Summary
Her beskriver vi en protokoll for å visualisere axonal målretting med et fluorescerende protein i voksen Ben Drosophila fiksering, montering, imaging og etter bildebehandling trinnene.
Abstract
Fleste arbeid på neuronal spesifikasjonen er utført i genetisk og fysiologisk medgjørlig modeller som C. elegans Drosophila larver og fisk, som alle deltar i undulatory bevegelser (som kravlesøk eller svømme) som sin primære modus for bevegelse. Men en mer sofistikert forståelse av personlige motoriske nervecellen (MN) spesifikasjonen-minst i informere sykdom behandling-krever en like tett system som bedre modeller for komplekse appendage-baserte bevegelse ordninger av virveldyr. Voksen Drosophila locomotor systemet for gangavstand oppfyller alle disse kriteriene med letthet, siden i denne modellen er det mulig å studere spesifikasjon av et lite antall enkelt å skille etappe MNs (ca 50 MNs per etappe) både med et stort matrise av kraftige genetisk verktøy, og i fysiologiske sammenheng av en appendage-baserte bevegelse. Her beskriver vi en protokoll for å visualisere etappe muskler gir i en voksen fly.
Introduction
Som virveldyr lem, er Drosophila voksen beinet organisert i segmenter. Hvert fly Ben inneholder 14 muskler, hver består av flere muskelfibre1,2. Cellen legemer voksen etappe MNs ligger i T1 (prothoracic), T2 (spirakelen) og T3 (metathoracic) Ganglion på hver side av ventrale (VNC), et strukturelt analoge til vertebrate ryggmargen (figur 1). Det er ca 50 MNs i hver Ganglion, hvilke mål muskler i fire segmenter av ipsilateral etappe (hofte, trochanter, femur og tibia) (figur 1)3. Betydelig, har personlige voksen etappe MN en unik morfologiske identitet som er svært stereotype mellom dyr3,4. Alle disse unike MNs er avledet fra 11 stamceller, kalt neuroblasts (NBs) produserer etappe MNs under larver stadier3,4. På slutten av larver stadier alle skille de umodne postmitotic MNs under metamorfose å anskaffe deres spesifikk dendrittiske arbors og axonal terminal mål som definerer deres unike morfologi3,4. Tidligere testet vi hypotesen at kombinasjon koden transkripsjonsfaktorer (TFs) angir unik morfologi av Drosophila voksen etappe MN5. Som modell brukte vi avstamning B, en av 11 NB linjen som produserer sju av MNs og viste at en kombinasjon kode TFs uttrykt i postmitotic voksen etappe MNs dikterer deres personlige morphologies. Av reprograming TF koden for MNs har vi kunnet slå MN morphologies på en forutsigbar måte. Vi kaller dette TFs: mTFs (morfologisk TFs)5.
En av de mest utfordrende delene av de morfologiske analysene av voksen MNs er å visualisere axons gjennom en tykk og auto-fluorescerende cuticle med høy oppløsning. Vi vanligvis merke axons med en membran-merket GFP som uttrykkes i MNs med en binær uttrykk, for eksempel DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP eller DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, der DVglut er en sterk driver uttrykt i motoneurons6. Ved å kombinere disse verktøyene med andre klonal teknikker som mosaikk analyse med repressible markør (MARCM)7, cis-MARCM8eller MARCMbow5, kan vi begrense det GFP uttrykket subpopulasjoner av MNs gjør fenotypiske analyse av axons enklere. Vi har generert en protokoll for å holde beinet MN axonal morfologi intakt for bildebehandling og påfølgende 3D rekonstruksjon av adressering problemer iboende til voksen Drosophila beinet som (1) fiksering av de interne strukturene i voksen beinet uten å påvirke axon morfologi, endogen fluorescerende uttrykk og Ben muskulaturen, (2) montering av benet til bevare den overordnede strukturen under en dekkglassvæske og i riktig retning for bildebehandling, og (3) bildebehandling for å få cuticle bakgrunn samt axonal fluorescerende signal. Mens denne protokollen er detaljert for påvisning av fluorescerende uttrykk i MN axons, kan den brukes for å se andre komponenter av Ben neuromusculature i leddyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. etappe disseksjon og fiksering
- Ta en glassplate flere godt og fyll riktig antall brønner med 70% etanol. Legge til 15-20 CO2-bedøvet fluer (av begge kjønn og alle aldre) til hver godt og ved hjelp av en pensel, forsiktig dab fluene i etanol løsningen før flyr helt senkes.
Merk: Dette trinnet er å fjerne hydrophobicity av cuticle. Ikke vask for mer enn 1 min, fordi dette øker auto-fluorescens av cuticle. - Skyll fluene 3 ganger med 0,3% ikke-ionisert surfactant rengjøringsmiddel i 1 x fosfat bufret saltvann (PBS). Holde fluene i denne løsningen for minst 10 min.
Merk: Ben er bedre løst inkludert vaskemiddel, som trolig vil øke gjennomtrengning av bindemiddel i beinet. - Plass en multi godt plate på isen med en tube med 4% paraformaldehyde (PFA).
Merk: Utarbeidelse av frisk 4% PFA fra en 16% PFA etanol gratis lager løsning er avgjørende. - Bruke pinsett fjerne hodet og magen Fluenes uten å skade thorax segmentet eller bena.
Merk: Fjerne magen gjør det enklere å holde fly og dissekere bena. - Dissekere bena fra thorax segmentet med tang og setter beina i brønnene som inneholder 4% PFA. For dette, kan du trykke forsiktig men bestemt i hofte-syn krysset med spissen av fine tang til beinet løsner.
- Fikse bena på 4% PFA overnatting på 4 ° C (ca 20 h totalt).
- Vask beina med 0,3% ikke-ionisert surfactant rengjøringsmiddel i 1 x PBS, 5 x for 20 min.
- Erstatte vaske bufferen med montering medium. Holde beinet montering medium for minst en dag før montering å tillate dens fullstendig gjennomtrengning i beinet.
Merk: Hvis montering mediet er svært tyktflytende, fortynne montering mediet til 80% med 1 x PBS fordi plutselige endringen i viskositet kan føre cuticle skjule og skade den overordnede strukturen i benet. Avhengig av Gal4 driveren, kan fluer bevares for 1-3 uker på 4 ° C i montering media før montering.
2. etappe montering
- Plass ca 20 µL 70% glyserol på venstre side av en microscope skyve og dekk med et kvadrat 22 x 22 mm2 dekkglassvæske (figur 2A, B). Pipetter ca 10 µL av montering medium langs en linje parallell til og en liten avstand fra høyre kant av denne dekkglassvæske. Legge til en annen 30 µL av montering medium videre på høyre side av lysbildet (figur 2C).
Merk: Når du bruker en dekkglassvæske over bena (se nedenfor) montering mediet vil forsiktig spre under dekkglassvæske og rundt beina uten displacing dem. - Bruke fine tang løft benet fra løsningen og forsiktig plassere den på montering mediet i den venstre dekkglassvæske. Gjør det samme for hver etappe og justere dem fra topp til bunn (figur 2D).
- Løft og overføre beina i en dråpe medium holdt mellom begge tips av pinsett. Orientere bena på to måter: ekstern side opp eller ned.
- Når alle bena (opp til 6-8 Ben kan monteres) justeres riktig, sette en andre dekkglassvæske over beina slik at denne dekkglassvæske hviler litt på den tidligere montert dekkglassvæske (figur 2E) å ha mellomrom mellom dekkglassvæske og vev og hindre bena fra å bli skadet (figur 2 g).
Merk: Alternativt bruke klistremerke brønner eller ortodontiske voks for å lage mellomrom mellom dekkglassvæske og lysbildet. - Bruk en neglelakk for å sikre plasseringen av coverslips i hvert hjørne (figur 2F).
Merk: Vev er nå klar til bildet.
3. imaging
- Definere ett enkelt spor bruke 488 nm laser og to detektorer samtidig for å få både GFP fluorescens og cuticle auto-fluorescens. Bruker kontrollen området eller skyve skjermen i vinduet spectral i vinduet lys banen av programvaren, angi oppdagelsen av en detektor (detektor 1) mellom 498-535 nm og den andre (detektor 2) mellom 566-652 nm.
Merk: Vanligvis detektoren 1 bør være en GaAsP detektor og detektoren 2 et photomultiplier rør. 498-535 kanalen oppdager optimalt GFP signalet, men også oppdager automatisk fluorescens fra cuticle. 566-652 kanalen finner imidlertid bare den automatisk fluorescensen fra cuticle (figur 3A). - Bruk en 20 X eller 25 X olje nedsenking mål, 1024 x 1024 piksler oppløsning, 12-bits dybde, og angi Z 1 µm. Angi piksel bor tid som ca 1.58 µs, og gjennomsnittlig 2 rammer/bilde. Bruk mål med høy numeriske blenderåpning.
- Angi alle andre innstillinger, avhengig av AC confocal mikroskop og bildebehandlingsprogramvare brukes.
- Sørg for å få en lysere cuticle signal fra 566-652 detektoren fremfor 498-535 detektoren. Dette gjør bruk samme laser kraft 488-laser for begge detektorer. Bruke metning markører, først justere gevinst på detektoren 1 for å få et sterkt nok GFP signal (figur 3B, D). Deretter justere forsterkningen av detektor 2 slik at noen områder med høy cuticle signal (kanter av bein, ledd) produsere et mettet signal i denne merker (Figur 3 c, E).
- Hvis beinet er utvidet og for stor til å avbildes i én ramme, kan du bruke alternativet fliser eller posisjon fra mikroskop tenkelig programvare.
- Rekonstruere den endelige bilder enten av proprietære mikroskopet tenkelig programvare eller bruke ImageJ/FIJI freeware (se nedenfor).
4. innlegget Imaging behandling
- Åpne AC confocal stabelen ImageJ/Fiji.
- Bruk Bioformats plugin (Plugins | Bio-formater | Bio-formats importør) i FIJI åpne bilder som ikke. TIF-format fra proprietære tenkelig programvare pakker9.
- Delt kanaler ved å velge bilde | Farge | Del opp kanaler.
Merk: Hvis bilder fra flere stillinger ble gjort og må være saman, bruker den parvis søm plugin i FIJI fra (Plugins > Stitching > parvis sømmer)10,11. - Vil trekke cuticle signalet fra GFP signalet, åpne bildet kalkulatoren (prosess | Bildet kalkulator): Velg stabelen detektor 1 bilde 1 (GFP + cuticle) (figur 4A), operasjon i vinduet Velg trekk, og velg stakken fra detektor 2 bilde 2 (cuticle) (figur 4B). Resultatet er bare endogene GFP signalet (GFP) oppnådd (figur 4C).
- Møtes rygg denne stakken (GFP) med 'cuticle-bare' stack fra detektor 2 (figur 4B bilde | Farge | Slå sammen kanaler) å få en RGB bildet består av vev-spesifikke GFP signalet samt cuticle signalet, som bidrar til å identifisere axon arbors i beinet segmentene (Figur 4 d).
- Justere kontrast og lysstyrke på hvert bilde (bilde | Justere | Brightness/Contrast) og genererer et enkeltbilde RGB (bilde | Type | RGB-farge).
Merk: Generere en maksimal projeksjon av Z-stakken (bilde | Stabler | Z prosjektet...), bruker maksimale intensitet projeksjon for GFP signalet og gjennomsnittlig intensitet for cuticle, som deretter kan justeres for skarphet før flette de to kanalene.
- Alternativt bruke en makro for automatisk subtraksjon og behandling av bilder i ImageJ/FIJI. Kopiere teksten i supplerende fil 1 i makro editor (Plugins | Ny | Makroen), lagre makroen i Plugins-mappen, og start ImageJ/FIJI én gang for å kunne bruke makroen.
- Du bruker makroen, åpne AC confocal stabelen, og åpne vinduet lysstyrke/kontrast (bilde | Justere | Brightness/Contrast). Kjør makroen (Plugin | Makro | Kjør) og følg instruksjonene.
- Når bedt om å angi operasjonen (Kalkulator bildevinduet), velge Bilde 1 som stack 1 (GFP), bilde 2 som stack 2 (cuticle) og trekk fra.
Merk: Makroen genererer en maksimal prosjektering bilde behandlet GFP signalet (MAX_Result av stack1), en gjennomsnittlig projeksjon av cuticle (AVG_stack2), resultatet av subtraksjon av cuticle stabelen fra GFP stakken (resultat av stack1) og den ubehandlet cuticle stack (stack2). - Spørsmål justere kontrast, bruke kontrollene i vinduet lysstyrkekontroll/justere lysstyrke/kontrast av maksimal prosjektering bildet GFP og gjennomsnittlig projeksjon av cuticle, generere en RGB sammenslåtte bildet av både signaler viser GFP i Green og cuticle i grått. Sammen stack1, og stack2, på samme måte genererer en kombinert GFP og cuticle stabel som kan brukes i neste trinn.
- For å visualisere beina i tre dimensjoner, bruke spesialiserte 3D programvare med de nyopprettede stablene (figur 4E).
- Åpne RGB stabelen med 3D-programvare (se Tabell for materiale). I vinduet popmusikk-opp dialogue, velge alle kanaler i avsnittet modus konvertering og angi størrelsen på en voxel (volum av en piksel).
Merk: All nødvendig informasjon finnes i bildefilene fra proprietære mikroskop programvaren brukes. - På kanal 2 modul (GFP signal), høyreklikk og velg skjerm | volren. Deretter venstre-klikk på volren modul. Klikk igjen på Rediger i delen egenskaper (nederst til venstre på skjermen) og velg volrengreen.col. På kanal 1 modul (cuticle signal) høyreklikk og velg skjerm | volren. Deretter venstre-klikk på volren modul. I Properties-inndelingen venstreklikk på Avansert og velger ddr (en gjennomsiktig røntgenbilde-lignende skjerm), deretter justere gammaverdien du cuticle bakgrunnen (figur 4E).
- For å generere en 3D-rotasjon, høyreklikk stabel prosjektmodulen. Velg animere | rotere. Venstreklikk på Roter modulen.
- I Egenskaper -delen Klikk på Bruk Bouygues center. På Roter modulen Høyreklikk og velg beregne | filmmaker. Klikk venstre museknapp på modulen filmmaker . Under Egenskaper klikker du på Avansert (øverst til høyre i delen egenskaper).
- Fyll ut navnet på filmen rotasjon feltet filnavn . I feltet kvalitet Skriv 1 (maks kvalitet). La rammen på 200 hvis en 8.3 s rotasjon (dette tallet kan være redusert eller økt endre hastigheten på rotasjon). Trykk deretter bruke (grønne knappen, nederst til venstre i inndelingen egenskaper (se Video 1)).
- Åpne RGB stabelen med 3D-programvare (se Tabell for materiale). I vinduet popmusikk-opp dialogue, velge alle kanaler i avsnittet modus konvertering og angi størrelsen på en voxel (volum av en piksel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som vist i Figur 4, kan denne prosedyren utmerket avbildning av GFP-merket axons i voksen Drosophila bena, sammen med deres terminal arbors. Viktigere oppnås en ren GFP signal uten noen forurensning fra fluorescens fra Ben cuticle. Signalet fra cuticle kan deretter kombineres med GFP signalet til å identifisere plasseringen av axons i bena (figur 4E figur 1og Video 1). Kritisk, er det viktig å få godt fast ben. Figur 5 viser eksempler på et godt fast (figur 5A) og en dårlig-fast etappe (figur 5B). I tilfelle de interne strukturene i bena er en jevn farge og tracheas, som er mørk, synlig. En viktigste tracheal tube kjører i midten av hvert ben segment (tilstøtende viktigste nerve stammen) og mange tynnere konsekvenser er også synlige. I det siste, mørk materiale finnes i tarsus og tibia og tracheal systemet er ikke synlig i femur og hofte: i slike tilfeller er det alltid observert at signalet fra fluorescerende proteiner er degradert av lav intensitet eller mangler helt. Andre, forsiktig Disseksjon av bena er å få alle Ben segmentene (fra hofte til tibia) og unngå mekanisk støt til bena. Tredje må bena bli værende i montering middels lang nok for seg å trenge gjennom innsiden av bena. Ben segmenter, særlig femur, vises skjult-dette kan være grunn av gjennomtrengning av bindemiddel eller montering medium. Til slutt, må man bruke høykvalitets mikroskop mål, korrigert for flat feltet og spesialdesignet til fluorescens og/eller apochromatic.
Figur 1: skjemaet for voksen Drosophila etappe motor systemet. Cellen legemer voksen beinet MNs (grønn) er lokalisert i cortex (grå) på den thorax ganglion VNC. MNs arborize sin dendrites i beinet neuropil (blå) og sende deres axons i benet til innervate en av 14 beinmuskulaturen (rød). Merk at bare T1 Ben er schematized. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: prosedyre å montere Ben på objektglass. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Imaging prosedyren. (A) utslipp spektra av GFP og Ben cuticle ved hjelp av 488 nm Argon laser eksitasjon, innhentet med spektral imaging deler av bena uttrykke GFP og ben av Drosophila som ikke uttrykke GFP henholdsvis. Merk at fluorescens intensiteten ikke har blitt normalisert, er f.eks fra rå data med de samme parameterne (mål, montering medium, laser makt, AC confocal blenderåpning, gevinst, forskyvning) for beinet imaging prosedyren. Også vist er vinduene detektor brukes for imaging GFP + cuticle fluorescens (detektor 1: grønn) og cuticle (detektor 2: rosa), basert på GFP vs cuticle bakgrunn spectra. (B, C) AC confocal delen av Ben merket med mCD8::GFP under kontroll av DVGlut-Gal4 Hentet fra detektor 1 (B) og detektor 2 (C). (D, E) Metning markør innstillinger til bilde (B, C) henholdsvis (se tekst for forklaring): blå ingen signal, røde metning. Merk at på detektoren 1 viktigste nerve sporene er mettet, mens på detektoren 2 noen regioner av cuticle er mettet (se piler). Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: bildebehandling bruker ImageJ/FIJI. (A) maks projeksjon av AC confocal stabler fra 498-535 nm detektor. (B) maks projeksjon av AC confocal stabelen fra 566-652 nm detektor. (C) Image med bare GFP signalet ved å trekke (A) fra (B). (D) sammen bilder av (B) og (C). (E) 3D rekonstruksjon av (C). Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: lavt strømforbruk visning av dissekert Ben viser eksempler på gode (A) og dårlige (B) fiksering. Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: film av GFP-merket axons (grønn) sammen med cuticle (grå) for en leg. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cuticle voksen Drosophila og andre leddyr, som inneholder mange mørke pigmenter, er en stor utfordring for visning av strukturer i kroppen sin. I tillegg er sterkt auto fluorescerende som er fremstilt verre av fiksering. Disse to funksjonene er svært problematisk for observasjoner av fluorescerende fargestoffer eller molekyler i kroppen av dyr med et ytre skjelett.
Prosedyren at vi har beskrevet og at vi rutinemessig bruk i lab gir ren og detaljerte bilder av axon baner og endingene terminal i voksen Drosophila ben. Viktigere oppnås en ren GFP signal uten noen forurensning fra fluorescens fra Ben cuticle. Denne funksjonen er obligatorisk for å kunne visualisere og quantitate tredimensjonale funksjoner av axon arbors bruker 3D-bildebehandling programmer. På denne måten kan data fra flere ben sammenlignes. Prosedyren er lett tilpasses for å observere signaler fra andre fluorescerende proteiner og kan enkelt brukes til bildet axons i andre voksne leddyr.
To viktige aspekter av prosedyren er i) for å få et sterkt signal om GFP og ii) riktig fiksering av bena. Sistnevnte får vi rutinemessig god fiksering, likevel bena noen ganger ikke fast riktig. Derfor prosedyren må bli bedre, kanskje ved å legge til agenter som fremmer gjennomtrengning av reagenser (som dimethylsulfoxide), eller andre former for fiksering (mikrobølgeovn fiksering, dersom den bevarer GFP fluorescens), men vi har ikke utforsket denne muligheten bortsett fra å bruke et preincubation skritt i PBS med Triton (som forbedret fiksering). For å få et godt GFP signal bruker vi en sterk DVglut-Gal4 -driver (også kalt OK371-Gal4). Det er også nødvendig å bruke en god reporter-vi bruker mCD8-GFP og har også fått gode signalene med cytoplasmatiske GFP eller mCherry. Uansett, bruker vi journalister som inneholder flere kopier av primære reporteren (hexameric) og flere kopier av LexO eller UAS områder.
En begrensning i denne fremgangsmåten er at det bare gjelder fast vev. Vi utvikler for tiden prosedyrer for i vivo observasjoner og tester ulike alternativer (montering og mikroskoper). En begrensning med AC confocal mikroskopi er at det er vanskelig å se gjennom hele beinet: Dette er fordi for signaler fra dype-liggende områder signalet fra GFP er spredt gjennom overliggende vev. Alternativt kan biphoton mikroskop imaging gjennom tykkelsen av hele beinet.
Til slutt, andre bruker forskjellige typer montering og fiksering4,12. Betydningen og styrke vår prosedyre er at litt subtraksjon skille ekte GFP signal fra andre (hovedsakelig cuticular) signaler gir utmerket 3-dimensjonale gjenoppbygging og visualisering av axons og deres terminal arbors.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Robert Renard for forbereder fly mat medium. Dette arbeidet ble støttet av en NIH stipend NS070644 å R.S.M. og finansiering fra ALS Association (#256), FRM (#AJE20170537445) og ATIP-Avenir programmet til J.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22 mm x 22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. Demerec, M. , John Wiley & Sons. New York, NY. 420-531 (1950).
- Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).
- Enriquez, J., Mann, R. S. Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).
- Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
- ImageJ. Bio-Formats. , Available from: http://imagej.net/Bio-Formats (2018).
- ImageJ. Image Stitching. , Available from: http://imagej.net/Image_Stitching (2018).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map. PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).
