Summary
在这里, 我们描述了一个协议, 通过固定, 安装, 成像和后成像步骤, 可视化的荧光灯蛋白在果蝇成人腿的轴突靶向。
Abstract
神经元规范的大部分工作都是在基因和生理上易于处理的模型 (如C) 中进行的。线虫,果蝇幼虫和鱼类, 它们都从事波动运动 (如爬行或游泳) 作为他们的主要运动模式。然而, 对单个运动神经元 (MN) 规范 (至少在告知疾病治疗方面) 的更复杂的理解要求一个同样易于驾驭的系统, 更好地模拟复杂的基于附属物的运动方案。脊椎动物。成人果蝇运动系统, 负责步行满足所有这些标准与轻松, 因为在这个模型中, 它是可能的研究一个小数目的容易分辨的腿 MNs (大约 50 MNs 每腿) 的规格都使用一个巨大的一系列强大的基因工具, 以及基于附属物的运动方案的生理环境。在这里, 我们描述一个协议, 以可视化腿部肌肉神经支配在成人苍蝇。
Introduction
像脊椎动物肢体,果蝇成人腿被组织成段。每只苍蝇腿包含14个肌肉, 其中每一个包括多个肌肉纤维1,2。成人腿 MNs 的细胞体位于 T1 (前胸), T2 (mesothoracic) 和 T3 (metathoracic) 神经节的两侧的腹神经线 (VNC), 结构类似于脊椎动物脊髓 (图 1)。有大约 50 MNs 在每个神经节, 目标肌肉在四段的同侧腿 (髋, 粗隆, 股骨和胫骨) (图 1)3。重要的是, 每一个成人腿 MN 有一个独特的形态特征, 是高度定型的动物之间3,4。所有这些独特的 MNs 来自11干细胞, 称为果蝇 (国家统计局) 生产腿部 MNs 在幼虫阶段3,4。在幼虫阶段结束时, 所有未成熟的分裂后 MNs 在蜕变过程中区分, 以获得其特定的树突状轴和突索末端目标, 它们定义了其独特的形态学3,4。以前, 我们测试了一个假设, 即转录因子组合编码 (TFs) 指定每个果蝇成人腿 MN5的独特形态。作为一个模型, 我们使用血统 B, 其中一个 11 NB 血统, 产生七的 MNs, 并证明了 TFs 的组合代码表示在分裂后成人腿 MNs 指示他们的个人形态。通过 reprograming MNs 的 TF 代码, 我们能够以可预测的方式切换锰形态。我们调用这些 tfs: mTFs (形态学 TFs)5。
成人 MNs 形态学分析的最具挑战性的部分之一是通过高分辨率的厚和自动荧光角质层可视化轴突。我们通常标签轴突与膜标签 GFP 表示在 MNs 与二进制表达系统, 如DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP或DVglut-QF/QUAS mCD8::GFP, 其中DVglut是一个强大的驱动程序表示在运动神经元6。通过将这些工具与其他克隆技术 (如镶嵌分析与阻遏标记 (MARCM)7、cis MARCM8或 MARCMbow5) 相结合, 我们可以将 GFP 表达限制为 MNs 的亚群进行表型分析轴突更容易。我们已经生成了一个协议, 以保持腿部锰轴突形态学完好的成像和随后的3D 重建通过解决成人果蝇腿固有的特定问题, 如 (1) 固定的成人腿的内部结构不影响轴突形态学、内源性荧光表达和腿部肌肉, (2) 腿的安装, 以保持盖玻片下的整体结构和适当的成像方向, 和 (3) 图像处理获得角质层背景以及轴突荧光信号。虽然该协议已被详细用于检测锰轴突的荧光表达, 但它可以应用于可视化节肢动物中腿部 neuromusculature 的其他成分。
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Protocol
1. 腿部解剖和固定
- 采用玻璃多孔板, 用70% 乙醇填充适当数量的水井。添加 15–20 CO2-麻醉苍蝇 (无论是性别和任何年龄) 对每个井和使用刷子, 轻轻地将苍蝇放入乙醇溶液, 直到苍蝇完全淹没。
注意: 这一步是去除角质层的疏水性。不要洗涤超过1分钟, 因为这增加了角质层的自动荧光。 - 在1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中用0.3% 非离子表面活性剂洗涤剂溶液冲洗苍蝇3次。在这个溶液中保持苍蝇至少10分钟。
注意: 在包括洗涤剂的情况下, 腿部会更好地固定, 这很可能会增加腿部内定影液的穿透力。 - 将一个多孔板放在冰上, 同时用4% 多聚甲醛 (PFA) 的管子。
注: 从 16% PFA 乙醇无酒精溶液中制备新鲜的 4% pfa 是至关重要的。 - 使用镊子去除苍蝇的头部和腹部, 而不会损坏胸段或腿部。
注意: 移除腹部可以更容易地保持苍蝇和解剖腿。 - 用镊子解剖胸段的腿部, 将腿部放在含 4% PFA 的水井中。为此, 用细钳尖端轻轻地用力按压髋, 直到腿部分离。
- 固定在 4% PFA 隔夜在4°c (约20小时总) 的腿。
- 用0.3% 个非离子表面活性剂洗涤剂溶液在 1x PBS 中清洗腿部, 每 5x 20 分钟。
- 用安装介质更换洗涤缓冲器。在安装前, 保持腿部在安装介质上至少一天, 以使其完全穿透腿部。
注: 如果安装介质高度粘性, 则使用 1x PBS 稀释安装介质至 80%, 因为粘度的突然变化会导致角质层坍塌, 并损坏腿部的整体结构。根据Gal4驱动程序, 在安装介质之前, 可将苍蝇保存在1周至3星期, 以4摄氏度为固定。
2. 腿部安装
- 将大约20µL 70% 甘油放在显微镜滑动的左手侧, 用正方形 22 x 22 毫米2盖玻片覆盖 (图 2A, B)。移液器大约10µL 的安装介质沿一条线平行于和在一个小的距离, 从这个盖玻片的右边缘。进一步在幻灯片右侧添加另30µL 的安装介质 (图 2C)。
注意: 在腿上涂抹盖玻片 (见下文) 时, 安装介质将轻轻地在盖玻片和腿部周围传播, 而不会置换它们。 - 使用细镊子将腿部从溶液中提起, 并将其轻轻放在左盖玻片附近的安装介质上。对每条腿执行相同操作, 并将其从上到下对齐 (图 2D)。
- 抬起和转移的双腿在钳的两个尖端之间举行的一滴中间。以两种方式定向腿部: 外部侧向上或向下。
- 一旦所有的腿 (高达6–8腿可以安装) 是正确的对齐, 在腿上放置第二个盖玻片, 这样, 这盖玻片在先前放置的盖玻片(图 2E)稍微休息, 以允许在盖玻片和组织之间的空间, 并防止腿部受伤 (图 2G)。
注: 或者, 使用贴纸井或正畸蜡在盖玻片和幻灯片之间创建空间。 - 使用指甲油固定盖玻片在每个角落的位置 (图 2F)。
注意: 组织现在已准备好进行图像。
3. 成像
- 使用 488 nm 激光和两个检测器同时设置单个轨道, 同时获得 GFP 荧光和角质层自动荧光。使用范围控制或滑块显示在软件的光路径窗口的频谱窗口中, 设置一个探测器 (检测器 1) 之间的检测范围 498–535 nm 和另一个 (检测器 2) 之间 566-652 nm。
注意: 通常情况下, 探测器1应为 GaAsP 检测器和探测器 2 a 光电倍增管。498-535 通道最佳地检测 GFP 信号, 但也检测从角质层的自动荧光。但是, 566–652通道仅检测角质层的自动荧光 (图 3A)。 - 使用20X 或25X 油浸入物镜, 1024 x 1024 像素分辨率, 12 位深度, 并将 Z 间距设置为1µm. 将像素停留时间设置为大约1.58 µs, 平均2帧/图像。使用高数值孔径物镜。
- 根据所使用的共聚焦显微镜和成像软件设置所有其他设置。
- 确保从566–652检测器而不是从498–535探测器获得更明亮的角质层信号。为此, 请对两个探测器使用相同的激光功率488激光。使用饱和度标记, 首先调整检测器1的增益以获得足够明亮的 GFP 信号 (图 3B, D)。然后调整检测器2的增益, 以确保某些具有高角质层信号 (腿部边缘、接头) 的区域在该检测器中产生饱和信号 (图 3C、E)。
- 如果腿部扩展且太大, 无法在单个帧中成像, 请使用显微镜成像软件中的磁贴或位置选项。
- 使用专有显微镜成像软件或使用 ImageJ/斐济免费软件重建最终图像 (见下文)。
4. 后成像处理
- 在 ImageJ/斐济打开共焦堆叠。
- 使用 Bioformats 插件 (插件 |生物格式 |生物格式进口商) 在斐济打开不在的图像。TIF 格式从专有成像软件包9。
- 通过选择图像分割通道|颜色 |拆分通道。
注意: 如果从多个位置的图像, 必须进行重组, 使用成对拼接插件在斐济从 (插件 > 缝合 > 成对拼接)10,11。 - 要从 GFP 信号中减去角质层信号, 请打开图像计算器 (过程 |图像计算器): 从检测器1中选择堆栈作为图像 1 (GFP + 角质层) (图 4A), 在操作窗口中选择减法, 然后从检测器2中选择堆栈作为图像 2 (角质层) (图 4B)。因此, 仅获得内源 GFP 信号 (gfp) (图 4C)。
- 将此堆栈 (GFP) 与从检测器2获得的 "仅角质层" 堆栈合并回 (图 4B 图像 |颜色 |合并通道) 以获得由组织特定的 GFP 信号和角质层信号组成的 RGB 图像, 这有助于识别腿部段内的轴突 (图 4D)。
- 调整每个图像的对比度和亮度 (图像 |调整 |亮度/对比度), 然后生成单个 RGB 图像 (图像 |类型 |RGB 颜色)。
注: 要生成 Z 堆栈的最大投影 (图像 |堆叠 |Z 项目...), 对 GFP 信号使用最大强度投影和角质层的平均强度, 然后可以在合并两个通道之前调整亮度。
- 或者, 使用宏自动减法和处理 ImageJ/斐济的图像。在宏编辑器中复制补充文件1中的文本 (插件 |新 |宏), 保存在插件文件夹中的宏, 并重新启动 ImageJ/斐济一次能够使用该宏。
- 若要使用该宏, 请打开共焦堆栈, 然后打开 "亮度/对比度" 窗口 (图像 |调整 |亮度/对比度)。然后运行宏 (插件 |宏 |运行) 并按照说明操作。
- 当要求指定操作 (图像计算器窗口) 时, 选择图像1作为堆栈 1 (GFP)、图像2作为堆栈 2 (角质层) 和减法。
注: 宏生成处理的 GFP 信号 (stack1 的 MAX_Result) 的最大投影图像, 角质层的平均投影 (AVG_stack2), 从 GFP 堆栈的角质层堆栈减影的结果 (stack1 的结果), 和未加工的角质层堆栈 (stack2)。 - 当要求调整对比度时, 使用 "亮度/控制" 窗口中的控件来调整 gfp 的最大投影图像的亮度/对比度, 以及角质层的平均投影, 以生成两个信号的 RGB 合并图像, 以显示 gfp 在绿色和角质层在灰色。合并的结果 stack1, 和 stack2, 以同样的方式生成一个组合的 GFP 和角质层堆栈, 可以在下一个阶段使用。
- 要在三维度中可视化腿部, 请使用带有新生成堆栈的专用3D 软件 (图 4E)。
- 使用3D 软件打开 RGB 堆栈 (请参见材料表)。在弹出对话框窗口中, 选择模式转换部分中的所有通道, 然后输入体素 (像素的体积) 的大小。
注意: 所有必要的信息都包含在图像文件中, 无论使用什么专有显微镜软件。 - 在通道2模块 (GFP 信号) 上, 右键单击并选择显示 | volren。然后, 在volren 模块上单击鼠标左键。在 "属性" 部分 (屏幕左下角), 单击 "编辑时左", 然后选择volrengreen。在通道1模块 (角质层信号) 上右键单击并选择显示 | volren。然后, 在volren 模块上单击鼠标左键。在 "属性" 部分左键单击 "高级", 然后选择 " ddr " (透明射线状显示), 然后调整伽玛值以查看角质层背景 (图 4E)。
- 要生成3D 旋转, 请右键单击项目堆栈模块。然后选择动画 | 旋转。在旋转模块上单击鼠标左键。
- 在属性部分中单击使用 bbox 中心。在旋转模块上右键单击并选择计算 | 影音制作。在电影制作器模块上, 单击鼠标左键。在属性部分左键单击左侧高级(属性部分的右上)。
- 在 "文件名" 字段中填充影片旋转的名称。在质量字段写入 1 (最大质量)。如果需要 8.3 s 旋转, 请将帧保持在 200 (此数字可以减少或增加以修改旋转速度)。然后按应用(绿色按钮, 左下角的属性部分 (请参阅视频 1))。
- 使用3D 软件打开 RGB 堆栈 (请参见材料表)。在弹出对话框窗口中, 选择模式转换部分中的所有通道, 然后输入体素 (像素的体积) 的大小。
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Representative Results
如图 4所示, 此过程允许在成人果蝇腿中使用 GFP 标记的轴突, 以及它们的末端芯棒成像。重要的是, 没有从腿部角质层发出的荧光的任何污染得到一个干净的 GFP 信号。然后, 从角质层的信号可以与 GFP 信号结合, 以确定轴突在腿部的定位 (图 4E、图 1和视频 1)。关键的是, 获得良好的固定腿是很重要的。图 5显示了一个良好的固定 (图 5A) 和一个严重固定的腿 (图 5B) 的例子。在前一种情况下, 腿内的内部结构是均匀的颜色和气管, 这是黑暗的, 是可见的。一个主气管管运行在每个腿段的中心 (毗邻主神经主干) 和许多更薄的影响也可见。在后者, 深色材料存在于数和胫骨和气管系统在股骨和髋不清楚地可见: 在这种情况下, 总是观察到, 荧光蛋白的信号被降级低强度或完全不存在。其次, 仔细解剖腿部是必要的, 以获得所有腿部段 (从髋到胫骨), 并避免机械休克腿部。第三, 腿部必须留在安装中足够长的时间, 以穿透腿部内侧。有时腿部部分, 特别是股骨, 出现折叠-这可能是由于缺乏固定剂和/或安装介质的渗透。最后, 必须使用高品质的显微镜物镜, 校正场的平坦度, 并专为荧光和/或复消色差而设计。
图 1: 成人果蝇腿马达系统的架构.成人腿 MNs (绿色) 的细胞体在 VNC 的胸椎节的皮质 (灰色) 中进行局部定位。MNs arborize 他们的树突在腿部 neuropil (蓝色) 和发送他们的轴突到腿部支配14腿部肌肉之一 (红色)。请注意, 只有 T1 腿是架构化的。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 在显微镜幻灯片上安装腿部的过程.请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: 成像过程.(A) 使用488纳米氩激光激发的 gfp 和腿部角质层的发射光谱, 通过表达 gfp 的腿部部分和不表达 gfp 的果蝇腿的频谱成像获得。请注意, 荧光强度尚未规范化,例如,使用与腿部成像程序相同的参数 (目标、安装介质、激光功率、共焦孔径、增益、偏移) 的原始数据。还显示了用于成像 gfp + 角质层荧光 (检测器 1: 绿色) 和角质层 (检测器 2: 粉红色) 的探测器窗口, 基于 gfp vs 角质层背景光谱。(B、 C)由检测器 1 (B) 和探测器 2 (C) 获得的 DVGlut-Gal4的控制下标记有 mCD8::GFP 的腿部共焦段。(D、 E)分别用于图像 (B、C) 的饱和度标记设置 (请参阅文本以供说明): 蓝色无信号, 红色饱和度。注意, 在探测器1的主要神经轨道是饱和的, 而在检测器2角质层的某些区域是饱和的 (见箭头)。比例尺 = 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 使用 ImageJ/斐济处理图像.(A) 从 498-535 nm 探测器获得的共焦堆叠的最大投影。(B) 从 566-652 nm 探测器获得的共焦堆叠最大投影。(C) 仅从 (B) 减去 (a) 获得 GFP 信号的图像。(D) 合并的 (B) 和 (C) 图像。(E) 3 维重建 (C)。比例尺 = 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 解剖腿的低功率视图显示好 (A) 和坏 (B) 固定的例子.缩放栏 = 200 µm.请点击这里查看这个数字的更大版本.
视频 1: GFP 标记的轴突 (绿色) 与一条腿的角质层 (灰色) 一起的电影.请点击这里查看此视频。(右键单击可下载.
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Discussion
成人果蝇的角质层和其他含有许多深色色素的节肢动物, 是观察其体内结构的主要障碍。此外, 它是强自动荧光, 这是由固定更糟。这两个特点是非常困难的观察荧光染料或分子体内的动物与外骨骼。
我们所描述的程序和我们在实验室中经常使用的过程会产生轴突轨迹的清晰和详细的图像, 以及它们在成年果蝇腿上的末端终点。重要的是, 没有从腿部角质层发出的荧光的任何污染得到一个干净的 GFP 信号。此功能是强制性的为了能够可视化和定量三维轴突的特征使用3维成像程序。这样可以比较从几条腿获得的数据。该程序很容易适应于观察其他荧光蛋白的信号, 可以很容易地用于其他成年节肢动物中的轴突成像。
该程序的两个关键方面是 i) 获得强 GFP 信号, 和 ii) 正确固定的腿。对于后者, 我们通常得到良好的固定, 然而有些腿有时不正确地固定。因此, 该程序需要改进, 也许通过添加促进试剂 (如砜) 的渗透剂或其他固定方法 (微波固定, 如果它保留 GFP 荧光), 但我们没有探索这种可能性除了在含有海卫一的 PBS 中使用 preincubation 步骤 (显著改善固定)。为了得到一个良好的 GFP 信号, 我们使用一个强大的 DVglut-Gal4驱动程序 (也称为OK371-Gal4)。也有必要使用一个好的记者-我们使用 mCD8-GFP, 也获得了良好的信号与细胞质 GFP 或 mCherry。无论如何, 我们使用包含主报告器 (hexameric) 的多个副本的记者和LexO或UAS网站的多个副本。
这个程序的局限性是它只适用于固定的组织。我们目前正在开发活体观察的程序, 并正在测试各种替代品 (安装和显微镜)。使用共聚焦显微镜的一个局限性是, 很难通过整个腿部进行观察: 这是因为对于来自深埋区域的信号, GFP 的信号散布在覆盖的组织中。另外, 双光子显微镜可以通过整个腿部的厚度进行成像。
最后, 其他方法使用不同类型的安装和固定4,12。我们的程序的意义和强度是, 从其他 (主要是表皮) 信号分离真正的 GFP 信号的减法步骤允许出色的3维重建和可视化的轴突和他们的终端。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢罗伯特纳尔准备飞行食品培养基。这项工作得到了 NIH 补助金 NS070644 R.S.M. 的支持, 并由 ALS 协会 (#256)、FRM (#AJE20170537445) 和 ATIP 艾文莉项目资助 J.E。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22 mm x 22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
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