Summary
Her beskriver vi en protokol til at visualisere den cytoskeletale målretning med en fluorescerende proteiner i voksen ben af Drosophila fiksering, montering, imaging og efter imaging skridt.
Abstract
Størstedelen af arbejdet på specifikationen neuronal foretaget i genetisk og fysiologisk tractable modeller såsom C. elegans, Drosophila larver og fisk, som alle deltage i undulatory bevægelser (gerne kravle eller svømning) som deres primære tilstand af bevægelse. Dog en mere nuanceret forståelse af den enkelte motor neuron (MN) specifikation — i det mindste i form af informere sygdom behandlinger — kræver en lige så tractable system, der bedre modeller komplekse vedhæng-baserede locomotion ordninger af hvirveldyr. Drosophila voksen bevægeapparatet ansvaret for gåafstand opfylder alle disse kriterier med lethed, da i denne model er det muligt at studere specifikation af et lille antal let at skelne ben MNs (ca 50 MNs pr. ben) begge bruger en langt matrix af stærke værktøjer, genetiske og fysiologiske led i en ordning for vedhæng-baserede locomotion. Her beskriver vi en protokol for at visualisere ben muskler innervation i en voksen flue.
Introduction
Ligesom de hvirveldyr lemmer, er Drosophila voksen benet organiseret i segmenter. Hvert fly ben indeholder 14 muskler, som hver består af flere muskelfibre1,2. Voksen ben MNs celle organer er placeret i T1 (prothoracic), T2 (mesothoracic) og T3 (metathoracic) ganglier på hver side af den ventrale nerve ledningen (VNC), en strukturel analog med hvirveldyr rygmarven (figur 1). Der er ca 50 MNs i hver ganglier, hvor målet muskler i fire segmenter af ipsilaterale benet (coxa, trochanter, lårben og skinneben) (figur 1)3. Vigtigere, har hvert enkelte voksne ben MN en unik morfologiske identitet er meget stereotype mellem dyr3,4. Alle disse unikke MNs er afledt af 11 stamceller, kaldet neuroblasts (NBs) producerer ben MNs under larve faser3,4. I slutningen af de larve faser alle differentiere de umodne postmitotic MNs under metamorfose at erhverve deres specifikke dendritiske Dorne og cytoskeletale terminal mål, der definerer deres enestående morfologi3,4. Vi har tidligere testet den hypotese, at en kombinatorisk kode af transkriptionsfaktorer (TFs) angiver den entydige morfologi af hvert Drosophila voksen ben MN5. Som en model brugte vi lineage B, en af de 11 NB slægter, som producerer syv ud af MNs og påvist, at en kombinatorisk kode af TFs udtrykt i postmitotic voksen ben MNs dikterer deres individuelle morfologier. Af reprograming TF kode af MNs har vi kunnet skifte MN morfologier på en forudsigelig måde. Vi kalder disse TFs: MHF'er (morfologiske TFs)5.
En af de mest udfordrende dele af de morfologiske analyser af voksen MNs er at visualisere axoner via en tyk og auto-fluorescerende neglebånd med høj opløsning. Vi mærker normalt axoner med en membran-tagged NGL, der er udtrykt i MNs med et binært udtryk system, som DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP eller DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, hvor DVglut er en stærk drivkraft udtrykt i motoneurons6. Ved at kombinere disse værktøjer med andre klonede teknikker som mosaik analyse med en repressible markør (MARCM)7, cis-MARCM8eller MARCMbow5, kan vi begrænse normal god landbrugspraksis udtryk til delpopulationer af MNs gør de fænotypiske analyser af axoner lettere. Vi har genereret en protokol for at holde benet MN cytoskeletale morfologi intakt til billedbehandling og efterfølgende 3D rekonstruktion ved at løse specifikke problemer iboende til voksen Drosophila benet som (1) fiksering af de interne strukturer af voksen benet uden at det påvirker axon morfologi, endogene fluorescerende udtryk og ben muskulatur, (2) montering af ben for at bevare den overordnede struktur under en coverslip og i de relevante orientering til billedbehandling, og (3) billedbehandling for at få neglebånd baggrund samt cytoskeletale fluorescerende signal. Mens denne protokol har været detaljeret til påvisning af fluorescerende udtryk i MN axoner, kan det anvendes til at visualisere andre komponenter af ben neuromusculature i leddyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ben dissektion og fiksering
- Tage en glasplade multi godt og fyld passende antal brønde med 70% ethanol. Tilføj 15 – 20 CO2-bedøvede fluer (af enten sex og enhver alder) til hver godt og ved hjælp af en pensel, forsigtigt duppe fluer i ethanol løsning indtil fluer er fuldt neddykket.
Bemærk: Dette trin er at fjerne hydrophobicity af neglebånd. Vask ikke for mere end 1 min, fordi det øger auto-fluorescens af neglebånd. - Skyl flyver 3 gange med 0,3% nonionisk overfladeaktivt rengøringsmiddel i 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Holde fluerne i denne løsning i mindst 10 min.
Bemærk: Ben er bedre fast, når herunder rengøringsmiddel, som kan forventes at øge penetration af fiksativ inde i benet. - Placer en multi godt plade på isen sammen med en tube 4% PARAFORMALDEHYD (PFA).
Bemærk: Forberedelse af frisk 4% PFA fra en 16% PFA ethanol gratis stock løsning er kritisk. - Bruge pincet til at fjerne hoved og underliv af fluer uden at beskadige den thorax segment eller benene.
Bemærk: At fjerne maven gør det nemmere at holde fluen og dissekere benene. - Dissekere benene fra thorax segmentet med pincet og placere ben i brøndene indeholdende 4% PFA. For dette, skubbe sagte men fast ved coxa-thorax krydset ved hjælp af spidsen af fine pincet, indtil ben løsner.
- Rette benene i 4% PFA natten over ved 4 ° C (ca 20 h samlede).
- Vaske benene med 0,3% nonionisk overfladeaktivt rengøringsmiddel i 1 x PBS, 5 x i 20 min.
- Erstatte vask buffer med montering medium. Holde benet i montering medium for mindst en dag før montering at tillade dens komplet indtrængen i benet.
Bemærk: Hvis montering medium er meget tyktflydende, fortyndes montering medium til 80% med 1 x PBS fordi den pludselige ændring i viskositet kan forårsage neglebånd at bryde sammen og beskadige den overordnede struktur af benet. Afhængigt af Gal4 driver, kan fluer bevares for 1 til 3 uger ved 4 ° C i montering medier indtil montering.
2. ben montering
- Placer ca 20 µL af 70% glycerol på venstre side af et objektglas og dæk dem med et firkantet 22 x 22 mm2 coverslip (figur 2A, B). Tilsæt 10 µL af montering medium langs en linje parallel til og i en lille afstand fra højre kant af denne coverslip. Tilføje en anden 30 µL af montering medium yderligere på højre side af dias (figur 2 c).
Bemærk: Når du anvender en coverslip over ben (se nedenfor) montering medium vil forsigtigt spredes under coverslip og omkring benene uden at fortrænge dem. - Ved hjælp af fine pincet løfte benet fra opløsningen og forsigtigt sætte det på montering medium nær den venstre coverslip. Gøre det samme for hvert ben og justere dem fra top til bund (figur 2D).
- Løft og overføre ben i en dråbe af medium afholdes mellem både tips til pincet. Orientere benene på to måder: eksterne side op eller ned.
- Når alle benene (op til 6-8 ben kan monteres) er korrekt justeret, sætte en anden coverslip over benene sådan, at denne coverslip hviler lidt på den tidligere indsatte coverslip (figur 2E) at give mulighed for plads mellem coverslip og væv og forhindre benene fra at blive beskadiget (fig. 2 g).
Bemærk: Alternativt bruge mærkat brønde eller tandregulering voks til at skabe plads mellem coverslip og diaset. - Brug en neglelak til at sikre positionen for coverslips i hvert hjørne (figur 2F).
Bemærk: Væv er nu klar til billede.
3. billedbehandling
- Oprette et enkelt spor ved hjælp af 488 nm laser og to detektorer samtidig for at opnå både normal god landbrugspraksis fluorescens og neglebånd auto-fluorescens. Ved hjælp af kontrolelementet rækkevidde eller Lysbillede display i vinduet spektrale i vinduet lys sti af softwaren, indstille registreringsområde af én detektor (detektor 1) mellem 498-535 nm og den anden (detektor 2) mellem 566-652 nm.
Bemærk: Typisk, detektor 1 bør være en GaAsP detektor og detektor 2 en photomultiplier tube. 498-535 kanal registrerer optimalt normal god landbrugspraksis signal men registrerer også automatisk fluorescens fra neglebånd. 566-652 kanal registrerer dog kun auto fluorescens fra neglebånd (figur 3A). - Bruge en 20 X eller 25 X olie fordybelse mål, opløsning 1024 x 1024 pixel, 12-bit dybde, og indstille Z afstand som 1 µm. sæt pixel dwell tid som ca 1,58 µs og gennemsnitlig 2 rammer/billede. Bruge mål med høj numerisk blænde.
- Angiv alle andre indstillinger, afhængigt af Konfokal mikroskop og billedbehandling software, der anvendes.
- Sørg for at få en lysere neglebånd signal fra 566-652 detektoren ikke fra 498-535 detektor. For at gøre dette, skal du bruge den samme laser power 488-laser for begge detektorer. Bruger mætning markører, først Juster forstærkningen af detektor 1 få en lys nok normal god landbrugspraksis signal (figur 3B, D). Derefter justere forstærkningen af detektoren 2 for at sikre, at nogle områder med høj neglebånd signal (kanterne af ben, leddene) producerer en mættet signal i denne detektor (figur 3 c, E).
- Hvis benet er udvidet og for stor til at blive afbildet i en enkelt ramme, bruge indstillingen flise eller holdning fra mikroskop billedbehandlingsprogrammer.
- Rekonstruere de endelige billeder enten ved hjælp af proprietære mikroskopet imaging software eller bruger ImageJ/FIJI freeware (se nedenfor).
4. indlæg billedbehandling forarbejdning
- Åbn den Konfokal stak i ImageJ/FIJI.
- Bruger Bioformats plugin (Plugins | Bio-formater | Bio-formats importør) i FIJI til at åbne billeder, ikke der i. TIF format fra proprietære imaging software pakker9.
- Opdele kanaler ved at vælge billede | Farve | Split kanaler.
Bemærk: Hvis billeder fra flere holdninger blev foretaget og må være rekombineret, brug den parvise syning plugin i FIJI fra (Plugins > syning > parvis syning)10,11. - For at trække neglebånd signal fra normal god landbrugspraksis signal, åbne billedet regnemaskine (processen | Billede regnemaskine): vælger stakken fra detektor 1 billede 1 (normal god landbrugspraksis + neglebånd) (figur 4A), Vælg trækkepå vinduet operation, og vælg stakken fra detektoren 2 som billede 2 (neglebånd) (figur 4B). Som følge heraf opnås kun den endogene normal god landbrugspraksis signal (NGL) (fig. 4 c).
- Flette tilbage denne stack (NGL) med 'neglebånd-bare' stakken fremstillet af detektor 2 (figur 4B billede | Farve | Sammenflet kanaler) at opnå en RGB-billede bestående af væv-specifikke normal god landbrugspraksis signal samt neglebånd signal, som hjælper med at identificere axon Dorne inden for ben segmenter (figur 4D).
- Indstil kontrast og lysstyrke af hvert billede (billede | Justere | Brightness/Contrast) og derefter generere en enkelt RGB-billede (billede | Type | RGB-farve).
Bemærk: Til at generere en maksimal projektion af Z-stak (billede | Stakke | Z projekt...), bruge maksimal intensitet projektion for normal god landbrugspraksis signal og gennemsnitlig intensitet for kutikula, som derefter kan justeres for lysstyrke før sammenlægningen af to kanaler.
- Alternativt kan du bruge en makro til automatisk subtraktion og behandling af billeder i ImageJ/FIJI. Kopiere teksten i supplerende fil 1 i makro editor (Plugins | Nye | Makro), gemme makroen i mappen Plugins og genstart ImageJ/FIJI én gang for at kunne bruge makroen.
- For at bruge makroen, skal du åbne Konfokal stakken og åbne vinduet lysstyrke/kontrast (billede | Justere | Brightness/Contrast). Derefter køre makroen (Plugin | Makro | Køre) og følg instruktionerne.
- Når bedt om at angive handlingen (billede regnemaskine vindue), vælge billede 1 som stak 1 (normal god landbrugspraksis), billede 2 som stack 2 (kutikula) og Subtraher.
Bemærk: Makroen genererer en maksimal projektion billede af den forarbejdede normal god landbrugspraksis signal (MAX_Result af stack1), en gennemsnitlig projektion af neglebånd (AVG_stack2), resultatet af subtraktion af neglebånd stak fra normal god landbrugspraksis stack (resultatet af stack1), og de uforarbejdede neglebånd stack (stack2). - Når bedt om at justere kontrast, Brug kontrolelementerne i vinduet lysstyrkekontrol/justere lysstyrke/kontrast af maksimal projektion billede af normal god landbrugspraksis, og den gennemsnitlige projektion af neglebånd, til at generere en RGB flettede billede af begge signaler viser normal god landbrugspraksis i grøn og neglebånd i grå. Flette resultatet af stack1 og stack2, for at på samme måde generere en kombineret normal god landbrugspraksis og neglebånd stak, der kan bruges i den næste fase.
- For at visualisere ben i tre dimensioner, skal du bruge specialiseret 3D software med de nyligt oprettede stakke (figur 4E).
- Åbn RGB-stakken med 3D-software (Se Tabel af materialer). Vælg alle kanaler i afsnittet tilstand konvertering i den affyre-oppe dialog rude, og Angiv størrelsen af en voxel (volumen af en pixel).
Bemærk: Alle nødvendige oplysninger er indeholdt i billedfiler fra hvad proprietære mikroskop software bliver brugt. - Højreklik på kanal 2 modul (normal god landbrugspraksis signal), og vælg Display | volren. Derefter venstre-klik på volren modul. Klik på venstre på Rediger i sektionen egenskaber (nederste venstre hjørne af skærmen) og vælg volrengreen.col. Højreklik på kanal 1 modul (kutikula signal) og vælg Display | volren. Derefter venstre-klik på volren modul. I sektionen egenskaber Venstreklik på Avanceret og vælge ddr (en gennemsigtig røntgenbillede-lignende visning), derefter justere gammaværdi for at se neglebånd baggrund (figur 4E).
- For at generere en 3D rotation, skal du højreklikke på stakken projektmodulet. Vælg derefter animere | rotere. Venstre-klik på Roter-modulet.
- Afsnit klik på bruge bbox centeri Egenskaber . På modulet rotere Højreklik og vælg beregne | movie maker. Klik på venstre museknap på modulet movie maker . I sektionen Egenskaber Venstreklik venstre på Avanceret (øverst til højre i afsnittet egenskaber).
- Udfylde navnet på filmen rotation i feltet filnavn . I feltet kvalitet skrive 1 (max kvalitet). Forlade ramme på 200 hvis en 8.3 s rotation ønskes (dette tal kan faldt eller steg for at ændre hastigheden af rotation). Tryk på Anvend (grøn knap, nederst til venstre i afsnittet egenskaber (Se Video 1)).
- Åbn RGB-stakken med 3D-software (Se Tabel af materialer). Vælg alle kanaler i afsnittet tilstand konvertering i den affyre-oppe dialog rude, og Angiv størrelsen af en voxel (volumen af en pixel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som vist i figur 4, giver denne procedure fremragende billeddannelse af normal god landbrugspraksis-mærket axoner i voksen Drosophila ben, sammen med deres terminal Dorne. Vigtigere er er en ren normal god landbrugspraksis signal fremstillet uden nogen forurening fra fluorescens udledes af ben neglebånd. Signalet fra neglebånd kan derefter kombineres med normal god landbrugspraksis signalet til at identificere placeringen af axoner i benene (figur 4E, figur 1og Video 1). Kritisk, er det vigtigt at få godt fast ben. Figur 5 viser eksempler på et godt fast (figur 5A) og et dårligt faste ben (figur 5B). I førstnævnte tilfælde de interne strukturer inde i benene er af en ensartet farve og tracheas, som er mørk, er synlige. En vigtigste trakeal tube løber i midten af hvert ben segment (støder op til hovedstammen nerve) og mange tyndere forgreninger er også synlige. I sidstnævnte, mørke materiale er til stede i tarsus og skinneben og luftrør systemet er ikke klart synlige i lårbenet og coxa: i sådanne tilfælde er det altid observeret, at signalet fra fluorescerende proteiner nedbrydes af lav intensitet eller fraværende helt. Andet, omhyggelig dissektion af benene er nødvendige for at opnå alle ben segmenterne (fra coxa til tibia) og undgå mekanisk chok for benene. Det tredje skal ben efterlades i montering medium lang nok til at trænge ind på indersiden af benene. Nogle gange ben segmenter, især lårbenet, vises skjulte – dette kan skyldes mangel på penetration af fiksativ og/eller montering medium. Endelig skal man bruge høj kvalitet mikroskop mål, korrigeret for fladhed af felt og specielt designet til fluorescens og/eller apokromatiske.
Figur 1: skemaet for den voksne Drosophila ben motoriske system. Celle organer af voksen benet MNs (grøn) er lokaliseret i cortex (grå) VNC thorax ganglion. MNs arborize deres dendritter i ben neuropil (blå) og sender deres axoner til benet til innerverer en af 14 benmusklerne (rød). Bemærk at kun T1 ben er skematiserede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Procedure at montere ben på objektglas. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Imaging procedure. (A) Emission spektre af normal god landbrugspraksis og ben neglebånd ved hjælp af 488 nm Argon laser excitation, fremstillet ved hjælp af spektrale billeddannelse af sektioner af ben udtryk for normal god landbrugspraksis og ben af Drosophila , der ikke udtrykker normal god landbrugspraksis henholdsvis. Bemærk at fluorescens-intensiteten ikke har været normaliseret, fx fra rå data ved hjælp af de samme parametre (mål, montering medium, laser power, Konfokal blænde, gevinst, offset) med hensyn til benet imaging procedure. Også vist er vinduerne detektor bruges til imaging normal god landbrugspraksis + neglebånd fluorescens (detektor 1: grøn) og neglebånd (detektor 2: pink), baseret på normal god landbrugspraksis vs neglebånd baggrund spektre. (B, C) Konfokal afsnit ben mærket med mCD8::GFP under kontrol af DVGlut-Gal4 fremstillet af detektor 1 (B) og detektor 2 (C). (D, E) Mætning markør indstillinger bruges til billede (B, C) henholdsvis (Se tekst for forklaring): blå ingen signal, røde mætning. Bemærk, at på detektor 1 de vigtigste nerve spor er mættet, mens på detektor 2 nogle regioner af neglebånd er mættet (Se pile). Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: behandling af billeder ved hjælp af ImageJ/FIJI. (A) Max projektion af Konfokal stakke fremstillet af 498-535 nm detektor. (B) Max projektion af Konfokal stakken fremstillet af 566-652 nm detektor. (C) Image med kun normal god landbrugspraksis signal fremkommer ved at fratrække (A) fra (B). (D) fusionerede billeder af (B) og (C). (E) 3D-genopbygning af (C). Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Low-power view dissekeret Ben viser eksempler på god (A) og dårlige (B) fiksering. Skalalinjen = 200 µm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: film af normal god landbrugspraksis-mærket axoner (grøn) sammen med neglebånd (grå) af en legoh Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hårstrået voksen Drosophila og andre leddyr, der indeholder mange mørke pigmenter, er en væsentlig hindring for at se strukturer inde i deres krop. Det er derudover stærkt auto fluorescerende, som forværres af fiksering. Disse to funktioner er meget problematisk for observationer af fluorescerende farvestoffer eller molekyler inde i kroppen af dyr med en exoskeleton.
Den procedure, vi har beskrevet, og at vi rutinemæssigt bruger i laboratoriet udbytter ren og detaljerede billeder af axon baner og tovbefæstigelsen terminal i voksen Drosophila ben. Vigtigere er er en ren normal god landbrugspraksis signal fremstillet uden nogen forurening fra fluorescens udledes af ben neglebånd. Denne funktion er obligatorisk for at kunne visualisere og kvantificere tredimensionale egenskaber i axon Dorne ved hjælp af 3D-billedbehandling programmer. På denne måde kan data indhentet fra flere ben sammenlignes. Proceduren er let tilpasses til observere signaler fra andre fluorescerende proteiner og kunne nemt bruges til billede axoner i andre voksne leddyr.
De to kritiske aspekter af proceduren er i) at få et stærkt signal om normal god landbrugspraksis, og ii) korrekt fiksation af benene. For sidstnævnte vi rutinemæssigt får god fiksering, ikke desto mindre nogle ben lejlighedsvis ikke rettet korrekt. Derfor, proceduren, der skal forbedres, måske ved at tilføje agenter, der fremmer udbredelsen af reagenser (såsom dimethylsulfoxide), eller andre former for fiksering (mikroovn fiksering, hvis den bevarer normal god landbrugspraksis fluorescens), men vi har ikke undersøgt denne mulighed bortset fra ved hjælp af et preincubation skridt i PBS, som indeholder Triton (som væsentligt forbedret fiksering). For at få en god normal god landbrugspraksis signal bruger vi en stærk DVglut-Gal4 driver (også kaldet OK371-Gal4). Det er også nødvendigt at bruge en god journalist – vi bruger mCD8-normal god landbrugspraksis og har også fået god signaler med cytoplasmatisk normal god landbrugspraksis eller mCherry. Uanset hvad, bruger vi journalister, der indeholder flere eksemplarer af den primære reporter (hexameric) og flere kopier af LexO eller UAS websteder.
En begrænsning af denne procedure er, at det kun gælder for faste væv. Vi er i øjeblikket ved at udvikle procedurer for i vivo observationer og afprøver forskellige alternativer (montering og mikroskoper). En begrænsning ved hjælp af Konfokal mikroskopi er, at det er svært at se gennem hele benet: Dette er fordi for signaler fra dybt-liggende områder signalet fra normal god landbrugspraksis er spredt gennem den overliggende væv. Skiftevis tillader biphoton mikroskop billeddannelse gennem tykkelsen af hele benet.
Endelig bruger andre metoder forskellige typer af montering og fastgørelse4,12. Betydning og styrke vores forretningsorden er at en subtraktion trin adskille ægte normal god landbrugspraksis signal fra andre (primært cuticular) signaler giver fremragende 3-dimensionelle genopbygning og visualisering af axoner og deres terminal Dorne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Robert Renard for at forberede flyve mad medium. Dette arbejde blev understøttet af en NIH grant NS070644 til R.S.M. og finansiering fra ALS Association (#256), FRM (#AJE20170537445) og ATIP-Avenir Program til J.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22 mm x 22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. Demerec, M. , John Wiley & Sons. New York, NY. 420-531 (1950).
- Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).
- Enriquez, J., Mann, R. S. Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).
- Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
- ImageJ. Bio-Formats. , Available from: http://imagej.net/Bio-Formats (2018).
- ImageJ. Image Stitching. , Available from: http://imagej.net/Image_Stitching (2018).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map. PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).
