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Medicine

Protocolo clínico de produzir tecido adiposo-derivado do estroma Vascular fração para a regeneração da cartilagem potenciais

Published: September 29, 2018 doi: 10.3791/58363
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 2, 2, 2, 2
1Mipro Medical Clinic, 2National Leading Research Laboratory, Department of Biological Sciences, Myongji University
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir uma tecido adiposo-derivado do estroma vascular fração e sua aplicação para melhorar as funções de joelho Regenerando o tecido da cartilagem, como em pacientes humanos com osteoartrite.

Abstract

Osteoartrite (OA) é uma das mais comuns doenças debilitantes. Recentemente, várias tentativas foram feitas para melhorar as funções dos joelhos usando diferentes formas de células-tronco mesenquimais (MSCs). Na Coreia, concentrados de medula óssea e cordão hemoderivados células-tronco foram aprovadas pela Korean Food and Drug Administration (KFDA) para regeneração da cartilagem. Além disso, uma tecido adiposo-derivado do estroma vascular fração (SVF) foi autorizada pelo KFDA para injeções conjuntas em pacientes humanos. SVF autóloga derivadas de tecido adiposo contém matriz extracelular (ECM), além de células-tronco mesenquimais. ECM excreta várias citocinas que, juntamente com o ácido hialurónico (HA) e o plasma rico em plaquetas (PRP) ativado pelo cloreto de cálcio, podem ajudar o MSCs para regenerar a cartilagem e melhorar as funções do joelho. Neste artigo, apresentamos um protocolo para melhorar as funções do joelho Regenerando o tecido da cartilagem, como em pacientes humanos com OA. O resultado do protocolo foi primeiramente relatado em 2011, seguido por algumas publicações adicionais. O protocolo envolve lipoaspiração para obter lipoaspirates autólogo que são misturados com colagenase. Esta mistura de lipoaspirates-colagenase é então cortada e homogeneizada para remover grandes de tecido fibroso que pode entupir a agulha durante a injeção. Depois disso, a mistura é incubada para obter SVF derivadas de tecido adiposo. O resultante SVF derivadas de tecido adiposo, contendo tecido adiposo-derivado MSCs e restos de ECM, é injetado em joelhos de pacientes, combinados com HA e cloreto de cálcio ativado PRP. Incluem-se três casos de pacientes que foram tratados com nosso protocolo, resultando em melhora da amplitude de movimento, juntamente com provas de MRI de cartilagem hialina, como tecido, inchaço e dor no joelho.

Introduction

Células-tronco mesenquimais (MSCs) são conhecidas por terem a capacidade de regenerar a cartilagem1,2,3,4,5,6. Elas podem ser facilmente obtidas de várias fontes: sangue do cordão umbilical, medula óssea e tecido adiposo, entre muitos outros. Entre essas fontes, o tecido adiposo é a única fonte onde um número suficiente de MSCs pode ser obtido sem qualquer expansão da cultura para regenerar a cartilagem em ambientes clínicos7,8. Autólogo de medula óssea do estroma vascular fração (SVF) pode ser facilmente obtida também. No entanto, o número de células-tronco contida na medula expandida não-cultura é muito baixa7,8. Sangue do cordão umbilical pode conter um número suficiente de MSCs. No entanto, o sangue do cordão umbilical não é uma fonte prontamente disponível de SVF autólogo.

Numerosos métodos de processamento de tecido adiposo para obter SVF estão disponíveis para aplicações clínicas. Entre estes, o método de obtenção MSCs de tecido adiposo usando colagenase, desenvolvida e confirmada pelo Zuk et al 5 , 6, é muito bem aceito. Este método de usar colagenase foi modificado para aplicações clínicas em Ortopedia. A fim de ser aplicada a situações clínicas, o sistema deve ser um sistema fechado para manter a esterilidade, mantendo a conveniência. Uma modificação particular apresentada neste artigo envolve homogeneização do lipoaspirates. Lipoaspirates tamanhos pequenos são digeridos relativamente mais rápido do que os maiores que estão resultando na repartição desigual de tecido adiposo. Além disso, estes lipoaspirates de tamanhos maiores pode produzir tecidos fibrosos que podem entupir as seringas e agulhas durante a execução conjunta de injeções9,10. Para evitar esses problemas, o lipoaspirates pode ser homogeneizado por corte e picagem a lipoaspirates antes da incubação com colagenase. O SVF derivadas de tecido adiposo resultante pode conter mais uniforme da matriz extracelular (ECM) em comparação com lipoaspirates que não são homogeneizadas11. O ECM quebrado contido o SVF pode funcionar como um andaime12.

Em 2009, foi autorizada pela Korean Food and Drug Administration (KFDA) quando processado dentro de uma instalação médica com processamento mínimo, por um médico13SVF autóloga derivadas de tecido adiposo. Depois, SVF autóloga derivadas de tecido adiposo tem sido utilizada como um agente potencial para melhorar as funções do joelho em pacientes de osteoartrite (OA) potencialmente regenerando tecido de cartilagem, como10,14,15 , 16 , 17 , 18 .

Em 2011, Pak mostrou pela primeira vez que derivadas de tecido adiposo as células-tronco (ASCs) contidas no SVF derivadas de tecido adiposo podem melhorar as funções de joelho potencialmente regenerar o tecido da cartilagem, como em pacientes humanos de OA quando injetado com rico em plaquetas plasma (PRP) 14. Além disso, Pak et al relataram dados de segurança em 2013 envolvendo 91 pacientes. A taxa de eficácia média relatada nesses dados de segurança foi 67%15. Posteriormente, estudos adicionais por Pak et al mostraram joelho melhorou funções potencialmente devido a regeneração do tecido de cartilagem, como em pacientes com um menisco lacrimal e condromalacia patelas10,16,17 ,18. Com base em artigos relatados, é sabido que o número de células-tronco contida em 100 g de tecido adiposo processado pelo protocolo apresentado neste artigo pode variar de 1.000.000-40,000,000 dependendo características8, dos pacientes 19 , 20 , 21 , 22 , 23.

Aqui, apresentamos um protocolo clínico do joelho humano OA usando SVF autóloga derivadas de tecido adiposo com HA e PRP ativado com cloreto de cálcio. A primeira versão do presente protocolo clínico, envolvendo um sistema fechado, manual para manter a esterilidade, foi relatada em 201114. O protocolo idêntico foi otimizado, manutenção de esterilidade e foi relatado em 2013 e 201610,15. Aqui, o protocolo otimizado é apresentado. A visão esquemática do protocolo é apresentado na Figura 1.

Figure 1
Figura 1: A visão esquemática do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

A aprovação e o consentimento para relatar após relatos de casos dispensadas pelo Comité do Conselho de revisão institucional Myongji University (MJUIRB). Além disso, este protocolo clínico foi em conformidade com as diretrizes da declaração de Helsinque e regulamento do KFDA. Para os procedimentos, consentimento informado foram obtido de pacientes.

1. lipoaspiração

Nota: Execute com técnica estéril.

  1. Use os seguintes critérios de inclusão: (1) provas de MRI da fase 3 OA; (2) masculino ou feminino; (3) mais de 18 anos de idade; (4) suficiente tecido adiposo de (100-110 g) para lipoaspiração; (5) falta de vontade de prosseguir com a intervenção cirúrgica; (6) a falha do tratamento conservador; e a dor incapacitante em curso (7).
  2. Use os seguintes critérios de exclusão: (1) doença inflamatória ou tecido conjuntivo ativa pensado para impactar a condição de dor (ou seja,lúpus, artrite reumatoide, fibromialgia); (2) ativo transtorno endócrino que possa afetar a condição de dor (ou seja,, hipotireoidismo, diabetes); (3) ativo distúrbio neurológico que possa afetar a condição de dor (ou seja,, neuropatia periférica, esclerose múltipla); (4) doença pulmonar ativa, que exigem o uso de medicação; e (5) sem histórico de injeções de esteroides conjuntas últimos 3 meses.
  3. Trazer o paciente para uma sala de cirurgia com uma capa de A de classe de risco biológico e coloque ele (ou ela) em posição supina.
  4. Limpe a área abdominal do paciente com 5% de betadine (povidone-iodo) e armar o paciente utilizando a técnica estéril, expondo a área limpa do abdômen para a lipoaspiração.
  5. Cerca de 5 cm infero-lateralmente a partir do umbigo, anestesiamos dois locais (um na esquerda e o outro no lado direito do umbigo) da incisão para fazer usando 2 mL de lidocaína a 2% sem epinefrina com uma agulha (25 gauge, 1½ polegadas) em uma seringa de 5 mL através da injeção de cada site a nível epidérmico.
  6. Anestesia o local da incisão para fazer usando 5 mL de solução tumescente (500 mL de normal salina, 40 mL de lidocaína a 2%, 20 mL de bupivacaína a 0,5%, 0,5 mL de epinefrina 1: 1000) em uma seringa de 10 mL com agulha (calibre 25, 1½ polegadas).
  7. Fazer 2 incisões de 0,5 cm aproximadamente 5 cm abaixo do umbigo lateralmente por beliscar a pele para aumentar a profundidade do nível subcutâneo.
  8. Usando lâmina n º 11, picar a pele levantada para penetrar ao nível subcutâneo, mas não para penetrar através da parede abdominal.
  9. Usando a cânula de calibre 16 cm 20, anestesia o nível subcutâneo da área conjunto inferior de abdômen, que é to-be-aspirada, com 700 a 800 mL da solução tumescente.
  10. Após acabamento infiltração do conjunto inferior abdômen com a solução tumescente, preparar um aparelho de lipoaspiração conectando-se uma cânula de 3,0 mm, ligada a um 60 mL (ou um 30ml) seringa para lipoaspiração manual ou uma cânula especialmente concebidos 3,0 mm conectado a um kit de centrífuga, uma seringa de sistema fechado, com a finalidade de manter a esterilidade, conectado a uma máquina de vácuo para a lipoaspiração assistida por vácuo.
  11. Execute a lipoaspiração para obter 100-110 g de tecido adiposo, excluindo a solução tumescente. Ao realizar a lipoaspiração, tecido adiposo será obtido junto com a solução tumescente, que deve ser separada e removida.
  12. Para separar a solução tumescente, primeiro pela gravidade, transfira o tecido adiposo no kit centrífuga a uma seringa de 60 mL e a seringa para baixo (ou seja, que a parte da seringa é na parte inferior). Por esperando 5-6 min, o tecido adiposo e o fluido tumescente serão separados. Remova o fluido na parte inferior da seringa pressionando a parte superior do êmbolo da seringa.
  13. Execute as etapas acima 1.9-1.11 até que tenha sido acumulado um total de 100-110 g de tecido adiposo (lipoaspirates) pelo joelho.

2. preparação da mistura ASC/ECM com sistema fechado estéril

  1. Após a separação da solução tumescente por gravidade e acumulando 50-55 g de lipoaspirates por cada kit de 60 mL centrífuga, um sistema fechado estéril, colocar os kits de 2 centrífuga em um balde de recipiente de centrífuga e girar a 1600 x g por 5 min, condensação a lipoaspirates e separando o fluido do tecido adiposo. Neste processo de mais condensa-se, o lipoaspirates pode produzir óleo gorduroso, em certos casos.
  2. Ser cauteloso para não agitar, remover a tampa de segurança e o plug na parte inferior do kit centrífuga.
  3. Remova o fluido de fundo pressionando lentamente para baixo na parte superior do êmbolo do kit centrífuga.
  4. Seringa de 60ml separado, dissolva 10mg de colagenase (5 mg de colagenase específico para o tecido conjuntivo24 ) e 5 mg de colagenase específico para tecido adiposo25com 50 mL de solução salina.
  5. Misturar aproximadamente 25-30 mL de lipoaspirate condensado com colagenase dissolvido (5 mg de colagenase específico para tecido conjuntivo) e 5 mg de colagenase específico para o tecido adiposo a uma proporção de 1:1 (v: v) conectando-se a seringa de 60 mL para um kit de centrífuga usando um conector especializado.
  6. Misture bem o lipoaspirate condensada e a colagenase, empurrando o conteúdo entre a seringa de 60 mL e os kits de centrífuga usando uma vara ou um traficante.
  7. Transfira a mistura da lipoaspirate e a colagenase volta para seringas de 60 mL.
  8. Conecte cada seringa de 60 mL contendo a mistura com um homogeneizador que contém lâminas.
  9. Conecte uma seringa de 60ml vazio à outra extremidade do homogenizador.
  10. Empurre a mistura na outra seringa de 60ml através do homogenizador para 4 -6 vezes, resultando em corte e picagem do lipoaspirate.
  11. Transferir o lipoaspirate homogeneizado e a mistura de colagenase volta para kits de centrífuga 60 mL através de um conector especializado
  12. Coloque os kits de centrífuga num recipiente para ser colocado em uma incubadora que tenha sido previamente aquecida a 37 ° C.
  13. Incube os kits de dois centrífuga com a mistura homogeneizada a 37 ° C por 40 min enquanto roda a 45 rpm.
  14. Após o 40 min de incubação, remova o recipiente da incubadora de forma estéril. Em seguida, remover os kits de centrífuga e colocá-los em uma máquina centrífuga.
  15. Centrifugar as misturas a 800 x g por 5 min separar o SVF derivadas de tecido adiposo.
  16. Após a centrifugação, remover o sobrenadante (que inclui a colagenase e digerido o tecido adiposo) de cada kits de centrífuga, removendo a tampa da seringa na parte superior do êmbolo e colocando uma seringa de 30 mL no êmbolo abertura através do bloqueio de seringa conexão.
  17. Lentamente, pressione para baixo a parte do barril da seringa de 30 mL para o sobrenadante encher a seringa de 30 mL.
  18. Pressione para baixo o barril de seringa de 30 mL até os último 3-4 mL de fundo do kit centrífuga, deixando apenas o último 3-4 mL de SVF derivadas de tecido adiposo. O sobrenadante será Descartado.
  19. Remova a seringa de 30 mL da parte superior do êmbolo e encha a seringa com dextrose 5% em solução de Ringer lactato (D5LR).
  20. Anexando-se a seringa de 30 mL, cheia de D5LR na parte superior do atuador de abertura, preencher os kits de centrífuga, contendo 3-4 mL de SVF derivadas de tecido adiposo, com D5LR até 55 mL.
  21. Remova a seringa de 30 mL, cap o êmbolo e centrifugue os kits de centrifugar novamente a 300 x g durante 4 min.
  22. Repita as etapas 2.17-2.21 para um total de 4 lavagens. A colagenase utilizada é xenogénica. Portanto, a maioria de colagenase é removido por 4 lavagens. No entanto, para aprovação da FDA, ajuste fino do protocolo pode ser necessário remover completamente os resíduos de colagenase em volume final, embora a quantidade atual de resíduos de colagenase pode ser insignificante o suficiente para os pacientes que não têm qualquer clínico efeitos colaterais.
  23. Após a centrifugaçãoth 4, a fim de obter o SVF final para a injeção, remova a tampa de segurança e o plug na abertura inferior do kit centrífuga, sem tremer ou transformar o kit de centrífuga.
  24. Anexe uma seringa de 20 mL para o fundo do kit centrífuga abertura usando um conector especialmente projetado.
  25. Puxe o êmbolo da seringa várias vezes e volta a agitar-se as células que se instalaram na parte inferior do kit centrífuga.
  26. Remover o volume total desejado o SVF contendo ASCs e ECM juntamente com outras células e tecidos (geralmente cerca de 3-4 mL de cada kit de centrífuga para injeções de articulação de joelho).

3. PRP preparação com técnica estéril

  1. Enquanto preparava o ASCs e ECM, desenhe com 2,5 mL de solução de anticoagulante citrato dextrose 30 mL de sangue autólogo.
  2. Transferi o sangue desenhado para os kits de centrífuga de 60 mL.
  3. Centrifugar o sangue extraído a 730 x g por 5 min e retire o sobrenadante para um novo kit de centrífuga de 60 mL. Centrifugue o sobrenadante a 1300 x g durante 4 min, resultando em 3-4 mL de PRP.
  4. Antes da injeção, adicionar 3% (p/v) de cloreto de cálcio na proporção de 10:2 (PRP: cloreto de cálcio, v: v) para a PRP para ativá-lo.
  5. Adicione 0,5% (p/v), como um andaime, HA para o PRP ativado com cloreto de cálcio. Estes ASCs com ECM, juntamente com o PRP, ativado pelo cloreto de cálcio, e HA defende a mistura ASC/ECM.

4. ASC/ECM baseada na mistura de tratamento

  1. Limpe o joelho do paciente com 5% de betadine e armá-lo de forma estéril.
  2. Palpe o anterior do joelho para o espaço articular entre os ossos da tíbia e fêmur.
  3. Anestesia o local da injeção superficialmente com lidocaína diluído (1 mL de lidocaína a 1% diluída com 4 mL de solução salina) da pele apenas fora da cápsula articular.
  4. Anestesia o interior da cápsula articular com ropivacaína diluída (ropivacaína a 0,75% 1ml diluída com 3 mL de solução salina).
  5. Misture 2 mL de HA para o 6-8 mL de SVF contido em uma seringa de 20 mL através do conector de seringa-para-seringa.
  6. Usando um conector de seringa-para-seringa, adicione 0,4 mL de cloreto de cálcio para o 3-4 mL de PRP que já foi preparado autólogo e estar pronto em uma seringa de 5 mL.
  7. Combine o 3,5-4,5 mL de cloreto de cálcio PRP em uma seringa de 5 mL com 8-10 mL de mistura SVF/HA em um 20ml seringa através de seringa para seringa conector.
  8. Imediatamente injete a mistura (cerca de 12-15 mL) lentamente a articulação tíbio-femoral anterior dos joelhos usando agulha de calibre 18 de 38 mm, com ou sem a orientação do ultra-som.
  9. Após a injeção, curativo no local da injeção com pressão dobrando a gaze de algodão 4 x 4 4 vezes e colocação de fitas sobre a gaze dobrada de 4 x 4.
  10. Instrua o paciente a permanecer ainda por 60 min permitir a fixação da célula.
  11. Instrua o paciente a limitar as atividades para o mínimo de 1 semana após a alta da clínica.
  12. Retornar à clínica para três injeções adicionais de PRP ativado por cloreto de cálcio durante 3 semanas.

5. acompanhamento pós-tratamento de

  1. Avalie o paciente na semana de 2, 4 e 16 (18 ou 22) para melhoria da dor em termos de escala analógica visual (VAS) e melhoria da função em termos de parâmetros de terapia física. Determine o índice de classificação funcional (FRI), VAS e amplitude de movimento (ROM) como descrito anteriormente,26,,27.
  2. Acompanhar o paciente por pós-tratamento MRI 3 meses após o tratamento.

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Representative Results

Três pacientes (uma mulher de 87 anos, com estágio 3 OA, um homem de 68 anos, com estágio 3 OA, e uma mulher de 60 anos com estágio 3 OA) sem qualquer passado significativo histórico médico apresentado à clínica com dor persistente no joelho e desejado para o potencial tratamento de SVF autólogo derivadas de tecido adiposo. Todos os três pacientes tinham seu joelho examinado por um cirurgião ortopédico e ofereceram-se para ter a substituição total do joelho (TKR) e estavam relutantes em fazer a cirurgia. Antes do procedimento, todos os três pacientes receberam múltiplas injeções de esteroides e HA sem qualquer melhoria prolongada.

O paciente do sexo feminino coreano 87 anos de idade, no momento do exame, queixou-se de dor intensa (Pontuação de VAS de 8; Figura 2A) enquanto no resto. Ela descreveu a dor aumentar ([FRI: 37; Figura 2A) ao caminhar, subir e descer escadas. Ao exame físico, observaram-se articulação suave inchaço com diminuição da ROM e ternura com flexão (Figura 2B). No entanto, sem frouxidão ligamentar foi apreciado. De McMurray e de Apley testes deram negativo. Um MRI antes-tratamento demonstrou um menisco medial diminuiu de tamanho junto com deformação e maceração. (Figura 2, 2E, 2Ge 2I).

O segundo paciente, um homem de 68 anos de idade coreano, se queixou de dor severa no joelho esquerdo (Pontuação VAS: 7; Figura 3A) enquanto no resto. A dor (FRI: 33; Figura 3A) foi descrito como aumentar ao caminhar, subir e descer escadas. Ao exame físico, havia deformidade leve com inchaço leve comum. ROM (Figura 3B) foi diminuída. Além disso, sem frouxidão ligamentar foi apreciado. De McMurray e de Apley testes deram negativo. Um antes-tratamento MRI mostrou cartilagem emagrecimento juntamente com um tamanho reduzido e deformada do menisco medial secundário para a meniscectomia anterior (Figura 3, 3E, 3Ge 3I). O paciente foi diagnosticado de ter fase 3 OA.

O terceiro paciente, uma mulher de 60 anos de idade coreano, também relatou dor severa (Pontuação VAS: 8; Figura 4A) no resto. A dor (FRI: 36; Figura 4A) foi descrito como aumentar ao caminhar. O paciente também tinha inchaço leve no joelho e diminuição da ROM (Figura 4B). Não há frouxidão ligamentar foi apreciado. De McMurray e de Apley testes deram negativo. Uma ressonância antes-tratamento mostrou diminuição do menisco medial tamanho com deformação e maceração, e houve queda de cartilagem (Figura 4, 4E, 4Ge 4I).

Plano de tratamento. Todos os três pacientes representativos foram impedidos de tomar esteroides, aspirina, drogas antiinflamatórias não-esteroides (AINEs) e asiáticos medicamentos à base de plantas pelo menos durante 1 semana antes do procedimento. Depois de tomar o MRI, estudos de imagem, lipoaspirates foram obtidas e processadas como referenciado acima. Depois, o SVF autóloga derivadas de tecido adiposo contendo ASCs, ECM, HA e cloreto de cálcio-ativado PRP autólogo foram injetados com os joelhos no dia 0. Não havia nenhuma complicação lipoaspirações e injeções conjuntas. Posteriormente, os pacientes retornou à clínica em uma semana, depois de 2 semanas e depois de 3 semanas para injeções adicionais de HA e PRP autólogo ativado com cloreto de cálcio.

Resultado. Após a segunda semana da injeção de mistura ASC/ECM, dor do paciente de 87 anos de idade e ROM melhoraram (Figura 2A e 2B). Na semana 16, dor do paciente e ROM melhoraram significativamente em mais de 70% (Figura 2A e 2B). Ressonância de pós-tratamento tomada após a 16º semana mostrou a maior espessura do tecido de cartilagem hialina, como no lado medial do joelho (Figura 2D, 2F, 2 He 2J). A título de comparação, a taxa de eficácia média foi 67% em dados usando este protocolo clínico, envolvendo 91 pacientes e relatado em 201315.

Figure 2
Figura 2: resultado das medições de dor (A) e gama de movimento (B); e MRI sagital (C-F) e coronal (G-J) sequencial T2 vista para o joelho do paciente caso 1. * indica uma constatação estatisticamente significativa (p < 0,05). Pré-tratamento de ressonâncias (C: imagem sequencial, 5/20; E: 6/20; G: 10/20; e eu: 11/20) mostram lesões de cartilagem (setas). Pós-tratamento MRI varreduras em 16 semanas (D: 6/20; F: 7/20; H: 10/20; e J: 11/20) indicam a regeneração dos tecidos, como cartilagem (seta) que tiver sido reparada por tratamento baseado na mistura ASC/ECM. Este valor foi modificado desde o relatório anterior da Pak et al 10. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Dor do paciente masculino 68 anos de idade e ROM melhoraram após a segunda semana da injeção de mistura ASC/ECM (Figura 3A e 3B). Por semana 18th , sua dor e ROM significativamente melhoraram a 80% (Figura 3A e 3B). Repetiu o MRI tomado após 18th semana mostrou um aumento na altura da cartilagem hialina, como tecido no lado anterior e medial do joelho (Figura 3D, 3F, 3h e 3J).

Figure 3
Figura 3 : Resultado das medições de dor (A) e gama de movimento (B); e MRI sagital (C-F) e coronal (G-J) sequencial T2 vista para o joelho do paciente caso 2. * indica uma constatação estatisticamente significativa (p < 0,05). Pré-tratamento de ressonâncias (C: imagem sequencial, 6/20; E: 7/20; G: 13/20; e eu: 14/20) mostram lesões de cartilagem (setas). Pós-tratamento MRI varreduras em 16 semanas (D: 6/20; F: 7/20; H: 13/20; e J: 14/20) indicam a regeneração dos tecidos, como cartilagem (seta) que tiver sido reparada por tratamento baseado na mistura ASC/ECM. Este valor foi modificado desde o relatório anterior da Pak et al 10. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Dor do paciente feminino de 60 anos e ROM melhoraram cerca de 50% após a segunda semana da injeção de mistura ASC/ECM, (Figura 4A e 4B). Na semana de 22nd , a dor e o ROM melhoraram significativamente mais 80% (Figura 4A e 4B). Repetidas MRI tomado após a semana de 22nd mostrou um aumento na altura da cartilagem hialina, como tecido no lado medial do joelho (Figura 4, 4F, 4he 4J).

Figure 4
Figura 4 : Resultado das medições de dor (A) e gama de movimento (B); e MRI sagital (C-F) e coronal (G-J) sequencial T2 vista para o joelho do paciente caso 3. * indica uma constatação estatisticamente significativa (p < 0,05). Pré-tratamento de ressonâncias (C: imagem sequencial, 4/20; E: 5/20; G: 10/20; e eu: 11/20) mostram lesões de cartilagem (setas). Pós-tratamento MRI varreduras em 16 semanas (D: 4/20; F: 5/20; H: 10/20; e J: 11/20) indicam a regeneração dos tecidos, como cartilagem (seta) que tiver sido reparada por tratamento baseado na mistura ASC/ECM. Este valor foi modificado desde o relatório anterior da Pak et al 10. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Em 2001, Zuk et al. células-tronco isoladas de tecido adiposo por quebrar a matriz de colágeno com colagenase6. Depois, o grupo mostrou que essas células-tronco isoladas de tecido adiposo pode transformar em cartilagem e outros tecidos da mesoderme, na origem, provando que essas células-tronco eram mesenquimais na origem.

Da mesma forma, o procedimento apresentado neste artigo é um protocolo modificado para aplicar o método semelhante para pacientes humanos. A principal modificação do protocolo é a incorporação do sistema fechado de seringas na obtenção e processamento da lipoaspirates a fim de minimizar o contato do ar, mantendo a facilidade da realização do procedimento. Usando tais seringas de sistema fechado, o tecido adiposo foi obtido através de lipoaspiração. Então, os lipoaspirates foram misturadas com colagenase dentro as seringas de sistema fechado. Depois, a colagenase foi removido da mistura diluindo a concentração de colagenase dentro as seringas de sistema fechado. O resultado final é uma SVF derivadas de tecido adiposo estéreis obtida com facilidade do processo.

Usando o método semelhante, Pak mostrou em 2011, pela primeira vez, que SVF autóloga derivadas de tecido adiposo pode ser usado para tratar a OA pacientes potencialmente regenerando tecidos semelhantes a cartilagem. Mais tarde, Pak et al. também demonstrou que SVF autóloga derivadas de tecido adiposo pode ser usado para tratar a lágrima menisco e condromalácia de patelas Regenerando o tecido fibroso, como cartilagem e cartilagem hialina, como tecido, respectivamente. Em 2013, Pak et al. relatou um estudo de segurança envolvendo 91 pacientes tratados com SVF autóloga derivadas de tecido adiposo. A eficácia média do estudo relatado foi de 67%, pavimentando o caminho para a possibilidade de aplicar autóloga derivadas de tecido adiposo SVF população em geral, paciente com cartilagem danos.

Um dos efeitos colaterais mais comuns relatados por Pak et al. em 2013 o estudo de segurança era inchaço comum pós-tratamento do joelho, que pode ser explicado pela morte de células-tronco) 1, 2) inflamação por hemácias contidas no PRP, e/ou colagenase 3) residual que permaneceu no volume final de SVF derivadas de tecido adiposo. Desde que MSCs existirem dentro de ECM de tecido adiposo11,12, digerir o lipoaspirates com colagenase para quebrar a matriz de arrendar as células-tronco é um processo obrigatório12. No entanto, depois de quebrar a matriz para liberar as células-tronco, a colagenase residual restante deverá ser totalmente retirado o volume final para evitar qualquer potencial inflamação que pode ser produzida pela colagenase residual28. Embora colagenase pode causar inflamação, uma quantidade insignificante de colagenase em volume final de SVF derivadas de tecido adiposo não pode provocar um inchaço comum. Tal volume final de SVF autóloga derivadas de tecido adiposo, com uma quantidade insignificante de colagenase tem sido usada com segurança para os últimos anos para tratar a OA de joelhos Regenerando o tecido da cartilagem, como.

Recentemente, dois métodos não enzimáticos para obtenção de derivados de tecido adiposo SVF foram introduzidas29,30. Estes métodos utilizam qualquer força ou ultra-som (vibracional) força mecânica, em vez de colagenase. Em 2018, D'Ambrosi et al. relatou um resultado de tratamento de quatro lesões osteocondrais do tálus do tornozelo com microfraturado, purificado autólogo tecido adiposo foi obtido por meio de força mecânica à desagregação da matriz29. A colagenase não foi usado para quebrar a matrix. Quatro pacientes foram tratados com microfraturou tecido adiposo (ou seja, mecanicamente quebrado tecido adiposo), para seu talo de29. Todos estes quatro pacientes mostrou melhora clínica 6 meses após o procedimento. Nenhum teve complicações. No entanto, sobre este estudo29, não havia nenhum relatório de potencial regeneração da cartilagem. Outro estudo publicado este ano envolvendo energia vibracional mostrou que a energia vibracional em certa frequência não era suficiente para isolar as células-tronco30.

Como mostrado acima, grupos diferentes têm diferentes protocolos para o uso de um tecido adiposo autólogo para tratar várias doenças degenerativas de comuns. O protocolo pode variar o tamanho da cânula utilizada para lipoaspiração, a quantidade de tecido adiposo utilizado, tipo e quantidade de colagenase (se houver), o método de injeções e assim por diante. Desde que MSCs existirem dentro de ECM do tecido adiposo, o efeito da colagenase, ou método de purificação usando forças mecânicas, pode desempenhar um papel importante. Especialmente, a eficácia da colagenase pode depender de fatores como o tamanho do tecido adiposo, quantidade de tecido adiposo, concentração de colagenase, tempo e temperatura de incubação com colagenase e o processo de remover as sobras colagenase, que pode causar danos de célula28.

Deve notar-se que colagenase, como é um componente importante deste procedimento para produzir células-tronco contendo derivados de tecido adiposo SVF, pode ter um efeito negativo sobre o volume final de SVF derivadas de tecido adiposo. Neste procedimento, colagenase é misturado com lipoaspirates condensado, homogeneizado, incubada e em seguida lavado. Ao longo deste processo, as células-tronco são expostas a colagenase, que pode ter um efeito prejudicial sobre a sobrevivência das células-tronco28. Muita concentração ou exposição prolongada de colagenase pode diminuir a viabilidade de células-tronco no volume final de28. Além disso, muito de colagenase deixada no volume final pode causar inflamação da articulação desde colagenase pode quebrar a matriz cartilaginosa do conjunto injetado28.

Além os potenciais efeitos negativos da colagenase, lipoaspiração pode levar a outras complicações potenciais. A fim de obter derivadas de tecido adiposo SVF, lipoaspiração deve ser realizada primeiro. Realizar lipoaspirações, como outros procedimentos médicos, carrega alguns potenciais complicações como irregularidades no contorno de pele, seromas, infecção, perfuração da parede abdominal, necrosante fasciíte, embolia gordurosa e embolia pulmonar. Entre essas complicações, irregularidades de contorno da pele são um efeito colateral muito comum que pode ser facilmente prevenido usando pequenas cânulas e evitando lipoaspirações superficial31,32. Seromas, que é uma coleção de líquido seroso na área aspirada, também pode ser um resultado de lipoaspiração agressivo33. Outras complicações potenciais tais como infecção, fascite necrosante, perfuração da embolia pulmonar, embolia gordurosa ou as paredes abdominais são possíveis. No entanto, estas complicações também podem ser prevenidas usando técnicas estéreis estritas e melhorando a adesão do paciente34.

Além disso, todos os três pacientes incluídos no estudo apresentado inicialmente com um leve derrame articular, um sinal claro de sinovite. Após o tratamento com derivados de tecido adiposo SVF, todos esses pacientes comuns inchaço melhorou. Por esta razão, também é razoável supor que a melhoria dos sintomas clínicos é não devido a regeneração de cartilagem possível, mas em vez disso, devido ao efeito anti-inflamatório e moduladora de células-tronco e/ou PRP na membrana sinovial35 , 36. Alternativamente, a melhora do sintoma pode ser contribuiu para efeito moduladora e anti-inflamatório de células-tronco e/ou PRP na membrana sinovial, juntamente com a possível regeneração do tecido, como cartilagem. Embora mais pesquisa é necessária para delinear o verdadeiro mecanismo de melhora do sintoma, esta injeção intra-articular percutânea de terapia com células em forma de autólogo, homogeneizado SVF derivadas de tecido adiposo com PRP autólogo ativado com cloreto de cálcio e/ou HA podem oferecer uma alternativa de tratamento para a atual estratégia de tratamento do joelho OA.

Quanto a adição de PRP autólogo é em causa, é amplamente aceito que o PRP contém vários fatores de crescimento e fatores de diferenciação para injetado MSCs para crescer e diferenciar37,38,39. PRP também demonstrou ter uma colagenase, neutralizando o efeito40. Sobre a adição de ácido hialurónico (HA), HA foi mostrado para ter um papel potencial como um material de andaime, devido a sua alta afinidade ao tecido cartilaginoso e um papel potencial para ajudar as células-tronco em penetrar a cartilagem matriz41.

Como mais novos processos de obtenção de derivados de tecido adiposo SVF disponíveis, uma otimização de um método de processamento lipoaspirates é necessária padronizar o processo. No entanto, isto pode ser uma tarefa difícil devido ao número de potenciais variações no processo de obtenção e processamento SVF autóloga derivadas de tecido adiposo. Por exemplo, diferenças na textura do tecido adiposo subcutâneo em cada paciente individual, devido ao envelhecimento ou o grau de obesidade, podem ter diferentes respostas a atividades de colagenase, resultando em um número diferente de ASCs no adiposo autólogo derivado de tecido SVF42. Além disso, o número de células-tronco em cada grama de tecido adiposo pode diferir de um paciente para outro, como mostrado pela grande variação dos números de células-tronco relatado em numerosas publicações7,19,20, 21 , 22 , 23.

Este protocolo apresentado neste artigo é um romance, inovador procedimento tentando melhorar a actual estratégia de tratamento humano joelho OA pelo potencialmente Regenerando o tecido da cartilagem, como com injeções percutâneas de autólogas derivadas de tecido adiposo SVF. O uso correto de colagenase é um passo importante e crítico neste protocolo. Usando o fechado sistema seringas para manter a esterilidade, enquanto mantendo a conveniência da realização do procedimento é a grande modificação do protocolo desenvolvido pela Zuk et al. 5 além disso, para aplicação em seres humanos, a quantidade residual de colagenase contido o final SVF derivadas de tecido adiposo deve ser insignificante para impedir qualquer inflamação das articulações. Existem limitações do presente protocolo: os resíduos de colagenase em volume final (embora isto possa ser insignificante), não controlar grupos que isoladamente injetado PRP e HA, sem biópsias, nenhuma evidência excluindo a melhoria dos sintomas clínicos devido ao PRP, o pequeno número de pacientes (estudo piloto), não desafiando componentes do SVF derivadas de tecido adiposo e nenhuma especificação do número de células-tronco em cada um dos 3 pacientes. Aplicando SVF derivadas de tecido adiposo para distúrbios como uma lágrima menisco, patelas condromalácia, distúrbios de hérnia de disco, uma cicatrização (ou não-cura) osso fratura, uma úlcera de pele não-cura, reconstrução de mama e outras doenças médicas podem Melhore os resultados clínicos. Embora estes são potenciais aplicações clínicas de SVF derivadas de tecido adiposo, pesquisas clínicas mais profunda e vigorosas são necessárias para incorporar SVF derivadas de tecido adiposo em configurações clínicas reais.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

O autor reconhece que o apoio da equipe do Mipro clínica médica e o desenho de figura por Mariana/David Lee. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação do Bio & programa de desenvolvimento de tecnologia médica da NRF financiada pelo MSIT (número NRF-2017M3A9E4078014); e o nacional Research Foundation da Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência e TIC (números NRF-2017R1A2B4002315 e NRF-2016R1C1B2010308).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
5% Betadine (povidone-iodine)  Firson Co., Ltd. 657400260
2% Lidocaine  Daehan Pharmaceutical Co. 670603480
Tumescent solution  Myungmoon Pharm. Co. Ltd. N01BB01 The solution was composed of 500 mL normal saline, 40 mL 2% lidocaine, 20 mL 0.5% marcaine, and 0.5 mL epinephrine 1:1000.
Liberase TL and TM research grade  Roche Applied Science 5401020001
D5LR Dahan Pharm. Co., Ltd. 645101072 Dextrose 5% in lactated Ringer's solution 
Anticoagulant citrate dextrose solution  Fenwal, Inc. NDC:0942-0641 The solution was composed of 0.8% citric acid,
0.22% sodium citrate, and 0.223% dextrose.
3% (w/v) Calcium chloride  Choongwae Pharmaceutical Co. 644902101
0.5% (w/v) HA (Hyaluronic acid ) Dongkwang pharm. Co., Ltd. 645902030
0.25% Ropivacaine Huons Co., Ltd. 670600150
Equipment
3.0 mm Cannula  WOOJU Medical Instruments Co. ML30200
60-mL Luer-Lock syringe BD (Becton Dickinson)  309653
Centrifuge Barrel Kit  CPL Co., Ltd. 30-0827044
Tissue homogenizer that contains blades CPL Co., Ltd. 30-0827045
Rotating incubator mixer Medikan Co., Ltd MS02060092
Centrifuge Hanil Scientific Inc. CE1133
Magnetic Resonance Imaging Philips Medical Systems Inc. 18068
Ultrasound Imaging System Samsung Medison co., Ltd CT-LK-V10-ICM-09.05.2007

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