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Genetics

O9-1 神经嵴细胞的培养与调控

Published: October 9, 2018 doi: 10.3791/58346
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern California

ERRATUM NOTICE

Summary

O9-1 是一种有多向的小鼠神经嵴细胞系。在这里, 我们描述了 O9-1 细胞培养的详细的分步协议, 将 O9-1 细胞分化为特定的细胞类型, 利用 siRNA 介导的击倒或 CRISPR-Cas9 基因组编辑基因操作 O9-1 细胞。

Abstract

神经嵴细胞 (净捐助国) 是迁移多能干细胞, 可分化成不同的细胞类型, 并产生多个组织和器官。O9-1 细胞系来源于内源性小鼠胚胎净捐助国, 并维持其多向分化潜能。然而, 在特定的培养条件下, O9-1 细胞可以分化为不同的细胞类型, 并在广泛的研究应用中加以利用。近年来, 结合小鼠研究和 O9-1 细胞研究表明, 河马信号通路效应在神经嵴源性颅颌面部发育中起着重要作用。虽然 O9-1 细胞的培养过程比其他细胞系更复杂, O9-1 细胞系是研究净捐助国体外的有力模型。在这里, 我们提出了培养 O9-1 细胞系的协议, 以维持其 stemness, 以及将 O9-1 细胞分化为不同细胞类型的协议, 如平滑肌细胞和成骨细胞。此外, 还介绍了使用 CRISPR-Cas9 删除和小干扰 RNA 介导的 O9-1 细胞进行基因功能损失研究的协议。

Introduction

神经嵴细胞 (净捐助国) 是在胚胎发育过程中具有显著的迁移能力和瞬态存在的多能茎样细胞。净捐助国起源于表面外胚层和神经管之间, 在胚胎发育期间迁移到胚胎的其他部位1。根据其功能领域, 净捐助国可以分为几种不同类型, 包括颅, 躯干, 迷走神经, 骶, 心脏净捐助国。此外, 净捐助国可以分化为多个细胞血统, 如平滑肌细胞, 骨骼细胞和神经元, 并产生各种组织2,3。净捐助国的发展特点是一系列复杂的形态发生事件, 由各种分子信号微调。鉴于净捐助国的复杂调控及其对众多结构的重要贡献, 失调的发展通常会导致先天性出生缺陷, 占人类先天性出生缺陷的近30%。畸形在神经嵴发育期间可能导致唇腭裂, 有缺陷的鼻子形成, 症状, 缺陷, 如有缺陷的心脏流出道, 甚至婴儿死亡率1,4,5,6,7. 了解协调发展的分子机制对于发展发展中的缺陷所造成的疾病治疗非常重要。使用不同的体外和体内方法8,9,10,11,12,13,14 ,15, 在协调研究所的研究方面取得了相当大的进展。在体内, 动物模型, 包括鸡, 两栖动物, 斑马鱼和老鼠, 已经被用来调查净捐助国1。此外, 人类胚胎已经被用来研究16早期人类胚胎发育过程中的 NCC 迁移。在体外, 净捐助国的细胞模型, 如源于病人皮下脂肪的人净捐助国, 已经被用来调查帕金森氏病17。O9-1, 最初来源于从 E8.5 小鼠胚胎中分离出来的内源净捐助国的大量培养,是研究净捐助国的强大细胞模型. 重要的是, 在不区分的文化条件下, O9-1 细胞是多能茎状净捐助国。然而, 在不同的培养条件下, O9-1 细胞可以分化为可分辨的细胞类型, 如平滑肌细胞、成骨细胞、软骨细胞和胶质干细胞18。鉴于这些特性, O9-1 细胞已广泛用于与协调相关的研究, 如调查颅面部缺损的分子机制19,20。

在这里, 提供了详细的协议, 以维持 O9-1 细胞, 区分 O9-1 细胞成不同的细胞类型, 并操纵 O9-1 细胞通过执行基因丧失功能的研究与 CRISPR-Cas9 基因组编辑和小干扰 RNA (siRNA)-介导的击倒技术。作为一个典型的例子, 描述了利用 O9-1 细胞研究狂吠和狂暴损失的功能。狂吠和狂暴是河马信号通路的下游效应, 在细胞增殖、分化和凋亡中起着至关重要的作用。河马通路也被证明是重要的发展和稳态的几个不同的组织和器官, 以及在不同疾病的发病机制20,21,22,23 ,24,25,26,27,28。河马信号的核心成分包括肿瘤抑制不育20样激酶 Mst1/2, WW 领域的萨尔瓦多支架蛋白, 和大肿瘤抑制同源 (Lats1/2) 激酶。河马信号抑制狂吠和狂暴活动, 并促进它们在细胞质中的降解。如果没有河马的压迫, 狂吠和植物常常将就可以进入细胞核, 并作为转录的共同激活剂发挥作用。我们最近表明, 特别是在小鼠净捐助国中, 使用Wnt1和Wnt1Cre2SOR 驱动程序, 以严重的 E10.5 导致胚胎致死, 从而使河马信号效应器狂吠和颅面缺损20。我们还进行了研究使用 O9-1 细胞来调查吠和净捐助国的作用。为了研究 O9-1 细胞在增殖和分化中的狂吠和 vap 功能, 利用 siRNA, 用 CRISPR-Cas9 基因组编辑的方法生成了吠击和狂暴细胞。同样的基因失功能策略可以应用于其他途径中的不同靶基因。此外, 功能增益的研究和转染检测也可以应用于 O9-1 细胞来研究基因功能和调控。本文所描述的协议旨在被研究者用来作为培养 O9-1 细胞的指南, 以维持多种 stemness, 在不同的培养条件下将 O9-1 细胞分化为其他细胞类型, 并研究基因功能和净捐助国的分子机制。

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Protocol

1. O9-1 细胞培养前的准备工作

注: 用于 O9-1 细胞培养的基底培养基必须受 Sandos 近交系小鼠硫鸟嘌呤/哇抗性小鼠成纤维细胞的制约;因此, 在开始 O9-1 细胞培养之前, 需要按照下面的描述来获得和准备细胞。

  1. 活跃的细胞培养
    1. 用7% 胎牛血清 (Dulbecco) (胚胎干细胞培养级)、100毫升青霉素、100µg/毫升链霉素和2毫米 l-谷氨酰胺 (最终浓度) 制作完整的修饰鹰的培养基 (DMEM), 准备培养基培养活性细胞。被表明)。
      注: 使用停用培养基用于培养活动的停送器细胞。青霉素、链霉素和 l-谷氨酰胺可在贮藏中形成沉淀;使用前完全溶解吹打。
    2. 在室温下涂上标准的100毫米细胞培养板, 0.1% 明胶为30分钟。孵化期后, 吸出额外的明胶。涂层后立即使用钢板。
      注: 另一种方法是, 用保持介质覆盖板, 并将盘子放在一个加湿的孵化器中, 以避免板材干燥 (这仅用于短期贮存, 而不用于储存预涂板)。
    3. 在37°c 的水浴中迅速解冻细胞;在打开前用70% 乙醇擦拭 cryovial, 并立即将整瓶细胞转移到离心管上。
    4. 将停用介质滴入离心管;细胞与介质的体积比例为1:10。
    5. 离心细胞在 180 x g 3 分钟的 RT。
    6. 通过温和的吹打和转移细胞到明胶涂层的板混合。
    7. 允许在标准孵化器 (37 摄氏度, 5% CO2) 中为24小时的细胞生长。
    8. 在播种并丢弃旧培养基后, 改变培养基 (仅在细胞粘附后) 24 小时。
    9. 每天在显微镜下检查并通过80% 融合的细胞。
      1. 在开始传代细胞前, 0.1% 明胶 (明胶容积等于该容器的生长培养基体积的一半) 在室温下为30分钟。
      2. 通过细胞, 吸入生长培养基和洗涤细胞与磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 两次 (增加 PBS 在同等数量的生长培养基)。
      3. 吸入 PBS 并添加0.25% 胰蛋白酶-EDTA (根据容器大小调整体积);然后, 在37摄氏度孵育5分钟。
        注: 对于100毫米板, 使用10毫升的生长培养基和3毫升的胰蛋白酶溶液。对于150毫米板, 使用20毫升的生长培养基和8毫升的胰蛋白酶溶液。所用的洗涤缓冲器体积等于生长介质的体积。
      4. 不灭活胰蛋白酶与相同数量的停用介质。种子将细胞放到新的板块上, 比例从1:3 到1:10。
        注: 一个共同的扩展方案是从一个 cryovial 扩展到一个100毫米板, 然后到一个150毫米板, 然后到四150毫米板, 最后到 16 150 毫米板。
  2. 停用细胞的灭活与冷冻
    1. 为准备2x 冷冻介质, 将以下内容添加到停用介质中 (最后浓度表示): 20%, 20% 二甲基亚砜 (亚砜)。
    2. 混合后, 过滤器杀菌2x 冷冻介质 (孔径0.22 µm), 并存储在4°c, 直到使用。使2x 冷冻介质同一天使用并丢弃未使用的冷冻介质。
    3. 在 PBS 中制备丝裂霉素 C 溶液, 浓度为0.5 毫克/毫升。要在 PBS 中溶解丝裂霉素 C, 将瓶子放在一个 vortexer 上, 在一个低设置的漩涡上放上大约45分钟, 完全溶解微粒。
      注: 丝裂霉素 C 轻敏感, 不易溶解。
      注意: 丝裂霉素 C 具有剧毒, 可能引起癌症。仅处理适当的个人防护设备。
    4. 通过将0.01 毫克/毫升丝裂霉素 C 的最终浓度添加到现有介质中, 禁用停用细胞。在标准孵化器内孵育2小时 (37 摄氏度, 5% CO2)。
    5. 用丝裂霉素 C 在失活后两次洗涤板 (150 毫米) 与20毫升 PBS。
    6. 吸入 PBS 溶液, 分离细胞通过使用8毫升0.25% 胰蛋白酶-EDTA, 并孵化5分钟内标准湿化孵化器 (37 °c, 5% CO2)。
    7. 禁用胰蛋白酶与8毫升的停用介质。
    8. 把细胞溶液转移到离心管上。将多个板块组合成一个离心管以节省时间。离心机为5分钟, 在 180 x g。
    9. 在5毫升 PBS 中吸入上清和并用重悬细胞颗粒。
    10. 使用10µL 的细胞解决方案, 通过使用 hemocytometer 来计数细胞。计算中心网格化正方形中的单元格数, 并将获得的数字乘以 104 , 以确定每1毫升的细胞数。对两个数字进行两次计数, 以获得每毫升细胞数的最终估计值。
    11. 离心细胞为5分钟, 在 180 x g。
    12. 吸入 PBS, 并添加 1:1 (按体积) 储存介质和2x 冷冻介质到细胞颗粒。调整体积为最终细胞浓度为 4 x 106细胞/毫升 (这个数量是好的一个100毫米板)。
      注: 例如, 从四150毫米的板上产生总共 60 x 106个细胞, 每 cryovial 冻结 4 x 106个细胞, 每个 cryovial 包含1毫升细胞溶液。四个板材屈服大约 15 cryovials (60/4 = 15)。添加7.5 毫升的储存介质和7.5 毫升的2x 冷冻介质到细胞颗粒, 并用重悬, 和整除1毫升进入每个 cryovial。
    13. 并用重悬通过缓慢吹打冷冻介质与细胞颗粒。将1毫升的细胞溶液转移到每个 cryovial 并相应地标注。
    14. 将 cryovials 放在盖聚苯乙烯盒内 (这提供了缓慢的冷却速率, 从而改善了细胞的存活)。在将 cryovial 转移到液氮之前, 将盒子转移到-80 摄氏度的冰箱中至少24小时。
      注: 为了达到最佳效果, 请最小化单元计数时间, 以及将2x 冷冻介质添加到单元格和将小瓶转移到-80 摄氏度之间的时间。

2. O9-1 细胞培养

  1. 通过在 DMEM 中添加以下内容, 为 O9-1 细胞培养准备基底培养基 (最后浓度表示): 15% 血清, 0.1 毫米最低基本培养基 (内存) 不必要氨基酸, 1 毫米丙酮酸钠, 55 毫米β-巯基乙醇, 100 u/毫升青霉素, 100 u/毫升链霉素, 2 毫米 l-谷氨酰胺, 103单位/毫升白血病抑制因子 (LIF; 在使用前添加, 不添加到库存瓶), 25 ng/毫升成纤维细胞生长因子碱性 (bFGF; 在使用前添加, 不添加到库存瓶)。
  2. 过滤器杀菌的基础介质 (孔径0.22 µm) 和包装箔, 以防止光。
  3. 从灭活细胞中收集条件基底介质。
    注意: 仅在获得灭活的停用细胞后进行。从 O9-1 的基底培养基中采集的细胞, 以下简称为条件基底介质。
    1. 如上文所述, 迅速解冻灭活室细胞 (一 cryovial 包含 4 x 106细胞是好为一个100毫米板材和产量大约100毫升被适应的基本的媒介在10天以后收集)。种子灭活细胞到明胶涂层板通过使用停用介质。允许细胞在一夜之间附加标准的湿润的孵化器 (37 °c, 5% CO2)。
    2. 24 h 在解冻细胞后, 丢弃现有的停用介质, 并替换为基底介质。
      注: 请勿将 LIF 和 bFGF 添加到灭活细胞培养皿中;只添加到 O9-1 细胞培养皿。
    3. 每24小时, 通过使用 O9-1 基底介质来改变介质, 并将基底介质从储存皿中收集到瓶子里。将含有条件基底介质的瓶子包装在箔上以保护光线。将收集到的所有介质存储在摄氏4摄氏度。
      注: 由于细胞被灭活, 他们可能不会像他们在收集数天后表现得那样健康;这是意料之中的。
    4. 可以选择检查是否有污染, 收集每个收集日的基础介质, 用不同的管子 (而不是一个瓶子) 包裹在箔上。使用24井板, 每天将1毫升的介质放到每个井中, 在标准的孵化器中孵化一夜, 以检查显微镜下的细菌污染情况。
      注意: 如果没有污染, 介质仍然是红色的, 但如果存在细菌污染, 则会发生黄色的变化。
    5. 收集条件基底介质10天后, 丢弃细胞。结合 (如果适用) 所有收集的条件基底介质和过滤器消毒 (毛孔大小0.22 µm) 成无菌瓶。把瓶子裹在箔上以保护光线。将经过过滤的条件基底介质保持在4摄氏度, 最大值为一个月, 从过滤器日期。

3. 维护 O9-1 细胞

注: 工作 O9-1 基础媒体是过滤灭菌条件的基础媒体, LIF (最终浓度 103单位/毫升) 和 bFGF (最终浓度 25 ng/毫升) 在使用前立即添加到细胞培养皿中。此介质需要保护光, 并存储在4摄氏度。

  1. O9-1 细胞的恢复
    1. 慢慢解冻地下室膜基质 (如胶) 的储存瓶, 在4摄氏度过夜, 准备整除数。
    2. 添加5毫升的 DMEM 与10% 血清5毫升的库存基底膜基质膜。混合吹打与冷吸管提示存储在-20 摄氏度。把原来的瓶子和整除管放在冰上。根据实验需要, 在不同体积 (0.5 毫升或1毫升整除数) 中冻结整除数。避免多次冻融基底膜基质。
      注: 基底膜基质在室温下快速聚合;使用冷吸管提示和保持管冷时, 工作, 以避免无意聚合。
    3. 在开始实验前, 将基底膜基质的整除在4摄氏度或冰2小时解冻。不要将矩阵存储在4摄氏度, 延长时间。
    4. 使用过滤灭菌 DMEM 与10% 的血清稀释基底膜基质, 最终浓度为0.5 毫克/毫升, 以涂层的板材。涂层与基底膜基质 (0.5 毫克/毫升) 室温1小时, 确保它完全覆盖板 (如图 1所示)。
    5. 在吸气基底膜基质时倾斜板, 避免接触涂层表面;干燥板在37°c 30 分钟。不要过度干燥的涂层板。
      注: 仅当所有介质和试剂准备使用 (条件基底培养基, 无菌过滤 10% DMEM, LIF, 和 bFGF)。
    6. 将 cryovial 放在37摄氏度水浴中迅速恢复 O9-1 细胞;慢慢地旋转瓶子, 直到溶液完全变成液体, 然后立即进入下一步。
    7. 将所有细胞溶液从 cryovial (大约1毫升) 转移到15毫升离心管。添加5卷的 DMEM 与10% 的血清 (过滤器的过滤孔大小0.22 µm) 和并用重悬。
    8. 离心机为3分钟, 在 180 x g。在不干扰细胞颗粒的情况下吸入上清液。并用重悬细胞颗粒 (通过攻丝) 在条件基底培养基中辅以 LIF 和 bFGF。使用 hemocytometer 计数单元格。
      注: 条件基底培养基辅以 LIF 和 bFGF 是维持 O9-1 细胞系多向分化潜能的关键。使用小心添加正确的媒体, 以避免意外的细胞分化。
    9. 种子细胞从1万到1.5万细胞/厘米2到6井板。允许细胞在一个标准细胞培养孵化器 (37 °c, 5% CO2) 在改变媒体之前过夜。
    10. 确保在继续更改媒体之前附加单元格 (健康的附加单元格类似于图 2所示)。
    11. 在 O9-1 细胞恢复后的第二天, 总要改变培养基 (使用条件基本培养基辅以 LIF 和 bFGF)。
  2. O9-1 细胞通道
    1. 当 O9-1 细胞达到80% 融合, 解冻基底膜基质, 并准备一个基底膜基质涂层板, 如上文所述。添加条件基底培养基辅以 LIF 和 bFGF 的船只。另外, 在不超过3天的情况下, 添加 DMEM, 使基底膜基质不干燥, 贮存在标准的湿式恒温箱内。
    2. 用2毫升的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 冲洗 O9-1-containing 井 (6 井板), 并轻轻吸管以避免失去细胞。
    3. 离解细胞与1毫升0.05% 胰蛋白酶-EDTA 在37°c 为3分钟中和胰蛋白酶与相等数量的 DMEM 与10% 个血清。反复在井的整个表面上吸液, 将尽可能多的细胞从盘子中分离出来。
      注: 胰蛋白酶浓度为0.05% 而非0.25%。使用 DPBS 稀释的股票瓶。
    4. 避免产生气泡时, 游离细胞从板块。
    5. 将所有细胞溶液转移到离心管和离心机上, 在 180 x g处3分钟。在不干扰细胞颗粒的情况下吸入上清液。并用重悬在离心管中用温和吹打的细胞颗粒, 辅以 LIF 和 bFGF。
    6. 使用 hemocytometer 计算上面所述的总单元格数。种子细胞 (1万到1.5万细胞/cm2) 的涂层板准备如步骤3.1.4 到3.1.8。6井板的一个井需要10万个细胞来播种。
    7. 允许细胞附加和生长在标准细胞培养孵化器 (37 °c, 5% CO2)。在传代 O9-1 细胞之后的第二天, 总是改变文化媒体。
  3. O9-1 细胞的冷冻
    1. 为 O9-1 细胞准备2x 冷冻介质, 稀释以下 DMEM (最后浓度): 40% 血清和20% 亚砜。
    2. 过滤器杀菌2x 冷冻介质, 保持4摄氏度。2x 冷冻介质必须在使用当天进行。丢弃所有未使用的冻结介质。
      注: 冷冻 O9-1 细胞在80% 融合。
    3. 用 DPBS 冲洗水井两次;轻轻吸管以避免失去细胞。
    4. 分离细胞与0.05% 胰蛋白酶-EDTA 在37°c 为3分钟, 然后中和的胰蛋白酶与等量的10% 血清在 DMEM。反复在井的整个表面上吸液, 将尽可能多的细胞从盘子中分离出来。
    5. 将所有板块的内容转移到离心管和离心机上, 在 180 x g处3分钟。吸入上清, 并添加2毫升的 PBS 和并用重悬通过攻丝。
    6. 使用10µL 的细胞解决方案来计数细胞通过使用 hemocytometer 如上所述。
    7. 离心细胞溶液3分钟在 180 x g。吸上清液并调整所需的基底介质量;然后, 添加相同数量的2x 冻结介质。
      注意: 细胞被冷冻在浓度为 1 x 106细胞/毫升 (1 毫升每 cryovial)。
    8. 将单元格转换为 cryovials 并相应地标记。将 cryovials 放在盖聚苯乙烯盒内, 冷却速度在-80 摄氏度, 至少24小时, 然后再转到液氮。
      注: 为达到最佳效果, 请尽量减少单元计数时间和添加2x 冷冻介质和将瓶子转移到-80 摄氏度之间的时间。

4. O9-1 细胞的操纵

  1. 在 O9-1 细胞中执行 siRNA 击倒
    1. 在开始实验前, 用基底膜基质解冻并涂上24井板 (步骤 3.1. 4–3.1 8)。恢复和种子 O9-1 细胞, 使其生长到60% 至80% 融合。
    2. 根据适当的容积, 在无血清介质中稀释脂质体。稀释 siRNA 在无血清培养基到决赛。添加稀释的 siRNA 稀释脂质体的比例, 由制造商推荐。混合吹打和孵化。
      注: 按照制造商的指南对所用的体积、时间和温度进行孵化。
    3. 根据制造商的建议, 在细胞中添加适当体积的 siRNA 脂复合物。
    4. 在标准细胞培养孵化器 (37 °c, 5% CO2) 孵化细胞为24小时。根据需要执行下游步骤 (提取 RNA, 提取蛋白质, 染色等)
      注: siRNA 击倒时间和浓度可能因个别实验而异。
  2. CRISPR-Cas9 基因组编辑在 O9-1 细胞基因敲除中的应用
    注: 参考先前发布的用于哺乳动物细胞29行中 CRISPR-Cas9 的协议。这里提供了 CRISPR-Cas9 基因组编辑和相关步骤的简化描述。
    1. 使用 sgRNA 设计工具获取 sgRNA 序列。
    2. 结扎 sgRNA 到 pSpCas9 (bb)-2 a-GFP 向量30。
    3. 根据制造商的建议, 使用标准的 lipofection 协议染 O9-1 细胞与载体。
    4. 孵化细胞在标准细胞培养孵化器在37°c 与 5% CO2为 24 h。
    5. 基于 GFP/7-AAD 进行荧光活化细胞分选。种子 GFP + 单细胞成96井板。
    6. 在孵化器中增加4天的细胞。丢弃所有有多个菌落的水井。
    7. 使用用于检测删除的底漆进行 PCR。pcr 后, 在琼脂糖凝胶上运行 pcr 产品, 以评估带的大小。通过使用 CRISPR-Cas9 editingby 执行西方印迹来验证挖空效率 (如图 3所示)。

5. O9-1 细胞分化

  1. O9-1 细胞分化成骨细胞的研究
    1. 为制备成骨分化培养基, 在阿尔法中稀释以下 (最终浓度): 0.1 毫米地塞米松, 100 ng/毫升骨形态发生蛋白 2 (BMP2), 50 µg/毫升抗坏血酸, 10 毫米 b-甘油, 10% 血清, 100 U/毫升青霉素和100毫克/毫升链霉素。
    2. 用染色测定成骨细胞中成骨素的标记, 骨钙素, 如图 4所示。
      注: 对成骨细胞的分化也可以用其他标志物或茜素红染色或碱性磷酸酶染色来评价。
  2. O9-1 细胞分化为细胞的研究
    1. 制备软骨细胞分化培养基, 稀释以下在阿尔法 (最终浓度表明): 5% 胎小牛血清 (FCS), 1% 胰岛素-转铁蛋白-硒 (其), 100 U/毫升青霉素, 100 毫克/毫升链霉素, 10 ng/毫升转化生长因子β (TGF-b3), 50 毫克/毫升抗坏血酸, 10 ng/毫升 BMP2, 0.1 毫米地塞米松, 1 毫米丙酮酸钠。
    2. 第一种培养一层 O9-1 细胞, 其成骨介质为3天, 然后胰蛋白酶处理和培养为 micromass 型, 在软骨分化介质中增加7天。
    3. 驴软骨分化与阿利新蓝染色或软骨细胞标记。
  3. O9-1 细胞分化为平滑肌细胞的研究
    1. 为制备平滑肌细胞分化培养基, 稀释以下 DMEM (最终浓度): 100 毫升青霉素, 100 µg/毫升链霉素, 10% 血清。
    2. 用抗体对平滑肌细胞的标记, 如平滑肌肌动蛋白 (SMA) 进行免疫荧光染色, 在图 5中以此为例, 研究了肌肉细胞的平滑分化。
  4. O9-1 细胞分化为胶质细胞的研究
    1. 制备胶质细胞分化培养基, 稀释以下 DMEM/F12 (最终浓度): 1x B-27 补充剂, 2 毫米 l-谷氨酰胺, 50 ng/毫升 BMP2, 100 毫升青霉素, 100 毫克/毫升链霉素, 50 ng/毫升, 和1% 热灭活血清。
    2. 通过对胶质细胞标记物 (如脂肪酸结合蛋白 7 (FABP7)) 进行免疫荧光染色, 评价胶质细胞的分化。

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Representative Results

我们的击倒和敲除实验的目的是研究狂吠和 O9-1 细胞功能丧失的影响。在击倒和挖空实验之前, 我们必须确保为基础培养基和培养 O9-1 细胞做准备, 如上文所述 (例如, 基底膜基质需要覆盖整个板块, 如图 1所示, O9-1 细胞恢复从液氮, 如图 2所示)。我们执行了上面所述的击倒实验, 其中狂吠和。同样数量的狂吠siRNA 和 siRNA 被添加到最终数量的制造商建议。对控制板, 增加了 nontargeting siRNA 的等量体积。

通过使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑, 如王等所描述的, 通过删除 O9-1 的外显子3来生成狂吠-空的细胞系。20. 我们使用 CRISPR-Cas9 基因组编辑的方法进行了击倒实验, 如上文所述和王等。20. 我们使用以下 sgRNA 序列, 两侧外显子3的狂吠: 5′-caccgtggattacgtgggtatgtt-3′ (sgRNA1-forward), 5′ aaacaacatacccacgtaatccac-3 (sgRNA1-reverse), 5′-caccgagatggtctaatgtagtga-3′ (sgRNA2-forward), 5′-aaactcactacattagaccatctc-3 (sgRNA2-reverse)

CACC 被添加到前链, AAAC 被添加到反向链。g 在前链的 5 ' 末端被增加了, 因为寡核苷酸没有从 G 开始, 并且 C 被增加了到反向链的 3 ' 末端。在 CRISPR-Cas9 基因组编辑步骤上面描述和在王等。20、细胞在条件基底培养基为 O9-1 细胞补充与 LIF 和 bFGF, 以避免不必要的分化。以下 PCR 引物用于检测狂吠删除: 5′-AAAACAGTCTCCACTACCCCTT-3′ (向前) 和 5′ GGCCATCATAGATCCTGGACG 3′ (反转)。sgRNAs 的位置从基 #7973399 到小鼠9号染色体上的 #7974433。PCR 底漆在染色体上的位置是从基 #7973306 到 #7974478。pcr 后, 在琼脂糖凝胶上以 138-bp 带为外显子3删除了吠击的 pcr 带;野生型狂吠作为 1173 bp 波段出现。使用 CRISPR-Cas9 基因组编辑的方法验证了吠击的效率, 如图 3所示。

如上文所述, O9-1 细胞可以在特定的分化诱导培养基中培养, 以促进分化为特定的细胞类型。对分化的评价可以采用多种方法进行, 如定量 PCR 或染色特定细胞标记。例如, 图 4显示了 O9-1 细胞在成骨细胞诱导的培养基中培养并分化成成骨体, 染色细胞用抗体对骨钙素 (Ocn, 成骨细胞标记) 进行评价。结合上述基因击倒和敲除实验, O9-1 细胞可广泛用于基因功能研究和表型分析。以染色细胞为例, 用平滑肌肌动蛋白 (SMA、平滑肌细胞标记) 对 O9-1 细胞进行了细胞分化, 并对其进行了评价。大多数野生型 O9-1 细胞产生了 sma-正平滑肌细胞 (图 5A), 而狂吠-空 O9-1 细胞未能分化为 sma-正平滑肌细胞 (图 5B), 这表明, 狂吠扮演一个关键的净捐助国分化为平滑肌细胞的作用。

Figure 1
图 1: 胶完全覆盖35毫米板.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 从液氮中恢复后的 O9-1 细胞24小时.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 使用 CRISPR-Cas9 基因组编辑的西方印迹数据显示 O9-1 细胞中狂吠的有效剔除 (高).野生型。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 成骨细胞标记骨钙素 (Ocn) 的免疫荧光染色, 表明 O9-1 细胞在成骨分化条件下产生成骨干细胞.细胞以成骨细胞标记 Ocn 抗体 (绿色) 染色, 细胞核染色 DAPI (蓝色)。箭头表示 Ocn 阳性细胞。骨钙素 (Ocn, 成骨细胞标记);DAPI (6-diamidino-2-苯基吲哚)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5.平滑肌肌动蛋白 (SMA) 的免疫荧光染色表明, 在平滑肌细胞分化条件下, 大多数野生型 O9-1 细胞产生平滑肌细胞 (A), 而狂吠-空 O9-1 细胞未能分化成平滑肌细胞 (B)。细胞以 SMA 抗体 (红色) 染色, 细胞核染色 DAPI (蓝色)。箭头表示 SMA 阳性细胞。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

在胚胎形态发生过程中, 该协调器是不同组织和器官的多功能和关键贡献者。O9-1 细胞系保持其分化为多种不同细胞类型的潜能, 模仿净捐助国的体内特征, 使其成为研究净捐助国基因功能和分子调控的一种有用的体外工具。O9-1 细胞的不同状态可能对应于不同的神经嵴子代在体内, 取决于 O9-1 细胞的培养条件。在不区分培养条件下培养的 O9-1 细胞可以保持在多能态, 类似于常规干细胞培养。非分化 O9-1 细胞在体内可能与前移和迁徙多能茎样净捐助国相对应。此外, O9-1 细胞在特异分化培养条件下可分化为多种不同的细胞类型, 这是研究多能茎净捐助国分化过程中基因功能和调控的重要优势。细胞转化为特定的分化细胞类型。分化 O9-1 细胞可能对应于后移神经嵴后代在体内, 有一个不同的细胞命运分化成各种细胞类型。根据研究兴趣 , O9 - 1 细胞可以作和培养不同 , 以补充在体内的研究与动物模型。

有多种方法来操作 O9-1 细胞来研究 NCC 事件, 包括基因丧失功能和功能增益。在这里, 举例说明了 siRNA 击倒和 CRISPR-Cas 9 基因编辑实验是在 O9-1 细胞进行的河马路径效应器狂吠功能损失研究20。通过对小鼠模型和 O9-1 细胞的联合应用, 我们的研究表明, 狂吠在调节20的平滑肌细胞增殖和分化方面起着至关重要的作用。其他研究在不同的模型也表明了一个重要的作用, 狂吠在净捐助国. 表明了小鼠神经嵴平滑肌分化31的需要和提高人类的命运和迁移32。此外, 狂吠是表达在早期的爪蟾发展33。O9-1 细胞基因击倒和挖空的效率, 结合其他下游分子技术的方便, 如定量 PCR (qPCR), 西方印迹, 和染色支持 O9-1 细胞系是一个很好的可以很容易地在体外操作的模型。除了我们在上面和之前20所描述的功能损失研究之外, O9-1 细胞的其他各种应用也被描述为研究净捐助国. O9-1 细胞可作为实验的有效替代品, 需要组织量相对较大, 如染色质免疫沉淀测序 (芯片序列)。然而, 许多体内细胞事件, 如 NCC 的迁移依赖于复杂的组织对组织的相互作用, 所以还不清楚 O9-1 细胞如何能够准确地模仿在体内的迁移。由于 O9-1 细胞体外研究的局限性, 建议使用动物模型对 O9-1 细胞在体内的观察进行验证。

O9-1 细胞系在体外研究净捐助国时, 维持细胞在常规培养过程中的多向分化潜能是至关重要的。O9-1 细胞的多向分化潜能可以通过对 AP-2a 和 Sox9 等基因表达的评价, 在培养初期进行检测。同样, O9-1 细胞的分化能力可以通过将它们区分为特定的细胞类型来进行测试。为了避免在常规培养 O9-1 细胞过程中产生不必要的分化, 实验程序必须按照此处所述的既定协议进行。仔细的准备条件基底培养基和新鲜添加正确浓度的 LIF 和 bFGF 是至关重要的维持多向分化潜能的 O9-1 细胞。此外, 实验时间线需要仔细规划, 因为培养 O9-1 细胞需要首先准备不活跃的饲养室细胞和收集条件的基础媒体, 这是一个只有大约一个月的好。以往的研究表明, 基底膜基质对维持肌肉和神经前体细胞分化潜能, 以及间充质干细胞34、35、36具有重要意义。在这里描述的协议的背景下, 基底膜基质提供了一个平台, O9-1 细胞附加和帮助保持分化潜能。因此, 基底膜基质是影响实验结果和重复性的重要因素。建议严格按照上述协议制备基底膜基质, 避免基底膜基质的多次冻融循环。此外, 当从冷冻状态恢复 O9-1 细胞到培养时, 需要快速完成将细胞从液氮转移到37摄氏度水浴的过程, 在整个过程中避免任何涡流。此外, 还需要避免 O9-1 细胞过度生长, 以维持 O9-1 细胞的多向分化潜能。当传代 O9-1 细胞时, 确保胰蛋白酶浓度被稀释到0.05% 而不是 0.25%, 并且细胞看起来是正确的离解。重复吹打非常温和, 以实现单细胞悬浮是必要的, 以避免形成聚集细胞。一般而言, 处理 O9-1 细胞线的整个过程需要轻轻而小心地完成。

总之, O9-1 细胞系是一个非常有用的工具, 研究净捐助国的体外, 特别是当作为一种补充的方法,在体内研究的净捐助国. O9-1 细胞具有明显的优势, 如可以方便地访问它们和轻松可以为实验获得足够的细胞数。考虑到 O9-1 细胞的分化能力, 它们在各种研究领域具有很大的应用潜力。O9-1 细胞可以方便地用于快速药物检测和筛选, 芯片序列, transposase 可接触染色质的高通量测序 (ATAC) 和 rna 排序 (rna 序), 基因增益的功能和丧失功能研究, 以及信号调控研究。使用标准化和完整的处理 O9-1 细胞的协议将有助于重复使用它们的研究。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

在德克萨斯心脏研究所的科学刊物上, 妮可. 伊尔克什坦博士提供了编辑支持。我们还感谢以下资金来源: 美国心脏协会的国家中心科学家发展补助金 (14SDG19840000), 2014 劳伦斯研究奖从 Rolanette 和 Berdon 劳伦斯骨骼疾病计划得克萨斯 (到 j. 王) 和国立卫生研究院 (DE026561 和 DE025873 到 j. 王, DE016320 和 DE019650 到 r 马克松)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active STO feeder cells ATCC ATCC CRL-1503 Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell line Millipore Sigma SCC049
DMEM, high glucose, no glutamine Gibco 11960-044
DMEM, high glucose Hyclone SH30243.01
FBS (fetal bovine serum) Millipore Sigma ES-009-B
Penicillin - streptomycin Gibco 15140-122
L-glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-081
Gelatin from porcine skin Sigma G1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS Genesee Scientific 25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium Lonza 17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100Xx Gibco 11140-050
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
2-Mercaptoethanol Sigma M-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mL Millipore Sigma ESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) R&D Systems 233-FB-025
Mitomycin C Roche 10107409001
Matrigel matrix Corning 356234
DMSO (dimethylsulfoxide) Millipore Sigma MX1458-6
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778-075
Opti-MEM I (1x) Gibco 31985-070
Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine Corning 10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA Dharmacon L-041057
ON-TARGETplus Non-targeting Pool Dharmacon D-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNA Dharmacon L-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium)
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement

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References

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Tags

遗传学 问题 140 CRISPR Cas9 O9-1 细胞 基因敲除 基因击倒 神经嵴细胞

Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

O9-1 神经嵴细胞的培养与调控
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Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. … More

Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. J. Vis. Exp. (140), e58346, doi:10.3791/58346 (2018).

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