Summary
כאן נתאר פרוטוקול להמחיש את מיקוד עצב עם חלבון נמכרות ברגליים למבוגרים של זבוב החומץ על ידי קיבוע, הרכבה, הדמיה, ההדמיה שלאחר צעדים.
Abstract
רוב העבודה על המפרט עצביים התבצע במודלים גנטית, מבחינה פיזיולוגית צייתן כמו C. elegans דרוזופילה הזחלים, דגים, אשר כולם עוסקים תנועות undulatory (כמו זחילה או שחייה) כמצב העיקרי שלהם ומכניקה. עם זאת, יותר מתוחכם הבנה של מפרט נוירון מוטורי הפרט (MN) — לפחות מבחינת להודיע טיפולים למחלות — דורש מערכת לא פחות צייתן יותר מודלים מורכבים מבוססי גפה ומכניקה של סכמות חולייתנים. למבוגרים דרוזופילה גינקולוגיות המערכת אחראית על הליכה עונה כל קריטריונים אלה בקלות, שכן במודל זה ניתן ללמוד את המפרט של מספר קטן של הרגל בקלות מכובד MNs (כ 50 MNs לכל הרגל) באמצעות שני עצום מערך של כלים רבי-עוצמה גנטי, בהקשר פיזיולוגיים של מזימת מבוססי גפה ומכניקה. כאן נתאר פרוטוקול להמחיש את העצבוב שריר הרגל ב זבוב למבוגרים.
Introduction
כמו האיבר חוליות, הרגל למבוגרים דרוזופילה מאורגן למקטעים. כל רגל לטוס מכיל 14 השרירים, שכל אחת מהן כוללת סיבי שריר מספר1,2. הגופים תא של הרגל למבוגרים MNs ממוקמים ב (prothoracic) T1, T2 (mesothoracic), ו T3 הגרעינים (metathoracic) בכל צד של חוט עצבי הגחון (VNC), הנדסי מקביל חוליות חוט השדרה (איור 1). ישנם כ- 50 MNs כל הגרעינים, היעד שבו השרירים ארבעה חלקים של הרגל חולשת (coxa תל הירך, עצם הירך, שוקה) (איור 1)3. חשוב, כל רגל מבוגרים בודדים MN יש זהות מורפולוגי ייחודי זה מאוד סטריאוטיפית בין בעלי חיים3,4. כל MNs ייחודיים אלה נגזרים מתאי גזע 11, שנקרא neuroblasts (שהודיעו) בהפקת הרגל MNs במהלך ה3,דרגות זחל4. בסוף כל הזחל MNs postmitotic ילדותי להבדיל במהלך המטמורפוזה לרכוש שלהם ובשבילים דנדריטים ספציפיות ויעדים עצב מסוף המגדירים שלהם3,ייחודי מורפולוגיה4. קודם לכן בדקנו את ההשערה כי קוד קומבינטורית של גורמי שעתוק (TFs) מציינת המבנה הייחודי של כל רגל למבוגרים דרוזופילה MN5. כמודל, השתמשנו השושלת B, לאחד שושלות NB 11, אשר מייצרת שבעה מתוך MNs והפגינו קוד קומבינטורית של TFs הביע ברגל למבוגרים postmitotic MNs מכתיבה מורפולוגיות בודדים שלהם. על ידי reprograming את הקוד TF של MNs היינו מסוגלים להחליף MN מורפולוגיות באופן צפוי. אנחנו קוראים להם שר: mTFs (TFs מורפולוגי)5.
אחד החלקים המאתגרים ביותר של המורפולוגיים של MNs למבוגרים הוא להמחיש את האקסונים דרך הקוטיקולה עבה, auto-פלורסנט עם רזולוציה גבוהה. בדרך כלל מתייגים אקסונים עם GFP מתויג ממברנה מתבטאת MNs עם מערכת בינארית הביטוי, כגון DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP או DVglut-העל / QUAS mCD8::GFP, כאשר DVglut הוא נהג חזק לידי motoneurons6. על ידי שילוב של כלים אלה עם טכניקות טיפול נוספות המשובטים פסיפס ניתוח עם סמן repressible (MARCM)7, cis-MARCM8או MARCMbow5, אנחנו ניתן להגביל את הביטוי GFP כדי subpopulations של MNs ביצוע הניתוח פנוטיפי של אקסונים קל יותר. יש לנו שנוצר פרוטוקול על מנת לשמור על הרגל מורפולוגיה עצב MN ללא פגע עבור שחזור 3D הדמיה ובעקבות שתתייחסי לנושאים ספציפיים מהותי הרגל דרוזופילה למבוגרים כגון קיבוע (1) של המבנים הפנימיים של הרגל למבוגרים מבלי להשפיע על מורפולוגיה האקסון ביטוי פלורסנט אנדוגני, לשריר הרגל, (2) הרכבה של הרגל כדי לשמר את המבנה הכללי תחת של coverslip, את הכיוון המתאים לעיבוד כדי להשיג את הקוטיקולה תמונה הדמיה, ו- (3) ברקע, כמו גם עצב אות ניאון. אמנם יש כבר מפורט פרוטוקול זה איתור פלורסנט ביטוי MN אקסונים, ניתן להחיל אותה לדמיין רכיבים אחרים של הרגל neuromusculature של פרוקי רגליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ניתוח של קיבוע רגל
- לקחת צלחת זכוכית רב טוב מילוי מספר מתאים של וולס עם 70% אתנול. להוסיף 15 – 20 CO2-מרדימים זבובים (של סקס, בכל גיל) לכל אחד טוב ואני באמצעות מברשת, בעדינות כי אמחה קלות את הזבובים בתוך תמיסת אתנול עד זבובים מלא טובע.
הערה: השלב זה כדי להסיר את hydrophobicity של הקוטיקולה. אנחנו לא שוטפים עבור יותר מ- 1 דקות, כי פעולה זו מגדילה אוטומטית-זריחה של הקוטיקולה. - יש לשטוף את הזבובים 3 פעמים עם פתרון דטרגנט חומרים פעילי שטח nonionic 0.3% 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS). שמור את הזבובים בפתרון זה לפחות 10 דקות.
הערה: הרגליים כדאי קבועים בעת כלילת דטרגנט, אשר, ככל הנראה להגדיל את חדירת מקבע בתוך הרגל. - מניחים צלחת רב טוב על הקרח יחד עם שפופרת של 4% paraformaldehyde (PFA).
הערה: הכנת טרי 4% כדורגלן מ 16% PFA אתנול מניות פתרון חופשי הוא קריטי. - להשתמש מלקחיים כדי להסיר את הראש והבטן של הזבובים מבלי להזיק על קטע בית החזה או הרגליים.
הערה: הסרת הבטן מקל להחזיק את הזבוב ומנתחים את הרגליים. - לנתח את הרגליים של המקטע בית החזה עם מלקחיים ולמקם את הרגליים הבארות המכיל 4% מחברים. עבור זה, לדחוף בעדינות אך בתקיפות בצומת coxa-החזה בעזרת קצה מלקחיים בסדר עד לניתוק הרגל.
- לתקן את הרגליים ב 4% מחברים בין לילה ב 4 ° C (כ 20 שעות סה כ).
- לשטוף את הרגליים עם פתרון דטרגנט חומרים פעילי שטח nonionic 0.3% ב- PBS 1 x, 5 x למשך 20 דקות.
- החלף את המאגר כביסה הרכבה בינונית. לשמור את הרגל הרכבה בינוני לפחות יום לפני הרכבה כדי לאפשר חדירה מלאה שלה לתוך הרגל.
הערה: אם המדיום הרכבה בעלי צמיגות גבוהה, לדלל המדיום הרכבה עד 80% עם 1 x PBS כי השינוי הפתאומי של צמיגות יכול לגרום את הקוטיקולה לכווץ או נזק המבנה הכולל של הרגל. בהתאם הנהג Gal4 , זבובים יכולים להישמר שבועות 1 עד 3-4 מעלות צלזיוס הרכבה מדיה עד הרכבה.
2. הרגל הרכבה
- במקום כ 20 µL של 70% גליצרול, בצד שמאל של שקופיות מיקרוסקופ וכן כיסוי עם מרובע 22 x 22 מ מ2 coverslip (איור 2 א, ב'). פיפטה µL כ- 10 של הרכבה בינונית לאורך קו מקביל, במרחק קטן מהקצה הימני של coverslip הזה. להוסיף עוד 30 µL של הרכבה בינונית נוספת על הצד הימני של השקופית (איור 2C).
הערה: בעת החלת של coverslip על הרגליים (ראה להלן) המדיום הרכבה בעדינות יתפשט תחת coverslip של אתרים בולטים ברגליים בלי ועקרו אותם מבתיהם. - באמצעות מלקחיים בסדר הרם את הרגל מהפתרון, בעדינות את זה המדיום הרכבה ליד coverslip השמאלי. לעשות את אותו הדבר עבור כל רגל וליישר אותן מלמעלה למטה (איור דו-ממדי).
- הרם, להעביר את הרגליים בכל טיפת בינוני בין שני קצות המלקחיים. אוריינט הרגליים בשתי דרכים: מהצד החיצוני למעלה או למטה.
- לאחר כל הרגליים (עד ל 6-8 רגליים יכול להיות מותקן) מיושרים כראוי, לשים את coverslip השנייה על הרגליים כך coverslip הזה מונח מעט על coverslip הקודם שמוקם (איור 2E) כדי לאפשר שטח בין coverslip את הרקמה למנוע את הרגליים של מקבל פגום (איור 2G).
הערה: לחלופין, להשתמש בארות מדבקה או שעווה אורתודונטי כדי ליצור רווח בין coverslip של השקופית. - השתמש לק כדי לאבטח את המיקום של coverslips בכל פינה (2F איור).
הערה: הרקמה מוכן כעת ליצירת תמונה.
3. הדמיה
- להגדיר מסלול יחיד באמצעות הלייזר 488 ננומטר וגלאים שני בו זמנית להשיג GFP פלורסצנטיות והן לציפורן אוטומטי-זריחה. שימוש בפקד טווח או התצוגה המחוון בחלון ספקטרלי של החלון נתיב האור של התוכנה, קביעת זיהוי טווח (גלאי 1) גלאי אחד של השני בין 498-535 nm (גלאי 2) בין 566-652 ננומטר.
הערה: בדרך כלל, גלאי 1 צריך להיות גלאי חאספ והגלאי 2 צינור האופטיקה. הערוץ 498-535 בצורה אופטימלית מזהה אות GFP אך גם מזהה אוטומטית פלורסצנטיות מ הקוטיקולה. עם זאת, בערוץ 566-652 מזהה רק את אוטומטי פלורסצנטיות מ הקוטיקולה (איור 3 א). - השתמש 20 X או 25 X שמן טבילה אובייקטיבי, 1024 x 1024 פיקסלים, עומק 12 סיביות והגדרת המרווח Z 1 מיקרומטר. פיקסל קבע להתעכב זמן כמו µs 1.58 בערך ולאחר ממוצע 2 מסגרות/תמונה. השתמש מטרות עם מפתח נומרי גבוהה.
- הגדר כל ההגדרות האחרות, בהתאם מיקרוסקופ קונפוקלי הדמיה התוכנה בשימוש.
- הקפד לקבל אות לציפורן בהיר יותר מ- 566-652 הגלאי ולא הגלאי 498-535. כדי לעשות זאת, השתמש אותו הכוח לייזר 488-לייזר לגלאי בשני. באמצעות הסמנים רוויה, תכוון תחילה את הרווח של גלאי 1 כדי לקבל אות GFP מספיק פיקח (איור 3B, יח). ואז להתאים את הרווח של גלאי 2 כדי להבטיח כי אזורים מסוימים קליטה גבוהה לציפורן (קצוות של הרגליים, המפרקים) לייצר אות רווי בתוך הגלאי הזה (איור 3C, E).
- אם הרגל המורחבת וגדולים גם ליצירת תמונה בתוך מסגרת בודדת, השתמש באפשרות אריח או מיקום בתוכנת הדמיה במיקרוסקופ.
- לשחזר את התמונות הסופי או באמצעות המיקרוסקופ קניינית imaging התוכנה או באמצעות ImageJ/פיג'י freeware (ראו להלן).
4. post Imaging עיבוד
- פתח את המחסנית קונאפוקלית בפיג'י/ImageJ.
- להשתמש תוסף Bioformats (תוספים | ביו-תבניות | Bio-formats יבואן) בפיג'י לפתוח תמונות שאינן בתוך. בפורמט TIF מ קניינית הדמיה חבילות תוכנה9.
- לפצל את הערוצים על-ידי בחירה תמונה | צבע | פצל ערוצים.
הערה: אם תמונות מתוך מספר מיקומים נעשו חייב להיות recombined, השתמש של pairwise תפרים תוסף בפיג'י מ (תוספים > Stitching > של Pairwise תפרים)10,11. - כדי לחסר את האות לציפורן האות ה-GFP, פתח את המחשבון התמונה (תהליך | תמונת מחשבון): לבחור את המחסנית גלאי 1 1 תמונה (GFP + לציפורן) (איור 4A), על החלון מבצע בחר לחסרובחר את המחסנית של גלאי 2 תמונה 2 (לציפורן) (איור 4B). כתוצאה מכך, רק אנדוגני GFP האות (GFP), מתקבל (איור 4C).
- מיזוג בחזרה זה מחסנית (GFP) עם הערימה 'לציפורן בלבד' המתקבל גלאי 2 (איור 4B תמונה | צבע | מזג ערוצים) כדי לקבל הכוללת תמונות RGB של האות GFP רקמות ספציפיות, כמו גם את האות לציפורן, אשר מסייע בזיהוי של האקסון ובשבילים בתוך המקטעים הרגל (איור 4D).
- כוונון הניגודיות והבהירות של כל תמונה (תמונה | התאם | Brightness/Contrast) ולאחר מכן ליצור תמונת RGB יחיד (תמונה | סוג | צבע RGB).
הערה: כדי ליצור תמונה מוקרנת מרבי של Z-המחסנית של (תמונה | ערימות | פרוייקט Z...), השתמש הטלה בעוצמה מרבית כדי להפוך את האות ה-GFP ממוצע עוצמת הקוטיקולה, אשר לאחר מכן ניתן לכוונן את הבהירות לפני מיזוג בין שני הערוצים.
- לחלופין, להשתמש במאקרו חיסור אוטומטי ועיבוד תמונות בפיג'י/ImageJ. העתק את הטקסט משלימה 1 הקובץ בעורך המאקרו (תוספים | חדש | מאקרו), לשמור את המאקרו בתיקיה Plugins, ולהפעיל מחדש ImageJ/פיג'י פעם כדי שניתן יהיה להשתמש במאקרו.
- כדי להשתמש במאקרו, פתח את המחסנית קונאפוקלית ולאחר לפתוח את החלון בהירות/ניגודיות (תמונה | התאם | Brightness/Contrast). ואז להפעיל את המאקרו (תוסף | מאקרו | לרוץ) ולעקוב אחר ההוראות.
- כאשר תתבקש לציין את הפעולה (תמונת מחשבון חלון), לבחור תמונה 1 כמו מחסנית 1 (GFP), תמונה 2 כמו מחסנית 2 (לציפורן) וחיסור.
הערה: המאקרו יוצר תמונת הקרנה מקסימלי של אות ה-GFP מעובד (MAX_Result של stack1), הקרנת הקוטיקולה (AVG_stack2), התוצאה של החיסור של הערימה לציפורן מתוך הערימה GFP (תוצאה של stack1), ולא את מעובד ממוצע מחסנית לציפורן (stack2). - כשנשאל להתאמת החדות, השתמש בפקדים בחלון בהירות/בקרה כדי לכוונן הבהירות/ניגודיות של התמונה הקרנה מקסימלי של ה-GFP, ואת התחזית הממוצע הקוטיקולה, כדי ליצור תמונת RGB הממוזג של שני אותות מציג את ה-GFP ב גרין, את הקוטיקולה באפור. מיזוג תוצאה של stack1, stack2, באופן דומה ליצור בשילוב GFP ואת לציפורן מחסנית יכול לשמש בשלב הבא.
- כדי להמחיש את הרגליים בתלת מימד, השתמש תוכנות תלת-ממד מיוחדות עם המחסן החדש שנוצר (איור 4E).
- פתח את מחסנית ה-RGB עם תוכנת תלת-ממד (ראה טבלה של חומרים). בחלון דו-שיח מוקפצות, בחר כל הערוצים במקטע המרה מצב והזן את גודל voxel (נפח של פיקסל).
הערה: כל המידע הנחוץ כלול בקבצי תמונה מ בכל תוכנה קניינית מיקרוסקופ בשימוש. - על ערוץ 2 מודול (אות GFP), לחץ לחיצה ימנית ובחר תצוגה | volren. לאחר מכן, לחץ על מודול volren. במקטע מאפייני (השמאלית התחתונה של המסך) לחץ על שמאל על עריכה ובחר volrengreen.col. על ערוץ 1 מודול (אות לציפורן) לחצו לחיצה ימנית ובחרו תצוגה | volren. לאחר מכן, לחץ על מודול volren. במאפייני מקטע שמאל לחץ על מתקדם , בחר ddr (תצוגה כמו radiograph שקוף), מכן התאם את ערך גמא לראות את הרקע לציפורן (איור 4E).
- כדי ליצור סיבוב תלת-ממד, לחץ לחיצה ימנית על ' פרוייקט ' מחסנית '. לאחר מכן בחר להנפיש | לסובב. שמאל לחץ על המודול לסובב.
- מאפייני מקטע לחץ על השתמש bbox במרכז. על המודול לסובב באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר לחשב | הסרטים. על מודול הסרטים לחץ על לחצן העכבר השמאלי. במקטע מאפייני שמאל שמאל על מתקדם (למעלה מימין ' מאפייני ').
- בשדה שם הקובץ מלא את שם הסרט הסיבוב. השדה ' איכות ' כתבו 1 (מקסימום איכות). נשאיר את מסגרת 200 אם סיבוב s 8.3 רצוי (מספר זה יכול להיות ירד או עלה כדי לשנות את מהירות הסיבוב). לאחר מכן הקש להחיל (הכפתור הירוק, השמאלית התחתונה של המקטע מאפיינים (ראה וידאו 1)).
- פתח את מחסנית ה-RGB עם תוכנת תלת-ממד (ראה טבלה של חומרים). בחלון דו-שיח מוקפצות, בחר כל הערוצים במקטע המרה מצב והזן את גודל voxel (נפח של פיקסל).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כפי שמוצג באיור4, הליך זה מאפשר הדמיה מצוינת של אקסונים GFP שכותרתו ברגליים דרוזופילה למבוגרים, יחד עם ובשבילים מסוף שלהם. חשוב מתקבל אות GFP נקי ללא כל זיהום מן ידי קרינה פלואורסצנטית הנפלטת לציפורן הרגל. האיתות הקוטיקולה אז יכול להיות משולב עם האות ה-GFP כדי לזהות את המיקום של אקסונים ברגליים (4E איור, איור 1ו- 1 וידאו). אנושות, חשוב לקבל את הרגליים היטב קבוע. איור 5 מציג דוגמאות של קבוע היטב (איור 5A) רגל ברע-קבועה (איור 5B). במקרה הראשון המבנים הפנימיים בתוך הרגליים של צבע אחיד, tracheas, אשר כהה, גלויים. . צינור הנשימה העיקרי פועל במרכז של כל אחד מהמקטעים הרגל (צמוד לתא המטען העצב הראשי) והם רבים השלכות רזה גם גלויים. בחודש האחרון, החומר האפל הוא נוכח טארסוס ושל שוקה ואינו מערכת הנשימה בבירור בציור עצם הירך ואת coxa: במקרים כאלה הוא תמיד ציין כי האיתות חלבונים פלורסנט יורד להיות בעוצמה נמוכה או נעדר לחלוטין. השני, זהירות דיסקציה של הרגליים היא הכרחית כדי להשיג את כל המקטעים הרגל (מ coxa ל שוקה) וכדי למנוע זעזועים מכני אל הרגליים. כדי. שלישית, יש להשאיר את הרגליים במדיום הרכבה, מספיק זמן לחדור הפנימי של הרגליים. הרגל מקטעים, במיוחד עצם הירך, מופיעים לעתים מכווצת — הדבר יכול להיות עקב חוסר חדירה מקבע ו/או הרכבה בינונית. לבסוף, צריך להשתמש מטרות מיקרוסקופ באיכות גבוהה, מתוקנות על השטיחות של שדה, תוכנן במיוחד עבור קרינה פלואורסצנטית ו/או apochromatic.
איור 1: סכימה של הרגל דרוזופילה למבוגרים מנוע המערכת. הגופים תא של הרגל למבוגרים MNs (ירוק) מותאמים קליפת המוח (אפור) של גנגליון בית החזה של VNC. MNs arborize שלהם דנדריטים ב הרגל מורכב (כחול), שולחים את האקסונים שלהם לתוך הרגל כדי innervate אחד של שרירי הרגליים 14 (אדום). שימו לב כי רק את הרגליים T1 הם schematized. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הליך כדי לטעון את הרגליים על שקופיות מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הדמיה הליך. (א) ספקטרום הפליטה של GFP ושל הרגל לציפורן באמצעות 488 ננומטר ארגון לייזר עירור, שהושג באמצעות הדמיה ספקטרלי של מקטעים של הרגליים לבטא GFP ואת הרגליים של דרוזופילה זה לא מבטא GFP בהתאמה. שימו לב כי עוצמות קרינה פלואורסצנטית לא מנורמל, הם למשל, מנתונים גולמיים באמצעות אותם פרמטרים (המטרה, הרכבה בינונית, עוצמת הלייזר, צמצם קונאפוקלית, רווח, היסט) באשר הרגל הדמיה בהליך. גם מוצגות החלונות גלאי המשמש הדמיה על GFP + לציפורן קרינה פלואורסצנטית (גלאי 1: ירוק) ואת לציפורן (גלאי 2: ורוד), המבוססת על ספקטרום רקע לציפורן לעומת ה-GFP. (B, C) סעיף קונאפוקלית של הרגליים המסומנת mCD8::GFP תחת השליטה של DVGlut-Gal4 המתקבל גלאי 1 (ב), גלאי 2 (ג). (יח, E) רוויה סמן ההגדרות המשמשות את התמונה (B, C) בהתאמה (ראה טקסט לקבלת הסבר): כחול לא רוויה אות, אדום. שימו לב כי על גלאי 1 המסילה העצבים רוויים, ואילו על גלאי 2 שבחלק מאזורי הקוטיקולה הן רוויות (ראה חצים). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: עיבוד של תמונות באמצעות ImageJ/פיג'י. (א) מקסימום הקרנת מהערימות קונאפוקלית המתקבל 498-535 nm גלאי. (B) הקרנה מקסימום של הערימה קונאפוקלית המתקבל 566-652 nm גלאי. (ג) תמונה עם האות ה-GFP רק על ידי הפחתת (א) מ (ב). (ד) למזג תמונות של (B) ו- (ג). (E) שחזור תלת-ממדי (C). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: צריכת חשמל נמוכה תצוגה של הרגליים גזור מציג דוגמאות (א) בין הטוב והרע (ב) קיבעון. סרגל קנה מידה = מיקרומטר 200. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
וידאו 1: הסרט של GFP שכותרתו אקסונים (ירוק) יחד עם לציפורן (אפור) של ברגל אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הקוטיקולה של דרוזופילה למבוגרים, של פרוקי רגליים אחרים, אשר מכיל פיגמנטים כהים רבים, זו היא מכשול גדול לצפייה מבנים בתוך הגוף שלהם. בנוסף, מומלץ מאוד פלורסנט אוטומטי אשר נעשה גרוע יותר על ידי קיבוע. שתי תכונות אלה הן בעייתי מאוד עבור תצפיות של צבעי פלורסנט או מולקולות בתוך הגוף של בעלי שלד חיצוני.
התהליך שתיארנו, אנו משתמשים באופן שגרתי במעבדה התשואות תמונות נקיות ומפורט של האקסון מסלולים ושל שלהם סופים מסוף ברגליים דרוזופילה למבוגרים. חשוב מתקבל אות GFP נקי ללא כל זיהום מן ידי קרינה פלואורסצנטית הנפלטת לציפורן הרגל. תכונה זו היא חובה כדי להיות מסוגל לדמיין quantitate תכונות תלת-ממדי של האקסון ובשבילים באמצעות תוכנות הדמיה תלת-ממד. בדרך זו ניתן להשוות נתונים המתקבלים מספר הרגליים. ההליך הוא להתאים בקלות להתבוננות אותות פלואורסצנט לחלבונים אחרים, יכול לשמש בקלות כדי התמונה אקסונים של פרוקי רגליים למבוגרים אחרים.
שני ההיבטים הקריטיים של ההליך הם i) כדי לקבל קליטה טובה GFP, ואת קיבוע נאות ii) של הרגליים. עבור הלה נקבל באופן שגרתי קיבוע טוב, בכל זאת למישהו את הרגליים מדי פעם אינם מתוקנים כראוי. לכן, ההליך צריך להיות שיפור, אולי על-ידי הוספת סוכנים המקדמים חדירה של ריאגנטים (כגון dimethylsulfoxide), או אמצעים אחרים של קיבעון (מיקרוגל קיבעון, אם שומרת על ידי קרינה פלואורסצנטית GFP), אך לא בחנו את האפשרות הזו מלבד שימוש צעד preincubation PBS המכיל טריטון (אשר לשפר באופן משמעותי את קיבוע). על מנת לקבל איתות GFP טוב אנו משתמשים נהג DVglut-Gal4 חזק (נקרא גם OK371-Gal4). יש גם צורך להשתמש עיתונאית טובה – אנחנו להשתמש mCD8-GFP גם השגת אותות טוב עם cytoplasmic GFP או mCherry. בכל מקרה, אנו משתמשים כתבים המכילים מספר עותקים של הכתב הראשי (hexameric) ואת מספר עותקים של אתרי LexO או UAS .
מגבלה של הליך זה הוא כי חלה רק על רקמות קבוע. כיום מפתחים נהלי ויוו תצפיות ואנו בוחנים חלופות שונות (הרכבה ומיקרוסקופים). מגבלה אחת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית היא כי קשה לצפייה דרך הרגל כולה: זה בגלל עבור אותות מאזורים עמוקות האות מ- GFP מפוזרים דרך הרקמות שמעליה. לסירוגין מיקרוסקופ biphoton מאפשר הדמיה באמצעות העובי של הרגל כולו.
לבסוף, שיטות אחרות להשתמש בסוגים שונים של קיבעון וביטול4,12. המשמעות והעוצמה של הנהלים שלנו הוא צעד חיסור להפריד אות GFP נכון בין אותות אחרים (בעיקר cuticular) מאפשרת שחזור תלת-ממדי מעולה והדמיה של אקסונים ו ובשבילים מסוף שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים רוברט רנארד על הכנת אוכל לטוס בינוני. עבודה זו היה נתמך על ידי מענק NIH NS070644 כדי R.S.M., במימון עמותת ALS (#256), עקרות (#AJE20170537445), ATIP-Avenir תוכנית כדי במקום
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22 mm x 22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. Demerec, M. , John Wiley & Sons. New York, NY. 420-531 (1950).
- Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).
- Enriquez, J., Mann, R. S. Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).
- Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
- ImageJ. Bio-Formats. , Available from: http://imagej.net/Bio-Formats (2018).
- ImageJ. Image Stitching. , Available from: http://imagej.net/Image_Stitching (2018).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map. PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).
