Summary
Les auteurs décrivent le protocole détaillé de conception, simulation, expériences de wet-lab et l’analyse pour un carré d’accordéon d’ADN reconfigurable de 6 par 6 mailles.
Abstract
Systèmes mécaniques de nanostructure ADN ou DNA nanomachines, qui produisent le mouvement nanométriques complexes en 2D et 3D dans le nanomètre à résolution ångström, montrer beaucoup de potentiel dans divers domaines de la nanotechnologie comme les réacteurs moléculaires, délivrance de médicaments, et systèmes de nanoplasmonic. Le reconfigurable rack accordéon de l’ADN, qui peut manipuler collectivement un réseau échelle nanométrique 2D ou 3D des éléments, en plusieurs étapes en réponse aux entrées de l’ADN, est décrite. La plateforme a le potentiel d’augmenter le nombre d’éléments ADN nanomachines pouvant contrôler quelques éléments à l’échelle du réseau avec plusieurs étapes de reconfiguration.
Dans ce protocole, nous décrivons l’ensemble du processus expérimental du panier accordéon reconfigurable ADN de 6 par 6 mailles. Le protocole prévoit une procédure de simulation et de la règle de conception des structures et une expérience de humide-laboratoire de synthèse et de reconfiguration. En outre, l’analyse de la structure à l’aide de TEM (microscopie électronique à transmission) et FRET (transfert d’énergie de fluorescence resonance) est inclus dans le protocole. Les nouvelles méthodes de conception et de simulation couverts par le présent protocole aidera les chercheurs à utiliser la grille accordéon de l’ADN pour les autres applications.
Introduction
Systèmes mécaniques basés sur des nanostructures d’ADN ou d’ARN nanomachines1,2,3,4,5 sont uniques parce qu’elles produisent mouvement nanométriques complexes en 2D et 3D dans le nanomètre à résolution Ångström, selon divers biomoléculaire des stimuli2,3,6. En joignant les matériaux fonctionnels sur ces structures et en contrôlant leurs positions, ces structures peuvent être appliquées à différents domaines. Par exemple, ADN nanomachines ont été proposés pour un réacteur moléculaire7et drogue livraison8nanoplasmonic systèmes9,10.
Auparavant, nous avons introduit le reconfigurable rack accordéon de l’ADN, qui peut manipuler un réseau échelle nanométrique 2D ou 3D des éléments11 (Figure 1 a). Contrairement aux autres ADN nanomachines qui contrôlent seulement quelques éléments, la plate-forme manipulables collectivement périodiquement déployèrent des éléments 2D ou 3D en différentes étapes. Nous prévoyons qu’un réseau programmable de réaction chimique et biologique ou un système informatique moléculaire peut être construit de notre système, en augmentant le nombre d’éléments contrôlables. La grille accordéon de l’ADN est une structure, dans laquelle le réseau de faisceaux multiples de l’ADN est connecté aux articulations composées d’ADN simple brin (Figure 1 b). La grille accordéon générée par les faisceaux de l’ADN est reconfigurée par les écluses de l’ADN, qui s’hybrident pour la partie collante de poutres et de changent l’angle entre les poutres selon la longueur de la partie pontage des écluses (état verrouillé). En outre, plusieurs étape reconfiguration est démontrée en ajoutant de nouvelles écluses après la formation de l’État libre en détachant les serrures d’ADN à brin axée sur le pied déplacement12,13.
Dans ce protocole, nous décrivons le processus complet de conception et synthèse du rack accordéon ADN reconfigurable. Le protocole inclut la conception, la simulation, wet-lab expériences et analyse pour la synthèse de la grille accordéon de l’ADN de 6 par 6 mailles et une reconfiguration de ces. La structure visée par le protocole est le modèle de base de la précédente recherche11 et 65 nm de 65 nm de taille, composé de 14 poutres. En ce qui concerne la conception et la simulation, la conception structurale de la grille accordéon diffère de classiques ADN origami14,15 (c.-à-d., serrés). Par conséquent, la règle de la conception et la simulation moléculaire ont été modifiés aux méthodes traditionnelles. Pour illustrer, nous montrer la technique de la conception à l’aide de la méthode modifiée de caDNAno14 et la simulation de la grille accordéon à l’aide d’oxDNA16,17 avec des scripts supplémentaires. Enfin, les deux protocoles de TEM et de FRET pour l’analyse des structures de support accordéon configuré sont décrits.
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Protocol
1. conception des 6 par 6 ADN accordéon Rack avec caDNAno14
- Téléchargez et installez caDNAno 2.0 logiciel14 pour concevoir une grille accordéon de l’ADN (caDNAno 2.5 est également disponible sur https://github.com/cadnano/cadnano2.5). Ouvrez caDNAno14 et cliquez sur l' Outil de la place pour ajouter une nouvelle partie avec un treillis carré.
- Numéro de chaque faisceau de la grille accordéon et tirer sur le panneau de gauche de treillis de le caDNAno14 (Figure 2).
- Cliquez sur l’outil crayon et dessiner chaque faisceau sur le panneau de droite modifier les caDNAno14. Rupture des faisceaux chaque 32 bp, ce qui est pour les joints entre les faisceaux adjacents. Placer les filtres discontinues dans la même position que les articulations. Utilisez l' Outil d’insertion et l' Outil crayon dans caDNAno14 de laisser les joints supplémentaires monocaténaire véhicules multisegments.
- Cliquez sur l' Outil crayon et assembler les jointures. Chaque faisceau a sept articulations.
- Générer des filtres d’échafaudage pour fusionner les échafaudages dans la boucle à l’aide de l’échafaud rapportée antérieurement routage algorithme11. Ne laissez pas le domaine de liaison minimale entre les torons échafaudage et agrafe soit inférieure à 8 bp (Figure 3).
- Placez les échafaudages qui ne servent pas à l’Assemblée sur les sommets situés sur les côtés opposés du rack, accordéon, comme illustré à la Figure 3.
- Cliquez sur l' outil de rompre. Casser les brins où brins discontinues sont circulaires ou plus de 60 ans bp.
- Concevoir les brins d’ADN serrure.
- Cliquez sur l' outil de rompre. Saut 8 bp d’une région d’ADN discontinue pour faire une partie collante et supprimer 8 bp d’une région d’ADN discontinue. Il y a 18 pièces collantes (Figure 1) dans le panier d’accordéon 6 par 6.
- Placer les séquences qui sont complémentaires aux parties collantes aux deux extrémités des brins de verrouillage et reliez-les par une région de transition, qui se compose de brins de poly T de la longueur désirée (Figure 1 b).
- Pour la reconfiguration, ajouter 8 bp de séquences de pied à la fin de l’ADN se verrouille pour déplacement de brin. La séquence de pied utilisée est dans le tableau 2.
- Préparer des brins de poly A qui sont inverser complémentaires dans la région de transition.
- Brins de conception qui sont inverser complémentaires des écluses d’ADN pour l’expérience de la reconfiguration.
- Cliquez sur l' Outil de la séquence , puis cliquez sur échafaudage ADN. Choisissez l’échafaudage standard M13mp18. cliquez sur l' Outil exporter et enregistrer la séquence au format csv (tableau 1).
2. simuler la Structure avec l’oxDNA
- Téléchargez et installez l’oxDNA16,17. Le dernier code source est disponible sur https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/.
- Faire des fichiers de configuration de départ depuis le fichier de14 caDNAno en utilisant python script « cadnano_interface.py », qui est fourni dans le paquet de17 16,oxDNA. L’utilisation est la suivante : « python cadnano_interface.py cadnano_file.json sq ». Le fichier de la topologie et le fichier de configuration sont maintenant générés.
Remarque : Le fichier de topologie comprend combien de chapelets et nucléotides sont dans la structure et des informations au sujet de la colonne vertébrale-épine dorsale liaisons entre nucléotides. Le fichier de configuration inclut des informations générales telles que timestep, énergie et la taille de la boîte. Information d’orientation comme vecteur position, vecteur de la base de la colonne vertébrale, vecteur normal, vitesse et vitesse angulaire de nucléotides est également inclus (Figure 4). - Modifier les informations contenues dans le fichier de configuration et de la topologie du caDNAno14 pour les rendre reflète l’information véritable structure de la grille accordéon. Toutes les poutres sont disposés en parallèle lorsque les fichiers de topologie et la configuration du caDNAno14 sont visualisées. Cependant, la grille accordéon est une structure en treillis ainsi la distance entre les nucléotides collés sont loin pour simulation (Figure 5).
- Tourner et déplacer chaque faisceau vers la structure souhaitée. Les neuf colonnes sur la gauche dans le fichier de configuration sont le vecteur position, vecteur de la base de la colonne vertébrale et un vecteur normal (Figure 4). Pour faire pivoter un faisceau, tournez tout de position, vecteurs de base de la colonne vertébrale et normales à l’aide de la transformation de rotation. Puis déplacez un faisceau en changeant le vecteur de position pour le localiser tel qu’illustré à la Figure 5.
- Détendre la structure en utilisant le script fourni dans le paquet d’oxDNA (Voir l’exemple de $oxDNA/exemples/RELAX_INITIAL_CONFIGURATION pour plus d’informations).
- Exécuter la simulation de dynamique moléculaire pour 10 millions étapes en utilisant le fichier de configuration détendue. L’utilisation est la suivante : ". / oxDNA < input >' enregistrer les données tous les 5000 ou 10000 étapes.
- Visualisation
Remarque : Les structures ont été visualisés à l’aide de cogli.- Téléchargez et installez la dernière version de la cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/).
- Exécutez le cogli avec les fichiers de la topologie et la configuration de la simulation oxDNA. L’utilisation est la suivante : ". / cogli1 -t < fichier topologie >< fichier de configuration >'.
- Masquer la zone en appuyant sur b.
3. synthèse de la Structure
Remarque : La méthode de synthèse est adaptée de la dent protocole15,18.
- Achetez les agrafes ADN conçus d’un fournisseur d’oligonucléotide.
- Ajuster la concentration de ces agrafes d’ADN à 100 μM à l’aide de l’eau exempte de nucléase.
- Chaque brin d’ADN qui constitue une structure « État libre » dans un tube de piscine et ajuster la concentration à 2 μM pour chaque volet.
- Piscine ADN lock brins de longueur et le nombre de sites de serrure dans des tubes et ajuster la concentration à 2 μM pour chaque volet. 18, 9 et 4 sites de blocage sont utilisés. Ajouter les brins de A poly qui sont complémentaires dans la région de transition à la même concentration.
- Volets de piscine qui sont inverser complémentaire à l’ADN verrouillent les brins en longueur dans des tubes et ajuster la concentration à 2 μM pour chaque volet.
- Préparer la solution de MgCl2 de 300 nM en mélangeant 70 μL d’eau exempte de nucléase et 30 μl de 1 μM MgCl2 solution. Préparer un 5 x solution d’EDTA Tris en mélangeant 95 μL d’eau exempte de nucléase et 5 μL de solution d’EDTA Tris 100 x.
- Ajouter 2 μL d’agrafe ADN, 1,1 μL de solution de MgCl2 , 2 μL de solution d’EDTA de Tris, 7,6 μL d’eau exempte de nucléase et 7,3 μL d’échafaudage ADN dont la concentration est de 110 nM à faire 20 μL de stock mixte. La valeur de la concentration finale de l’échafaudage ADN à 40 nM, agrafez ADN à 200 nM, MgCl2 à 16 mM et solution d’EDTA de Tris à 0,5 x.
- Chauffer rapidement la mélange de la solution stock dans un thermocycleur à 80 ° C et laisser refroidir à 60 ° C à raison de 4 min par ° C et refroidir à 60 ° c à 4 ° C à raison de 40 min par ° C.
4. la purification de la Structure
Remarque : Les échantillons de toutes les structures ont été purifiées avant l’analyse. Dans cette section, nous décrivons le protocole de purification PEG, qui est une adaptation du précédent littérature19. L’échantillon peut également être purifié par électrophorèse sur gel comme décrit dans les précédents littérature15,18.
- Préparer 5 M de NaCl et 100 x Tris-EDTA.
- Préparer les précipitations-tampon en mélangeant 150 μL de PEG 8000, 500 μL de 100 x Tris EDTA et 101 μL de 5 M de NaCl et 249 μL d’eau exempte de nucléase.
- Préparer tampon cible en mélangeant 5,5 μL de solution 300 nM MgCl2 Section 3.3, 10 μL de solution d’EDTA de Tris pour la x 5 de l’article 3.3 et 84,5 μL d’eau exempte de nucléase.
- Mélanger 20 μL de la structure synthétisée de la Section 3 et 20 μL de tampon de précipitation de la Section 4.2. Puis faites tourner le stock mixte à 16000 x g à 4 ° C. Retirez le surnageant et dissoudre les granulés dans le tampon cible de la Section 4.3.
5. reconfiguration du panier accordéon d’un « État libre » pour un « état verrouillé »
- Synthétiser la structure sans blocages d’ADN pour l’expérience de la configuration.
- Préparer des brins d’ADN verrouillage du chapitre 3.
- Ajouter 2 μL verrouillage des brins d’ADN de la longueur désirée en 20 μL de la structure synthétisée. Concentration des brins d’écluse l’ADN est cinq fois supérieure à la structure.
- Incuber l’échantillon pour 0, 10, 25, 50 ou 100 minutes pour voir à quelle vitesse reconfiguration se produit.
- Pour les 100 minutes d’incubation, incuber les échantillons à 50 ° C pendant 30 minutes et refroidir lentement à 25 ° C à un taux de 0,33 ° C par minute.
- Pour les 50 minutes d’incubation, incuber les échantillons à 50 ° C pendant 15 minutes et refroidir lentement à 25 ° C à un taux de 0,66 ° C par minute.
- Pour les 25 minutes d’incubation, incuber les échantillons à 50 ° C pendant 7,5 minutes et refroidir lentement à 25 ° C à un taux de 1,32 ° C par minute.
- Pour les 10 minutes d’incubation, incuber les échantillons à 50 ° C pendant 3 minutes et refroidir lentement à 25 ° C à un taux de 3,3 ° C par minute.
- Pour les 0-minutes d’incubation, stocker échantillon à 4 ° C droite après ajoutent des brins d’ADN serrures.
- Juste après l’étape de fixation, refroidir rapidement l’échantillon à 4 ° C pour éviter la dénaturation indésirable.
6. reconfiguration de la grille accordéon d’un état « verrouillé » à un « État libre »
- Synthétiser la structure avec les verrous de l’ADN de la longueur désirée pour l’expérience de la configuration.
- Préparer l’inverse des brins complémentaires du chapitre 3.
- Ajouter 2 μL de brins qui sont inverser complémentaires pour les brins de verrouillage de la longueur désirée en 20 μL de la structure synthétisée. Concentration des brins d’écluse l’ADN est cinq fois supérieure à la structure.
- Incuber l’échantillon pour 0, 12, 60, 120, 240 minutes pour voir à quelle vitesse reconfiguration se produit.
- Pour la 12, 60, 120, 240 minutes d’incubation, rapidement chauffer l’échantillon à 40 ° C et refroidir lentement jusqu'à 20 ° C pendant le temps correspondant à chacun. Juste après l’étape détachant, refroidir rapidement l’échantillon à 4 ° C pour éviter la dénaturation indésirable.
- Pour les 0-minutes d’incubation, stocker échantillon à 4 ° C droit après avoir ajoutent les brins complémentaires inverses.
7. TEM imagerie
Remarque : Protocole d’imagerie TEM est une adaptation du précédent littérature18,20.
- Préparer une solution de NaOH 1,25 M en mélangeant 87,5 μL d’eau exempte de nucléase et 12,5 μL de solution de NaOH à 10 M.
- Ajouter 1 μL de solution de NaOH de 1,25 M à 50 μL de la solution 2 % de formiate d’uranyle.
- Vortex la solution pendant 3 minutes et centrifuger à vitesse maximum pendant 3 minutes. Déposer 3 μl de l’échantillon purifié sur la grille TEM lueur-déchargé pendant 3 minutes et rincer rapidement avec du papier filtre.
- Déposer 7 μL de solution de formiate d’uranyle préparés pendant 30 secondes et rincer rapidement avec du papier filtre.
- Mesurer la longueur et l’angle de la structure accordéon imagée par TEM.
8. frette analyse
- Utilisez Atto 550 et Atto 647N colorant, pour lesquelles la distance Förster est 6,5 nm. Remplacer les Staple 58 et agrafe 117 dans le tableau 1 avec des brins de fluorescent étiquetés. Alors synthétiser la structure avec des brins de fluorescent étiquetés selon la méthode décrite à la Section 3.
- Mesurer la concentration de l’échantillon purifié.
- Normaliser l’échantillon à 10 nM et charge 50 μL de la 384 microplaque bien.
- Exciter l’échantillon avec colorants donneur et accepteur à 550 nm et mesurer le spectre de fluorescence de 570 nm à 800 nm avec un fluorimètre.
- Mesurer le spectre de fluorescence de l’échantillon donneur uniquement de la même manière.
- Exciter les colorants de l’échantillon à 650 nm et le spectre de fluorescence et la mesure de 670 nm à 800 nm. Il s’agit de mesurer la concentration de l’accepteur.
- Obtenir les écarts-types en répétant la même expérience avec trois échantillons, qui sont synthétisés et purifiés séparément.
- Calculer l’efficacité de la frette avec le rapport entre une méthode telle que décrite par l’équation ci-dessous21.
DA550: intensité de fluorescence accepteur pics de l’échantillon avec donneur et accepteur à une excitation de 550 nm.
D550: intensité de la Fluorescence à la gamme d’émissions accepteur de l’échantillon donneur uniquement à une excitation de 550 nm.
DA650: intensité de fluorescence accepteur pics de l’échantillon avec donneur et accepteur à une excitation de 650 nm.
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Representative Results
La grille accordéon de 6 conçu par 6 ADN est simulée de l’oxDNA16,17 et les résultats sont présentés dans la Figure 6. Du résultat de la simulation, il a été confirmé que la structure envisagée est formée sans déformation de la structure.
Les images TEM en Figure 7 sont des images de structures configurés avec une longueur de serrure de bp 2, 8, 13 et 20. Sur l’image, l’angle des structures (Figure 8 a) est diminué puisque la longueur de l’écluse s’allonge. Pour statistiquement analyser la tendance, la moyenne et l’écart-type de l’angle (Figure 8 a), de multiples structures configurés ont été obtenus (Figure 8 b). En outre, les résultats de mesure frette montrent des changements structurels et sa vitesse, en plus de la tendance structurelle illustré dans l’image TEM (Figure 8).
De ces procédures d’analyse, caractérisation de la grille accordéon ADN tels que les verrouillages combien sont nécessaires pour la configuration structurale et vitesse de reconfiguration a été déterminée.
Figure 1. Une porte accordéon reconfigurable-ADN. A. grille accordéon de l’ADN est composé de poutres rigides de l’ADN et les multiples articulations souples qui relient chaque faisceau. La grille accordéon est configurée différemment selon la longueur de l’ADN de serrures. Diverses plates-formes 2D et 3D peuvent être conçus en modifiant la plate-forme. B. la reconfiguration de la grille accordéon ADN est réalisée avec l’hybridation d’ADN écluses avec différentes longueurs. Dans la structure « État libre », lorsque des nucléotides supplémentaires sont ajoutés pour les véhicules multisegments (ou les articulations, jaunes), en raison de la mauvaise connexion entre les poutres de l’ADN (comprenant deux hélices), l’angle peut être modifié (partie supérieure). Hybridation de l’ADN de serrures avec différentes longueurs de la pièce de pont à la partie collante de deux faisceaux adjacents génère l’état « verrouillé » (partie inférieure). Brin de déplacement utilisant les éléments de pied (bleus) de l’ADN de serrures avec le brin de carburant détacher les verrous de l’ADN de l’état de verrouillage de la structure et modifier l’état de la liberté. En répétant le processus avec les différentes bibliothèques des écluses ADN, la structure est reconfigurée avec des angles différents. Ce chiffre a été modifié de la précédente recherche11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. porte accordéon-6 de 6 est conçu à l’aide de la caDNAno. Les 14 poutres de la grille accordéon de l’ADN sont numérotées et dessinés sur le panneau de treillis de le caDNAno. Ce chiffre a été modifié de la précédente recherche11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Algorithme de routage d’échafaudage. A. les échafaudages qui ne servent pas à l’Assemblée sur les sommets situés sur les côtés opposés de la grille accordéon. B. sept boucles fermées sont fusionnées en une seule boucle en générant des véhicules multisegments échafaudage. Au moins six points de véhicules multisegments échafaudage sont nécessaires et la position des filtres de l’échafaudage est adaptée de la littérature antérieure. Ce chiffre a été modifié de la précédente recherche11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Exemple de fichier de configuration. Le fichier de configuration inclut des informations générales, notamment le timestep, énergie et boîte de taille et l’orientation. Les neuf colonnes sur la gauche dans le fichier de configuration sont respectivement le vecteur position, vecteur de la base de la colonne vertébrale et un vecteur normal. Les six colonnes sur la droite sont des vitesses et des vitesses angulaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5. Visualisation du fichier de configuration avant et après la modification. Position, vecteur de base de la colonne vertébrale et normal a été modifiée à l’aide de transformation rotation pour faire en sorte que les informations contenues dans le fichier de configuration reflète l’information structurale de la grille accordéon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6. Résultat de la simulation d’oxDNA. La grille accordéon avec verrous de l’ADN, dont les longueurs sont bp 2, 8, 13 et 20, ont été simulées. 18 sites de blocage ont été utilisés. Un rack accordéon 6 par 6 avec de l’ADN verrouiller dont la longueur est A 2 bp, B 8 bp, C 13 bp et D 20 bp sont simulées etvisualisés par cogil. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7. Images TEM de supports accordéons à ADN 6 configurée par 6. Structures avec des longueurs de serrure A 2 bp, B 8 bp, C 13 bp et D 20 bp ont été imagées. 18 sites de blocage ont été utilisés pour cette expérience. (barre d’échelle : 100 nm). Ce chiffre a été modifié de la précédente recherche11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8. Le contrôle de l’angle de la grille accordéon 2D. L’angle de la grille accordéon composée de 6 par 6 mailles était contrôlée par la longueur des écluses ADN. A. en ajoutant serrures d’ADN avec des longueurs de 2, 8, 13 et 20 PB pour les 18 sites de verrouillage de la porte accordéon, l’angle (bleu) est configuré comme on le voit dans les images représentatives de TEM. La paire de colorant, Atto647N et Atto550 est attachée à la structure pour l’analyse de l’efficacité de frette. (barre d’échelle : 100 nm) B. la distribution des angles configurés. La ligne de tendance superposés (gris) est sur le graphique de le 1 écluse par 2 mailles. En outre, la grille de l’axe des abscisses correspond à la même grille sur le graphique de le 1 écluse par 2 mailles. Barres représentent un écart de l’angle moyen. C. la distribution des gains en efficience frette. Barres représentent un écart type de l’efficacité moyenne. D. Vous inquiétez pas changement d’efficacité alors que l’État est passé de la gratuité à verrouillé ou vice versa a été mesuré selon le temps d’incubation différentes. Le verrou de l’ADN avec la longueur de 2 bp a été utilisé. Barres représentent un écart type de l’efficacité moyenne. Ce chiffre a été modifié de la précédente recherche11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Nom | Séquence | Longueur | |||
| Aliment de base 1 | ATAAGAGGTCATTTTTGCGGATGGATGTTACT | 32 | |||
| Agrafe 2 | CAAAGTTACCAGAAGGAAACCGAGACATCGGG | 32 | |||
| Aliment de base 3 | ACAATGAAATAGCAATAGCTATCTCAAATAAA | 32 | |||
| Agrafe 4 | CGCTAATATGAACGGTGTACAGACCAGGCGCATAGGCTGGGAACAAAGTCAGAGGG | 56 | |||
| Agrafe 5 | CAGAAAACCCGGAATAGGTGTATCACCGTACTCAGGAGGTCCCCCTCAAATGCTTT | 56 | |||
| Agrafe 6 | AGTGAGAATAGAAAGGTATGATATTCAACCGTTCTAGCTGATAAATTATCAACAGT | 56 | |||
| Aliment de base 7 | ATTTGGGGCGCGAGCTATATGGTT | 24 | |||
| Aliment de base 8 | GCCTTTATTTCAACGCAAGGATAATTAATGGA | 32 | |||
| Staple 9 | TCAATTACCCACTACGAAGGCACCGGTAAAAT | 32 | |||
| Aliment de base 10 | ATTCAGTGAATAAGGCTTGCCCTGAAAACAGA | 32 | |||
| Staple 11 | AGAAACAATAACGGATTCGCCTGATAGCCGAA | 32 | |||
| Agrafes 12 | ATCAATATCTGGTCAGTTGGCAAAAGTAACAA | 32 | |||
| Agrafe 13 | CGGAGACAGTCAAATCACCATCAAGGGTTAGA | 32 | |||
| Agrafe 14 | GAGAATTAACTGAACACGAAACAAAGTACAACGGAGATTTGTATCATCGAAGCGCA | 56 | |||
| Aliment de base 15 | CGAGAGGGTTGATATAAGTATAGCATAGGAAC | 32 | |||
| Agrafes 16 | CCCTTATTAGCGTTTGCCATCTTTTGGTGCCG | 32 | |||
| Aliment de base 17 | GTTTTCATCGGCATTTATGCCGGA | 24 | |||
| Agrafes 18 | GTAGCAACTTCCAGTAAGCGTCATGTCTCTGA | 32 | |||
| Staple 19 | AGCTAATGCAGAACGCAATAAACA | 24 | |||
| Aliment de base 20 | CCGTAATGGGATAGGTCACGTTGGGCCTATTT | 32 | |||
| Staple 21 | ACCAGAGCCACCACCGCGAGAGGC | 24 | |||
| Agrafe 22 | AGGCTCCAAAAGGAGCCGTTTACCAGACGACGATAAAAACCAAAATAGAAAATCTC | 56 | |||
| Aliment de base 23 | GCCGGAAGGAAACGCAATAATAACGGAATACCCAAAAGAACTCACAATTCCACACA | 56 | |||
| Agrafe 24 | TTTTTCACCGGTGTCTGGAAGTTTCATTCCATATAACAGTACTAAAGGAATTGCGA | 56 | |||
| Aliment de base 25 | ATCAGGTCTTTACCCTCGCATTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTGACCATA | 56 | |||
| Agrafe 26 | TGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTGACATTCA | 32 | |||
| Staple 27 | AATAAAGAAATTGCGTAGATTTTCAGCTGCTC | 32 | |||
| Staple 28 | CCCAATCCTCGCACTCCAGCCAGCTTTCCGGCACCGCTTCAAAATAAACAGCCATA | 56 | |||
| Staple 29 | AAAGACTTCAAATATCATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTTGAGTGATTAAGAG | 56 | |||
| Staple 30 | GTAGCGACAGAATCAAGTTTGCCTGATTTAGA | 32 | |||
| Staple 31 | GCCACCCTCAGAACCGCCACCCTCAACAAGAG | 32 | |||
| Agrafe 32 | AAGCAAGCCGTTTTTATTTTCATCTCCTGATT | 32 | |||
| Staple 33 | GAGGGTAGCTATTTTTGAGAGATCCGTCAGAC | 32 | |||
| Agrafe 34 | TATGACCCTGTAATACTCCCATCCTAATTTACGAGCATGTAGAAACCAGTTGTACC | 56 | |||
| Staple 35 | GATTAGAGAGTACCTTAACAGTGCCCGTATAAACAGTTAATGCCCCCTAACTCCAA | 56 | |||
| Aliment de base 36 | CGTCTTTCCAGACGTTGTAGGAATCATTACCGCGCCCAATAGCAAGCACGATCTAA | 56 | |||
| Staple 37 | TTTAACGTCAAAAATGAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACAAGAAACG | 56 | |||
| Staple 38 | TTTAACGGGGTCAGTGCCTTGAGTATAAGGGA | 32 | |||
| Aliment de base 39 | AATTGTGTGCAAAATCCCTTATAAGGTGGTTC | 32 | |||
| Staple 40 | ACCAGTAGCACCATTACCATTAGCTTTCAGGG | 32 | |||
| Staple 41 | AAACATCAAGAAAACAAAATTAATTCACATTA | 32 | |||
| Staple 42 | TTGGCCTTGATATTCATCATCTTT | 24 | |||
| Staple 43 | TGCATCAATCAACAGTTGAAAGGAATTGAGGAAGGTTATCATTATAGTCAGAAGCA | 56 | |||
| Staple 44 | GCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTAGGGGACG | 32 | |||
| Staple 45 | TCCTCATTAAAGCCAGAATGGAAAAGCAAGAA | 32 | |||
| Staple 46 | GAGCCTAATTTGCCAGGGGGGTAATAGTAAAATGTTTAGACTGGATAGAACGAGCG | 56 | |||
| Staple 47 | TAAGAGCAACACTATCATAACCCTTTAACGTC | 32 | |||
| Staple 48 | ATAGCAAGCCCAATAGGAACCCATGCAAAATC | 32 | |||
| Staple 49 | CATAAAAACTTAGAGCTTAATTGCTGAATATAATGCTGTATAGCAGCCTTTACAGA | 56 | |||
| Agrafes 50 | ATTTACCGGGCTACAGAGGCTTTGGAACGAGG | 32 | |||
| Staple 51 | GTGCCTAATGAGTGAGAATGCAGATACATAACGCCAAAAGGAATTACGAAGTGTAA | 56 | |||
| Staple 52 | ATACCGATAGTTGCGCATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTTTCTTAA | 56 | |||
| Staple 53 | ATAACCGATACCGAAGCCCTTTTTAAGAAAAGTAAGCAGAAATGACAACAACCATC | 56 | |||
| Staple 54 | TCAGAGCCGCCACCCTCAGAACCGGCTCAACA | 32 | |||
| Staple 55 | TTTTGCAAAAGAAGTTTTGCCAGAAATCAAAA | 32 | |||
| Staple 56 | GGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTAAGAAACC | 32 | |||
| Staple 57 | ACATGTTCAAAGACACCACGGAATCATATAAA | 32 | |||
| Staple 58 | CTGTGTGAAATTGTTAGAGTAATGTGTAGGTAAAGATTCAAAAGGGTGTGGTCATA | 56 | |||
| Staple 59 | TTTCGAGGCCGGATATTCATTACCCAAATCAACGTAACAAAATTGTATCGGTTTAT | 56 | |||
| Aliment de base 60 | CTTTAGGAGCACTAACAACTAATAAGCCCCAA | 32 | |||
| Staple 61 | AGATTAGTTGCTATTTTACAAAGGCTATCAGGTCATTGCCTGAGAGTCTTGAAGCC | 56 | |||
| Aliment de base 62 | GAGCCGCCGCCAGCATTGACAGGACTGACCTT | 32 | |||
| Staple 63 | GAAACCAGGCAAAGCGCCATTCGCTCATAGCC | 32 | |||
| Aliment de base 64 | CATCAAGAGTAATCTTGACAAGAACACCACCA | 32 | |||
| Staple 65 | AACCTTGCTTCTGTAAATCGTCGCTTATCAAC | 32 | |||
| Agrafe 66 | TAGTTAGCGACAACTCGTATTAAATCCTTTGCCCGAACGTGTAGCATTCCACAGAC | 56 | |||
| Staple 67 | ACCGATTGAGGGAGGGAAGGTAAAGGGGGATG | 32 | |||
| Agrafe 68 | TACCAGCGCCAAAGACAAAAGGGCGTTTAGCT | 32 | |||
| Staple 69 | TCATATATTTTAAATGCAATGCCTAAAACGAA | 32 | |||
| Staple 70 | ACATTATCATTTTGCGTATTGACG | 24 | |||
| Agrafe 71 | CGGAACCTATTATTCTGAAACATGCGGATTGA | 32 | |||
| Staple 72 | CCTGAGAGATATTTTGTTAAAATTTAAATTGT | 32 | |||
| Staple 73 | GAAACCATCGATAGCAAATCAGAT | 24 | |||
| Staple 74 | CTCAGAGCCGCCACCATATTGGGC | 24 | |||
| Staple 75 | CACCGACTTGAGCCATTTGGGAATACACTGAG | 32 | |||
| Staple 76 | TCATGAGGAAGTTTCCATTAAACGTTTGCGGG | 32 | |||
| Staple 77 | AAACAGGAAGATTGTATAAGCAAATAAAATAT | 32 | |||
| Staple 78 | ATCGTCACCCTCAGCAGCGAAAGAAGACTTTT | 32 | |||
| Staple 79 | ATCAACATTAAATGTGTTGTTCCA | 24 | |||
| Agrafes 80 | TGCAGGGAGTTAAAGGAACGAAAGAGGCAAAAGAATACACTAAAACACTTCGGTCG | 56 | |||
| Staple 81 | ACGTAATGCTGAGCAAAAGAAGATTATTCATT | 32 | |||
| Agrafe 82 | AATCGATGAACGGTAATCGTAAAATTAGTACC | 32 | |||
| Staple 83 | GACCCCCAGCGATTATACCAAGCGGAGGCAGG | 32 | |||
| Staple 84 | CGAAATCCGCGACCTGGCCTGATA | 24 | |||
| Staple 85 | GCCATCAAAAATAATTCGCGTCTGAGTGCCGT | 32 | |||
| Staple 86 | TCGGCTGTCTTTCCTTATCATTCCATTACCTT | 32 | |||
| Staple 87 | CAGACCGGGGGCGCATCGTAACCGTGCATCTGCCAGTTTGTTTAATTCGAGCTTCA | 56 | |||
| Staple 88 | GTTTGGAACAAGAGTCCACTATTACCTGTAGC | 32 | |||
| Staple 89 | AACAGTACATAAATCAATATATGTCGGGAGAA | 32 | |||
| Agrafes 90 | GACGTTGGGAAGAAAAATCTACGTCTGGCATG | 32 | |||
| Staple 91 | CAAAATCGCGCAGAGGCGGGAAAC | 24 | |||
| Staple 92 | ATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTGATGAAAC | 32 | |||
| Agrafe 93 | CCCCGGTTGATAATCACGTCCAAT | 24 | |||
| Staple 94 | ATGCCTGCAGGTCGACAAGAACGGGTATTAAACCAAGTACCGCACTCACCAGTGCC | 56 | |||
| Aliment de base 95 | GTTTGGATTATACTTCTGAATAATTGATTCCC | 32 | |||
| Staple 96 | ACCGAACTGACCAACTTTGAAAGATAATAAGT | 32 | |||
| Staple 97 | GCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCCCTCAGAG | 32 | |||
| Staple 98 | CAGTTGAGATTTAGGAATACCACATACATTTA | 32 | |||
| Staple 99 | TAGCCGGAACGAGGCGCAGACGGTTCCTTTTG | 32 | |||
| Aliment de base 100 | AGTATTAGACTTTACAAACAATTCCGTAATCA | 32 | |||
| Staple 101 | CTTGCGGGAGAACCGCCACCCTCAGAGCCACCACCCTCATGAGGCGTTTTAGCGAA | 56 | |||
| Staple 102 | TTAAGAACTGGCTCATATCAATAA | 24 | |||
| Staple 103 | CATACAGGCAAGGCAAAGAATTAGAAGTTTAT | 32 | |||
| Agrafe 104 | ATTGAGTTAAGCCCAAACATGGCTTTTGATGATACAGGAGTGTACTGGGAGATAAC | 56 | |||
| Staple 105 | ATAGAAGGCTTATCCGGTATTCTACGGAAACG | 32 | |||
| Staple 106 | CTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGATTTGAATA | 32 | |||
| Staple 107 | CTTACCAAGATTAGAGCCGTCAATAGATAATACATTTGAGCCCAGCTACAATTTTA | 56 | |||
| Staple 108 | ACCTTGCTGAACCTCAAAAGTATTAAGAGGCTGAGACTCCTCAAGAGAAAAAATCT | 56 | |||
| Staple 109 | TTTGTCACAATCAATAGAAAATTCCAATAAAT | 32 | |||
| Staple 110 | CAATTCTATTCAACTTTAATCATTCTTGAGAT | 32 | |||
| Staple 111 | ACGACAGTATCGGCCTCAGGAAGAGCTGGTTT | 32 | |||
| Staple 112 | ACTGCGGAATCGTCATAAATATTCATGTCAAT | 32 | |||
| Staple 113 | TTTCGTCACCAGTACAAACTACAAATCACCGT | 32 | |||
| Staple 114 | AATTCTGCGAACGAGTAGATTTAGTCCTGATT | 32 | |||
| Staple 115 | GAAATTATTCATTAAAGGTGAATTTTTAAAAG | 32 | |||
| Staple 116 | ACCAGAAGGAGCGGAATTATCATCTCGGTGCG | 32 | |||
| Staple 117 | AATTCGTAACGAGAAACACCAGAACGAGTAGTAAATTGGGGAGGATCCCCGGGTAC | 56 | |||
| Staple 118 | ATTAAGACTCCTTATTACGCAGTACCAGTCAG | 32 | |||
| Staple 119 | GGTTTAATCTAATAGTAGTAGCATGGTGGCAT | 32 | |||
| Staple 120 | AAACCGTCTTAGCGGGGTTTTGCTCAGTACCAGGCGGATATGGACTCCAACGTCAA | 56 | |||
| Staple 121 | TATCAAAATTATTTGCAGAAAGGC | 24 | |||
| Staple 122 | ACAACATTATTACAGGTAGAACCC | 24 | |||
| Staple 123 | CCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACCCTCA | 32 | |||
| Staple 124 | ACAATTTCATTTGAATTACCTTTTAGATTCAT | 32 | |||
| Staple 125 | GCTAAACACATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGAAATGAATTTTCTGTAT | 56 | |||
| Staple 126 | AATAGATAAGTCCTGAACAAGAAAGAGTGAAT | 32 | |||
| Staple 127 | AAAGCTAATGTTAGCAAACGTAGAAAATACATACATAAAGTTAAGCAATAAAGCCT | 56 | |||
| Staple 128 | TGTTTTAAATATGCAACTAAAGTACGCCTCCC | 32 | |||
| Staple 129 | ATACAGTAACAGTACCAGGCATAG | 24 | |||
| Staple 130 | GTAAAACGTTTGACCATTAGATACATTTCGCAAATGGTCACAGGGTTTTCCCAGTC | 56 | |||
| Agrafe 131 | AGTTGCAGCAAGCGGTCGCCTGGC | 24 | |||
| Staple 132 | ATGGCAATTCATCAATTCGAGAAC | 24 | |||
Le tableau 1. Séquence des brins discontinues
| Nom | Séquence |
| Toehold_1 | AGAAGTCG |
| Toehold_2 | AGGTATGG |
| Toehold_3 | CTCCACTC |
| Toehold_4 | GTGTCCGA |
| Toehold_5 | AAGTAGAC |
| Toehold_6 | GAGTCGCT |
| Toehold_7 | AGTGTCTA |
| Toehold_8 | GTATCGTG |
| Toehold_9 | CATCACAG |
| Toehold_10 | CGAGACTT |
| Toehold_11 | ACGGACGA |
| Toehold_12 | GCCTACTC |
| Toehold_13 | GATGTGGA |
| Toehold_14 | GCGTGCGT |
| Toehold_15 | GTGGACAA |
| Toehold_16 | TACGACTG |
| Toehold_17 | CAGCCGTG |
| Toehold_18 | TGCCGCAT |
Le tableau 2. Séquence de pied pour l’expérience de déplacement de brin
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Discussion
Ce protocole présente l’ensemble du processus de conception, simulation, synthèse et analyse de la base grille accordéon 2D de l’ADN. La conception modifiée et règles de simulation ont été décrites parce que la règle de conception diffère de celle de l’origami d’ADN standard, dans lequel la grille accordéon ADN a des nucléotides supplémentaires sur les filtres pour flexibilité14,15. Sur cette base, nous prévoyons que le protocole peut accélérer diverses recherches à l’aide de grilles accordéons ADN. En outre, le protocole décrit peut également servir à d’autres recherches en utilisant l’ADN nanostructure plutôt que standard origami ADN.
Pour les structures autres que la structure de base 2D a démontré dans le rapport de recherche original, la conception peut être faite sous réserve de modifications du protocole décrit. En bref, une structure de boxe-gants-printemps est conçue en changeant le nombre de faisceau et la longueur de la modèle de base. Nanotubular 3D structures peuvent également être créées en reliant les deux extrémités d’une structure de grille accordéon 2D. Toutefois, pour simuler les structures 3D, la position initiale des poutres sont à considérer dans l’espace 3D et l’état initial des poutres est censé être plié. Par conséquent, plus transformation informatique est nécessaire. Conception et simulation de divers 2D et 3D ADN accordéon grille structures seront déroulera en développant le programme assistée par ordinateur à l’avenir de la recherche.
Vitesse et la répétabilité de déclenchement sont également des facteurs importants dans le domaine de la nanotechnologie d’ADN dynamique. Des structures d’ADN récemment dynamiques qui répondent aux externes électriques ou de champ magnétique sont proposés et exploités à grande vitesse22,23. Tandis que la grille accordéon ADN a permis à actionnement collective des faisceaux multiples de l’ADN, la vitesse de reconfiguration n’est pas sensiblement améliorée depuis actionnement est basé sur le déplacement de brin de l’ADN. Pour les autres applications, réponse à des stimuli externes devrait être améliorée par l’optimisation de conception de serrure d’ADN ou d’utiliser un autre stimuli externes.
Comme une étude de la demande pour la structure accordéon reconfigurable, divers matériaux fonctionnels tels que les molécules de médicaments, nanoparticules, ou des protéines peuvent être attachée à la structure. Pour cela, les molécules peuvent être connectés à l’aliment de base qui existe à la position voulue. Dans l’ensemble, une série d’études de la demande peut être effectuée par le biais de ce protocole et ses modifications.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Cette recherche a été partiellement financée par le programme mondial de centre de développement de recherche par le biais de la Fondation des recherches National de Korea(NRF) financé par le ministère de la Science et les TIC (MSIT) (2015K1A4A3047345) et les Nano· Programme de développement des technologies matérielles grâce à la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de la Science et de la TIC (MSIT) (2012M3A7A9671610). L’Institut du génie à l’Université nationale de Séoul a fourni les installations de recherche pour ce travail. Auteurs reconnaissent la gratitude envers Yoon Tae-Young (Sciences biologiques, Université nationale de Séoul) au sujet de la spectroscopie de fluorescence pour l’analyse de la frette.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M13mp18 Single-stranded DNA | NEB | N4040s | |
| 1M MgCl2 Solution | Biosesang | M2001 | |
| Tris-EDTA buffer | Biosesang | T2142 | |
| Nuclease-Free Water | Qiagen | 129114 | |
| 5M Sodium Chloride solution | Biosesang | s2007 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| 10N NaOH | Biosesang | S2038 | |
| Uranyl formate | Thomas Science | C993L42 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | ||
| Nanodropic 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| TEM (LIBRA 120) | Carl Zeiss | ||
| Fluorometer Enspire 2300 | Perkin-Elmer | ||
| Centrifuge | Labogene | LZ-1580 |
References
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