Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Dyrking og manipulering av O9-1 Neural Crest celler
Summary October 9th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
O9-1 er en multipotent musen neural crest cellen linje. Her beskriver vi detaljerte trinnvise protokoller for dyrking O9-1 cellene skille O9-1 celler i spesifikke celletyper og genetisk manipulering O9-1 celler ved hjelp av siRNA-mediert knockdown eller CRISPR-Cas9 genomet redigering.
Transcript
O9-1 cellelinjen er et svært nyttig verktøy for å studere neural crest celler in vitro. Den har et stort potensial for bruk i et bredt spekter av søknad i ulike bruk av forskning. O9-1-celler har åpenbare fordeler, for eksempel enkel tilgang, og raskt å skaffe tilstrekkelige celletall for eksperimenter, noe som gjør det til en kraftig metode gratis å in vitro studier av neural crest celler.
For å begynne, forberede basal media for O9-1 cellekultur, i henhold til tekstprotokollen. Deretter filtrerer du basalmediet, og vikler det i folie for å beskytte det mot lyset. Etter dette samler du inn bedede basale medier fra en aktivert STO-celler i henhold til tekstprotokollen.
Først tine en aliquot av kjeller membran matrise på is i to timer. Deretter fortynner kjelleren membran matrise med filtrert sterilisert DMEM med 10% FBS til en endelig konsentrasjon på 0,5mg/ml. Coat platen med kjelleren membran matrise ved romtemperatur i en time.
Deretter aspirerer kjellermembranmatrisen mens du vipper platen. Tørk platene ved 30 grader Celsius i 30 minutter. Når du legger kjellermembranmatrisen til platen, må du sørge for at løsningen dekket brønnen jevnt for å opprettholde celleegenskapene og unngå unødvendig variasjon mellom eksperimenter.
Gjenopprett O9-1-celler ved å plassere et kryo-hetteglass i et 37 graders Celsius vannbad. Virvle hetteglasset langsomt til oppløsningen blir helt til væske. Etter dette overfører du celleoppløsningen fra kryo-hetteglasset til et 15 ml sentrifugerør.
Legg til fem volumer dmem med 10% FBS til røret for å suspendere cellene på nytt. Sentrifuge cellene i tre minutter ved 180 Gs.Deretter aspirerer de overnaturlige, og tar vare på å ikke forstyrre pelleten. Deretter, re-suspendere pellet i betinget basal media supplert med LIF og BFGF.
Seed cellene i en seks brønnplate, og agiter platen for å så cellene jevnt. Når du rører platen, gjør det horisontalt og vertikalt, da virvlende platen vil føre til at cellene konsentrerer seg mot midten. Og la disse cellene feste og vokse i en standard cellekultur inkubator over natten.
Kontroller at cellene er festet før du endrer mediet. Når O9-1 cellene når 80% samløpet, tine kjelleren membran matrise og forberede en kjeller membran matrise belagt plate som beskrevet tidligere. Deretter legger basal media supplert med LIF og BFGF til membranmatrisen.
Skyll brønnene forsiktig med 2 ml DPBS to ganger. Deretter dissosier cellene med 1 ml 0,05% trypsin EDTA ved 37 grader Celsius i tre minutter. Nøytraliser trypsinen med like mye DMEM med 10% FBS ved gjentatte ganger å pipes væsken over hele overflaten av brønnen.
Deretter overfører du celleløsningen til et sentrifugerør. Og sentrifuge i tre minutter ved 180 Gs.Aspirer supernatent uten å forstyrre pellet av celler. Deretter, resuspend cellen pellet ved forsiktig pippetting betinget basal media supplert med LIF og BFGF.
Seed cellene til den belagte platen som tidligere beskrevet. Deretter lar cellene feste og vokse i en standard cellekultur inkubator. Først forberede 2X frysing media i henhold til tekstprotokollen.
Deretter filtrerer du på mediet. Skyll veggene på platen med DPBS to ganger, pipettering forsiktig for å unngå å miste celler. Deretter dissosiere cellene med 0,05% trypsin EDTA ved 37 grader Celsius i tre minutter.
Nøytraliser trypsinen med like mye 10% FBS og DMEM. Overfør innholdet i platen til et sentrifugerør, og sentrifuge i tre minutter ved 180 Gs.Deretter aspirerer den overnaturlige og legger til 2 ml PBS for å gjenopplive pelleten. Sentrifuger celleløsningen igjen og aspirer den overnatur.
Juster mengden basalmedier i røret etter behov, og legg til like mye 2x frysemedier. Deretter overfører du cellene til de merkede kryobrendene. Plasser kryohettebrene inne i en polystyrenboks med et lokk for å oppnå en langsom kjølehastighet ved 80 grader Celsius i minst 24 timer.
For å utføre SIRNA knockdown i O9-1 celler, gjenopprette og så cellene. Fortynn liposomer i et passende volum serumfritt medium. Deretter fortynner SIRNA i serumfritt medium i henhold til tekstprotokollen.
Etter dette legger du til den fortynnede SIRNA til de fortynnede liposomer, i henhold til produsentens instruksjoner. Bland løsningen ved pipettering, og inkuber i fem minutter ved romtemperatur. Deretter legger du til et passende volum av SIRNA lipidkompleks til cellene.
Deretter inkubere cellene i 24 timer i en standard cellekultur inkubator. O9-1-celler kan differensiere til forskjellige celletyper under spesifikke differensieringskulturforhold. For å skille O9-1-celler til osteoplaster, lag osteogen differensieringsmedier i henhold til tekstprotokollen.
Til slutt, oppdage osteoplast markør osteocalcin i differensierte osteoplaster ved immuno farging. For å skille O9-1 celler i glatte muskelceller, kultur dem under differensiering media i henhold til tekstprotokollen, og vurdere differensiering av glatt-muskel actin immuno farging. I denne protokollen ble både knock out og knock down eksperiment for å studere Yap tap av funksjon i O9-1 celler utført.
Under glatt muskel celle differensiering forhold, de fleste vill type O9-1 celler ga opphav til glatt muskel handlingi positive glatte muskelceller. Yap null celler men generelt ikke klarte å skille seg inn SMA positive glatte muskelceller. Dette indikerer at Yap spiller en kritisk rolle i differensieringen av nevrale crest celler i glatte muskelceller.
Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å håndtere O9-1 cellelinjen forsiktig og forsiktig under hele prosessen. Pass på å fortynne og bruke basalmembranmatrisen riktig, og bruk 0,05% trypsin for celledissosiasjon. Ikke glem at under forberedelsen til O9-1 cellekultur, arbeide med mitomycin c kan være ekstremt farlig, og forholdsregler som iført en lab frakk og hansker bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.
Related Videos
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE