Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Dyrking og manipulering av O9-1 Neural Crest celler

Published: October 9, 2018 doi: 10.3791/58346
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern California

ERRATUM NOTICE

Summary

O9-1 er en multipotent musen neural crest cellen linje. Her beskriver vi detaljerte trinnvise protokoller for dyrking O9-1 cellene skille O9-1 celler i spesifikke celletyper og genetisk manipulering O9-1 celler ved hjelp av siRNA-mediert knockdown eller CRISPR-Cas9 genomet redigering.

Abstract

Neural crest celler (NCCs) overfører multipotent stamceller kan differensiere i ulike celletyper og gi opphav til flere vev og organer. O9-1 celle linjen er avledet fra den endogene mus embryonale NCCs og opprettholder sin multipotency. Imidlertid bestemte kultur tilfeller O9-1 celler kan differensiere i ulike celletyper og benyttes i en rekke forskningsformål. Nylig med en kombinasjon av mus studier og O9-1 celle studier, har vi vist at Hippo signalering veien effektor Yap og Taz spille viktige roller i neural crest-avledet craniofacial utvikling. Selv om culturing prosessen O9-1 celler er mer komplisert enn som brukes for andre cellelinjer, er O9-1 celle linjen en effektiv modell for å undersøke NCCs i vitro. Her presenterer vi en protokoll for dyrking O9-1 celle linjen for å opprettholde sin stemness, i tillegg til protokoller for skille O9-1 celler i ulike celletyper, for eksempel glatt muskelceller og osteoblasts. I tillegg beskrives protokoller for å utføre genet tap av funksjon studier i O9-1 celler ved hjelp av CRISPR-Cas9 sletting og lite forstyrrende RNA-mediert knockdown.

Introduction

Neural crest celler (NCCs) er multipotent stilk-lignende celler med en bemerkelsesverdig vandrende evne og forbigående eksistens under embryonale utviklingen. NCCs oppstår mellom overflaten ektoderm og medfødte og migrere til andre deler av fosteret i embryoutvikling1. Basert på sine funksjonelle domener, kan NCCs deles inn i flere typer, inkludert skallen, trunk, vagal, sakral, og cardiac NCCs. I tillegg kan NCCs skille ut flere celle linjene, som glatt muskelceller, beinet cellene og neurons, og gi opphav til ulike vev2,3. Utviklingen av NCCs er preget av en kompleks serie av Morfogenetiske hendelser som er finjustert med ulike molekylær signaler. Gitt komplekse regulering av NCCs og deres viktige bidrag til flere bygninger, kan feilregulering NCC utvikling ofte føre til congenital fødselsskader, som står for nesten 30% av alle menneskelige congenital fødselsskader. Abnormiteter under neural crest utviklingen kan føre til leppe leppe/ganen, feil nesen formasjon, syndromer, mangler defekt hjerte ut skrift eller selv spedbarnsdødeligheten1,4,5, 6 , 7. forstå molekylære mekanismer for NCC utvikling er viktig for å utvikle behandlinger for sykdommer forårsaket av feil i NCC utvikling. Med bruk av ulike i vitro og vivo tilnærminger8,9,10,11,12,13,14 ,15, betydelig fremgang har blitt gjort i NCC forskning. I vivo, dyr modeller, inkludert kyllinger, amfibier, sebrafisk og mus, har blitt brukt til å undersøke NCCs1. Videre har menneskelige embryo brukt til å studere prosessen for NCC tidlig menneskelige embryo utvikling16. In vitro, celle modeller for NCCs, som menneskelige NCCs som stammer fra pasienten subkutant fett, har blitt brukt til å undersøke Parkinsons17. O9-1 NCC linjen, som opprinnelig stammet fra masse kulturer av endogene NCCs isolert E8.5 musen embryo18, er en kraftig celle modell for å studere NCCs. viktigst, under ikke-differensierende oppdrettsforholdene, O9-1 celler Multipotent stilk-lignende NCCs. Men under varierende kultur forhold, kan O9-1 celler differensieres til unike celletyper, for eksempel glatt muskelceller, osteoblasts, chondrocytes og gliacellene18. O9-1 celler gitt disse egenskapene, og har blitt bredt brukt for NCC-relaterte studier, som undersøker molekylær mekanismen av skallen-ansikts defekter19,20.

Her, detaljert protokoller gis for opprettholde O9-1 cellene skille O9-1 celler i forskjellige celletyper og manipulere O9-1 celler ved å utføre genet tap-av-funksjon studier med CRISPR-Cas9 genomet redigering og lite forstyrrende RNA (siRNA)- mediert knockdown teknologier. Som et representativt eksempel er bruk av O9-1 celler å studere Yap og Taz tap-av-funksjon beskrevet. Yap og Taz er de nedstrøms effektor flodhesten signalveien, som spiller en avgjørende rolle i celle spredning, differensiering og apoptose. Hippo veien har også vist seg å være viktig i utviklingen og homeostase av flere ulike vev og organer og patogenesen av ulike sykdommer20,21,22,23 ,,24,,25,,26,,27,,28. Kjernekomponentene Hippo signalnettverk inkluderer tumor suppressor sterilt 20-lignende kinaser Mst1/2, WW domenet inneholder Salvador stillaset protein og store tumor suppressor homolog (Lats1/2) kinaser. Hippo signalering hemmer Yap og Taz og fremmer deres fornedrelse i cytoplasma. Uten undertrykkelse fra Hippo, kan Yap og Taz translocate i kjerner og fungere som transcriptional co aktivator. Vi nylig viste at spesielt inaktivere Hippo signalering effektor Yap og Taz musen NCCs ved hjelp av det Wnt1grobunn og Wnt1Cre2SOR drivere resulterte i embryonale dødelighet på E10.5 med alvorlig craniofacial feil20. Vi har også gjennomført studier med O9-1 celler for å undersøke rollen Yap og Taz i NCCs. For å studere Yap og Taz funksjon i NCC spredning og differensiering, Yap og Taz knockdown celler ble generert i O9-1 celler ved hjelp av siRNA og Yap knockout celler ble generert ved hjelp av CRISPR-Cas9 genomet redigering. De samme genet tap-av-funksjon strategiene kan brukes på ulike gener i andre veier. Gevinst-av-funksjon studier og transfection analyser kan i tillegg også brukes til O9-1 celler gen funksjon og regulering. Protokollene beskrevet her er ment å brukes av etterforskerne som støttelinjer for dyrking O9-1 celler for å opprettholde multipotent stemness, for å skille O9-1 celler i andre celletyper under annen kultur forhold og for å studere gen funksjon og molekylære mekanismer av NCCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelser før O9-1 cellekultur

Merk: Basal medier som brukes til O9-1 cellekultur må har vært betinget av Sandos innavlede mus thioguanine/ouabain-resistente (STO) musen fibroblast celler. STO celler må derfor være innhentet og forberedt som beskrevet nedenfor før du starter O9-1 cellekultur.

  1. Aktive STO cellekultur
    1. Forberede medier for dyrking aktive STO celler ved å gjøre hele Dulbecco endret Eagle's media (DMEM) med 7% fosterets bovin serum (FBS) (embryonale stamcelleforskningen kultur grad), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 2 mM L-glutamin (siste konsentrasjoner er angitt).
      Merk: STO mediet brukes for dyrking av aktive STO mater celler. Penicillin, streptomycin og L-glutamin kan danne nedbør i lagring; oppløse helt av pipettering før bruk.
    2. Lag en standard 100 mm celle kultur plate med 0,1% gelatin i 30 min ved romtemperatur. Sug opp ekstra gelatin etter inkubasjonstiden. Bruke plate umiddelbart etter belegg.
      Merk: Alternativt dekk platen med STO media og la platen i en fuktet inkubator å unngå tørking av platen (dette er ment bare for kortsiktige lagring og ikke lagre precoated plater).
    3. Tine STO cellene raskt i et 37 ° C vannbad; Tørk cryovial med 70% etanol før åpningen, og øyeblikkelig overføre hele ampullen celleområde slik sentrifuge.
    4. Legge til STO media dropwise sentrifuge røret; volumprosent cellene til media er 1:10.
    5. Sentrifuge cellene på 180 x g i 3 minutter på RT.
    6. Bland ved mild pipettering og overføre celler til gelatin-belagt plate.
    7. Tillate STO cellene vokse for 24 timer i en standard inkubator (37 ° C, 5% CO2).
    8. Endre medium (bare etter cellene følge) 24 timer etter såing og kast gamle medium.
    9. Sjekk STO celler hver dag under et mikroskop og ved 80% confluency.
      1. Før du starter STO celle passaging, pels plater med 0,1% gelatin (gelatin volum tilsvarer halvparten av veksten medier volum for at fartøyet) i 30 min ved romtemperatur.
      2. For å passasje STO celler, Sug opp vekst medier og vaske celler med fosfat-bufret saltvann (PBS) to ganger (Legg PBS i en like volum av veksten medier).
      3. Sug opp PBS og legge til 0,25% trypsin-EDTA (Juster volumet avhengig fartøy); deretter ruge ved 37 ° C i 5 minutter.
        Merk: For en 100 mm plate, bruke 10 mL vekst medier og 3 mL trypsin løsning. For en 150 mm plate, kan du bruke 20 mL vekst medier og 8 mL trypsin løsning. Volumet av vaske bufferen er volumet av veksten medier.
      4. Deaktiver trypsin med en lik mengde STO media. Frø STO celler til nye plater med forholdet 1:3-1:10.
        Merk: En felles voksende ordningen er å utvide fra en cryovial i en 100 mm plate, så til en 150 mm plate og fire 150 mm plater, og til slutt til 16 150 mm plater.
  2. Deaktivering og frysing av STO celler
    1. For å forberede 2 x frysing media, legge til følgende STO media (siste konsentrasjoner er angitt): 20% FBS, 20% dimethyl sulfoxide (DMSO).
    2. Etter miksing, filter sterilisere 2 x frysing media (pore størrelse 0.22 µm) og lagre den på 4 ° C før bruk. Gjøre 2 x frysing media samme dag i bruk og forkaste frysing er ubrukte medier.
    3. Forberede mitomycin C løsning i PBS i en konsentrasjon på 0,5 mg/mL. For å oppløse mitomycin C i PBS, tape flasken vortexer og vortex på en lav innstilling for ca 45 min for å oppløse partikler helt.
      Merk: Mitomycin C er lys følsom og vanskelig å oppløse.
      Forsiktig: Mitomycin C er akutt giftig og kan forårsake kreft. Håndtere bare med riktig personlig verneutstyr.
    4. Deaktiver STO celler ved å legge til en siste konsentrasjon av 0,01 mg/mL mitomycin C eksisterende media. Inkuber for 2t inne en standard inkubator (37 ° C, 5% CO2).
    5. Vask plater (150 mm) med 20 mL PBS to ganger etter inaktivering med mitomycin C.
    6. Sug opp PBS løsningen distansere celler ved hjelp av 8 mL 0,25% trypsin-EDTA og ruge i 5 minutter i en standard fuktet inkubator (37 ° C, 5% CO2).
    7. Deaktiver trypsin med 8 mL STO media.
    8. Overføre celle løsningen slik sentrifuge. Kombinere mer enn en plate i en sentrifuge tube å spare tid. Sentrifuger i 5 min på 180 x g.
    9. Sug opp nedbryting og resuspend celle pellet i 5 mL PBS.
    10. Bruk 10 µL av cellen løsningen for å telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Teller cellene i den sentrale gridded plassen og multipliserer tallet ved 104 for å bestemme antall celler per 1 mL. Teller dobbelt og gjennomsnittlig to tall for å få siste estimering av antallet celler per milliliter.
    11. Sentrifuge celler for 5 min på 180 x g.
    12. Sug opp PBS og Legg til 1:1 (volumprosent) STO media og 2 x frysing media celle pellets. Justere volumet for en siste celle konsentrasjon på 4 x 106 celle/mL (dette beløpet er bra for en 100 mm plate).
      Merk: For eksempel fra fire 150 mm plater gir totalt 60 x 106 celler, fryse 4 x 106 celler per cryovial, med hver cryovial som inneholder 1 mL av cell løsningen. Fire plater gir ca 15 cryovials (60/4 = 15). Legge til 7,5 mL STO medier og 7,5 mL 2 x frysing media til celle pellet, resuspend og aliquot 1 mL i hver cryovial.
    13. Resuspend av sakte pipettering frysing media med cellen pellets. Overføre 1 mL av cell løsningen til hver cryovial, og merk deretter.
    14. Plasser cryovials i en lidded polystyren boks (dette gir en langsom avkjøling rente, som forbedrer celle overlevelse). Overføre boksen til-80 ° C fryser for minst 24 timer før du overfører cryovial til flytende nitrogen.
      Merk: For best resultat, minimere cellen teller tid, samt tiden mellom legge 2 x frysing media til celler og overføre ampuller til-80 ° C.

2. O9-1 cellekultur

  1. Forberede basale media O9-1 cellekultur ved å legge til følgende i DMEM (siste konsentrasjoner er angitt): 15% FBS, 0,1 mM minimum viktige medier (MEM) unødvendige aminosyrer, 1 mM natrium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL Streptomycin, 2 mM L-glutamin, 103 enheter/mL leukemi hemmende faktor (LIF; lagt umiddelbart før bruk, ikke Legg til lager flaske), og 25 ng/mL fibroblast vekst faktor-grunnleggende (bFGF; lagt umiddelbart før bruk, ikke Legg til lager flaske).
  2. Filteret sterilisere basale media (pore størrelse 0.22 µm) og pakk i aluminiumsfolie å beskytte mot lyset.
  3. Samle betinget basale medier fra deaktivert STO celler.
    Merk: Fortsett bare etter få deaktivert STO celler. O9-1 basale media fra STO celle platene kalles heretter betinget basale media.
    1. Tine inaktivert STO cellene raskt som beskrevet ovenfor (en cryovial som inneholder 4 x 106 celler er bra for en 100 mm plate og gir ca 100 mL betinget basale media etter 10 dager i samlingen). Frø inaktivert STO celler til gelatin-belagt platen ved hjelp av STO medier. Lar celler å feste natten i en standard fuktet inkubator (37 ° C, 5% CO2).
    2. 24 timer etter tining STO celler, forkaste eksisterende STO media og erstatte med basal media.
      Merk: Ikke Legg LIF og bFGF til deaktivert STO celle kultur retter; bare legge til O9-1 celle kultur retter.
    3. Hver 24 h, endre media O9-1 basale media og samle basale media fra STO celle plater i en flaske. Pakk flasken inneholder betinget basale media i folie å beskytte mot lyset. Lagre alle innsamlede medier på 4 ° C.
      Merk: Fordi cellene var inaktiv, de kan ikke vises så sunn som de gjorde etter flere dager med samlingen; Dette er å være forventet.
    4. Eventuelt for å sjekk for forurensning, samle basale media for hver samling dag i forskjellige rør (i stedet for en flaske) innpakket i folie. Bruke en 24-vel plate, sett 1 mL av media fra hver dag i hver brønn og ruge over natten i en standard inkubator etter bakteriell forurensning under mikroskopet.
      Merk: Media forblir en rød farge hvis det er ingen forurensning men endringer gul hvis bakteriell forurensning.
    5. Etter samle betinget basale media for 10 dager, forkaste STO cellene. Kombinere (hvis aktuelt) samlet betinget basale media og filteret sterilisere (pore størrelse 0.22 µm) i et sterilt flaske. Pakk flasken i folie å beskytte mot lyset. Hold filtrerte betinget basale media på 4 ° C for maksimalt én måned fra filteret datoen.

3. vedlikeholde O9-1 celler

Merk: Arbeider O9-1 basale media er filteret sterilisert betinget basale media, til hvilke LIF (siste konsentrasjon 103 enheter/mL) og bFGF (siste konsentrasjon 25 ng/mL) legges umiddelbart til celle kultur rett før bruk. Dette mediet må beskyttes lys og lagret på 4 ° C.

  1. Gjenoppretting av O9-1 celler
    1. Sakte tine lager flaske kjelleren membran matrix (f.eksMatrigel) natten på 4 ° C å forberede dele.
    2. Legge til 5 mL av DMEM med 10% FBS til 5 mL av lager kjelleren membran matrix membranen. Bland godt pipettering med kaldt pipette-spisser lagret på 20 ° C. Behold opprinnelige flaske og aliquot rør på is. Fryse dele i ulike volumer (0,5 mL eller 1 mL dele) avhengig av eksperimentet behov. Unngå fryse-tining kjelleren membran matrise flere ganger.
      Merk: kjelleren membran matrise polymerizes raskt ved romtemperatur; Bruk kald pipette-spisser og holde rør kaldt for å unngå utilsiktet polymerisasjon.
    3. Tine en aliquot av kjelleren membran matrix 4 ° C eller is 2t før du starter eksperimentet. Ikke Oppbevar matrisen ved 4 ° C over en lengre periode.
    4. Bruke filter-steriliseres DMEM med 10% FBS å fortynne kjelleren membran matrisen til en siste konsentrasjon på 0,5 mg/mL til coat platene. Pelsen plater med kjelleren membran matrix (0,5 mg/mL) ved romtemperatur for 1 h. Kontroller at den helt dekker plate (som vist i figur 1).
    5. Vipp platen når aspirating kjelleren membran matrisen for å unngå å berøre belagt overflaten; tørr plater på 37 ° C i 30 min. Ikke over tørr belagt plater.
      Merk: Fortsett bare når alle medier og reagenser er klar til bruk (betinget basale media, sterile-filtrert 10% FBS i DMEM, LIF og bFGF).
    6. Gjenopprette O9-1 cellene raskt ved å plassere cryovial i et vannbad 37 ° C; sakte swirl ampullen til løsningen helt blir flytende og umiddelbart videre til neste trinn.
    7. Overføre alle cellen løsningen fra cryovial (ca 1 mL) slik 15 mL sentrifuge. Legge til 5 mengder DMEM med 10% FBS (filter sterilisert med filteret porestørrelse på 0.22 µm) og resuspend.
    8. Sentrifuge for 3 min 180 x g. Sug opp nedbryting uten å forstyrre det cellen pellet. Resuspend celle pellet (ved å trykke) i betinget basale media supplert med LIF og bFGF. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
      Merk: Betinget basale media supplert med LIF og bFGF er avgjørende for å opprettholde multipotency av O9-1 cellen linje. Forsiktighet til riktig media for å unngå utilsiktet celledifferensiering.
    9. Frø celler fra 10.000 15.000 cellen/cm2 til en 6-vel plate. Lar celler å feste og vokse i en standard celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) over natten før du endrer media.
    10. Kontroller at cellene er festet før du fortsetter å endre media (friske tilknyttede celler se som vist i figur 2).
    11. Alltid endre kultur medier dagen etter O9-1 celler (bruker betinget basale media supplert med LIF og bFGF).
  2. Passering av O9-1 celler
    1. Når O9-1 celler når 80% confluency, tine kjelleren membran matrix og forberede en kjeller membran matrix-belagt plate som beskrevet ovenfor. Legge til betinget basale medier supplert med LIF og bFGF til fartøyet. Også legge til DMEM uten FBS holde kjelleren membran matrix tørker og lagre i en standard fuktet inkubator for mer enn 3 dager.
    2. Skyll O9 1-inneholder brønnene (6-vel plate) med 2 mL Dulbeccos fosfat-bufret saltvann (DPBS) to ganger og Pipetter forsiktig for å unngå å miste celler.
    3. Distansere celler med 1 mL av 0,05% trypsin-EDTA ved 37 ° C i 3 min. nøytralisere trypsin med en lik mengde DMEM med 10% FBS. Gjentatte ganger Pipetter væsken over hele overflaten av brønnen å dissociate så mange celler fra platen som mulig.
      Merk: Trypsin konsentrasjonen er 0,05% istedenfor 0,25%. Bruk DPBS for å fortynne fra lager flasken.
    4. Unngå å generere bobler når dissociating celler fra platen.
    5. Overføre alle cell løsningen til en sentrifuge rør og sentrifuge for 3 min 180 x g. Sug opp nedbryting uten å forstyrre det cellen pellet. Resuspend celle pellet i sentrifuge røret ved mild pipettering i betinget basale media supplert med LIF og bFGF.
    6. Bruk en hemocytometer total-celle tall som beskrevet ovenfor. Frø celler (10.000 til 15.000 celler/cm2) til belegg plate forberedt som beskrevet i trinnene 3.1.4 til 3.1.8. En brønn av en 6-vel plate ville kreve 100 000 celler frøet.
    7. Lar celler å feste og vokse i en standard celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2). Alltid endre kultur medier dagen etter passaging O9-1 celler.
  3. Frysing av O9-1 celler
    1. For å forberede 2 x frysing medier for O9-1 celler, fortynne følgende i DMEM (siste konsentrasjoner er angitt): 40% FBS og 20% DMSO.
    2. Filteret sterilisere 2 x frysing media og holde det ved 4 ° C. 2 x frysing media må gjøres på dagen det er brukt. Forkaste alle ubrukte frysing medier.
      Merk: Fryse O9-1 cellene på 80% confluency.
    3. Skyll brønner med DPBS to ganger; Pipetter forsiktig for å unngå å miste celler.
    4. Distansere celler med 0,05% trypsin-EDTA ved 37 ° C i 3 minutter, deretter nøytralisere trypsin med en lik mengde 10% FBS i DMEM. Gjentatte ganger Pipetter væsken over hele overflaten av brønnen å dissociate så mange celler fra platen som mulig.
    5. Overføre alle plate innholdet til en sentrifuge rør og sentrifuge for 3 min 180 x g. Sug opp nedbryting og legge 2 mL PBS og resuspend ved å trykke.
    6. Bruk 10 µL av cell løsningen for å telle celler ved hjelp av en hemocytometer som beskrevet ovenfor.
    7. Sentrifuge celle løsning for 3 min 180 x g. Sug opp nedbryting og justere basale media nødvendig; deretter legge til en lik mengde 2 x frysing media.
      Merk: Celler er frosset i en konsentrasjon av 1 x 106 celler/mL (1 mL per cryovial).
    8. Overføre celler til cryovials, og merk deretter. Plasser cryovials inne en lidded polystyren boks for en langsom avkjøling hastigheten-80 ° C i minst 24 timer før du overfører til flytende nitrogen.
      Merk: For best resultat, minimere cellen teller tid og tiden mellom legge 2 x frysing media og overføre ampuller til-80 ° C.

4. manipulasjon celleområde O9-1

  1. Utfører siRNA knockdown i O9-1 celler
    1. Tine og pels en 24-vel plate med kjelleren membran matrise som beskrevet ovenfor (trinn 3.1.4–3.1.8) før du starter eksperimentet. Gjenopprette og frø O9-1 celler, slik at de kan vokse til 60% til 80% confluency.
    2. Fortynne liposomer i serum-free media etter riktig godt volumet. Fortynn siRNA i serum-free media til finalen. Legge til utvannet siRNA utvannet liposomer i forholdet anbefalt av produsenten. Bland godt pipettering og ruge.
      Merk: Følg produsentens guide på volumet brukes, tid og temperatur på inkubasjon.
    3. Legge til en passende mengde siRNA-lipid kompleks celler i henhold til produsentens anbefalinger.
    4. Inkuber celler for 24 timer i en standard celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2). Nedstrøms fremgangsmåten som passer (ekstra RNA, ekstra proteiner, flekker, etc.)
      Merk: siRNA knockdown ganger og konsentrasjoner kan variere avhengig av individuelle eksperimentet.
  2. Utføre genet knockout i O9-1 celler ved hjelp av CRISPR-Cas9 genomet redigering
    Merk: Se tidligere publiserte protokollen for å bruke CRISPR-Cas9 i pattedyr cellen linjer29. Gis her en forenklet beskrivelse av CRISPR-Cas9 genomet redigering og relaterte trinnene.
    1. Få sgRNA sekvenser ved hjelp av en sgRNA design verktøyet.
    2. Ligate sgRNA til pSpCas9 (bb) - 2a - GFP vektor30.
    3. Transfect O9-1 celler med vektoren ved hjelp av en standard lipofection-protokollen i henhold til produsentens anbefalinger.
    4. Inkuber celler i en standard celle kultur inkubator på 37 ° C med 5% CO2 24 h.
    5. Utføre fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) basert på GFP/7-AAD. Frø GFP + enkeltceller i 96-brønnen platene.
    6. Vokse cellene i inkubator for ytterligere 4 dager. Forkaste alle brønnene som har mer enn én koloni.
    7. Utføre PCR primere utformet for å oppdage slettingen. Etter PCR, kjøre PCR produkter på en agarose gel å evaluere bandet størrelsen. Validere knockout effektiviteten ved hjelp av CRISPR-Cas9 editingby utfører vestlige blotting (et eksempel på Yap knockout resultater er vist i Figur 3).

5. O9-1 celledifferensiering

  1. Differensiering av O9-1 celler i osteoblasts
    1. For å forberede osteogenic differensiering media, fortynne følgende i alpha-MEM (siste konsentrasjoner er angitt): 0,1 mM deksametason, 100 ng/mL bein Morfogenetiske proteinet 2 (BMP2), 50 µg/mL askorbinsyre, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin.
    2. Oppdage den osteoblast markøren, osteocalcin, i ulike osteoblasts av immunostaining som vist i Figur 4.
      Merk: Osteogenic differensiering kan også vurderes ved hjelp av andre markører av osteoblasts eller Alizarin røde flekker eller alkalisk fosfatase flekker.
  2. Differensiering av O9-1 celler i chondrocytes
    1. For å forberede chondrocyte differensiering media, fortynne følgende i alpha-MEM (siste konsentrasjoner er angitt): 5% fosterets kalv serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selen (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transformere vekstfaktor beta (TGF-b3) 50 mg/mL askorbinsyre, 10 ng/mL BMP2, 0,1 mM dexamethasone og 1 mM natrium pyruvate.
    2. Første kultur i monolayer av O9-1 celler med osteogenic media for 3 dager og deretter trypsinize og kultur som et micromass format i chondrocyte differensiering medier for ytterligere 7 dager.
    3. Esler chondrogenic differensiering med Alcian blå flekker eller markører av chondrocytes.
  3. Differensiering av O9-1 celler i glatt muskelceller
    1. For å forberede glatt muskel celle differensiering media, fortynne følgende i DMEM (siste konsentrasjoner er angitt): 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, og 10% FBS.
    2. Esler glatt muskel celledifferensiering med immunofluorescence flekker ved hjelp av antistoffer mot markører for glatt muskelceller, for eksempel glatt muskel utgangen (SMA), vises som et eksempel i figur 5.
  4. Differensiering av O9-1 celler i gliacellene
    1. For å forberede glial celle differensiering media, fortynne følgende i DMEM/F12 (siste konsentrasjoner er angitt): 1 x B-27 supplement, 2 mM L-glutamin, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF og 1% inaktivert FBS.
    2. Evaluere glial celledifferensiering ved å utføre immunofluorescence farging med antistoffer mot glial celle markører som fettsyrer bindende protein 7 (FABP7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med vår knockdown og knockout eksperimenter var å studere virkningene av Yap og Taz tap-av-funksjon i O9-1 celler. Før knockdown og knockout eksperimentene har vi sørge for at forberede basale media og kultur O9-1 cellene som beskrevet ovenfor (for eksempel kjelleren membranen matrise må dekke hele platen som vist i figur 1og O9-1 celler gjenopprettet fra flytende nitrogen som vist i figur 2). Vi utførte knockdown eksperimenter som beskrevet ovenfor der Yap og Taz ble samtidig slått ned. Like mye Yap siRNA og Taz siRNA ble lagt til det siste bindet anbefalt av produsenten. Kontroll plate, en lik mengde nontargeting siRNA ble lagt til.

En Yap-null O9-1 celle linje ble generert ved å slette ekson 3 av Yap ved hjelp CRISPR/Cas9 genomet redigering, som beskrevet av Wang et al. 20. vi utført knockout eksperimenter ved hjelp av CRISPR-Cas9 genomet redigering som beskrevet ovenfor og Wang et al. 20. vi brukte følgende sgRNA sekvenser, som flankert ekson 3 av Yap: 5 '-caccgtggattacgtgggtatgtt-3 (sgRNA1-frem), 5 '-aaacaacatacccacgtaatccac-3 (sgRNA1-revers), 5 '-caccgagatggtctaatgtagtga-3 (sgRNA2-frem), 5 ' - aaactcactacattagaccatctc-3 (sgRNA2-revers)

CACC ble lagt til den fram stranden, og AAAC ble lagt til den omvendte stranden. G ble lagt på 5' slutten av den fremre stranden fordi oligo ikke begynner med G, og C ble lagt til 3 slutten av den omvendte stranden. Under CRISPR-Cas9 genomet redigering fremgangsmåten ovenfor og Wang et al. 20, celler var betinget basale medier for O9-1 celler med LIF og bFGF for å unngå uønskede differensiering. De følgende PCR primerne ble brukt for å oppdage Yap slettingen: 5 '-AAAACAGTCTCCACTACCCCTT-3 (fremover) og 5 '-GGCCATCATAGATCCTGGACG-3 (bakover). SgRNAs er fra base #7973399 til #7974433 på musen kromosom 9. PCR er primer på kromosomet fra base #7973306 til #7974478. Etter PCR, PCR bandet for Yap knockout med ekson 3 slettet dukket opp som en 138-bp bandet på en agarose gel; vill-type Yap dukket opp som en 1173-bp. Effektiviteten av Yap knockout ved hjelp av CRISPR-Cas9 genomet redigering ble validert med vestlige blotting, som vist i Figur 3.

Som beskrevet ovenfor, kan O9-1 celler kultivert i bestemte differensiering-inducing media å fremme differensiering i bestemt celletyper. Evaluering av differensiering kan gjøres ved hjelp av ulike tilnærminger, slik som kvantitative PCR eller immunostai-av bestemt celle markører. Som et eksempel, viser Figur 4 O9-1 celler som ble dyrket i osteoblast-inducing media og differensiert i osteoblasts, som ble vurdert av immunostai-celler med antistoffer mot osteocalcin (Ocn, en osteoblast markør). Kombinert med gene knockdown og knockout eksperimenter beskrevet ovenfor, O9-1 celler kan grovt brukes gen funksjon studier og fenotypiske analyser. Som et eksempel, begge vill-type og Yap-null O9-1 celler ble kultivert i glatt muskel celle differensiering media og vurdert av immunostai-celler med antistoffer mot glatt muskel utgangen (SMA, en glatt muskel celle markør). De fleste vill-type O9-1 celler ga opphav til SMA-positive glatt muskelceller (figur 5A), mens Yap-null O9-1 celler kan ikke skille ut SMA-positive glatt muskelceller (figur 5B), noe som indikerte at Yap spiller en kritisk rolle i differensiering av NCCs i glatt muskelceller.

Figure 1
Figur 1: Matrigel fullt ut dekker en 35 mm plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: O9-1 celler 24 timer etter utvinning fra flytende nitrogen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Western blot data som viser den effektive knockout (ko) av Yap i O9-1 celler ved hjelp av CRISPR-Cas9 genomet redigering. wt: vill-type. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Immunofluorescence farging av osteoblast markør osteocalcin (Ocn) indikerer at O9-1 celler ga opphav til osteoblast celler under osteogenic differensiering forhold. Celler var farget med osteoblast markør Ocn antistoff (grønn) og kjerner var farget med DAPI (blå). Pilene angir Ocn-positive celler. Osteocalcin (Ocn, en osteoblast markør); DAPI (′, 6-diamidino-2-phenylindole). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Immunofluorescence farging av glatt muskel utgangen (SMA) som angir at under glatt muskel celle differensiering forhold, de fleste vill-type O9-1 celler ga opphav til glatte muskelcellene (A), mens Yap-null O9-1 celler ikke skille ut glatte muskelcellene (B). Celler var farget med SMA antistoff (rød) og kjerner var farget med DAPI (blå). Pilene angir SMA-positive celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

NCC er en allsidig og viktigste bidragsyter til forskjellige vev og organer i løpet embryonale morphogenesis. O9-1 celle linjen opprettholder sitt potensial til å skille ut mange forskjellige celletyper og etterligner i vivo egenskapene til NCCs, gjør det en nyttig i vitro verktøy for å studere gen funksjon og molekylære regulering i NCCs. De ulike statusene O9-1 celler kan svarer til ulike neural crest avkom i vivo, avhengig av kultur forholdene celleområde O9-1. O9-1 celler kan opprettholdes tilstanden multipotent når kultivert under ikke-differensierende oppdrettsforholdene, ligner på vanlige stamcelleforskningen kultur. Ikke-differensierende O9-1 cellene kan tilsvare pre-migratory og vandrende multipotent stilk-lignende NCCs i vivo. Videre kan O9-1 celler skille i mange ulike celletyper under bestemte differensiering kultur forhold, som er en viktig fordel for å studere gen funksjon og regulering under differensiering av NCCs fra multipotent stilk celler i en bestemt differensiert celle type. Unike O9-1 cellene kan tilsvare post-migratory neural crest avkom i vivo, som har en annen celle skjebne å differensiere i ulike celletyper. Avhengig av forskningsinteresse, kan O9-1 celler være manipulert og kultivert annerledes supplement i vivo NCC studier med dyr modeller.

Det finnes ulike måter å manipulere O9-1 celler for å studere NCC begivenheter, inkludert gene tap-av-funksjon og gevinst-av-funksjon. Her presenteres eksempler i hvilke siRNA knockdown og CRISPR-Cas 9 genet redigering eksperimenter ble utført i O9-1 celler for Hippo veien effektor Yap tap av funksjon studier20. Med kombinert bruk av en musemodell og O9-1 celler viste vår studie at Yap spiller en avgjørende rolle i å regulere NCC spredning og differensiering inn glatt muskel celler20. Andre studier i forskjellige modeller har også indikert en viktig rolle for Yap i NCCs. Yap ble vist behov for musen neural crest glatt muskel differensiering31 og for å forbedre menneskelig NCC skjebne og migrasjon32. Videre uttrykkes Yap i tidlig Xenopus utvikling33. Effektiviteten av genet knockdown og knockout i O9-1 celler, kombinert med bekvemmeligheten av utfører andre nedstrøms molekylær teknikker som kvantitative PCR (qPCR), vestlige blotting og immunostai-støtter at O9-1 celle linjen er en utmerket NCC modell som enkelt kan manipuleres i vitro. I tillegg til tap av funksjon studier vi har beskrevet ovenfor, og tidligere20, ulike programmer O9-1 celler har blitt beskrevet for studerer NCCs. O9-1 celler kan brukes som et effektivt alternativ for eksperimenter som krever en relativt stor mengde vev, som chromatin immunoprecipitation sekvensering (ChIP-seq). Men mange i vivo celle hendelser som NCC overføring er avhengige av komplekse vev til vev interaksjoner, så det er fortsatt uklart hvor godt O9-1 celler kan nøyaktig etterligne i vivo NCC migrasjon. På grunn av begrensningene i vitro studier med O9-1 celler anbefales det å validere observasjoner gjort med O9-1 celler i vivo ved hjelp dyremodeller.

Når du bruker O9-1 celle linjen for å studere NCCs i vitro, opprettholde multipotency cellene under rutinemessig kultur er avgjørende. Multipotency O9-1 celler kan testes i begynnelsen av kultur ved å evaluere uttrykk for NCC markør gener som AP-2a og Sox9. Tilsvarende kan differensiering evne til O9-1 celler testes ved å skille dem i spesifikke celletyper. For å unngå uønskede differensiering under rutinemessig dyrking av O9-1 celler, må de eksperimentelle prosedyrene gjennomføres i overensstemmelse med etablerte protokollen beskrevet her. Nøye planlegging av betinget basale media og fersk tillegg av riktig konsentrasjonen av LIF og bFGF er avgjørende for å opprettholde multipotency celleområde O9-1. I tillegg eksperimentelle tidslinjen må planlegges nøye, gitt at dyrking O9-1 celler krever først forberede inaktive mater STO celler og samle betinget basale media, som er bra for bare én måned. Tidligere studier har vist at kjelleren membran matrix er viktig for differensiering potensielle av muskel- og neural precursor celler, samt mesenchymal stem celler34,35,36. I forbindelse med protokollen beskrevet her, kjelleren membran matrise gir en plattform for O9-1 celler å feste og bidrar til å opprettholde differensiering potensielle. Derfor er kjelleren membran matrix en viktig faktor som kan påvirke eksperimentelle resultater og deres konsistens ved gjentatt. Vi anbefaler forbereder kjelleren membran matrix strengt i henhold til protokollen beskrevet ovenfor og unngå flere fryse-Tin sykluser av kjelleren membran matrix. Også når utvinne O9-1 celler fra frossen tilstand til kultur, må prosessen med å flytte cellene fra flytende nitrogen til en 37 ° C vannbad gjøres raskt, unngå noen vortexing under hele prosessen. I tillegg må overvekst av O9-1 cellene også unngås for å opprettholde multipotency celleområde O9-1. Når passaging O9-1 celler, sikre at trypsin konsentrasjonen er utvannet til 0,05% istedenfor 0,25% og at celler vises riktig avstand. Gjentatte ganger pipettering svært forsiktig er for å oppnå en enkeltcelle suspensjon nødvendig for å unngå dannelse av aggregert celler. Generelt må hele prosessen med å håndtere O9-1 celle linjen gjøres forsiktig og nøye.

Oppsummert O9-1 celle linjen er et veldig nyttig verktøy for å studere NCCs i vitro, spesielt når de brukes som en metode utfyllende til i vivo studier NCCs. O9-1 celler har åpenbare fordeler som enkelt med som de kan nås og enkel med hvilken tilstrekkelig celle kan tall oppnås for eksperimenter. Gitt differensiering egenskapene til O9-1 celler, har de stort potensial for bruk i en rekke programmer i ulike felt av forskning. O9-1 celler kan enkelt brukes for programmer som hastig bedøve tester og screening, ChIP-seq, transposase tilgjengelig chromatin med høy gjennomstrømming sekvensering (ATAC-seq) og RNA sekvensering (RNA-Seq), gene gevinst-av-funksjon og tap-av-funksjon studier, samt signalnettverk regulering studier. Bruk av en standardisert og komplett protokoll for håndtering av O9-1 celler vil lette reproduserbarhet studier der de brukes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Nicole Stancel, Ph.D., ELS, vitenskapelige publikasjoner ved Texas Heart Institute, gitt redaksjonelle støtte. Vi takker også følgende finansiering kilder: American Heart Association's National Center forsker Development Grant (14SDG19840000 å J. Wang), 2014 Lawrence forskning prisen fra Rolanette og Berdon Lawrence bein sykdom Program of Texas (til J. Wang ), og de nasjonale instituttene for helse (DE026561 og DE025873 å J. Wang, DE016320 og DE019650 til R. Archers).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active STO feeder cells ATCC ATCC CRL-1503 Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell line Millipore Sigma SCC049
DMEM, high glucose, no glutamine Gibco 11960-044
DMEM, high glucose Hyclone SH30243.01
FBS (fetal bovine serum) Millipore Sigma ES-009-B
Penicillin - streptomycin Gibco 15140-122
L-glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-081
Gelatin from porcine skin Sigma G1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS Genesee Scientific 25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium Lonza 17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100Xx Gibco 11140-050
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
2-Mercaptoethanol Sigma M-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mL Millipore Sigma ESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) R&D Systems 233-FB-025
Mitomycin C Roche 10107409001
Matrigel matrix Corning 356234
DMSO (dimethylsulfoxide) Millipore Sigma MX1458-6
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778-075
Opti-MEM I (1x) Gibco 31985-070
Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine Corning 10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA Dharmacon L-041057
ON-TARGETplus Non-targeting Pool Dharmacon D-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNA Dharmacon L-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium)
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
  2. Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
  3. Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
  4. Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
  5. Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
  6. Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
  7. Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
  8. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
  9. Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
  10. Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
  11. Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
  12. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).
  13. Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
  14. Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
  15. Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
  16. Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).
  17. Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
  18. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  19. Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
  20. Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
  21. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
  22. Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
  23. Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
  24. Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).
  25. Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
  26. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  27. Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
  28. Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
  29. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).
  30. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  31. Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
  32. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208 (2016).
  33. Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
  34. Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).
  35. Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
  36. Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).

Tags

Genetikk problemet 140 CRISPR Cas9 O9-1 celler gene knockout gene knockdown neural crest celler

Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

Dyrking og manipulering av O9-1 Neural Crest celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. … More

Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. J. Vis. Exp. (140), e58346, doi:10.3791/58346 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter