Summary
여기는 고정, 설치, 영상, 및 후 이미징 단계 초파리 의 성인 다리에 형광 단백질 axonal 대상으로 시각화 하는 프로토콜에 설명 합니다.
Abstract
대부분 신경 사양에 대 한 작업의 유전자와 순수 세공 모델 C에서 실시 되었습니다. 선 충, 초파리 애벌레 및 물고기, 모든 운동의 그들의 기본 모드 (예: 크롤링 또는 수영) undulatory 운동에 참여. 그러나, 보다 정교한 개별 모터 신경 (미네소타) 규격의 이해-이상 질병 치료를 알리는 측면에서-더 나은 모델의 복잡 한 돌출부 기반 운동 체계는 동등 하 게 세공 시스템 요구 척추 동물입니다. 걸어 담당 성인 초파리 운전 시스템 모두 충족 이러한 기준의 쉽게, 이후이 모델에서 쉽게 고유 다리 MNs (다리 당 약 50 MNs) 작은 수의 규격을 연구 수 둘 다 광대 한 사용 강력한 유전자 도구, 및 돌출부 기반 운동 체계의 생리 적 맥락에서 배열입니다. 여기 우리는 성인 비행에 다리 근육 신경 분포를 시각화 하는 프로토콜을 설명 합니다.
Introduction
척 추가 있는 사지 처럼 초파리 성인 다리 세그먼트로 구성 됩니다. 각 비행 다리는 각각의 구성 하는 여러 근육 섬유1,214 근육을 포함 되어 있습니다. 성인 다리 MNs의 셀 시체 (prothoracic) T1, t 2 (mesothoracic), 및 복 부 신경 코드 (VNC), 척추 척수 (그림 1)에 유사한 구조의 각 측에 T3 (metathoracic) 중추에 있습니다. 어떤 대상 근육은 동측 다리 (고관절, trochanter, 대 퇴 골, 경골)의 4 개의 세그먼트에서 (그림 1)3각 중추에 약 50 MNs가 있다. 중요 한 것은, 각 개별 성인 다리 미네소타 동물3,4사이 진부 매우 독특한 형태학 상 id를 있다. 이러한 독특한 MNs 라는 neuroblasts (NBs) 다리 MNs 애벌레 단계3,4생산 11 줄기 세포에서 파생 됩니다. 모든 애벌레 단계의 끝에 미 숙 postmitotic MNs 취득 그들의 특정 수지상 아 버 및 axonal 터미널 대상 그들의 독특한 형태3,4를 정의 하는 변 태 중 분화. 이전 녹음 방송 요인 (TFs)의 조합 코드 각 초파리 성인 다리 미네소타5의 독특한 형태를 지정 하는 가설 테스트. 모델, 우리 혈통 B 11 주의 계보는 MNs에서 7을 생산 하 고 조합 코드 postmitotic 성인 다리 MNs에에서 표현 하는 TFs의 그들의 개별 형태학 지시 증명 중 하나를 사용 합니다. MNs의 TF 코드 reprograming 여 우리 미네소타 형태학 예측 가능한 방식으로 전환할 수 있다. 우리는 이러한 TFs 전화: mTFs (형태학 TFs)5.
성인 MNs의 형태소 분석의 가장 어려운 부분 중 하나는 높은 해상도 자동 형광 표 피를 통해 축 삭을 시각화입니다. 우리는 일반적으로 DVglut Gal4같은 이진 식 시스템과 MNs에 표현 되는 막 태그 GFP와 축 삭 라벨 /UAS-mCD8::GFP 또는 DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, DVglut 는에 표현 하는 강한 드라이버 motoneurons6. Repressible 마커 (MARCM)7,8, cis-MARCM 또는 MARCMbow5모자이크 분석 등 다른 클론 기술로 이러한 도구를 결합 하 여 MNs phenotypic 분석의 모집단 GFP 식이 제한할 수 있습니다. 축 삭 쉽게. 우리는 프로토콜 성인 다리의 내부 구조 (1) 고정 등 성인 초파리 다리에 본질적인 특정 문제를 해결 하 여 이미징 및 후속 3D 재구성 그대로 다리 미네소타 axonal 형태를 유지 하기 위해 생성 된 축 삭 형태학, 형광 식 생과 다리 근육에 영향을 주지 않고 전체 구조는 coverslip 아래와 표 피를 처리 하는 이미지, 그리고 (3) 이미지에 대 한 적절 한 방향으로 유지 하기 위해 다리의 (2) 장착 배경으로 axonal 형광 신호입니다. 이 프로토콜 미네소타 axons에서 형광 식의 검출에 대 한 자세한 되었습니다 동안 시각화 절지동물의 다리 neuromusculature의 다른 구성 요소에 적용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 다리 절 개 및 고정
- 유리 다 잘 접시와 채우기 적절 한 수의 70% 에탄올과 웰 스 가져가 라. 추가 15-20 공동2-각 (중 섹스의 모든 나이) 마 취 파리 잘와 브러쉬를 사용 하 여 부드럽게 소량 에탄올 솔루션으로 파리 파리 완전히 잠긴 때까지.
참고:이 단계는 표 피의 hydrophobicity를 제거 하는. 이 자동-형광 표 피의 증가 하기 때문에 1 분 이상 씻지 않는. - 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1에서 3 번 0.3% 비 계면 활성 제 세제 솔루션으로 파리를 헹 구 십시오. 적어도 10 분 동안이 솔루션에 파리를 유지.
참고: 때 다리 안쪽 정착 액의 침투를 증가 하는 세제를 포함 하 여 다리 고정 잘 됩니다. - 4 %paraformaldehyde (PFA) 튜브 함께 얼음에 다 잘 접시를 놓습니다.
참고: 신선한 4%의 준비는 16 %PFA 에탄올 무료 재고 솔루션에서 PFA이 중요 합니다. - 집게를 사용 하 여 머리와 파리의 복 부 흉부 세그먼트 또는 다리를 손상 없이 제거 하.
참고: 비행 하 고 다리 부를 쉽게 제거 하는 복 부. - 집게와 흉부 세그먼트에서 다리를 해 부하 고 4%를 포함 하는 우물에서 다리 PFA. 이 위해, 다리 분리 될 때까지 잘 집게의 팁을 사용 하 여 고관절 흉부 접합에서 부드럽게 하지만 단단히 밀어.
- 4% PFA 4 ° C (대략 20 h 총)에서 하룻밤에 다리를 수정.
- 1 x PBS에 0.3% 비 계면 활성 제 세제 솔루션, 20 분 동안 5 배 다리를 씻어.
- 설치 중간에 세척 버퍼를 바꿉니다. 다리에 그것의 완전 한 침투 수 있도록 장착 전에 적어도 하루에 대 한 설치 중간에 다리를 유지.
참고: 경우 장착 매체는 높은 점성, 점도에 급격 한 변화는 붕괴 하 고 다리의 전체 구조를 손상 표 피를 발생할 수 있습니다 때문에 장착 매체 1 x PBS와 80%에 희석. Gal4 드라이버에 따라 장착까지 미디어를 마운트에 4 ° C에서 1 ~ 3 주 위해 파리를 유지 수 있습니다.
2. 다리 장착
- 70% 글리세롤의 약 20 µ L 현미경 슬라이드와 커버 평방 22 x 22 m m2 coverslip (그림 2A, B)의 왼쪽에 놓습니다. 평행 하는 작은 거리에서이 coverslip의 오른쪽 가장자리에서 라인을 따라 설치 매체의 약 10 µ L 플라스틱 (그림 2C) 슬라이드의 오른쪽에 추가 장착 매체의 또 다른 30 µ L를 추가 합니다.
참고: 다리 (아래 참조)는 coverslip를 적용할 때 설치 매체 부드럽게 확산 됩니다는 coverslip 아래와 다리 주위 그들을 전치 하지 않고. - 미세 집게를 사용 하 여 솔루션에서 다리를 들어올려 고 부드럽게 왼쪽된 coverslip 근처 장착 매체에 그것을 넣어. 각 다리에 대해 동일 하 고 위에서 아래로 (그림 2D) 그들을 정렬.
- 들어올린 다리는 집게의 두 끝 사이 매체의 한 방울에 전송. 두 가지 방법으로 다리 방향: 외부 측 위 또는 아래로.
- 모든 다리 (최대 6-8 다리 거치 될 수 있다) 올바르게 정렬 하 고, 일단 넣어 두 번째 coverslip 다리는이 coverslip 이전 배치 coverslip (그림 2E) 하는 coverslip와 조직 사이의 공간에 대 한 있도록 약간 달려있다 점점 손상된 (그림 2G)에서 다리를 방지 합니다.
참고: 또는 스티커 우물 또는 교정 왁 스는 coverslip와 슬라이드 사이의 공간에 사용. - 매니큐어를 사용 하 여 각 모서리 (그림 2F)에서 coverslips의 위치를 확보.
참고: 조직 이미지 준비가 이제는.
3입니다. 영상
- GFP 형광과 표 피 자동 형광을 동시에 488 nm 레이저 및 두 개의 검출기를 사용 하는 단일 트랙을 설정 합니다. 소프트웨어의 빛 경로 창의 스펙트럼 창에서 범위 컨트롤 또는 슬라이더 디스플레이 사용 하 여 하나의 검출기 (검출기 1) 498-535 nm와 다른 하나 (감지기 2) 566-652 nm 사이 사이 감지 범위를 설정 합니다.
참고: 일반적으로, 발견자 1 이어야 한다 GaAsP 검출기와 검출기 2 광 전 증폭 관 관. 498-535 채널 최적의 GFP 신호를 감지 하지만 표 피에서 자동 형광 탐지. 그러나, 566-652 채널 (그림 3A) 표 피에서 자동 형광만 감지합니다. - X 20을 사용 하 여 또는 25 X 기름 침수 목표, 1024 x 1024 픽셀 해상도, 12-비트 깊이 Z 간격으로 1 µ m. 설정된 픽셀 면만 약 1.58 µs, 시간 평균 2 프레임/이미지 설정. 목표를 사용 하 여 높은 수 가늠 구멍으로.
- Confocal 현미경 및 이미징 소프트웨어 사용에 따라 다른 모든 설정을 설정 합니다.
- 498-535 검출기 보다 566-652 검출기에서 밝은 표 피 신호를 얻을 수 있는지 확인 합니다. 이렇게 하려면 두 탐지기 488-레이저 같은 레이저 파워를 사용 합니다. 채도 마커를 사용 하 여 먼저 검출기 충분히 밝은 GFP 신호 (그림 3B, D)를 1의 이득을 조정 합니다. 그런 다음 높은 표 피 신호 (다리, 관절의 가장자리)와 일부 지역이이 검출기 (그림 3C, E)에서 포화 신호 생성 되도록 감지기 2의 이득 조정.
- 다리 확장 하 고 단일 프레임에 이미지를 너무 큰 경우 현미경 이미징 소프트웨어에서 타일 또는 위치 옵션을 사용 합니다.
- 중 독점 현미경 이미징 소프트웨어 또는 ImageJ/피지 프리웨어 (아래 참조)를 사용 하 여 사용 하 여 최종 이미지를 재구성 합니다.
4입니다. 게시물 처리 이미징
- ImageJ/피지에 confocal 스택을 엽니다.
- Bioformats 플러그인을 사용 하 여 (플러그인 | 바이오-형식 | Bio-formats 수입)에 되지 않은 이미지를 열고 피지에서. 독자적인 이미징 소프트웨어 패키지9에서 TIF 형식입니다.
- 이미지를 선택 하 여 채널 분할 | 컬러 | 분할 채널.
참고: 여러 위치에서 이미지 되었다 재결합 해야 하는 경우는 없음을 사용 바느질에서 피지에 플러그인 (플러그인 > 바느질 > 쌍 바느질)10,11. - GFP 신호에서 표 피 신호를, 열고 이미지 계산기 (과정 | 이미지 계산기): 이미지 1 (GFP + 표 피) 탐지기 1에서에서 스택 선택 (그림 4A), 작업 창에서 빼기, 선택한 스택 탐지기 2에서에서 이미지 2 (표 피) (그림 4B). 그 결과, GFP 생 신호 (GFP)에 (그림 4C) 얻을 수 있다.
- 발견자 2에서에서 얻은 ' 표 피 전용 ' 스택 (GFP)이이 스택을 다시 병합 (그림 4B 이미지 | 컬러 | 병합 채널)는 RGB 이미지 구성 된 조직 관련 GFP 신호 뿐만 아니라 (그림 4D) 다리 세그먼트 내의 축 삭 아 버를 식별 하는 데 도움이 표 피 신호를.
- 각 이미지의 밝기 및 대비 조정 (이미지 | 조정 | Brightness/Contrast) 단일 RGB 이미지를 생성 하 고 (이미지 | 유형 | RGB 색상).
참고: Z 스택의 최대 투영 생성 하 (이미지 | 스택 | Z 프로젝트...), GFP 신호 및 다음 두 개의 채널을 병합 하기 전에 밝기 조정 될 수 있는 표 피에 대 한 평균 강도 대 한 최대 강도 투영을 사용 하 여.
- 또는 매크로 사용 하 여 자동 뺄셈과 ImageJ/피지에 이미지의 처리에 대 한. 매크로 편집기에서 추가 파일 1에서 텍스트를 복사 (플러그인 | 새로운 | 매크로), 플러그인 폴더에 매크로 저장 하 고 매크로 사용할 수에 ImageJ/피지 한 번 다시 시작.
- 매크로 사용 하려면 confocal 스택 열고 밝기/대비 창을 엽니다 (이미지 | 조정 | Brightness/Contrast). 다음 매크로 실행 (플러그인 | 매크로 | 실행) 지침을 따릅니다.
- 작업 (이미지 계산기 창)을 지정 하도록 요청 하는 경우 스택 1 (GFP) 이미지 1, 이미지 2 스택 2 (표 피), 그리고 빼기를 선택 합니다.
참고: 매크로 생성 최대한 프로젝션 이미지 처리 GFP 신호 (stack1 MAX_Result)의 표 피 (AVG_stack2), 표 피 스택 GFP 스택 (stack1의 결과), 그리고는 처리에서 뺄셈의 결과의 평균 투영 표 피 스택 (stack2)입니다. - 대비를 조정 하도록 요청 받을 때 밝기/제어 창에서 컨트롤을 사용 하 여 GFP, 최대한 프로젝션 이미지의 밝기/명암 대비를 조정 하 고 RGB를 생성 하는 표 피의 평균 투영의 두 신호에 GFP를 보여주는 이미지를 병합 녹색 그리고 회색에 표 피입니다. 마찬가지로 다음 단계에서 사용할 수 있는 결합된 GFP와 표 피 스택 생성을 stack1, 그리고 stack2의 결과 병합 합니다.
- 3 차원에 다리를 시각화 하려면 새로 생성 된 더미 (그림 4E)와 전문된 3D 소프트웨어를 사용 합니다.
- 3D 소프트웨어와 RGB 스택 엽니다 ( 재료의 표참조). 팝업 대화 상자 창에서 모드 전환 섹션에 모든 채널을 선택 하 고 복 (픽셀의 볼륨)의 크기를 입력 합니다.
참고: 필요한 모든 정보는 사용 되 고 어떤 독점 현미경 소프트웨어에서 이미지 파일에 포함 됩니다. - 채널 2 모듈 (GFP 신호), 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 디스플레이 | volren. 그런 다음, volren 모듈에 왼쪽 클릭 하십시오. 속성 섹션 (화면 왼쪽 아래)에서 왼쪽 편집을 클릭 하 고 volrengreen.col를 선택 합니다. 채널 1 모듈 (표 피 신호)에 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 디스플레이 | volren. 그런 다음, volren 모듈에 왼쪽 클릭 하십시오. 고급 선택 ddr (투명 한 방사선 사진 처럼 디스플레이)에 속성 섹션 왼쪽에서 다음 표 피 배경 (그림 4E) 보러 감마 값을 조정 합니다.
- 3 차원 회전을 생성 하려면 프로젝트 스택 모듈에 마우스 오른쪽 단추로. 다음 선택 애니메이션 | 회전. 회전 모듈에서 왼쪽 클릭 하십시오.
- 속성 에서 섹션 bbox 센터를 사용 하 여클릭 합니다. 회전 모듈에서 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 계산 | 영화 제작자. 무비 메이커 모듈에서 마우스 왼쪽된 버튼을 클릭 합니다. 속성 섹션에서 클릭 왼쪽된에 고급 (속성 섹션의 오른쪽 상단).
- 파일 이름 필드에 영화 회전의 이름 입력. 품질 분야에서 1 (최고 품질)을 작성 합니다. 8.3 s 회전 바란다면 200 프레임 을 두고 (이 수 감소 또는 증가 하는 회전의 속도 수정). (녹색 버튼, 속성 섹션 (참조 비디오 1)의 왼쪽 아래) 적용 을 누릅니다.
- 3D 소프트웨어와 RGB 스택 엽니다 ( 재료의 표참조). 팝업 대화 상자 창에서 모드 전환 섹션에 모든 채널을 선택 하 고 복 (픽셀의 볼륨)의 크기를 입력 합니다.
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Representative Results
그림 4에서 같이,이 절차 그들의 터미널 버는 함께 성인 초파리 다리 GFP 표시 된 축 삭의 우수한 영상이 있습니다. 중요 한 것은 깨끗 한 GFP 신호 다리 표 피에 의해 방출 하는 형광에서 어떤 오염 없이 얻은 것입니다. 표 피에서 신호는 GFP 신호 식별 (그림 4E, 그림 1및 비디오 1) 다리에 축 삭의 위치를 다음 결합 수 있습니다. 비판적으로, 잘 고정 다리를 얻기 위해 중요 하다. 그림 5 는 잘 고정 (그림 5A)와 심하게 고정 다리 (그림 5B)의 예를 보여줍니다. 경우에서 다리 안쪽 내부 구조는 균일 한 색상의 고이 어두운, tracheas 볼 수 있습니다. 주요 tracheal 튜브 (주요 신경 트렁크에 인접 한) 각 다리 세그먼트의 중심에서 실행 하 고 많은 얇은 파급 효과 또한 볼 수 있습니다. 후자에 어두운 물자는 다소 경골에 존재 및 tracheal 시스템 대 퇴 골과 고관절에 명확 하 게 표시 되지 않습니다: 이러한 경우에 그것은 항상 관찰 형광 단백질에서 신호 전부 결 석 또는 낮은 강도의 저하 됩니다. 다리의 두 번째, 조심 해 부 (경골에 고관절)에서 모든 다리 세그먼트를 하 고 다리에 기계적 충격을 피하기 위해 필요 하다. 셋째, 다리는 다리의 내부를 관통 하는 그것을 위해 충분히 설치 매체에 남아 있을 해야 합니다. 가끔 다리 세그먼트, 특히 대 퇴 골, 축소 표시-정착 액 장착 매체의 침투의 부족 수 있습니다. 마지막으로, 하나는 고품질 현미경 목표, 분야의 평탄 하 고 형광 또는 apochromatic 특별히 사용 해야 합니다.
그림 1: 성인 초파리 다리 모터 시스템의 스키마. 성인 다리 MNs (녹색)의 셀 시체 VNC의 흉부 신경 절의 피 질 (회색)에서 지역화 됩니다. MNs 다리 neuropil (파란색)에서 그들의 dendrites arborize 고 14 다리 근육 (빨간색) 중 하나를 자극 하는 다리에 그들의 축 삭을 보낸다. 참고 전용 T1 다리 도식화 는입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 현미경 슬라이드에 다리를 마운트 하는 절차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 이미징 절차. (A) 방출 스펙트럼과 다리 표 피 488 nm 아르곤 레이저 여기, GFP를 표현 하는 다리의 각각에 GFP를 표현 하지 않는 초파리 의 다리의 섹션의 스펙트럼 이미지를 사용 하 여 얻은 사용 하 여 GFP의 주 형광 강렬 정규화 되지 있다, 예를 들어, 이미징 절차 다리에 관해서는 동일한 매개 변수 (목표, 매체, 레이저 전원, confocal 조리개, 게인, 오프셋)를 사용 하 여 원시 데이터에서 있습니다. 검출기 windows 이미징 GFP + 표 피에 사용 되는 표시 형광 (감지기 1: 녹색) 및 표 피 (감지기 2: 분홍색), GFP vs 표 피 배경 스펙트럼에 따라. (B, C) 다리 mCD8::GFP DVGlut Gal4 의 통제 이라고의 confocal 섹션 2 (C) 탐지기 1 (B)와 검출기에서 얻은. (D, E) 이미지 (B, C)에 각각 사용 되는 채도 마커 설정 (에 대 한 설명은 텍스트 참조): 신호, 빨간색 채도 없음 블루. Note는 감지기 1에 주요 신경 트랙은 포화, 검출기에 2 표 피의 몇몇 지구는 포화 (화살표 참조) 하는 동안. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: ImageJ/피지를 사용 하 여 이미지의 처리. (A) 498-535 nm 검출기에서 얻은 confocal 스택 최대 투영 (B) 566-652 nm 검출기에서 얻은 confocal 스택 최대 투영 (A)에서 (B) 빼면만 GFP 신호 (C) 이미지. (D) (B)의 이미지를 병합 하 고 (C). ((C)의 E) 3 차원 개조. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 좋은 (A)과 나쁜 (B) 고정의 예를 보여주는 해 부 다리의 저전력 보기. 눈금 막대 200 µ m. = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1: GFP 표시 된 축 삭 (녹색)는 다리의 표 피 (회색) 함께 영화 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
표 피 성인 초파리와 다른 절지동물의 많은 어두운 안료를 포함 하는 그들의 신체 내부 구조를 보기 위한 중요 한 장애 이다. 또한, 그것은 강력 하 게 고정 하 여 악화 시킨 자동 형광입니다. 이 두 기능은 매우 형광 염료 또는 외 골격을 가진 동물의 체 내 분자의 관찰에 대 한 문제가 있다.
우리가 설명 하 고 우리가 일상적으로 실험실에서 사용 하는 절차는 축 삭 궤도의 고 성인 초파리 다리에 그들의 터미널 엔딩의 깨끗 하 고 상세한 이미지를 생성 합니다. 중요 한 것은 깨끗 한 GFP 신호 다리 표 피에 의해 방출 하는 형광에서 어떤 오염 없이 얻은 것입니다. 이 기능은 시각화 및 3D 이미징 프로그램을 사용 하 여 축 삭 아 버의 3 차원 기능을 quantitate 수 필수입니다. 이 방법으로 여러 다리에서 얻은 데이터를 비교할 수 있습니다. 절차 쉽게 다른 형광 단백질에서 신호를 관찰에 대 한 적응 하 고 다른 성인 절지동물 축 삭 이미지를 쉽게 사용할 수 있습니다.
절차의 두 가지 중요 한 측면은 i) 강한 GFP 신호, 및 다리의 ii) 적절 한 고정. 후자에 대 한 우리는 정기적으로 좋은 정착을 얻을, 그럼에도 불구 하 고 일부 다리는 때때로 고정 되지 제대로. 따라서, 절차 개선, 아마도 (예: dimethylsulfoxide), 시 약의 침투 또는 고정 (전자 레인지 고정, GFP 형광을 보존 하는 경우), 다른 수단을 홍보 하는 에이전트를 추가 하 여 필요 하지만 우리는이 가능성을 탐험 하지 않은 갈라는 preincubation를 사용 하 여 트리톤 (는 크게 고정 개선)를 포함 하는 PBS에 단계. 좋은 GFP 신호를 얻기 위하여 우리가 강한 DVglut Gal4 드라이버 ( OK371-Gal4라고도 함)를 사용 합니다. 그것은 또한 좋은 기자를 사용 하는 데 필요한-mCD8-GFP를 사용 하 고도 좋은 신호 세포질 GFP 또는 mCherry를 입수. 어쨌든, 우리는 주 기자 (hexameric)의 여러 복사본과 LexO 또는 UAS 사이트의 여러 복사본을 포함 하는 기자를 사용 합니다.
이 절차의 한계는 그것은 고정 된 조직에만 적용 됩니다. 우리는 현재 비보에 관측에 대 한 절차를 개발 하 고 다양 한 대안 (장착 및 현미경) 테스트. Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 한 가지 한계는 전체 다리를 통해 볼 수 어렵습니다: 이것은 깊은 거짓말 지역에서 신호를 위한 신호 GFP에서 overlying 조직을 통해 흩어져 있기 때문에. 또는 biphoton 현미경 이미징을 전체 다리의 두께 통해 수 있습니다.
마지막으로, 다른 방법 장착 및 고정4,12의 다른 종류를 사용합니다. 의미와 우리의 절차의 힘 빼기 단계 다른 (주로 cuticular) 신호에서 진정한 GFP 신호 분리 수 우수한 3 차원 재구성 및 축 삭 및 그들의 터미널 아 버의 시각화입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 감사 로버트 Renard 비행 음식 매체를 준비. 이 작품은 NIH 그랜트 NS070644 R.S.M.에 의해 지원 되 고 J.E.에 ALS 협회 (#256), FRM (#AJE20170537445)와 ATIP 미래 프로그램에서 자금
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22 mm x 22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
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