Summary
Vi beskriver detaljert protokollen for design, simulering, våt-lab eksperimenter og analyse for en rekonfigurerbare DNA trekkspill rack med 6 av 6 masker.
Abstract
DNA nanostructure-baserte mekaniske systemer eller DNA nanomachines, som produsere komplekse nanoskala bevegelse i 2D og 3D i nanometer ångström oppløsning, viser stort potensial i ulike nanoteknologi som de molekylære reaktorene, narkotika-leveranser, og nanoplasmonic systemer. Det rekonfigurerbare DNA trekkspill racket, som kan kollektivt manipulere et 2D eller 3D nanoskala nettverk av elementer i flere etapper svar på DNA innganger, er beskrevet. Plattformen har potensial til å øke antall elementer som DNA nanomachines kan styre fra noen elementer til en nettverk skala med flere etapper for konfigurering.
I denne protokollen beskriver vi hele eksperimentelle prosessen med rekonfigurerbare DNA trekkspill rack med 6 av 6 masker. Protokollen inneholder en design regelen og simulering prosedyre av strukturer og en våt-lab eksperiment for syntese og konfigurering. I tillegg er analyse av strukturen TEM (overføring elektronmikroskop) og bånd (fluorescens resonans energioverføring) inkludert i protokollen. De nye design og simulering metodene dekket i denne protokollen vil assistere forskere bruke DNA trekkspill stativet for videre søknader.
Introduction
Mekaniske systemer basert på DNA nanostrukturer eller DNA nanomachines1,2,3,4,5 er unike fordi de produserer komplekse nanoskala bevegelse i 2D og 3D i nanometer til Ångström oppløsning, ifølge ulike biomolecular stimuli2,3,6. Feste funksjonelle materialer på disse strukturene og kontrollere sine posisjoner, kan disse strukturene brukes til ulike områder. For eksempel er DNA nanomachines foreslått for molekylær reaktoren7, stoffet levering8og nanoplasmonic systemer9,10.
Tidligere har innført vi det rekonfigurerbare DNA trekkspill racket, som kan manipulere et 2D eller 3D nanoskala nettverk av elementer11 (figur 1A). I motsetning til andre DNA nanomachines som kontrollerer bare noen elementer, kan plattformen kollektivt manipulere regelmessig plassert 2D eller 3D-elementer i ulike stadier. Vi forventer at en programmerbar kjemiske og biologiske reaksjon nettverk eller en molekylær datasystem kan bygges fra våre system, ved å øke antall kontrollerbar elementer. DNA trekkspill stativet er en struktur som nettverk av flere DNA bjelker er koblet til leddene består av enkelt-strandet DNA (figur 1B). Trekkspill stativet generert av DNA bjelker konfigureres av DNA-låser, som hybridize til klissete del av bjelker og endre vinkelen mellom bjelker ifølge den bygge bro delen av låser (låst). I tillegg er flere trinn rekonfigurering demonstrert ved å legge til nye låser etter dannelsen av free state ved frakobling DNA låser gjennom toehold-baserte strand forskyvning12,13.
I denne protokollen beskriver vi hele design og syntese prosessen med rekonfigurerbare DNA trekkspill stativet. Protokollen inneholder design, simulering, våt-lab eksperimenter og analyse for syntese av DNA trekkspill rack med 6 av 6 masker og en ny konfigurering av disse. Strukturen i protokollen er grunnmodellen til den tidligere forskning11 og er 65 nm ved 65 nm i størrelse, bestående av 14 bjelker. Når det gjelder design og simulering er den strukturelle utformingen av trekkspill stativet forskjellig fra konvensjonelle DNA origami14,15 (dvs. tett pakket). Derfor er design regelen og molekylære simulering endret fra tradisjonelle metoder. For å demonstrere, viser vi design teknikken bruker den endrede tilnærmingen caDNAno14 og simulering av trekkspill stativet oxDNA16,17 med skript. Til slutt, begge protokollene TEM og bånd for analyse av konfigurerte trekkspill rack strukturer er beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. prosjektert av 6 av 6 DNA trekkspill Rack med caDNAno14
- Laste ned og installere caDNAno 2.0 programvare14 for å designe en DNA trekkspill rack (caDNAno 2.5 er også tilgjengelig på https://github.com/cadnano/cadnano2.5). Åpne caDNAno14 og klikk Square verktøyet for å legge til en ny del med en firkantet gitter.
- Nummerere hver stråle av trekkspill stativet og trekke på venstre gitter panelet caDNAno14 (figur 2).
- Klikk blyant-verktøyet og tegn hver bjelke på høyre redigeringspanelet caDNAno14. Pause bjelker hver 32 bp, som er for skjøter mellom tilstøtende bjelker. Plass stiften overganger i samme posisjon som leddene. Bruk Sett inn verktøy og Blyant-verktøyet i caDNAno14 for å la leddene har flere single-strandet overganger.
- Klikk Blyant-verktøyet og koble leddene. Hver bjelke har syv leddene.
- Generere stillaset overganger for å flette stillasene i enkelt løkken ved hjelp av tidligere rapporterte stillaset ruting algoritmen11. Ikke la minimum domene bindende mellom stillaset og stift tråder være mindre enn 8 bp (Figur 3).
- Plass stillasene som ikke brukes i forsamlingen på hjørnene plassert på motsatte sider av trekkspill racket, som vist i Figur 3.
- Klikk bryte verktøyet. Bryte tråder der stift tråder er sirkulær eller lenger enn 60 bp.
- Utforme DNA lås tilnærmingene.
- Klikk bryte verktøyet. Pause 8 bp en stift DNA-regionen gjør en klebrig del og slette 8 bp en stift DNA-regionen. Det er 18 klissete deler (figur 1) i 6 av 6 trekkspill racket.
- Plasser sekvenser som er omvendt komplementær til klissete deler i begge ender av Lås tråder og koble dem ved en bygge bro region, som består av poly T tråder ønsket lengde (figur 1B).
- Konfigurere, legge 8 bp toehold sekvenser på slutten av DNA låser for strand forskyvning. Toehold sekvensen brukes er i tabell 2.
- Forberede poly A tråder som utføres omvendt utfyllende til bygge bro regionen.
- Design tråder som er omvendt komplementære DNA låser for rekonfigurering eksperimentet.
- Klikk Sekvens verktøyet og stillaset DNA. Velg skafottet som standard M13mp18. Klikk Eksporter verktøyet og lagre sekvens i csv-format (tabell 1).
2. simulere strukturen med oxDNA
- Dataoverføre og installere oxDNA16,17. Siste kildekoden er tilgjengelig på https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/.
- Gjøre Start konfigurasjonsfiler fra caDNAno14 filen med python-skript 'cadnano_interface.py', som er gitt i oxDNA16,17 pakken. Bruken er som følger: 'python cadnano_interface.py cadnano_file.json sq'. Topologi filen og filen genereres nå.
Merk: Filen topologi omfatter hvor mange tråder og nukleotider i strukturen og informasjon om ryggraden-ryggraden bånd mellom nukleotider. Konfigurasjonsfilen inneholder generell informasjon som timestep, energi og størrelse. Orienteringsinformasjon som posisjon vektor, ryggraden-base vektor, normal vektor, hastighet og vinkelhastighet av nukleotider er også inkludert (Figur 4). - Endre informasjonen i filen topologi og konfigurasjon fra caDNAno14 slik at de gjenspeiler den virkelige strukturinformasjonen fra trekkspill stativet. Alle bjelker ordnes parallelt når topologi og konfigurasjon filene fra caDNAno14 er visualisert. Trekkspill stativet er imidlertid en gitter struktur slik at avstanden mellom limt nukleotider langt for simulering (figur 5).
- Roter og Flytt hver bjelke ønsket gitteret struktur. Ni kolonnene til venstre i konfigurasjonsfilen er posisjon vektor, ryggraden-base vektor og normal vektor (Figur 4). Hvis du vil rotere en bjelke, rotere alle posisjon, ryggraden-base og normalt vektorer med roterende transformasjon. Deretter Flytt en bjelke ved å endre posisjon vektoren for å finne den som vist i figur 5.
- Slapp av strukturen med manuset leveres i oxDNA pakken (se eksempel i $oxDNA/eksempler/RELAX_INITIAL_CONFIGURATION for ytterligere informasjon).
- Kjør molecular dynamics simulering for ti millioner trinnene bruker avslappet konfigurasjonsfilen. Bruken er som følger: '. / oxDNA < input > "lagre data hver 5000 eller 10000 trinn.
- Visualisering
Merk: Strukturer ble visualisert ved hjelp av cogli.- Dataoverføre og installere den nyeste versjonen av cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/).
- Kjøre cogli med topologi og konfigurasjon filene fra oxDNA simuleringen. Bruken er som følger: '. / cogli1 -t < topologi filen >< konfigurasjonen arkiv >'.
- Trykk bfor å skjule boksen.
3. syntese av strukturen
Merk: Metoden syntese er tilpasset fra den forrige protokoll15,18.
- Kjøpe designet DNA stiftene fra en leverandør av oligonucleotide.
- Justere konsentrasjonen av disse stiftene DNA til 100 μM ved hjelp av nuclease-fritt vann.
- Bassenget hver DNA strand som utgjør en "free state" struktur i en tube og justere konsentrasjonen til 2 μM for hver strand.
- Bassenget DNA lås tråder av lengden og antallet Lås i rør og justere konsentrasjonen til 2 μM for hver strand. 18, 9 og 4 lås områder brukes. Legg poly A tråder som er komplementære til regionen bygge bro på samme konsentrasjonen.
- Bassenget tråder som utføres omvendt utfyllende til DNA lås tråder lengden på rørene og justere konsentrasjonen til 2 μM for hver strand.
- Forberede MgCl2 løsning 300 nM ved å blande 70 μL nuclease-fritt vann og 30 μL 1 μM MgCl2 løsningen. Forbered en 5 x Tris EDTA løsning ved å blande 95 μL nuclease-fritt vann og 5 μL 100 x Tris EDTA løsningen.
- Legg 2 μL stift DNA, 1.1 μL MgCl2 løsning, 2 μL Tris EDTA løsning, 7,6 μL nuclease-fritt vann og 7.3 μL stillaset DNA som konsentrasjonen er 110 nM å gjøre 20 μL blandet lager. Angi siste konsentrasjonen av stillaset DNA til 40 nM, stifter DNA 200 nM, MgCl2 til 16 mM og Tris EDTA løsning til 0,5 x.
- Raskt varme blandet lager løsningen i en termisk cycler til 80 ° C og kjølig til 60 ° C med en hastighet på 4 minutter per ° C og kule fra 60 ° C til 4 ° C med en rate på 40 min per ° C.
4. rensing av strukturen
Merk: Utvalg av alle strukturer ble renset før analyse. I denne delen beskriver vi protokollen for PEG rensing, som er tilpasset fra forrige litteratur19. Prøven kan også bli renset av gel geleelektroforese som beskrevet i forrige litteratur15,18.
- Forberede 5 M NaCl og 100 x Tris-EDTA.
- Forberede nedbør-bufferen ved å blande 150 μL av PEG 8000, 500 μL 100 x Tris EDTA og 101 μL 5 M NaCl og 249 μL nuclease-fritt vann.
- Forberede mål-bufferen ved å blande 5,5 μL 300 nM MgCl2 løsning fra delen 3.3, 10 μL 5 x Tris EDTA løsning fra delen 3.3 og 84.5 μL nuclease-fritt vann.
- Mix 20 μL syntetisert strukturen fra avsnitt 3 og 20 μL av nedbør-buffer fra delen 4.2. Store blandet aksjen 16000 x g på 4 ° C. Fjern nedbryting og oppløse pellet i mål-bufferen fra del 4.3 tilgang.
5. konfigurere trekkspill stativet fra "Fristat" til en "låst tilstand"
- Syntetisere strukturen uten DNA låser for konfigurasjon eksperimentet.
- Forberede DNA lås tråder fra avsnitt 3.
- Legge til 2 μL DNA lås tråder ønsket lengde i 20 μL syntetisert strukturen. DNA lås tilnærmingene konsentrasjonen er fem ganger høyere enn strukturen.
- Inkuber utvalget for 0, 10, 25, 50 eller 100 minutter å se hvor fort rekonfigurering oppstår.
- For 100 minutter-inkubasjon ruge prøven ved 50 ° C i 30 minutter og sakte kjøle ned 25 ° C med en hastighet på 0,33 ° C per minutt.
- 50 minutters inkubering, ruge prøven ved 50 ° C i 15 minutter og sakte kjøle ned 25 ° C med en hastighet på 0,66 ° C per minutt.
- 25 minutters inkubering, ruge prøven ved 50 ° C i 7,5 minutter og sakte kjøle ned 25 ° C med en hastighet på 1.32 ° C per minutt.
- 10 minutters inkubering, ruge prøven ved 50 ° C i 3 minutter og sakte kjøle ned 25 ° C med en hastighet på 3,3 ° C per minutt.
- Den 0-minutters inkubering, lagre utvalg 4 ° C til høyre når DNA låser tråder er lagt til.
- Rett etter det feste trinnet, må du raskt avkjølt prøve å 4 ° C å hindre uønsket rødsprit.
6. konfigurere trekkspill stativet fra en "låst tilstand" til en fri stat
- Syntetisere strukturen med DNA slusene i ønsket lengde for konfigurasjon eksperimentet.
- Forberede omvendt komplementære tråder fra avsnitt 3.
- Tilsett 2 μL av tråder som utføres omvendt utfyllende til lås tråder ønsket lengde i 20 μL syntetisert strukturen. DNA lås tilnærmingene konsentrasjonen er fem ganger høyere enn strukturen.
- Inkuber utvalget for 0, 12, 60, 120, 240 minutter å se hvor fort rekonfigurering skjer.
- For 12, 60, 120, 240 minutter inkubasjon raskt varme prøven til 40 ° C og sakte kjøle ned 20 ° C for gang tilsvarer hvert. Rett etter detaching trinn, må du raskt avkjølt prøve å 4 ° C å hindre uønsket rødsprit.
- Den 0-minutters inkubering, lagre utvalg 4 ° C til høyre når omvendt komplementære tråder er lagt til.
7. TEM Imaging
Merk: TEM tenkelig protokollen ble tilpasset fra forrige litteratur18,20.
- Forberede 1,25 M NaOH løsning ved å blande 87,5 μL nuclease-fritt vann og 12,5 μL 10 M NaOH løsning.
- Tilsett 1 μL 1,25 M NaOH løsning 50 μL av 2% uranyl formiat løsning.
- Vortex løsningen i 3 minutter og sentrifuger på maks fart i 3 minutter. Innskudd 3 μL renset prøven på glød-utladet TEM rutenettet i 3 minutter og raskt vaske ut med filter papir.
- Innskudd 7 μL forberedt uranyl formiat løsning i 30 sekunder og raskt vaske ut med filter papir.
- Måle lengden og vinkelen av trekkspill fotografert av TEM.
8. bånd analyse
- Bruke Atto 550 og Atto 647N fargestoff, som han selvmord avstanden er 6.5 nm. Erstatt stift 58 og stift 117 i tabell 1 med fluorescently merket tråder. Deretter syntetisere strukturen med fluorescently merket tråder av metoden beskrevet i kapittel 3.
- Måle konsentrasjonen av renset prøven.
- Normalisere prøve å 10 nM og laste 50 μL til 384 microplates godt.
- Opphisse prøven med giver og acceptor fargestoffer på 550 nm og måle fluorescens spekteret fra 570 nm 800 nm med en fluorometer.
- Måle fluorescens spekteret av donor-bare prøven på samme måte.
- Opphisse fargestoffer av utvalget på 650 nm og fluorescens spektrum og mål fra 670 nm 800 nm. Dette er å måle konsentrasjonen av acceptor.
- Få på standardavvikene ved å gjenta samme eksperiment med tre prøver, som syntetiserte og renset separat.
- Beregne bånd effektiviteten med forholdet en metode som beskrevet av ligningen under21.
DA550: Acceptor peak fluorescens intensiteten av prøven med giver og acceptor på 550 nm eksitasjon.
D550: fluorescens intensitet på acceptor utslipp rekke donor-bare prøven på 550 nm eksitasjon.
DA650: Acceptor peak fluorescens intensiteten av prøven med giver og acceptor på 650 nm eksitasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Designet 6 av 6 DNA trekkspill stativet er simulert oxDNA16,17 , og resultatene vises i figur 6. Fra simulering resultatet, ble det bekreftet at den tiltenkte strukturen dannes uten forvrengning av strukturen.
TEM bildene i figur 7 er bilder av konfigurerte strukturer med en lås lengde på 2, 8, 13 og 20 bp. På bildet, er vinkelen på strukturer (figur 8A) redusert som lengden på låsen blir lengre. Statistisk analysere tendensen, ble gjennomsnittet og standardavviket for vinkel (figur 8A) flere konfigurerte strukturer innhentet (figur 8B). Også bånd målingen resultatene viser strukturelle endringen og hastigheten, i tillegg til den strukturelle tendensen vises i TEM bildet (Figur 8 c).
Fra disse analyse prosedyrer, karakterisering av DNA trekkspill stativet som hvor mange låser er nødvendig for strukturelle konfigurasjon og rekonfigurering hastighet ble bestemt.
Figur 1. En rekonfigurerbare DNA trekkspill rack. A. The DNA trekkspill rack består av stive DNA bjelker og flere fleksibel leddene som kobler hver bjelke. Trekkspill stativet er konfigurert annerledes ifølge DNA låser. Ulike 2D og 3D plattformer kan utformes ved å endre plattformen. B. konfigurere DNA trekkspill stativet er oppnådd med blanding av DNA låser med forskjellige lengder. I 'fristat' strukturen, når ekstra nukleotider legges til overganger (eller ledd, gul), kan på grunn av løs forbindelsen mellom DNA bjelker (består av to helikser), vinkelen endres (øverst). Blanding av DNA låser med forskjellige lengder av broen til klissete del av både tilstøtende bjelker genererer "låst tilstand" (lavere del). Strand forskyvning toehold delene (blå) i DNA låser med drivstoff-strand løsne DNA låser fra låst av strukturen og endre statusen til gratis. Ved å gjenta prosessen med ulike biblioteker av DNA låser, konfigureres strukturen med forskjellige vinkler. Dette tallet er endret fra den forrige forskning11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. 6 av 6 trekkspill stativet er utformet med caDNAno. Den 14 bjelker av DNA trekkspill stativet er nummerert og trukket på gitter panel av caDNAno. Dette tallet er endret fra den forrige forskning11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Stillaset ruting algoritmen. A. skafottet som ikke brukes i forsamlingen på hjørnene plassert på motsatte sider av trekkspill stativet. B. syv lukkede sløyfer slås sammen til en enkelt løkke ved å generere stillaset overganger. Minst seks stillaset overganger poeng er nødvendig og plasseringen av stillaset overganger er tilpasset fra forrige litteratur. Dette tallet er endret fra den forrige forskning11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Eksempel på en konfigurasjonsfil. Konfigurasjonsfilen inneholder generell informasjon som timestep, energi og boksen størrelse og retning informasjonen. Ni kolonnene til venstre i konfigurasjonsfilen er posisjon vektor, ryggraden-base vektor og normal vektor henholdsvis. Seks kolonnene til høyre er fart og angular hastigheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Visualisering av konfigurasjonsfilen før og etter endringen. Posisjon, ryggraden-base og normalt vektor ble endret med roterende transformasjon gjøre informasjonen i konfigurasjonsfilen gjenspeiler strukturinformasjon fra trekkspill stativet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Simulering resultat oxDNA. Trekkspill brettet med DNA låser, som lengde er 2, 8, 13 og 20 bp, ble oppnådd. 18 låste områder ble brukt. En 6 x 6 trekkspill rack med en DNA låse som er A 2 bp, B 8 bp, C 13 bp og D 20 bp er simulert ogvisualisert ved cogil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. TEM bilder av konfigurerte 6 av 6 DNA trekkspill stativer. Strukturer med lås lengder A 2 bp, B 8 bp, C 13 bp og D 20 bp ble fotografert. 18 låste områder ble brukt til dette eksperimentet. (skala bar: 100 nm). Dette tallet er endret fra den forrige forskning11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Vinkel kontroll av 2D trekkspill stativet. Vinkelen på trekkspill stativet består av 6-av-6 masker ble kontrollert av lengden på DNA låser. A. legger til DNA låser med lengder på 2, 8, 13 og 20 bp i 18 låsing nettstedene til trekkspill stativet, vinkelen (blå) er konfigurert som sett i representant TEM bilder. Den dye par, Atto647N og Atto550 legges til strukturen for bånd effektivitet analyse. (skala bar: 100 nm) B. distribusjon av konfigurerte vinkler. Overlappet trendlinjen (grå) er fra grafen til 1 låsen per 2 masker. I tillegg tilsvarer rutenettet for x-aksen av samme rutenettet på grafen for 1 låsen per 2 masker. Barer representerer ett standardavvik fra mener vinkelen. C. fordelingen av bånd effektivitet. Barer representerer ett standardavvik fra mener effektiviteten. D. SLITE effektivitet endre mens staten overført gratis låst eller omvendt ble målt etter ulike inkubasjon ganger. DNA låsen lengden av 2 bp ble brukt. Barer representerer ett standardavvik fra mener effektiviteten. Dette tallet er endret fra den forrige forskning11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| navn | Sekvens | Lengde | |||
| Stift 1 | ATAAGAGGTCATTTTTGCGGATGGATGTTACT | 32 | |||
| Stift 2 | CAAAGTTACCAGAAGGAAACCGAGACATCGGG | 32 | |||
| Stift 3 | ACAATGAAATAGCAATAGCTATCTCAAATAAA | 32 | |||
| Stift 4 | CGCTAATATGAACGGTGTACAGACCAGGCGCATAGGCTGGGAACAAAGTCAGAGGG | 56 | |||
| Stift 5 | CAGAAAACCCGGAATAGGTGTATCACCGTACTCAGGAGGTCCCCCTCAAATGCTTT | 56 | |||
| Stift 6 | AGTGAGAATAGAAAGGTATGATATTCAACCGTTCTAGCTGATAAATTATCAACAGT | 56 | |||
| Stift 7 | ATTTGGGGCGCGAGCTATATGGTT | 24 | |||
| Stift 8 | GCCTTTATTTCAACGCAAGGATAATTAATGGA | 32 | |||
| Stift 9 | TCAATTACCCACTACGAAGGCACCGGTAAAAT | 32 | |||
| Stift 10 | ATTCAGTGAATAAGGCTTGCCCTGAAAACAGA | 32 | |||
| Stift 11 | AGAAACAATAACGGATTCGCCTGATAGCCGAA | 32 | |||
| Stift 12 | ATCAATATCTGGTCAGTTGGCAAAAGTAACAA | 32 | |||
| Stift 13 | CGGAGACAGTCAAATCACCATCAAGGGTTAGA | 32 | |||
| Stift 14 | GAGAATTAACTGAACACGAAACAAAGTACAACGGAGATTTGTATCATCGAAGCGCA | 56 | |||
| Stift 15 | CGAGAGGGTTGATATAAGTATAGCATAGGAAC | 32 | |||
| Stift 16 | CCCTTATTAGCGTTTGCCATCTTTTGGTGCCG | 32 | |||
| Stift 17 | GTTTTCATCGGCATTTATGCCGGA | 24 | |||
| Stift 18 | GTAGCAACTTCCAGTAAGCGTCATGTCTCTGA | 32 | |||
| Stift 19 | AGCTAATGCAGAACGCAATAAACA | 24 | |||
| Stift 20 | CCGTAATGGGATAGGTCACGTTGGGCCTATTT | 32 | |||
| Stift 21 | ACCAGAGCCACCACCGCGAGAGGC | 24 | |||
| Stift 22 | AGGCTCCAAAAGGAGCCGTTTACCAGACGACGATAAAAACCAAAATAGAAAATCTC | 56 | |||
| Stift 23 | GCCGGAAGGAAACGCAATAATAACGGAATACCCAAAAGAACTCACAATTCCACACA | 56 | |||
| Stift 24 | TTTTTCACCGGTGTCTGGAAGTTTCATTCCATATAACAGTACTAAAGGAATTGCGA | 56 | |||
| Stift 25 | ATCAGGTCTTTACCCTCGCATTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTGACCATA | 56 | |||
| Stift 26 | TGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTGACATTCA | 32 | |||
| Stift 27 | AATAAAGAAATTGCGTAGATTTTCAGCTGCTC | 32 | |||
| Stift 28 | CCCAATCCTCGCACTCCAGCCAGCTTTCCGGCACCGCTTCAAAATAAACAGCCATA | 56 | |||
| Stift 29 | AAAGACTTCAAATATCATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTTGAGTGATTAAGAG | 56 | |||
| Stift 30 | GTAGCGACAGAATCAAGTTTGCCTGATTTAGA | 32 | |||
| Stift 31 | GCCACCCTCAGAACCGCCACCCTCAACAAGAG | 32 | |||
| Stift 32 | AAGCAAGCCGTTTTTATTTTCATCTCCTGATT | 32 | |||
| Stift 33 | GAGGGTAGCTATTTTTGAGAGATCCGTCAGAC | 32 | |||
| Stift 34 | TATGACCCTGTAATACTCCCATCCTAATTTACGAGCATGTAGAAACCAGTTGTACC | 56 | |||
| Stift 35 | GATTAGAGAGTACCTTAACAGTGCCCGTATAAACAGTTAATGCCCCCTAACTCCAA | 56 | |||
| Stift 36 | CGTCTTTCCAGACGTTGTAGGAATCATTACCGCGCCCAATAGCAAGCACGATCTAA | 56 | |||
| Stift 37 | TTTAACGTCAAAAATGAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACAAGAAACG | 56 | |||
| Stift 38 | TTTAACGGGGTCAGTGCCTTGAGTATAAGGGA | 32 | |||
| Stift 39 | AATTGTGTGCAAAATCCCTTATAAGGTGGTTC | 32 | |||
| Stift 40 | ACCAGTAGCACCATTACCATTAGCTTTCAGGG | 32 | |||
| Stift 41 | AAACATCAAGAAAACAAAATTAATTCACATTA | 32 | |||
| Stift 42 | TTGGCCTTGATATTCATCATCTTT | 24 | |||
| Stift 43 | TGCATCAATCAACAGTTGAAAGGAATTGAGGAAGGTTATCATTATAGTCAGAAGCA | 56 | |||
| Stift 44 | GCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTAGGGGACG | 32 | |||
| Stift 45 | TCCTCATTAAAGCCAGAATGGAAAAGCAAGAA | 32 | |||
| Stift 46 | GAGCCTAATTTGCCAGGGGGGTAATAGTAAAATGTTTAGACTGGATAGAACGAGCG | 56 | |||
| Stift 47 | TAAGAGCAACACTATCATAACCCTTTAACGTC | 32 | |||
| Stift 48 | ATAGCAAGCCCAATAGGAACCCATGCAAAATC | 32 | |||
| Stift 49 | CATAAAAACTTAGAGCTTAATTGCTGAATATAATGCTGTATAGCAGCCTTTACAGA | 56 | |||
| Stift 50 | ATTTACCGGGCTACAGAGGCTTTGGAACGAGG | 32 | |||
| Stift 51 | GTGCCTAATGAGTGAGAATGCAGATACATAACGCCAAAAGGAATTACGAAGTGTAA | 56 | |||
| Stift 52 | ATACCGATAGTTGCGCATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTTTCTTAA | 56 | |||
| Stift 53 | ATAACCGATACCGAAGCCCTTTTTAAGAAAAGTAAGCAGAAATGACAACAACCATC | 56 | |||
| Stift 54 | TCAGAGCCGCCACCCTCAGAACCGGCTCAACA | 32 | |||
| Stift 55 | TTTTGCAAAAGAAGTTTTGCCAGAAATCAAAA | 32 | |||
| Stift 56 | GGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTAAGAAACC | 32 | |||
| Stift 57 | ACATGTTCAAAGACACCACGGAATCATATAAA | 32 | |||
| Stift 58 | CTGTGTGAAATTGTTAGAGTAATGTGTAGGTAAAGATTCAAAAGGGTGTGGTCATA | 56 | |||
| Stift 59 | TTTCGAGGCCGGATATTCATTACCCAAATCAACGTAACAAAATTGTATCGGTTTAT | 56 | |||
| Stift 60 | CTTTAGGAGCACTAACAACTAATAAGCCCCAA | 32 | |||
| Stift 61 | AGATTAGTTGCTATTTTACAAAGGCTATCAGGTCATTGCCTGAGAGTCTTGAAGCC | 56 | |||
| Stift 62 | GAGCCGCCGCCAGCATTGACAGGACTGACCTT | 32 | |||
| Stift 63 | GAAACCAGGCAAAGCGCCATTCGCTCATAGCC | 32 | |||
| Stift 64 | CATCAAGAGTAATCTTGACAAGAACACCACCA | 32 | |||
| Stift 65 | AACCTTGCTTCTGTAAATCGTCGCTTATCAAC | 32 | |||
| Stift 66 | TAGTTAGCGACAACTCGTATTAAATCCTTTGCCCGAACGTGTAGCATTCCACAGAC | 56 | |||
| Stift 67 | ACCGATTGAGGGAGGGAAGGTAAAGGGGGATG | 32 | |||
| Stift 68 | TACCAGCGCCAAAGACAAAAGGGCGTTTAGCT | 32 | |||
| Stift 69 | TCATATATTTTAAATGCAATGCCTAAAACGAA | 32 | |||
| Stift 70 | ACATTATCATTTTGCGTATTGACG | 24 | |||
| Stift 71 | CGGAACCTATTATTCTGAAACATGCGGATTGA | 32 | |||
| Stift 72 | CCTGAGAGATATTTTGTTAAAATTTAAATTGT | 32 | |||
| Stift 73 | GAAACCATCGATAGCAAATCAGAT | 24 | |||
| Stift 74 | CTCAGAGCCGCCACCATATTGGGC | 24 | |||
| Stift 75 | CACCGACTTGAGCCATTTGGGAATACACTGAG | 32 | |||
| Stift 76 | TCATGAGGAAGTTTCCATTAAACGTTTGCGGG | 32 | |||
| Stift 77 | AAACAGGAAGATTGTATAAGCAAATAAAATAT | 32 | |||
| Stift 78 | ATCGTCACCCTCAGCAGCGAAAGAAGACTTTT | 32 | |||
| Stift 79 | ATCAACATTAAATGTGTTGTTCCA | 24 | |||
| Stift 80 | TGCAGGGAGTTAAAGGAACGAAAGAGGCAAAAGAATACACTAAAACACTTCGGTCG | 56 | |||
| Stift 81 | ACGTAATGCTGAGCAAAAGAAGATTATTCATT | 32 | |||
| Stift 82 | AATCGATGAACGGTAATCGTAAAATTAGTACC | 32 | |||
| Stift 83 | GACCCCCAGCGATTATACCAAGCGGAGGCAGG | 32 | |||
| Stift 84 | CGAAATCCGCGACCTGGCCTGATA | 24 | |||
| Stift 85 | GCCATCAAAAATAATTCGCGTCTGAGTGCCGT | 32 | |||
| Stift 86 | TCGGCTGTCTTTCCTTATCATTCCATTACCTT | 32 | |||
| Stift 87 | CAGACCGGGGGCGCATCGTAACCGTGCATCTGCCAGTTTGTTTAATTCGAGCTTCA | 56 | |||
| Stift 88 | GTTTGGAACAAGAGTCCACTATTACCTGTAGC | 32 | |||
| Stift 89 | AACAGTACATAAATCAATATATGTCGGGAGAA | 32 | |||
| Stift 90 | GACGTTGGGAAGAAAAATCTACGTCTGGCATG | 32 | |||
| Stift 91 | CAAAATCGCGCAGAGGCGGGAAAC | 24 | |||
| Stift 92 | ATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTGATGAAAC | 32 | |||
| Stift 93 | CCCCGGTTGATAATCACGTCCAAT | 24 | |||
| Stift 94 | ATGCCTGCAGGTCGACAAGAACGGGTATTAAACCAAGTACCGCACTCACCAGTGCC | 56 | |||
| Stift 95 | GTTTGGATTATACTTCTGAATAATTGATTCCC | 32 | |||
| Stift 96 | ACCGAACTGACCAACTTTGAAAGATAATAAGT | 32 | |||
| Stift 97 | GCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCCCTCAGAG | 32 | |||
| Stift 98 | CAGTTGAGATTTAGGAATACCACATACATTTA | 32 | |||
| Stift 99 | TAGCCGGAACGAGGCGCAGACGGTTCCTTTTG | 32 | |||
| Stift 100 | AGTATTAGACTTTACAAACAATTCCGTAATCA | 32 | |||
| Stift 101 | CTTGCGGGAGAACCGCCACCCTCAGAGCCACCACCCTCATGAGGCGTTTTAGCGAA | 56 | |||
| Stift 102 | TTAAGAACTGGCTCATATCAATAA | 24 | |||
| Stift 103 | CATACAGGCAAGGCAAAGAATTAGAAGTTTAT | 32 | |||
| Stift 104 | ATTGAGTTAAGCCCAAACATGGCTTTTGATGATACAGGAGTGTACTGGGAGATAAC | 56 | |||
| Stift 105 | ATAGAAGGCTTATCCGGTATTCTACGGAAACG | 32 | |||
| Stift 106 | CTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGATTTGAATA | 32 | |||
| Stift 107 | CTTACCAAGATTAGAGCCGTCAATAGATAATACATTTGAGCCCAGCTACAATTTTA | 56 | |||
| Stift 108 | ACCTTGCTGAACCTCAAAAGTATTAAGAGGCTGAGACTCCTCAAGAGAAAAAATCT | 56 | |||
| Stift 109 | TTTGTCACAATCAATAGAAAATTCCAATAAAT | 32 | |||
| Stift 110 | CAATTCTATTCAACTTTAATCATTCTTGAGAT | 32 | |||
| Stift 111 | ACGACAGTATCGGCCTCAGGAAGAGCTGGTTT | 32 | |||
| Stift 112 | ACTGCGGAATCGTCATAAATATTCATGTCAAT | 32 | |||
| Stift 113 | TTTCGTCACCAGTACAAACTACAAATCACCGT | 32 | |||
| Stift 114 | AATTCTGCGAACGAGTAGATTTAGTCCTGATT | 32 | |||
| Stift 115 | GAAATTATTCATTAAAGGTGAATTTTTAAAAG | 32 | |||
| Stift 116 | ACCAGAAGGAGCGGAATTATCATCTCGGTGCG | 32 | |||
| Stift 117 | AATTCGTAACGAGAAACACCAGAACGAGTAGTAAATTGGGGAGGATCCCCGGGTAC | 56 | |||
| Stift 118 | ATTAAGACTCCTTATTACGCAGTACCAGTCAG | 32 | |||
| Stift 119 | GGTTTAATCTAATAGTAGTAGCATGGTGGCAT | 32 | |||
| Stift 120 | AAACCGTCTTAGCGGGGTTTTGCTCAGTACCAGGCGGATATGGACTCCAACGTCAA | 56 | |||
| Stift 121 | TATCAAAATTATTTGCAGAAAGGC | 24 | |||
| Stift 122 | ACAACATTATTACAGGTAGAACCC | 24 | |||
| Stift 123 | CCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACCCTCA | 32 | |||
| Stift 124 | ACAATTTCATTTGAATTACCTTTTAGATTCAT | 32 | |||
| Stift 125 | GCTAAACACATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGAAATGAATTTTCTGTAT | 56 | |||
| Stift 126 | AATAGATAAGTCCTGAACAAGAAAGAGTGAAT | 32 | |||
| Stift 127 | AAAGCTAATGTTAGCAAACGTAGAAAATACATACATAAAGTTAAGCAATAAAGCCT | 56 | |||
| Stift 128 | TGTTTTAAATATGCAACTAAAGTACGCCTCCC | 32 | |||
| Stift 129 | ATACAGTAACAGTACCAGGCATAG | 24 | |||
| Stift 130 | GTAAAACGTTTGACCATTAGATACATTTCGCAAATGGTCACAGGGTTTTCCCAGTC | 56 | |||
| Stift 131 | AGTTGCAGCAAGCGGTCGCCTGGC | 24 | |||
| Stift 132 | ATGGCAATTCATCAATTCGAGAAC | 24 | |||
Tabell 1. Sekvensen av stiften tråder
| navn | Sekvens |
| Toehold_1 | AGAAGTCG |
| Toehold_2 | AGGTATGG |
| Toehold_3 | CTCCACTC |
| Toehold_4 | GTGTCCGA |
| Toehold_5 | AAGTAGAC |
| Toehold_6 | GAGTCGCT |
| Toehold_7 | AGTGTCTA |
| Toehold_8 | GTATCGTG |
| Toehold_9 | CATCACAG |
| Toehold_10 | CGAGACTT |
| Toehold_11 | ACGGACGA |
| Toehold_12 | GCCTACTC |
| Toehold_13 | GATGTGGA |
| Toehold_14 | GCGTGCGT |
| Toehold_15 | GTGGACAA |
| Toehold_16 | TACGACTG |
| Toehold_17 | CAGCCGTG |
| Toehold_18 | TGCCGCAT |
Tabell 2. Toehold sekvens for strand forskyvning eksperimentet
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen lanserer hele prosessen fra design, simulering, syntese og analyse av grunnleggende 2D DNA trekkspill stativet. Modifisert design og simulering regler har blitt beskrevet fordi design regelen er forskjellig fra standard DNA origami, i at DNA trekkspill stativet har flere nukleotider på overganger for fleksibilitet14,15. Fra dette forventer vi at protokollen kan akselerere ulike undersøkelser med DNA trekkspill stativer. I tillegg kan beskrives protokollen også brukes til andre forskning ved hjelp av DNA nanostructure i stedet for standard DNA origami.
For strukturer enn 2D basisstrukturen vist i det opprinnelige forskning papiret, kan design gjøres med modifikasjoner av beskrevet protokollen. I korte trekk er en boksing-hansker-våren struktur designet av endre strålen antall og varighet fra den grunnleggende modellen. 3D nanotubular strukturer kan også opprettes ved å koble begge ender av en 2D trekkspill rack struktur. Men for å simulere 3D strukturer, utgangsposisjon for bjelker bør vurderes i 3D-rom og utgangstilstanden for bjelker skal være. Derfor er mer beregningsorientert transformasjon nødvendig. Design og simulering av ulike 2D og 3D DNA trekkspill rack strukturer vil bli utført ved å utvikle programmet datamaskin-hjulpet i fremtiden forskning.
Hastighet og repeatability av aktivering er også viktige faktorer i feltet dynamisk DNA nanoteknologi. Nylig dynamisk DNA-strukturer som svarer til eksterne elektrisk eller magnetiske felt er foreslått og drives med høy hastighet22,23. Mens DNA trekkspill stativet har aktivert kollektive aktivering av flere DNA bjelker, var rekonfigurering hastigheten ikke betydelig bedret siden aktivering er basert på DNA strand forskyvning. For videre søknader, bør svar på eksterne stimuli forbedres ved å optimalisere DNA lås design eller en annen ytre stimuli.
Som en søknad studie for rekonfigurerbare trekkspill strukturen, ulike funksjonelle materialer som stoffet molekyler, kan nanopartikler eller proteiner knyttes til strukturen. For dette, kan molekyler kobles til stiften som finnes på den tiltenkte beliggenheten. Samlet kan en rekke programmet studier bli gjennomført gjennom denne protokollen og modifikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Denne forskningen ble delvis støttet av Global Development Center forskningsprogrammet gjennom National Research Foundation av Korea(NRF) finansiert av departementet for vitenskap og IKT (MSIT) (2015K1A4A3047345) og Nano· Materielle Technology Development Program gjennom National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap og IKT (MSIT) (2012M3A7A9671610). Institute of Engineering Research ved Seoul National University gitt forskningsanlegg for dette arbeidet. Forfatterne bekrefter takknemlighet mot Tae-unge Yoon (biologi, Seoul National University) om fluorescens spektroskopi for bånd analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M13mp18 Single-stranded DNA | NEB | N4040s | |
| 1M MgCl2 Solution | Biosesang | M2001 | |
| Tris-EDTA buffer | Biosesang | T2142 | |
| Nuclease-Free Water | Qiagen | 129114 | |
| 5M Sodium Chloride solution | Biosesang | s2007 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| 10N NaOH | Biosesang | S2038 | |
| Uranyl formate | Thomas Science | C993L42 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | ||
| Nanodropic 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| TEM (LIBRA 120) | Carl Zeiss | ||
| Fluorometer Enspire 2300 | Perkin-Elmer | ||
| Centrifuge | Labogene | LZ-1580 |
References
- Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
- Cha, T. -G., et al. Design principles of DNA enzyme based walkers: Translocation kinetics and photo-regulation. Journal of the American Chemical Society. 137 (29), 9429-9437 (2015).
- Gerling, T., Wagenbauer, K. F., Neuner, A. M., Dietz, H. Dynamic DNA devices and assemblies formed by shape-complementary, non-base pairing 3D components. Science. 347 (6229), 1446-1452 (2015).
- Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology. Nature nanotechnology. 6 (12), 763-772 (2011).
- Li, J., et al. Exploring the speed limit of toehold exchange with a cartwheeling DNA acrobat. Nature Nanotechnology. 1, (2018).
- Krishnan, Y., Simmel, F. C. Nucleic acid based molecular devices. Angewandte Chemie International Edition. 50 (14), 3124-3156 (2011).
- Liu, M., et al. A DNA tweezer-actuated enzyme nanoreactor. Nature communications. 4, 2127 (2013).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), New York, N.Y. 831-834 (2012).
- Kuzyk, A., et al. Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules. Nature Materials. 13 (9), 862-866 (2014).
- Zhou, C., Duan, X., Liu, N. A plasmonic nanorod that walks on DNA origami. Nature communications. 6, 8102 (2015).
- Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. A Reconfigurable DNA Accordion Rack. Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).
- Chen, H., et al. Understanding the Mechanical Properties of DNA Origami Tiles and Controlling the Kinetics of their Folding and Unfolding Reconfiguration. Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6995-7005 (2014).
- Han, D., Pal, S., Liu, Y., Yan, H. Folding and cutting DNA into reconfigurable topological nanostructures. Nature Nanotechnology. 5 (10), 712-717 (2010).
- Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature methods. 8 (3), 221-229 (2011).
- Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. DNA Nanotweezers Studied with a Coarse-Grained Model of DNA. Physical Review Letters. 104 (17), 178101 (2010).
- Snodin, B. E. K., et al. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
- Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami. Journal of Visualized Experiments. (106), e51272 (2015).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and Scalable Preparation of Pure and Dense DNA Origami Solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles. Journal of Visualized Experiments. (99), e52486 (2015).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in enzymology. 211, 353-388 (1992).
- Kopperger, E., et al. A self-assembled nanoscale robotic arm controlled by electric fields. Science. 359 (6373), New York, N.Y. 296-301 (2018).
- Lauback, S., et al. Real-time magnetic actuation of DNA nanodevices via modular integration with stiff micro-levers. Nature Communications. 9 (1), 1446 (2018).
