा संतति के अनुरूप हो सकता है । O9-1 कोशिकाओं multipotent राज्य में बनाए रखा जा सकता है जब गैर के तहत संस्कृति-विभेदन संस्कृति की स्थिति, नियमित रूप से स्टेम सेल संस्कृति के समान । गैर अंतर O9-1 कोशिकाओं vivo मेंपूर्व प्रवासी और प्रवासी multipotent स्टेम की तरह NCCs के अनुरूप हो सकता है । इसके अलावा, O9-1 कोशिकाओं को विशिष्ट विभेद संस्कृति की स्थिति है, जो multipotent स्टेम से NCCs के भेदभाव के दौरान जीन समारोह और विनियमन के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ है के तहत कई विभिंन प्रकार के सेल में अंतर कर सकते है किसी विशिष्ट विभेदित कक्ष प्रकार में कक्ष । अंतर O9-1 कोशिकाओं को vivo मेंप्रवासी तंत्रिका शिखा संतान के बाद, जो एक अलग सेल भाग्य विभिंन प्रकार के सेल में अंतर करने के लिए अनुरूप हो सकता है । अनुसंधान ब्याज पर निर्भर करता है, O9-1 कोशिकाओं और हेरफेर किया जा सकता है अलग ढंग से पशु मॉडल के साथ vivo एनसीसी अध्ययन में पूरक करने के लिए प्रसंस्कृत ।

O9-1 कोशिकाओं को एनसीसी की घटनाओं का अध्ययन करने में हेरफेर करने के विभिन्न तरीके हैं, जिनमें जीन हानि-समारोह और लाभ-समारोह शामिल हैं । यहाँ, उदाहरण प्रस्तुत कर रहे हैं जिसमें सिरना पछाड़ना और CRISPR-कैस 9 जीन संपादन प्रयोगों हिप्पो मार्ग प्रभाव के लिए O9-1 कोशिकाओं में प्रदर्शन किया गया याप हानि के समारोह अध्ययन20. एक माउस मॉडल और O9-1 कोशिकाओं के संयुक्त उपयोग के साथ, हमारे अध्ययन से संकेत दिया कि याप20चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में एनसीसी प्रसार और भेदभाव को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । विभिंन मॉडलों में अंय अध्ययनों से भी NCCs में याप के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का संकेत दिया है । याप माउस तंत्रिका शिखा चिकनी मांसपेशी भेदभाव31 के लिए आवश्यक हो दिखाया गया था और मानव एन बी सी भाग्य और प्रवास३२बढ़ाने के लिए । इसके अलावा, याप जल्दी Xenopus विकास३३के दौरान व्यक्त की है । O9-1 कोशिकाओं में जीन पछाड़ना और नॉकआउट की दक्षता, ऐसे मात्रात्मक पीसीआर (qPCR), पश्चिमी सोख्ता के रूप में अंय बहाव आणविक तकनीकों के प्रदर्शन की सुविधा के साथ संयुक्त, और immunostaining का समर्थन करता है कि O9-1 सेल लाइन एक उत्कृष्ट है एनसीसी मॉडल कि इन विट्रो मेंआसानी से हेर-फेर किया जा सकता है. के नुकसान के अलावा समारोह अध्ययन हम ऊपर और पहले20, O9-1 कोशिकाओं के विभिंन अंय अनुप्रयोगों का वर्णन किया गया है NCCs अध्ययन के लिए वर्णित किया गया है । O9-1 कोशिकाओं प्रयोगों के लिए एक कुशल विकल्प है कि एक की आवश्यकता के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ऊतक की अपेक्षाकृत बड़ी राशि है, जैसे क्रोमेटिन immunoprecipitation अनुक्रमण (चिप-seq) । हालांकि, ऐसे एनसीसी प्रवास के रूप में vivo सेल की घटनाओं में कई जटिल ऊतक के लिए ऊतक बातचीत पर निर्भर है, तो यह स्पष्ट नहीं है कि कैसे अच्छी तरह से O9-1 कोशिकाओं सही vivo एनसीसी प्रवास में नकल कर सकते हैं । इन विट्रो O9-1 कक्षों के साथ अध्ययनों की सीमाओं के कारण, यह O9-1 कक्षों के साथ vivo में पशु मॉडल का उपयोग करके किए गए टिप्पणियों को मान्य करने के लिए अनुशंसित है ।

इन विट्रो मेंNCCs का अध्ययन करने के लिए O9-1 सेल लाइन का उपयोग करते समय, नियमित संस्कृति के दौरान कोशिकाओं के multipotency को बनाए रखना महत्वपूर्ण है । O9-1 कोशिकाओं के multipotency एपी-2a और Sox9 जैसे एनसीसी मार्कर जीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करके संस्कृति की शुरुआत में परीक्षण किया जा सकता है । इसी तरह, O9-1 कोशिकाओं की भिंनता क्षमता उंहें विशिष्ट कोशिका प्रकार में अंतर द्वारा परीक्षण किया जा सकता है । O9-1 कोशिकाओं के रूटीन संवर्धन के दौरान अवांछित विभेद से बचने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को यहां वर्णित स्थापित प्रोटोकॉल के अनुरूप तरीके से किया जाना चाहिए । वातानुकूलित बेसल मीडिया और लिफ और bFGF की सही सांद्रता के ताजा इसके अलावा के सावधान तैयारी O9-1 कोशिकाओं के multipotency बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं । इसके अतिरिक्त, प्रयोगात्मक समयरेखा को ध्यान से नियोजित करने की जरूरत है, यह देखते हुए कि संवर्धन O9-1 कोशिकाओं को पहले निष्क्रिय फीडर STO कोशिकाओं की तैयारी करने और वातानुकूलित बेसल मीडिया का संग्रह करने की आवश्यकता है, जो केवल लगभग एक महीने के लिए अच्छा है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मांसपेशी और तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं के भेदभाव की क्षमता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, साथ ही mesenchymal स्टेम कोशिकाओं३४,३५,३६। यहां वर्णित प्रोटोकॉल के संदर्भ में, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स O9-1 कोशिकाओं के लिए एक मंच प्रदान करता है और संलग्न करने में मदद करता है भेदभाव की क्षमता को बनाए रखने । इसलिए, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स एक महत्वपूर्ण कारक है कि प्रयोगात्मक परिणाम और उनकी निरंतरता को प्रभावित कर सकता है जब दोहराया । हम तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स सख्ती से ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के कई फ्रीज-गल चक्र से बचने की तैयारी की सलाह देते हैं । इसके अलावा, जब जमे हुए राज्य से संस्कृति को O9-1 कोशिकाओं को ठीक करने, तरल नाइट्रोजन से एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान के लिए कोशिकाओं को जाने की प्रक्रिया को जल्दी से किया जा करने की जरूरत है, पूरी प्रक्रिया के दौरान किसी भी भंवर से परहेज । इसके अलावा, O9-1 कोशिकाओं की अधिक वृद्धि भी O9-1 कोशिकाओं के multipotency को बनाए रखने के लिए बचने की जरूरत है । जब passaging O9-1 कोशिकाओं, सुनिश्चित करें कि trypsin एकाग्रता ०.२५% के बजाय ०.०५% करने के लिए पतला है और यह कि कोशिकाओं को ठीक से असंबद्ध दिखाई देते हैं । एक सिंगल-सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए बार-pipetting बहुत धीरे से एकत्रित कोशिकाओं के गठन से बचने के लिए आवश्यक है । सामांय में, O9-1 सेल लाइन से निपटने की पूरी प्रक्रिया को धीरे और ध्यान से किया जाना चाहिए ।

सारांश में, O9-1 सेल लाइन इन विट्रो मेंNCCs का अध्ययन करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है, खासकर जब NCCs. O9-1 की vivo स्टडीज में पूरक एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया है कि आसानी के साथ वे पहुंचा जा सकता है और आसानी के रूप में स्पष्ट लाभ है जिसके साथ प्रयोगों के लिए पर्याप्त सेल नंबर प्राप्त किए जा सकते हैं । O9-1 कोशिकाओं की भिंनता क्षमताओं को देखते हुए, वे अनुसंधान के विभिंन क्षेत्रों में आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोग के लिए महान क्षमता है । O9-1 कोशिकाओं को आसानी से उच्च प्रवाह अनुक्रमण (ATAC-seq) और आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-seq) के साथ त्वरित दवा परीक्षण और स्क्रीनिंग, चिप seq, transposase सुलभ क्रोमेटिन के रूप में अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जीन लाभ के समारोह और हानि के समारोह अध्ययन, साथ ही संकेतन विनियमन अध्ययन । O9-1 कोशिकाओं की हैंडलिंग के लिए एक मानकीकृत और पूर्ण प्रोटोकॉल के उपयोग में वे अध्ययन की reproducibility की सुविधा होगी जिसमें इनका उपयोग किया जाता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

निकोल Stancel, पीएच. डी., टेक्सास हार्ट इंस्टीट्यूट में वैज्ञानिक प्रकाशनों के ELS, संपादकीय समर्थन प्रदान की है । हम भी निंनलिखित धन स्रोतों धंयवाद: अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन के राष्ट्रीय केंद्र वैज्ञानिक विकास अनुदान (14SDG19840000 जे वांग के लिए), २०१४ Rolanette और Berdon लॉरेंस अस्थि रोग टेक्सास के कार्यक्रम से (जे वांग के लिए) लॉरेंस अनुसंधान पुरस्कार ), और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (DE026561 और DE025873 जे वांग, DE016320 और DE019650 को आर Maxson) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active STO feeder cells ATCC ATCC CRL-1503 Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell line Millipore Sigma SCC049
DMEM, high glucose, no glutamine Gibco 11960-044
DMEM, high glucose Hyclone SH30243.01
FBS (fetal bovine serum) Millipore Sigma ES-009-B
Penicillin - streptomycin Gibco 15140-122
L-glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-081
Gelatin from porcine skin Sigma G1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS Genesee Scientific 25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium Lonza 17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100Xx Gibco 11140-050
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
2-Mercaptoethanol Sigma M-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mL Millipore Sigma ESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) R&D Systems 233-FB-025
Mitomycin C Roche 10107409001
Matrigel matrix Corning 356234
DMSO (dimethylsulfoxide) Millipore Sigma MX1458-6
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778-075
Opti-MEM I (1x) Gibco 31985-070
Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine Corning 10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA Dharmacon L-041057
ON-TARGETplus Non-targeting Pool Dharmacon D-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNA Dharmacon L-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium)
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement

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References

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आनुवंशिकी अंक १४० CRISPR Cas9 O9-1 कोशिकाओं जीन नॉकआउट जीन पछाड़ना तंत्रिका शिखा कोशिकाओं

Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

संवर्धन और हेरफेर के O9-1 तंत्रिका शिखा कोशिकाओं
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Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. … More

Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. J. Vis. Exp. (140), e58346, doi:10.3791/58346 (2018).

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