Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Kliniska protokoll för att producera fettvävnad-Derived Stromal vaskulär bråkdel för potentiella brosk regenerering

Published: September 29, 2018 doi: 10.3791/58363
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 2, 2, 2, 2
1Mipro Medical Clinic, 2National Leading Research Laboratory, Department of Biological Sciences, Myongji University
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att producera en fettvävnad-derived stromal vaskulär fraktion och dess tillämpning på förbättra knä funktioner genom att regenerera brosk-liknande vävnad hos patienter med artros.

Abstract

Osteoartrit (OA) är en av de vanligaste försvagande sjukdomar. Nyligen, har det gjorts många försök att förbättra funktionerna i knäna med hjälp av olika former av mesenkymala stamceller (MSC). I Korea, benmärgen koncentrat och sladd har blod-derived stamceller godkänts av Korean Food and Drug Administration (KFDA) för brosk regenerering. Dessutom har en fettvävnad-derived stromal vaskulär bråkdel (SVF) tillåtits av KFDA för gemensamma injektioner hos patienter. Autologa fettvävnad-derived SVF innehåller extracellulär matrix (ECM) förutom mesenkymala stamceller. ECM utsöndrar olika cytokiner som, tillsammans med hyaluronsyra (HA) och trombocyter-rich plasma (PRP) aktiveras av kalciumklorid, kan hjälpa MSCs att regenerera brosk och förbättra knä funktioner. I denna artikel presenterade vi ett protokoll för att förbättra knä funktioner genom att regenerera brosk-liknande vävnad hos patienter med Artros. Resultatet av protokollet först rapporterades 2011 följt av några ytterligare publikationer. Protokollet innebär fettsugning för att erhålla autologa lipoaspirates som blandas med kollagenas. Denna lipoaspirates-kollagenas blandning sedan skärs och homogeniseras för att ta bort stora fibrös vävnad som kan täppa upp nålen under injektionen. Efteråt, inkuberas blandningen för att få fettvävnad-derived SVF. Den resulterande fettvävnad-derived SVF, som innehåller både fettvävnad-derived MSCs och resterna av ECM, injiceras i knäna av patienter, i kombination med HA och kalciumklorid aktiveras PRP. Här ingår tre fall av patienter som behandlades med våra protokoll som leder till förbättring av knäsmärta, svullnad och rörelseomfång tillsammans med MRI bevisning Hyalint brosk-liknande vävnad.

Introduction

Mesenkymala stamceller (MSC) är kända för att ha förmåga att regenerera brosk1,2,3,4,5,6. De lätt kan erhållas från olika källor: benmärg, navelsträngsblod och fettvävnad bland många andra. Bland dessa källor är fettvävnad den enda källan där ett tillräckligt antal MSCs kan erhållas utan någon kultur utvidgning att regenerera brosk i kliniska inställningar7,8. Autolog benmärg stromal vaskulär bråkdel (SVF) kan lätt erhållas samt. Antalet stamceller som finns i icke-kultur utökat benmärg är dock mycket låg7,8. Navelsträngsblod kan innehålla ett tillräckligt antal MSCs. Navelsträngsblod är dock inte en lättillgänglig källa av autologa SVF.

Det finns många metoder av bearbetning fettvävnad att erhålla SVF för kliniska tillämpningar. Bland dessa, metoden för att få MSCs från adipose vävnad med kollagenas, utvecklat och bekräftas av Zuk o.a. 5 , 6, är mycket väl accepterat. Denna metod för att använda kollagenas har ändrats för kliniska tillämpningar inom ortopedi. För att tillämpas på kliniska inställningar, måste systemet vara ett slutet system att provbehållarna samtidigt som bekvämligheten. En viss ändring som presenteras i denna artikel innebär homogenisering av lipoaspirates. Liten storlek lipoaspirates rötas relativt snabbare än de större som resulterar i en ojämn nedbrytning av fettvävnad. Dessa större storlek lipoaspirates kan dessutom producera fibrösa vävnader som kan täppa upp sprutor och nålar medan du utför gemensamma injektioner9,10. För att förhindra dessa problem, kan lipoaspirates homogeniseras genom styckning och malning av lipoaspirates före inkubering med kollagenas. Den resulterande fettvävnad-derived SVF kan innehålla mer enhetlig extracellulär matrix (ECM) jämfört med lipoaspirates som inte är homogeniserad11. Trasig ECM som ingår i SVF kan fungera som en byggnadsställning12.

I 2009, har autolog fettvävnad-derived SVF tillåtits av Korean Food and Drug Administration (KFDA) när behandlas inom en medicinsk facilitet med minimal bearbetning av en läkare13. Efteråt, autolog fettvävnad-derived SVF har använts som en potentiell agent att förbättra knä funktioner i artros (OA) patienter av potentiellt regenererande brosk-liknande vävnad10,14,15 , 16 , 17 , 18 .

I 2011 visade Pak för första gången att fettvävnad-derived stamceller (ASCs) som ingår i den fettvävnad som härrör SVF kan förbättra knä funktioner potentiellt regenererande brosk-liknande vävnad hos OA patienter när injiceras med trombocyt-rika plasma (PRP) 14. Dessutom har Pak et al. rapporterade säkerhetsdata i 2013 med 91 patienter. Den genomsnittliga effekten redovisas i detta säkerhetsdatablad var 67%15. Därefter ytterligare studier av Pak et al. visade förbättrad knä funktioner potentiellt på grund av brosk-liknande vävnadsregeneration hos patienter med en menisk tår och chondromalacia patellae10,16,17 ,18. Baserat på artiklarna rapporterade, är det känt att antalet stamceller som finns i 100 g av fettvävnad som bearbetas av det protokoll som presenteras i denna artikel kan variera från 1.000.000-40.000.000 beroende på patienternas kännetecken8, 19 , 20 , 21 , 22 , 23.

Här presenterar vi ett kliniska protokoll av mänskliga knä Artros med autolog fettvävnad-derived SVF med HA och PRP aktiveras med kalciumklorid. Den första versionen av detta kliniska protokoll, som omfattar en sluten, manuella system för att upprätthålla sterilitet, rapporterades i 201114. Identiska protokollet var optimerad, att upprätthålla sterilitet, och rapporterades i 2013 och 201610,15. Här presenteras optimerad protokollet. En schematisk översikt över protokollet presenteras i figur 1.

Figure 1
Figur 1: Schematisk översikt över protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Godkännande och samtycke att rapportera efter fallrapporter avfärdades av Myongji universitet institutionella Granskningsnämnden kommittén (MJUIRB). Vidare var detta kliniska protokoll i enlighet med Helsingforsdeklarationen och förordning riktlinjerna i KFDA. För förfaranden erhölls informerat samtycke från patienterna.

1. fettsugning

Obs: Utför med steril teknik.

  1. Använda de följande inklusionskriterierna: (1) MRI bevis för etapp 3 OA; (2) antingen manliga eller kvinnliga; (3) över 18 år; (4) tillräckliga (100-110 g) fettvävnad för fettsugning; (5) ovilja att gå vidare med kirurgisk intervention. (6) underlåtenhet av konservativ hantering; (7) pågående invalidiserande smärta.
  2. Använd de följande uteslutningskriterierna: (1) aktiv inflammatorisk eller bindväv sjukdom tros påverka smärttillstånd (dvs, lupus, reumatoid artrit, fibromyalgi); (2) aktiv endokrin sjukdom som kan påverka smärttillstånd (dvs,, hypotyreos, diabetes); (3) aktiva neurologisk sjukdom som kan påverka smärttillstånd (dvs,, perifer neuropati, multipel skleros); (4) aktiv pulmonell sjukdom som kräver medicinering användning; och (5) ingen historia av gemensamma steroidinjektioner senaste 3 månaderna.
  3. Få patienten i ett operationsrum med biohazard klass A huva och placera honom (eller henne) i ryggläge.
  4. Rent buken av patienten med 5% betadine (povidonjod) och drapera patienten med den steril tekniken, utsätta det rengjorda området av buken för fettsugning.
  5. Ca 5 cm infero-sido från umbilicus, söva två platser (en till vänster och den andra på höger sida av umbilicus) i snitt att-vara-med injektionsnål (25 gauge, 1½ tum) i 5 mL spruta 2 mL 2% lidokain utan adrenalin genom att injicera varje plats på den epidermala nivån.
  6. Söva platsen för snitt att-vara-med 5 mL svullen lösning (500 mL normal koksaltlösning, 40 ml 2% lidokain, 20 mL bupivakain 0,5%, 0,5 mL av 1: 1000 adrenalin) i en 10 mL spruta med en kanyl (25 gauge, 1½ tum).
  7. Gör 2 snitt 0,5 cm ca 5 cm nedanför umbilicus sidled genom att nypa huden för att öka djupet av den subkutana nivån.
  8. Med hjälp av nr 11 blad, peta upphöjda huden tränger igenom till den subkutana nivån men inte tränga in genom bukväggen.
  9. Genom att använda 20 cm 16-gauge kanyl, söva den subkutana nivån av hela nedre buken området, vilket är att-vara-fettsugning, med 700-800 mL svullen lösningen.
  10. Efter efterbehandling infiltration av hela nedre delen av buken med svullen lösningen, förbereda en fettsugning apparaten genom att ansluta en 3,0 mm kanyl ansluten till en 60 mL (eller en 30 mL) spruta för manuell fettsugning eller en specialdesignad 3,0 mm kanyl ansluten till en Centrifugera kit, en stängd-systemet spruta i syfte att hålla sterilitet, ansluten till ett vakuum maskin för vakuum-assisted fettsugning.
  11. Utför fettsugning för att erhålla 100-110 g av fettvävnad exklusive svullen lösning. När du utför fettsugning, kommer fettvävnaden att erhållas tillsammans med den svullen lösning som bör avskiljas och tas bort.
  12. För att separera svullen lösningen, först av gravitation, överföra fettvävnaden i centrifug kit till en 60 mL spruta och placera sprutan ner (dvs. del av sprutan är längst). Genom att vänta 5-6 min, separeras fettvävnaden och svullen vätska. Ta bort vätskan längst ned på sprutan genom att trycka på den övre delen av sprutkolven.
  13. Utför stegen ovan 1,9-1.11 tills totalt 100-110 g av fettvävnad (lipoaspirates) per knä har ackumulerats.

2. beredning av ASC/ECM blandning med steril slutet System

  1. Efter separera svullen lösningen genom gravitation och ackumulera 50-55 g lipoaspirates per varje 60 mL centrifug kit, en steril slutet system, placera 2 centrifug kit i en centrifug behållare hink och spinn vid 1600 x g i 5 min, kondenserande den lipoaspirates och separera vätska från fettvävnaden. I denna process av ytterligare kondenserar, lipoaspirates kan producera fet olja i vissa fall.
  2. Att vara försiktig att inte skaka, ta bort säkerhet locket och kontakten längst ned på den centrifug kit.
  3. Ta bort botten vätskan genom att långsamt trycka ned på toppen av kolven i centrifug kit.
  4. På separat 60 mL spruta, lös 10 mg kollagenas (kollagenas specifika för bindväv24 5 mg) och 5 mg kollagenas specifika för fettväv25med 50 mL fysiologisk koksaltlösning.
  5. Blanda ca 25-30 mL kondenserad lipoaspirate med upplöst kollagenas (5 mg kollagenas specifika för bindväv) och 5 mg kollagenas specifika för fettvävnad i förhållandet 1:1 (v: v) genom att ansluta 60 mL sprutan till en centrifug kit med hjälp av en specialiserad kontakt.
  6. Grundligt blanda den kondenserade lipoaspirate och kollagenas genom att trycka innehållet mellan 60 mL sprutan och centrifugera kits med hjälp av en stav eller en pusher.
  7. Överför blandningen av lipoaspirate och kollagenas tillbaka till 60 mL sprutor.
  8. Anslut varje 60 mL spruta innehåller blandningen med en vävnad Homogenisatorer som innehåller blad.
  9. Anslut en tom 60 mL spruta till andra änden av homogenisatorn.
  10. Tryck blandningen på andra 60 mL sprutan genom homogenisatorn för 4 -6 gånger, vilket resulterar i styckning och malning av lipoaspirate.
  11. Överföra den homogeniserade lipoaspirate och kollagenas blandningen tillbaka till 60 mL centrifug kit via en specialiserad connector
  12. Placera den centrifug kit i en behållare placeras i en inkubator som har förvärmd vid 37 ° C.
  13. Inkubera två centrifug kit med homogeniserad blandningen vid 37 ° C i 40 min samtidigt vrida på 45 rpm.
  14. Efter de 40 min inkubering, ta bort behållaren från inkubatorn i en steril mode. Ta sedan bort den centrifug kit och placera dem i en centrifug maskin.
  15. Centrifugera blandningar vid 800 x g i 5 min att separera den fettvävnad som härrör SVF.
  16. Efter centrifugen, avlägsna supernatanten (som innehåller kollagenas och rötas fettvävnad) från varje centrifug kit genom att ta bort sprutans lock på toppen av kolven och placera en 30 mL sprutan på kolven öppna via spruta lås anslutning.
  17. Tryck långsamt ned det fat med 30 mL sprutan för supernatanten att fylla i 30 mL sprutan.
  18. Tryck ned på 30 mL sprutan ända ner till de sista 3-4 mL av botten av den centrifug kit, lämnar bara de sista 3-4 mL av fettvävnad-derived SVF. Supernatanten kastas.
  19. Ta bort 30 mL sprutan från toppen av kolven och Fyll sprutan med 5% glukoslösning ringer-laktat lösning (D5LR).
  20. Genom att fästa 30 mL sprutan fylls med D5LR på toppen av kolven öppna, fylla den centrifug kit, som innehåller 3-4 mL av fettvävnad-derived SVF, med D5LR upp till 55 mL.
  21. Ta bort 30 mL sprutan, cap kolven och Centrifugera i centrifug kit igen vid 300 x g i 4 min.
  22. Upprepa steg 2,17-2,21 för sammanlagt 4 tvättar. Den används kollagenas är xenogen. Därför är de flesta kollagenas bort av 4 tvättar. Dock för FDA godkännande, kan finjustering av protokollet vara nödvändigt att helt ta bort kollagenas rester i den slutliga volymen, även om den aktuella mängden kollagenas rester kan vara försumbar nog för de patienter som inte har någon klinisk biverkningar.
  23. Efter de 4th centrifugeringen, för att få den slutliga SVF injektionsvätska, ta bort säkerhet locket och botten öppnandet av den centrifug kit, kontakten utan skakningar eller vrida den centrifug kit.
  24. Bifoga en 20 mL spruta till centrifug kit botten öppning med hjälp av en specialdesignad kontakt.
  25. Dra kolven i sprutan flera gånger fram och tillbaka att skaka upp de celler som har bosatt sig på botten av centrifug kit.
  26. Ta bort önskad totala volymen av den SVF som innehåller både ASCs och ECM tillsammans med andra celler och vävnad (vanligtvis ca 3-4 mL från varje centrifug kit för knä gemensamma injektioner).

3. PRP förberedelser med steril teknik

  1. Medan förbereda ASCs och ECM, dra 30 mL av autologt blod med 2,5 mL blodförtunnande citratlösning dextros.
  2. Överföra ritade blodet i 60 mL centrifug kits.
  3. Centrifugera ritade blodet vid 730 x g i 5 min och avlägsna supernatanten till ett nytt 60 mL centrifug kit. Centrifugera supernatanten vid 1300 x g i 4 min, vilket resulterar i 3-4 mL av PRP.
  4. Precis före injektion, Lägg till 3% (w/v) kalciumklorid i förhållandet 10:2 (PRP: kalciumklorid, v: v) till Lösenordsreplikeringsprincipen för att aktivera funktionen.
  5. Lägga till 0,5% (w/v) HA, som en byggnadsställning, principen för Lösenordsreplikering aktiveras med kalciumklorid. Dessa ASCs med ECM, tillsammans med PRP, aktiveras av kalciumklorid, och HA stå för ASC/ECM blandningen.

4. ASC/ECM blandning-baserad behandling

  1. Rengöra knäet av patienten med 5% betadine och drapera den i ett sterilt sätt.
  2. Palpera den främre i knäet för det gemensamma utrymmet mellan Tibia och femorala benen.
  3. Söva injektionsstället ytligt med utspädda lidokain (1 mL 1% lidokain utspädd med 4 mL fysiologisk koksaltlösning) från huden för att precis utanför ledkapseln.
  4. Söva insidan av ledkapseln med utspädda ropivacaine (1 mL 0,75% ropivacaine utspädd med 3 mL fysiologisk koksaltlösning).
  5. Blanda 2 mL av HA den 6-8 mL av SVF som ingår i en 20 mL spruta via spruta-till-sprutan connector.
  6. Med hjälp av en spruta-till-spruta-kontakt, lägga till 0,4 mL kalciumkloridlösning i de 3-4 mL av autologa PRP som redan har förberetts och vara redo i en 5 mL spruta.
  7. Kombinera 3,5-4,5 mL av PRP/kalciumklorid i 5 mL spruta med 8-10 mL av HA/SVF blandning i en 20 mL spruta via spruta-till-sprutan connector.
  8. Omedelbart Injicera blandningen (ca 12-15 mL) långsamt in i främre tibiofemoralleden-femoral gemensamma i knäna med 38 mm 18 gauge nål med eller utan ultraljud vägledning.
  9. Efter injektionen, bandage injektionsstället med trycket genom att vika 4 x 4 bomull gasbinda 4 gånger och att placera band över vikta 4 x 4 gasväv.
  10. Instruera patienten att förbli fortfarande för 60 min för cell fastsättning.
  11. Instruera patienten att begränsa aktiviteter för minimal 1 vecka efter utskrivning från kliniken.
  12. Tillbaka till kliniken för tre ytterligare injektioner av PRP aktiveras av kalciumklorid över 3 veckor.

5. efter behandlingen följa upp

  1. Bedöma patienten på veckan i 2, 4 och 16 (18 eller 22) för smärta förbättring när det gäller visuell analog skala (VAS) och funktion förbättring när det gäller sjukgymnastik parametrar. Fastställa funktionella rating index (fre), VAS och rörelseomfång (ROM) som tidigare beskrivits26,27.
  2. Följ patienten med efterbehandling MRI 3 månader efter behandlingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tre patienter (en 87-årig kvinna med stage 3 OA, en 68-årig man med stage 3 OA, och en 60-årig kvinna med scen 3 OA) utan någon betydande förflutna medicinsk historia fram till kliniken med ihållande knäsmärta och önskade för potentiella autologa fettvävnad-derived SVF behandling. Alla tre patienter hade sina knän som undersöktes av en ortoped och erbjöds att ha total knäledsplastik (TKR) och var ovilliga att ha kirurgi. Före ingreppet, hade alla tre patienter fick flera injektioner av steroider och HA utan någon långvarig förbättring.

Den 87-åriga koreanska kvinnliga tålmodig, vid tiden för undersökningen, klagade av svår smärta (VAS poäng av 8. Figur 2A) samtidigt på resten. Hon beskrev smärtan öka ([fre: 37; Figur 2A) När man går upp och ner för trappor. På fysisk undersökning noterades lindrig ledsvullnad med minskad ROM och ömhet med flexion (figur 2B). Dock uppskattades inga ligament slapphet. Mcmurrays och Apleys test var negativa. En före-behandling MRI visade en minskad storlek mediala menisken tillsammans med deformation och maceration. (Figur 2 c, 2E, 2 Goch 2I).

Den andra patienten, en 68-årig Koreansk hane, klagade över svåra vänster knäsmärta (VAS Poäng: 7; Figur 3A) samtidigt på resten. Smärtan (fre: 33; Figur 3A) beskrevs som ökar när man går upp och ner för trappor. På fysisk undersökning fanns det milda deformitet med lindrig ledsvullnad. ROM (figur 3B) minskade. Vidare, inga ligament slapphet uppskattades. Mcmurrays och Apleys test var negativa. En före-behandling MRI visade brosk gallring tillsammans med en minskad storlek och deformerade mediala menisken sekundärt till den tidigare meniscectomy (figur 3 c, 3E, 3 Goch 3I). Patienten fick diagnosen har scenen 3 OA.

Den tredje patienten, en 60-year-old koreanska kvinna, rapporterade också svår smärta (VAS Poäng: 8; Figur 4A) på resten. Smärtan (fre: 36; Figur 4A) beskrevs som ökar när man går. Patienten hade också milda knä svullnad och minskade ROM (figur 4B). Inga ligament slapphet uppskattades. Mcmurrays och Apleys test var negativa. En före-behandling MRI visade minskade storlek mediala menisken med deformation och maceration, och det var brosk gallring (figur 4 c, 4E, 4 Goch 4I).

Behandlingsplan. Alla tre representativa patienter var begränsad från att ta steroider, acetylsalicylsyra, icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID) och asiatiska örtmediciner minst 1 vecka före ingreppet. Efter att Mr imaging studier, var lipoaspirates erhålls och behandlas som det hänvisas till ovan. Efteråt, den autolog fettvävnad-derived SVF som innehåller ASCs, ECM, HA och kalcium-klorid-aktiverat autolog PRP injicerades till knäna på dag 0. Det fanns ingen komplikation på grund av Fettsugningar och gemensamma injektioner. Patienterna återvände därefter, till kliniken i en vecka, sedan 2 veckor och sedan 3 veckor för ytterligare injektioner av HA och autolog PRP aktiveras med kalciumklorid.

Resultatet. Efter andra veckan i ASC/ECM blandning injektion, 87-åriga kvinnliga patientens smärta och ROM förbättrades (figur 2A och 2B). Den 16: e veckan, patientens smärta och ROM betydligt bättre med mer än 70% (figur 2A och 2B). Efter behandling MRI tagit efter den 16: e veckan visade hyaline brosk-liknande vävnad ökad tjocklek på den mediala sidan av knäet (figur 2D, 2F, 2 Hoch 2J). Som en jämförelse var genomsnittlig effekt 67% i data använder detta kliniska protokoll, omfattande 91 patienter och rapporterade i 201315.

Figure 2
Figur 2: resultatet av smärta mätningar (A) och utbud av motion b, och MRI sagittal (C-F) och koronala (G-J) sekventiella T2 utsikt över knäet från patient fallet 1. * anger en statistiskt signifikant fynd (p < 0,05). Förbehandling Magnettomografi (C: sekventiell bild, 5/20; E: 6/20; G: 10/20; och jag: 11/20) Visa brosk lesioner (pilar). Efter behandling MRI File på 16 veckor (D: 6/20; F: 7/20; H: 10/20; och J: 11/20) ange brosk-liknande vävnadsregeneration (pilspets) som har reparerats av ASC/ECM blandning-baserad behandling. Denna siffra har ändrats från föregående rapport av Pak o.a. 10. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

68-årig manlig patientens smärta och ROM förbättrades efter andra veckan i ASC/ECM blandning injektion (figur 3A och 3B). Av den 18: e veckan, hans smärta och ROM betydligt förbättras ytterligare till 80% (figur 3A och 3B). Upprepade MRI tagit efter 18: e veckan visade en ökning i höjden av Hyalint brosk-liknande vävnad på den främre mediala sidan av knäet (figur 3D, 3F, 3 H och 3J).

Figure 3
Figur 3 : Resultatet av smärta mätningar (A) och utbud av motion b, och MRI sagittal (C-F) och koronala (G-J) sekventiella T2 utsikt över knäet från patient fallet 2. * anger en statistiskt signifikant fynd (p < 0,05). Förbehandling Magnettomografi (C: sekventiell bild, 6/20; E: 7/20; G: 13/20; och jag: 14/20) Visa brosk lesioner (pilar). Efter behandling MRI File på 16 veckor (D: 6/20; F: 7/20; H: 13/20; och J: 14/20) ange brosk-liknande vävnadsregeneration (pilspets) som har reparerats av ASC/ECM blandning-baserad behandling. Denna siffra har ändrats från föregående rapport av Pak o.a. 10. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

60-åriga kvinnliga patientens smärta och ROM förbättrade cirka 50% efter den andra veckan av ASC/ECM blandning injektion, (figur 4A och 4B). Av 22nd veckan förbättrats smärta och ROM avsevärt över 80% (figur 4A och 4B). Upprepade MRI tagit efter 22nd veckan visade en ökning i höjden av Hyalint brosk-liknande vävnad på den mediala sidan av knäet (figur 4 d, 4F, 4 Hoch 4J).

Figure 4
Figur 4 : Resultatet av smärta mätningar (A) och utbud av motion b, och MRI sagittal (C-F) och koronala (G-J) sekventiella T2 utsikt över knäet från patient fallet 3. * anger en statistiskt signifikant fynd (p < 0,05). Förbehandling Magnettomografi (C: sekventiell bild, 4/20; E: 5/20; G: 10/20; och jag: 11/20) Visa brosk lesioner (pilar). Efter behandling MRI File på 16 veckor (D: 4/20; F: 5/20; H: 10/20; och J: 11/20) ange brosk-liknande vävnadsregeneration (pilspets) som har reparerats av ASC/ECM blandning-baserad behandling. Denna siffra har ändrats från föregående rapport av Pak o.a. 10. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I 2001, Zuk et al. isolerade stamceller från adipose vävnad genom att bryta ner kollagenmatrisen med kollagenas6. Efteråt, gruppen visade att dessa stamceller isoleras från fettvävnaden kunde omvandla till brosk och andra vävnader i mesoderm ursprung, bevisar att dessa stamceller var mesenkymala ursprung.

Likaså är det förfarande som presenteras i denna artikel ett modifierat protokoll för att använda metoden liknande mänskliga patienter. Den viktigaste ändringen av protokollet är införlivandet av slutna system sprutor att erhålla och bearbetning av lipoaspirates för att minimera luft kontakten bibehållen lättheten att göra ingreppet. Använder sådana slutna system sprutor, erhölls fettvävnad via fettsugning. Sedan blandades lipoaspirates med kollagenas inom slutna system sprutorna. Efteråt, kollagenas togs bort från blandningen av späda kollagenas koncentrationen inom de slutna systemet sprutorna. Slutresultatet är en steril fettvävnad-derived SVF erhålls med lätthet av processen.

Med hjälp av liknande metoden, visade Pak under 2011 för första gången att autologa fettvävnad-derived SVF kan användas för att behandla OA patienter av potentiellt regenererande brosk-liknande vävnad. Senare, Pak et al. också visat kan att autologa fettvävnad-derived SVF användas att behandla menisken tår och chondromalacia av patellae genom att regenerera fibröst brosk-liknande vävnad och Hyalint brosk-liknande vävnad, respektive. I 2013, Pak et al. rapporterade en säkerhetsstudie med 91 patienter behandlades med autolog fettvävnad-derived SVF. Genomsnittliga effekten av studien rapporterade var 67%, banar vägen till möjligheten att tillämpa autolog fettvävnad-derived SVF i allmänhet patientpopulationen med brosk skada.

En av de vanligaste biverkningarna som rapporterats av Pak et al. år 2013 var säkerhetsstudie efter behandling knä ledsvullnad, vilket kan förklaras av 1) stamceller död, 2) inflammation av röda blodkroppar som ingår i principen för Lösenordsreplikering, eller 3) återstående kollagenas som förblivit i sista volymen av fettvävnad-derived SVF. Eftersom MSCs föreligger inom ECM fettvävnad11,12, är smälta lipoaspirates med kollagenas att bryta ner matrix att leasa stamcellerna en obligatorisk process12. Dock efter att bryta ner matrisen att släppa stamcellerna, bör den återstående resterande kollagenas tas bort helt från den slutliga volymen för att förhindra eventuella potentiella inflammation som kan produceras av kvarvarande kollagenas28. Även om kollagenas kan orsaka inflammation, kan en obetydlig mängd av kollagenas i sista volymen av fettvävnad-derived SVF inte utlösa en ledsvullnad. Sådan slutlig volym av autologa fettvävnad-derived SVF med en obetydlig mängd av kollagenas har använts på ett säkert sätt för de senaste åren för att behandla Artros i knäna genom att regenerera brosk-liknande vävnad.

Två icke-enzymatiska metoder för att få fettvävnad-derived SVF har nyligen varit introducerade29,30. Dessa metoder använder antingen mekanisk kraft eller ultraljud (vibrerande) kraft, i stället för kollagenas. 2018, D'Ambrosi et al. rapporterade ett resultat av att behandla fyra osteokondrala lesioner av talus i fotleden med mikro-brutna, renat autolog fettvävnad som hämtades med hjälp av mekanisk kraft till uppdelning av matrix29. Ingen kollagenas användes för att bryta ner matrisen. Fyra patienter behandlades med fettvävnaden mikro-brutna (dvs, mekaniskt nedslitet fettvävnad), för deras talus29. Alla dessa fyra patienter visade klinisk förbättring sex månader efter ingreppet. Ingen hade några komplikationer. Men på denna studie29fanns det någon rapport om potentiella regenerering av brosk. En annan studie publicerad år som inbegriper vibrationell energi visade att vibrationell energi i viss frekvens inte var tillräcklig för att isolera stamceller30.

Som visats ovan har har olika grupper olika protokoll för att använda en autolog fettvävnad för att behandla olika degenerativa ledbesvär. Protokollet kan variera från storleken på kanylen används för fettsugning, mängden fettvävnad som används, typen och mängden kollagenas (om någon), injektioner, och så vidare. Eftersom MSCs föreligger inom ECM av fettvävnad, kan effekten av kollagenas eller reningsmetod som använder mekaniska krafter, spela en viktig roll. Särskilt, kan effekten av kollagenas bero på faktorer såsom storleken av fettvävnad, mängden fettvävnad, koncentration av kollagenas, tid och temperatur för inkubation med kollagenas och processen för att ta bort överblivna kollagenas, vilket kan orsaka cell skador28.

Det bör noteras att kollagenas, eftersom det är en viktig komponent i detta förfarande för att producera stamceller som innehåller fettvävnad-derived SVF, kan ha en negativ effekt på den slutliga volymen av fettvävnad-derived SVF. I den här proceduren är kollagenas blandat med kondenserad lipoaspirates, homogeniserad, inkuberas och sedan tvättas bort. Hela processen utsätts stamceller för kollagenas, som kan ha en skadlig effekt på överlevnaden av de stamceller28. För mycket koncentration eller långvarig exponering av kollagenas kan sänka stamceller livskraft i slutlig volym28. Ytterligare, för mycket av kollagenas kvar i den slutliga volymen kan orsaka inflammation i gemensamt eftersom kollagenas kan bryta ner brosk matris av den gemensamma injicerade28.

Förutom de potentiella negativa effekterna av kollagenas, kan Fettsugning bära andra potentiella komplikationer. För att erhålla fettvävnad-derived SVF, utföras fettsugning först. Utför Fettsugningar, som andra medicinska procedurer, bär några potentiella komplikationer såsom oegentligheter i huden kontur, seromas, infektion, perforering av bukväggen, nekrotiserande fasciit, fett emboli och lungemboli. Bland dessa komplikationer är hud kontur oegentligheter en mycket vanlig biverkning som kan undvikas med hjälp av små kanyler och undvika ytliga Fettsugningar31,32. Seromas, som är en samling av serös vätska i området sugs, kan också vara ett resultat av aggressiva fettsugning33. Andra potentiella komplikationer såsom infektion, nekrotiserande fasciit, perforering av buken väggar, fett lungemboli eller lungemboli är alla möjliga. Dessa komplikationer kan dock också förebyggas med hjälp av strikt steril teknik och genom att förbättra patienternas följsamhet34.

«««Vidare, alla tre patienter ingick i studien inledningsvis presenteras med en mild gemensamma utgjutning, ett tydligt tecken på synovit. Efter behandling med fettvävnad-derived SVF, alla dessa patienter som gemensamma svullnad förbättrad. Av denna anledning är det också rimligt att anta att en förbättring av kliniska symtom är inte på grund av möjliga brosk regenerering, men istället, på grund av immunmodulerande och antiinflammatoriska effekten av stamceller eller PRP på ledhinnan35 , 36. Alternativt symptom förbättring kan bidra till både immunmodulerande och antiinflammatoriska effekten av stamceller eller PRP på ledhinnan tillsammans med möjliga förnyelse av brosk-liknande vävnad. Även om mer forskning krävs för att avgränsa sant mekanismen av symptom förbättring, homogeniserad denna perkutan intraartikulär injektion av cellterapi i form av autologa, fettvävnad-derived SVF med autolog PRP aktiveras med kalciumklorid och/eller HA kan erbjuda en alternativ behandling till den nuvarande strategin för att behandla knä Artros.

När det gäller tillägg av autologa PRP är berörda, det är allmänt accepterat att PRP innehåller olika tillväxtfaktorer och särskiljande faktorer för injiceras MSCs att växa och differentiera37,38,39. PRP har också visat sig ha en kollagenas neutraliserande effekt40. När det gäller tillsats av hyaluronsyra har (HA), HA visat sig ha en potentiella roll som byggnadsställningar material, på grund av dess hög affinitet till broskvävnad, och en potentiell roll att hjälpa stamceller tränger in i brosk matris41.

Fler nya processer för att få fettvävnad-derived SVF finns en optimering av en metod för bearbetning av lipoaspirates är nödvändigt att standardisera processen. Detta kan dock vara en svår uppgift på grund av antalet potentiella variationer i processen för att erhålla och bearbetning autolog fettvävnad-derived SVF. Till exempel kan skillnader i texturen av subkutan fettvävnad i varje enskild patient, på grund av åldrande eller graden av fetma, ha olika svar på kollagenas aktiviteter, vilket resulterar i olika antal ASCs i de autologa adipose vävnad-derived SVF42. Dessutom antalet stamceller i varje gram av fettvävnad kan skilja sig från en patient till en annan som framgår av den stora variationen av rapporterade stem cell nummer i talrika publikationer7,19,20, 21 , 22 , 23.

Detta protokoll som presenteras i denna artikel är en roman, innovativa förfarande försöker förbättra den nuvarande strategin att behandla mänskliga knä Artros av potentiellt regenererande brosk-liknande vävnad med perkutan injektioner av autologa fettvävnad som härrör SVF. Korrekt användning av kollagenas är ett viktigt och avgörande steg i detta protokoll. Använda slutna system sprutor att hålla sterilitet medan underhålla bekvämligheten att göra ingreppet är en större ändring av de protokoll som utvecklats av Zuk et al. 5 i tillägg, för användning på människa, det resterande beloppet av kollagenas som ingår i den slutliga fettvävnad-derived SVF bör vara obetydlig för att förhindra eventuella ledinflammation. Det finns begränsningar i detta protokoll: kollagenas rester i sista volymen (även om detta kan vara försumbar), ingen styra grupper som ensamma injiceras PRP och HA, ingen biopsier, inga bevis exklusive förbättring av kliniska symtom på grund av PRP, små antal patienter (pilot-studie), inga trotsar komponenter i den fettvävnad som härrör SVF och ingen specifikation av antalet stamceller i var och en av de 3 patienterna. Tillämpning av fettvävnad-derived SVF för störningar såsom en menisk tår, chondromalacia patellae, spinal skivan sjukdomar, en fördröjd läkning (eller icke-läkande) ben fraktur, icke-läkande hudsår, bröstrekonstruktion, och andra medicinska sjukdomar kan förbättra det kliniska resultatet. Även om dessa potentiella kliniska tillämpningar av fettvävnad-derived SVF, är mer grundlig och livskraftiga kliniska undersökningar nödvändiga för att införliva fettvävnad-derived SVF i faktiska kliniska inställningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författaren erkänner stöd från personal Mipro Medicinklinik och den figur designen av Jaepil/David Lee. Detta arbete stöds av forskningsanslag från Bio & medicinsk teknik Development Program för det nya regelverket som finansieras av MSIT (nummer NRF-2017M3A9E4078014); och den nationella Research Foundation i Korea (NRF) finansieras av ministeriet för vetenskap och IKT (antalet NRF-2017R1A2B4002315 och NRF-2016R1C1B2010308).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
5% Betadine (povidone-iodine)  Firson Co., Ltd. 657400260
2% Lidocaine  Daehan Pharmaceutical Co. 670603480
Tumescent solution  Myungmoon Pharm. Co. Ltd. N01BB01 The solution was composed of 500 mL normal saline, 40 mL 2% lidocaine, 20 mL 0.5% marcaine, and 0.5 mL epinephrine 1:1000.
Liberase TL and TM research grade  Roche Applied Science 5401020001
D5LR Dahan Pharm. Co., Ltd. 645101072 Dextrose 5% in lactated Ringer's solution 
Anticoagulant citrate dextrose solution  Fenwal, Inc. NDC:0942-0641 The solution was composed of 0.8% citric acid,
0.22% sodium citrate, and 0.223% dextrose.
3% (w/v) Calcium chloride  Choongwae Pharmaceutical Co. 644902101
0.5% (w/v) HA (Hyaluronic acid ) Dongkwang pharm. Co., Ltd. 645902030
0.25% Ropivacaine Huons Co., Ltd. 670600150
Equipment
3.0 mm Cannula  WOOJU Medical Instruments Co. ML30200
60-mL Luer-Lock syringe BD (Becton Dickinson)  309653
Centrifuge Barrel Kit  CPL Co., Ltd. 30-0827044
Tissue homogenizer that contains blades CPL Co., Ltd. 30-0827045
Rotating incubator mixer Medikan Co., Ltd MS02060092
Centrifuge Hanil Scientific Inc. CE1133
Magnetic Resonance Imaging Philips Medical Systems Inc. 18068
Ultrasound Imaging System Samsung Medison co., Ltd CT-LK-V10-ICM-09.05.2007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arnoczky, S. P. Building a meniscus. Biologic considerations. Clinical Orthopaedics and Related Research. (367 Suppl), S244-S253 (1999).
  2. Barry, F. P. Mesenchymal stem cell therapy in joint disease. Novartis Foundation Symposium. 249, 86-241 (2003).
  3. Usuelli, F. G., et al. Adipose-derived stem cells in orthopaedic pathologies. British Medical Bulletin. 124 (1), 31-54 (2017).
  4. Zhang, H. N., Li, L., Leng, P., Wang, Y. Z., Lv, C. Y. Uninduced adipose-derived stem cells repair the defect of full-thickness hyaline cartilage. Chinese Journal of Traumatology. 12 (2), 92-97 (2009).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  6. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  7. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
  8. Zhu, Y., et al. Adipose-derived stem cell: a better stem cell than BMSC. Cell Biochemistry and Function. 26 (6), 664-675 (2008).
  9. Bellei, B., Migliano, E., Tedesco, M., Caputo, S., Picardo, M. Maximizing non-enzymatic methods for harvesting adipose-derived stem from lipoaspirate: technical considerations and clinical implications for regenerative surgery. Scientific Reports. 7 (1), 10015 (2017).
  10. Pak, J., Lee, J. H., Park, K. S., Jeong, B. C., Lee, S. H. Regeneration of Cartilage in Human Knee Osteoarthritis with Autologous Adipose Tissue-Derived Stem Cells and Autologous Extracellular Matrix. BioResearch Open Access. 5 (1), 192-200 (2016).
  11. Alexander, R. W. Understanding Adipose-derived Stromal Vascular Fraction (AD-SVF) Cell Biology and Use on the Basis of Cellular, Chemical, Structural and Paracrine Components: A Concise Review. Journal of Prolotherapy. 4, e855-e869 (2012).
  12. Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
  13. Korean Food and Drug Administration (KFDA). Cell therapy: Rules and Regulations. KFDA. , (2009).
  14. Pak, J. Regeneration of human bones in hip osteonecrosis and human cartilage in knee osteoarthritis with autologous adipose-tissue-derived stem cells: a case series. Journal of Medical Case Reports. 5, 296 (2011).
  15. Pak, J., Chang, J. J., Lee, J. H., Lee, S. H. Safety reporting on implantation of autologous adipose tissue-derived stem cells with platelet-rich plasma into human articular joints. BMC Musculoskeletal Disorders. 14, 337 (2013).
  16. Pak, J., Lee, J. H., Kartolo, W. A., Lee, S. H. Cartilage Regeneration in Human with Adipose Tissue-Derived Stem Cells: Current Status in Clinical Implications. BioMed Research International. 2016, 4702674 (2016).
  17. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. A novel biological approach to treat chondromalacia patellae. PLoS One. 8 (5), e64569 (2013).
  18. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. Regenerative repair of damaged meniscus with autologous adipose tissue-derived stem cells. BioMed Research International. 2014, 436029 (2014).
  19. Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
  20. De Ugarte, D. A., et al. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow. Cells Tissues Organs. 174 (3), 101-109 (2003).
  21. Guilak, F., et al. Clonal analysis of the differentiation potential of human adipose-derived adult stem cells. Journal of Cellular Physiology. 206 (1), 229-237 (2006).
  22. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  23. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  24. Liberase TL information available from Sigma Millipore online. , https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US (2018).
  25. Liberase TM information available from Sigma Millipore online. , https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/Libtmro?lang=en®ion=US (2018).
  26. Childs, J. D., Piva, S. R. Psychometric properties of the functional rating index in patients with low back pain. European Spine Journal. 14 (10), 1008-1012 (2005).
  27. Price, D. D., McGrath, P. A., Rafii, A., Buckingham, B. The validation of visual analogue scales as ratio scale measures for chronic and experimental pain. Pain. 17 (1), 45-56 (1983).
  28. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicine. 3 (5), 705-715 (2008).
  29. D'Ambrosi, R., Indino, C., Maccario, C., Manzi, L., Usuelli, F. G. Autologous Microfractured and Purified Adipose Tissue for Arthroscopic Management of Osteochondral Lesions of the Talus. Journal of Visualized Experiments. (131), e56395 (2018).
  30. Packer, J. D., Chang, W. T., Dragoo, J. L. The use of vibrational energy to isolate adipose-derived stem cells. Plastic Reconstructive Surgery-Global Open. 6 (1), e1620 (2018).
  31. Hanke, C. W., Bernstein, G., Bullock, S. Safety of tumescent liposuction in 15,336 patients. National survey results. Dermatologic Surgery. 21 (5), 459-462 (1995).
  32. Illouz, Y. G. Complications of liposuction. Clinics in Plastic Surgery. 33 (1), 129-163 (2006).
  33. Dixit, V. V., Wagh, M. S. Unfavourable outcomes of liposuction and their management. Indian Journal of Plastic Surgery. 46 (2), 377-392 (2013).
  34. Lehnhardt, M., et al. Major and lethal complications of liposuction: a review of 72 cases in Germany between 1998 and 2002. Plastic and Reconstructive Surgery. 121 (6), 396e-403e (2008).
  35. Iyer, S. S., Rojas, M. Anti-inflammatory effects of mesenchymal stem cells: novel concept for future therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (5), 569-581 (2008).
  36. Zhang, J., Middleton, K. K., Fu, F. H., Im, H. J., Wang, J. H. HGF mediates the anti-inflammatory effects of PRP on injured tendons. PLoS One. 8 (6), e67303 (2013).
  37. Li, N. Y., Yuan, R. T., Chen, T., Chen, L. Q., Jin, X. M. Effect of platelet-rich plasma and latissimus dorsi muscle flap on osteogenesis and vascularization of tissue-engineered bone in dogs. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 67 (9), 1850-1858 (2009).
  38. Parsons, P., et al. The biological effect of platelet rich-plasma on the fracture healing process. The Journal of bone and joint surgery. British volume. 91-B, 293 (2009).
  39. Wu, W., Chen, F., Liu, Y., Ma, Q., Mao, T. Autologous injectable tissue-engineered cartilage by using platelet-rich plasma: experimental study in a rabbit model. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 65 (10), 1951-1957 (2007).
  40. Cooper, T. W., Eisen, A. Z., Stricklin, G. P., Welgus, H. G. Platelet-derived collagenase inhibitor: characterization and subcellular localization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2779-2783 (1985).
  41. Uzuki, M., Sawai, T. A. A comparison of the affinity of sodium hyaluronate of various molecular weights for degenerated cartilage: a histochemical study using hyaluronic acid binding protein. International Congress Series. 1223, 279-284 (2001).
  42. Pagano, C., et al. Molecular and morphometric description of adipose tissue during weight changes: a quantitative tool for assessment of tissue texture. International Journal of Molecular Medicine. 14 (5), 897-902 (2004).

Tags

Medicin fråga 139 medicin fettvävnad-Derived stamceller extracellulär Matrix mänskligt brosk regenerering artros regenerativ medicin mesenkymala stamceller
Kliniska protokoll för att producera fettvävnad-Derived Stromal vaskulär bråkdel för potentiella brosk regenerering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pak, J., Lee, J. H., Pak, N. J.,… More

Pak, J., Lee, J. H., Pak, N. J., Park, K. S., Jeon, J. H., Jeong, B. C., Lee, S. H. Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (139), e58363, doi:10.3791/58363 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter