Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Syntese og struktur bestemmelse af µ-Conotoxin PIIIA isomerer med forskellige disulfid Connectivities

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58368
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Pharmaceutical Biochemistry and Bioanalytics, Pharmaceutical Institute, University of Bonn
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Cystein-rige peptider fold i særskilte tredimensionale strukturer afhængigt af deres disulfid connectivity. Målrettet syntese af individuelle disulfid isomerer er påkrævet, når buffer oxidation ikke fører til den ønskede disulfid connectivity. Protokollen beskæftiger sig med den selektive syntese af 3-disulfid-bonded peptider og deres strukturelle analyse ved hjælp af NMR- og MS/MS undersøgelser.

Abstract

Peptider med et stort antal cysteines påvirkes normalt med tre-dimensionelle struktur af deres disulfid connectivity. Det er således meget vigtigt at undgå uønskede disulfid obligation dannelse under faststadie peptidsyntese, fordi det kan resultere i en helt anden peptid struktur, og derfor ændrede bioactivity. Den korrekte dannelsen af flere disulfid obligationer i et peptid er imidlertid vanskelig at opnå ved hjælp af standard selv folde metoder såsom konventionelle buffer oxidation protokoller, fordi flere disulfid connectivities kan dannes. Denne protokol udgør en avanceret strategi kræves for målrettede syntese af flere disulfid bro peptider, der ikke kan syntetiseres via buffer oxidation i høj kvalitet og mængde. Undersøgelsen viser anvendelsen af en særskilt beskytte gruppe strategi for syntesen af alle mulige 3 disulfid-bundne peptid isomerer af µ-conotoxin PIIIA i en målrettet måde. Peptider er udarbejdet af Fmoc-baseret solid fase peptidsyntese ved hjælp af en beskyttelse gruppe strategi for definerede disulfid obligation dannelse. De respektive par af cysteines er beskyttet med trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) og tert-butyl (tBu) beskytte grupper for at sikre, at kun de nødvendige cysteines under hver oxidation skridt er deprotected og forbundet. Ud over de målrettede syntese anvendes en kombination af flere analytiske metoder til at afklare de korrekte folding og generation af de ønskede peptid strukturer. Sammenligning af forskellige 3-disulfid-bonded isomerer angiver betydningen af nøjagtig bestemmelse og viden om disulfid tilslutningsmuligheder for beregningen af den tre-dimensionelle struktur og fortolkning af biologiske aktivitet af peptid isomerer. Den analytiske karakterisering indeholder nøjagtige disulfid obligation udredning via tandem massespektrometri (MS/MS) analyse, som er udført med delvist reduceret og alkylerede derivater af intakt peptid isomer produceret af en tilpasset protokol. Derudover fastlægges peptid strukturer ved hjælp af 2D Kernemagnetisk resonans (NMR) eksperimenter og viden indhentet fra MS/MS analyse.

Introduction

Brugen af bioaktive peptider i farmaceutisk forskning og udvikling er meget anerkendt, fordi de repræsenterer potent og yderst selektiv forbindelser for specifikke biologiske mål1. For deres bioactivity, men er de tre-dimensionelle struktur af stor betydning for at kunne udføre struktur-aktivitet relationer undersøgelser2,3,4. Ud over den primære aminosyresekvens der påvirker den generelle kropsbygning, stabilisere disulfid obligationer betydeligt strukturen af cystein-rige peptider5. Flere disulfid bro peptider omfatter conotoxins som µ-PIIIA fra Conus purpurascens som indeholder seks cysteines i dens sekvens. Denne høje cystein indhold teoretisk tillader dannelsen af 15 disulfid isomerer. Den korrekte disulfid connectivity er meget vigtigt, at den biologiske aktivitet6,7. Men spørgsmålet er, om der er mere end én bioaktive kropsbygning af naturligt forekommende peptider og hvis så, hvilke af disse isomerer besidder den højeste biologiske aktivitet? I forbindelse med µ-conotoxins, de biologiske mål spænding-gated natrium Ionkanaler, og µ-PIIIA især er mest potente for undertyper NaV1.2, NaV1,4 og NaV1.73.

Syntesen af disulfid bro peptider kan opnås ved hjælp af forskellige metoder. Den mest bekvemme metode til dannelsen af svovlbroer inden for et peptid er den såkaldte oxidative selvstændige folde tilgang. Her, er den lineære forløber for den ønskede cyklisk peptid syntetiseret, først ved hjælp af solid faststadie peptidsyntese, som kommer efter spaltning af polymert støtte udsat for oxidation i en buffersystem. Redox-aktive stoffer såsom reduceret og oxideret glutathion (GSH/GSSG) tilsættes ofte til at fremme dannelsen af disulfid obligationer. Den største ulempe ved buffer-støttede selvstændige folde er at disulfid obligationer ikke er dannet selektivt i en trinvis måde. I forhold til den indfødte peptid, som ofte kun én specifik disulfid isomer er beskrevet, er det muligt at opnå talrige andre isomere med denne tilgang til8. µ-PIIIA har allerede vist sig at resultere i mindst tre anderledes foldede isomerer ved selvstændig foldning i et tidligere studie3. Adskillelse af sådan en isomer blanding er temmelig vanskelig på grund af lignende retentionstider anvender chromatografiske rensning metoder9. Den målrettede syntese af en bestemt isomer er derfor fordelagtige. Til specifikt producere en isomer med definerede disulfid connectivity, en særlig strategi kræves som disulfid obligationer er successivt lukket. Derfor, den lineære forløber transporterer særskilt beskytte grupper på de enkelte cystein par er syntetiseret i polymer støtte. Efter eliminering, cystein par er individuelt og successivt deprotected og knyttet en oxidation reaktion til at give den ønskede disulfid obligationer10,11,12,13, 14 , 15 , 16. efter syntese og rensning af reaktionsprodukt, er det nødvendigt at bekræfte identitet og disulfid tilslutning af egnede analysemetoder. Findes mange analytiske metoder til udredning af den primære aminosyresekvens, fx., MS/MS, mens fastsættelsen af disulfid connectivity er stadig langt mindre undersøgte. Ud over kompleksiteten af sådanne flere disulfid-bonded peptider, produkt-relaterede urenheder (fx., fra disulfid scrambling), på grund af prøve forberedelse og arbejde op kan yderligere komplicere analyse. I dette papir viser vi, at brugen af en kombination af forskellige analytiske teknikker er nødvendigt at utvetydigt tydeliggøre identiteten af disulfidbroer i µ-PIIIA isomerer. Vi har kombineret kromatografiske metoder med massespektrometri og leveres de samme prøver at NMR spektroskopi. I matrix assisted laser desorption/ionization(MALDI) MS/MS analyse identificeret vi disulfid obligationer ved hjælp af delvis reduktion og iodoacetamide forædling fordi top-down analyse ikke er muligt for dette peptid. 2D NMR eksperimenter blev udført for at opnå en tredimensionel struktur af hver isomer. Ved at kombinere forskellige avancerede analytiske metoder, er det således muligt at belyse korrekt disulfid connectivity og tre-dimensionelle struktur af komplekse flere disulfid-bonded peptider7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Alle aminosyrer bruges heri var i L-konfiguration. Forkortelser af aminosyrer og aminosyre derivater blev brugt overensstemmelse med anbefalingerne fra nomenklatur-Udvalget af IUB og IUPAC-IUB fælles Kommissionen på biokemiske nomenklatur.

1. faststadie syntese (SPP'ER)

Bemærk: Udføre syntesen med en faststadie synthesizer. Udføre syntesen af lineære peptid forløbere for den almindelige sequence ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2 ved hjælp af en standardprotokol for 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) kemi. Anvende de følgende beskyttede aminosyrer: Pyr (Boc (tert-butyloxycarbonyl)), Arg (Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl)), Asn(Trt), Asp(tBu), Hyp(tBu), Lys(Boc), Ser(tBu), Gln(Trt), Glu(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), Thr(tBu) og hans (Trt). Beskytte cystein par med Trt-, Acm- eller tBu-grupper ifølge den tilsigtede disulfid connectivity.

  1. Forberedelse
    1. Tørre Fmoc Rink-AMID harpiks (indlæsning: 0,28 mmol/g) ved hjælp af en lyophilizer natten over.
    2. Angiv ønskede peptid sekvens (1-bogstavers kode) i programmet for synthesizeren. Programmet beregner den nødvendige mængde for hver enkelte reagens og angiver de solvente mængder.
    3. Vejer de enkelte reagenser (aminosyrer, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) i henhold til protokollen og opløse dem i dimethylformamid (DMF) til en slutkoncentration på 2,4 M (aminosyrer) og 0,6 M ( HBTU), henholdsvis.
    4. Overføre de forskellige reagenser (aminosyrer, HBTU, N-methylmorpholine (NMM, 50% i DMF), Piperidin (20% i DMF), DMF, dichlormethan (DCM)) til de tilsvarende fartøjer og placere dem i passende ketsjere af faststadie synthesizer.
    5. Tilføje 100 mg af tørre harpiks til kolonnerne reaktion og sætte dem i ketsjeren af synthesizeren. Start faststadie syntese.
  2. SPP'ER-protokollen (leveres af synthesizer)
    Bemærk: Protokollen gælder for 100 mg af harpiks (indlæsning: 0,28 mmol/g) tilføjet til én reaktion kolonne for 28 µmol skala.
    1. Forberedelse af harpiks
      1. Skyl harpiks med 2500 µL af DMF, 1400 µL af DCM og 1400 µL af DMF.
      2. Skyl harpiks med luft, indtil opløsningsmidlet er fjernet og skyl harpiks med 2500 µL af DMF.
    2. Spaltning af Fmoc beskytte gruppe
      1. Tilføj 20% Piperidin i DMF (1000 µL) til harpiks og vente på 6 min. fjerne løsningen fra harpiks. Gentag trin 1.2.2.1.
      2. Skylles to gange med DMF (1st 4000 µL, 2nd1400 µL), skyl harpiks med luft, indtil opløsningsmidlet er fjernet og skylles to gange med 2000 µL af DMF.
    3. Kobling reaktion
      1. Bland de følgende reagenser i en separat hætteglas: HBTU (450 µL; 0,6 M i DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% i DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino syre (420 µL; 2,4 M i DMF; 1,01 mmol; 36 eq.). Tilsæt blandingen til harpiks og vente på 13 min. Fjern løsning fra harpiks. Gentag trin 1.2.3.1.
      2. Vask med 3000 µL af DMF. Vaskes to gange med 1400 µL af DMF. Vaskes to gange med 2000 µL af DMF.
      3. Gentag trin 1.2.2 og 1.2.3 efter antallet af aminosyrer i peptid sekvens.
    4. Endelige Fmoc kavalergang og harpiks vask
      1. Tilføj 20% Piperidin i DMF (1000 µL) til harpiks og vente på 6 min. fjerne løsningen fra harpiks. Gentag trin 1.2.4.1.
      2. Skylles to gange med DMF (1st 4000 µL, 2nd 1400 µL) og skyl harpiks med luft. Skylles to gange med 2000 µL af DMF, 4 gange med 1400 µL af DCM, og skylles to gange med luft.
  3. Arbejde op
    1. Lyophilize harpiks fra reaktionen kolonner natten når syntesen er fuldført.

2. peptid kavalergang fra harpiks (fig. 1A)

Bemærk: Under proceduren kavalergang alle aminosyre sidekæder med undtagelse af Cys(Acm) og Cys (tBu) vil være deprotected. Protokollen gælder for 100 mg af harpiks.

  1. Kombiner den frysetørrede harpiks i en 12 ml rør og afkøles det til 0 ° C på is.
  2. Tilføj 150 µL af en ådselsæder blanding (forberedt fra 0,75 g phenol, 0,5 mL thioanisole, 0,25 mL ethanedithiol) og 1 mL trifluoreddikesyre (TFA, 95% i vand (H2O)) på is til harpiks. Lad forsigtigt ryste i 3 timer ved stuetemperatur.
  3. Blandingen filtreres gennem en glasfritte og saml filtratet i rør individuelt fyldt med iskolde diethylether (1 mL af kavalergang blanding pr. 8-10 mL dietylaeter). Peptid udfældes som en hvid solid.
  4. Skyl filteret kage med yderligere TFA (95% i H2O, ca. 1-3 mL).
  5. Lukke de rør, der indeholder bundfaldet og centrifugeres (3400 x g) suspensioner for 1 min, den dekanteres og vaske pellets med 8-10 mL iskold diethylether. Gentag dette trin 3 gange.
  6. Forlade pellets stående uden prop i 5 min at fjerne resterende spor af diethylether. Opløse de rå vare pellets i 1 mL tert-butanol (80% i H2O). Frysetørre peptider (-80 ° C).

3. rensning af den lineære forløber med semi-forberedende High-performance væskekromatografi (HPLC)

Bemærk: Rense de rå peptider ved semi-forberedende med omvendt fase (RP) HPLC udstyret med en C18 kolonne (5 µm partikelstørrelse, 100 Å porestørrelse, 250 x 32 mm) og en 3,6 mL injektion løkke. Bruge en gradient eluering system på 0.1% TFA i H2O (elueringsvæsken A) og 0,1% TFA i acetonitril (MeCN) h2O (9:1, elueringsvæsken B). Opdage toppe på 220 nm.

  1. Tilføje ca. 70 mg af den rå peptid til en 15 mL tube og opløse den solide peptid i mængden af HPLC prøve loop (fx., 3,6 mL). Brug en blanding af 0,1% TFA MeCN/H2O (1:1). Vortex indtil komplet opløsning og centrifuge (3400 x g) løsning for 1 min.
  2. Udarbejde prøve (3,6 mL) i en 5 mL sprøjte og tilføre injektion løkke prøve uden eventuelle luftbobler. Tilføre HPLC-system. Adskille peptid blandingen ved hjælp af en gradient i 0-50% elueringsvæsken B over 120 min med en væskehastighed på 10 mL/min.
  3. Indsamle fraktioner i enkelte rør, som de vises. Når kørslen er udført, forberede udvalgte fraktioner til massespektrometri (MS) og HPLC-analysen (trin 6.1-6.2). Frysetørre fraktioner og gemme dem på-20 ° C.
  4. Efter MS og HPLC analyse, kombinere de ren brøkdele af lineære peptid og forberede prøverne for den første oxidation.

4. selektiv dannelsen af disulfid obligationer

  1. 1 st Oxidation (figur 1B)
    Bemærk: Under peptid kavalergang fra harpiks, Cys(Trt) er deprotected, fører til to ubeskyttede Cys rester, som efterfølgende er underlagt oxidation til at danne den første disulfid obligation. Følgende protokol gælder for 15 mg af lineære renset peptid (2864.5 g/mol; 5,2 µmol; 1 eq.).
    1. Opløse den lineære peptid (15 mg) i 105 mL af en isopropanol/H2O-blanding (1:2, 0,05 mM, pH 8,5 justeret med natriumhydroxid (NaOH)) og forlade forsigtigt ryste i luften under forudsætninger for 12-48 h.
    2. Overvåge oxidation reaktion via HPLC og MS. Confirm dannelsen af den første bro af iodoacetamide (IAA) forædling (trin 6).
    3. Frysetørre peptid og bruge det uden yderligere rensning til 2nd oxidation.
  2. 2nd Oxidation (figur 1C)
    Bemærk: Under den anden oxidation, deprotection af de Acm-beskyttet cysteines og dannelsen af den anden bro er katalyseret af jod. Protokollen gælder for 15 mg af peptid efter 1st oxidation (2862.5 g/mol; 5,2 µmol; 1 eq.)
    1. Opløse peptid (15 mg, endelig koncentration på 0,05 mM) i 105 mL af en isopropanol/H2O/1 M saltsyre (HCl) blanding (80:12.5:7.5).
    2. Tilføje 158 µL af en 0,1 M iodopløsning i methanol (MeOH) (15,7 µmol; 3 eq.) til løsningen. Rør reaktionen ved stuetemperatur 3-52 h, dvs., indtil oxidation er afsluttet.
    3. Overvåge oxidation reaktion via HPLC og MS. Confirm dannelsen af den anden disulfid obligation af iodoacetamide (IAA) forædling (trin 6).
    4. Reaktionen standses ved at tilføje 79 µL af en 1 M ascorbinsyre løsning i H2O (78,8 µmol; 15 eq.). Frysetørre reaktionsmiljøet og bruge pulver til 3rd oxidation.
  3. 3rd Oxidation (figur 1D)
    Bemærk: Den sidste oxidation fører til deprotection af tBu-beskyttet cysteines og dannelsen af den tredje disulfid bro. Protokollen gælder for 15 mg af peptid efter 2nd oxidation (2718.3 g/mol; 5,5 µmol; 1 eq.).
    1. Opløses peptid (15 mg, endelig koncentration på 1 mM) i 5,5 mL TFA. Det indeholder en ådselsæder blanding bestående af 11,2 mg diphenylsulfoxide (55 µmol; 10 eq.), 60.2 µL af anisole (0,6 mmol; 100 eq.) og 97.2 µL af trichloromethylsilane (0,8 mmol; 150 eq.). Rør blandingen i 3-5 timer ved stuetemperatur.
    2. Overvåge oxidation reaktion via HPLC og MS. Confirm dannelsen af den tredje disulfid obligation af iodoacetamide (IAA) forædling (trin 6).
    3. Bundfald peptid i rør indeholdende kolde diethylether (0 ° C, 1 mL af reaktion løsning pr. 8-10 mL dietylaeter).
    4. Centrifugeres suspensioner (3400 x g, 1 min), den dekanteres og vaske pellets gentagne gange (4 gange) med 8-10 mL koldt dietylaeter (0 ° C). Lad pellets tørre på luft (3 min).
    5. Opløse pellets i 1 mL 80% tert-butanol (i H2O), frysetørre peptid og opbevar den ved-20 ° C.

5. peptid rensning

Bemærk: Rense de oxiderede peptider ved semi-præparativ RP HPLC udstyret med en C18 kolonne (10 µm partikelstørrelse, 300 Å porestørrelse, 250 x 22 mm) og en 3,6 mL injektion løkke. Bruge en gradient eluering system på 0.1% TFA i H2O (elueringsvæsken A) og 0,1% TFA MeCN/H2O (9:1, elueringsvæsken B). Opdage toppe på 220 nm.

  1. Tilføje 15 mg af den frysetørrede rå vare fra trin 4.3.5 til en 15 mL tube. Opløse den rå vare i mængden af HPLC prøve loop (fx., 3,6 mL). Brug en blanding af 0,1% TFA MeCN/H2O (1:1). Vortex indtil komplet opløsning og centrifuge (3400 x g) løsning for 1 min.
  2. Udarbejde 3,6 mL blanding i en 5 mL sprøjte og tilføre injektion løkke prøve uden eventuelle luftbobler. Start indsprøjtning i HPLC system. Rense peptid blandingen ved hjælp af en gradient i 0-50% elueringsvæsken B over 120 min med en væskehastighed på 10 mL/min.
  3. Indsamle fraktioner i enkelte rør, som de vises. Når kørslen er udført, forberede MS og HPLC analyse (trin 6.1-6.2) udvalgte fraktioner. Frysetørre alle fraktioner og gemme dem på-20 ° C.
  4. Når kørslen er udført, forberede MS og HPLC analyse (trin 6.1-6.2) udvalgte fraktioner. Frysetørre alle fraktioner og gemme dem på-20 ° C.

6. peptid Analytics

  1. Analytiske HPLC
    NOTE: Bekræfte renheden af et peptid af analytiske RP HPLC udstyret med en C18 kolonne (5 µm partikelstørrelse, 300 Å porestørrelse, 250 x 4,6 mm) og en 500 µL injektion løkke. Bruge en gradient eluering system på 0.1% TFA i H2O (elueringsvæsken A) og 0,1% TFA i MeCN (elueringsvæsken B). Opdage toppe på 220 nm.
    1. Overføre et udsnit af peptid brøker eller reaktion kontrolelementer i en HPLC hætteglasset og opløse den i en blanding af 0,1% TFA i MeCN/H2O (1:1, 300-500 µL). Placere HPLC hætteglasset i autosampler af analytiske RP HPLC.
    2. Injicér 250 µL af hver prøve. Bruge en gradient eluering system på 0.1% TFA i H2O (elueringsvæsken A) og 0,1% TFA i MeCN (elueringsvæsken B). Rense peptid ved hjælp af et forløb af 10-40% elueringsvæsken B over 30 min på en gennemstrømningshastighed på 1,0 mL/min.
  2. MALDI TOF-massespektrometri
    NOTE: Bekræfte identiteten af et peptid af MALDI TOF (tid for flyvning) massespektrometri med α- cyano-4-hydroxycinnamic syre som matrix.
    1. Overføre en synlig mængde af peptid til en 1,5 mL microcentrifuge tube og opløse den i 10 µL af 37 mM α- cyano-4-hydroxycinnamic syre opløsning i en blanding af 0,1% TFA i H2O/MeCN (1:1).
    2. Vortex løsning for 10 s, gælde et jorden stål mål 2 µL af prøven, og lufttørre prøven.
    3. Bruge tilstanden reflektor for målingerne og et peptid kalibreringsstandardens for kindtand masserne nedenfor 6000 g/mol.
  3. Iodoacetamide forædling
    NOTE: Da iodoacetamide reagerer med thiol grupper, iodoacetamide forædling af peptider angiver gratis thiol grupper. Derfor fungerer manglen på gratis thiol grupper som en reaktion kontrol via MS under 1st oxidation.
    1. Opløse peptid i 10 mM fosfat buffer (100 µL; 0,05 mM, pH 7,8) i 1,5 mL microcentrifuge rør. Tilsæt 100 µL af iodoacetamide i 10 mM fosfat buffer (4 mM) peptid løsning og Ryst forsigtigt reaktion i 2 timer ved stuetemperatur i mørke. Frysetørre reaktionsmiljøet og opbevar den ved-20 ° C.
    2. Bruge en C18-koncentration filter pipette tip og betingelse spidsen med 10 µL 80% (3 gange), 50% (3 gange), 30% (3 gange) og 0% (3 gange) MeCN i H2O (+ 0,1% TFA).
    3. Opløse prøven fra trin 6.3.1 i 1 µL af 0,1% TFA i H2O og tilføje løsningen til filter pipette tip. Tilsæt forsigtigt op og ned så at peptid binder til perle. Fjerne H2O ud af pipette tip og skyl filteret pipette spidsen med 10 µL af 0,1% TFA i H2O.
    4. Tilføj 2 µl af 0,1% TFA i H2O/MeCN (1:1) med en anden pipette spids (uden filter) på toppen af den kugle, der indeholder peptid. Anvende filtratet til jorden stål mål og lufttørre prøven.
    5. Anvende 1 µL af 37 mM α-cyano-4-hydroxycinnamic syre opløsning i en blanding af 0,1% TFA i H2O/MeCN (1:1) til jorden stål målrette med prøven og lufttørre prøven.
    6. Bruge tilstanden reflektor for målingerne og et peptid kalibreringsstandardens for kindtand masserne nedenfor 6000 g/mol.
  4. Aminosyre analyse
    Bemærk: Analysere den nøjagtige peptid koncentration samt aminosyresammensætning af peptid ved hjælp af en aminosyre analyzer.
    1. Overføre 100 µg af den rene peptid (2604 g/mol, 0,04 µmol) til en 1,5 mL microcentrifuge tube og opløse pulveret i 200 µL af 6 M HCl.
    2. Overføre 200 µL af opløsningen til et glas ampul og skyl 1,5 mL microcentrifuge tube to gange med 200 µL af 6 M HCl. oploesningen føres til glas ampul så godt.
    3. Luk ampullen af varme halsen af ampul med en bunsenbrænder flamme. Sætte ampullen i et glasrør. Placere det i en opvarmning blok i 24 timer ved 110 ° C til hydrolyse.
    4. Åbn ampullen og opløsningen overføres til en 2 mL microcentrifuge tube. Vaske ampul (3 x 200 µL) og fælles landbrugspolitik (3 x 100 µL) med dobbeltdestilleret H2O og overføre det ind i microcentrifuge røret.
    5. Der centrifugeres løsning i 6 timer ved 60 ° C og 210 x g i en roterende vakuum koncentrator. Opløse den hydrolyseret produkt i 192 µL af prøven fortynding buffer (200 µM) og opløsningen overføres til en mikro-centrifugal filter.
    6. Der centrifugeres prøve for 1 min på 2300 x g og overføre 100 µL af filtratet i et amino-syre analysis prøveglas. Glasset anbringes i aminosyre analyzer og begynde analysen. En aminosyre standard bruges til kalibrering.

7. MS/MS analyse af disulfid Connectivity

  1. Delvis reduktion og alkylering17
    1. Opløse 600 µg af den rene peptid (2604 g/mol, 0,23 µmol) i 1,2 mL 0,05 M citratbuffer (pH 3,0; 0,14 mM peptid koncentration) som indeholder 7,5 mg af tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP; 0,02 M; 0,03 mmol).
    2. Inkuber blanding ved stuetemperatur og tage flere reaktion kontrolprøver (100 µL) spænder fra 0 min til 30 min.
    3. Bland prøver i en 1,5 mL microcentrifuge tube med 300 µL af alkylering buffer (0,5 M tris-acetat, pH 8,0; 2 mM ethylendiamintetra syre (EDTA); 1.1 M iodoacetamide) at stoppe reaktionen og udføre carbamidomethylation af gratis thiol grupper.
    4. Reaktionen standses efter 5 min ved at tilføje 100 µL af 10% TFA (i H2O) og store prøver på tøris. Forberede HPLC prøver som beskrevet i trin 6.1.2 og indsprøjte 400 µL. (fig. 2A)
    5. Bruge en gradient eluering system på 0.1% TFA i H2O (elueringsvæsken A) og 0,1% TFA i MeCN (elueringsvæsken B). Analysere peptider ved hjælp af en kombination af en isocratic adskillelse (10% elueringsvæsken B for 15 min) og derefter et efterfølgende forløb af 10-35% elueringsvæsken B over 25 min med en væskehastighed på 10 mL/min. detektere toppe på 220 nm.
    6. Indsamle fraktioner i 1,5 mL microcentrifuge rør og frysetørre peptider. (Figur 2B)
    7. Overføre en lille mængde af hver fraktion til en 1,5 mL microcentrifuge tube til MS/MS analyse af oxideret former (fortsætte på trin 7.1.12).
    8. Opløse den resterende peptid (10-100 µg) i 0,1% TFA i H2O (10-50 µL) og tilsættes en passende mængde af 100 mM TCEP opløsning (i H2O) for at få en endelig TCEP koncentration på 10 mM.
    9. Inkuber reaktion i 1 timer ved 37 ° C (figur 2C). Frysetørre reaktionsmiljøet og opbevar den ved-20 ° C.
    10. Forberede MS/MS prøver som beskrevet i trin 6.3.2-6.3.5.
    11. Udføre MS/MS-målinger på en MALDI-TOF eller TOF massespektrometer. Brug MS/MS låg (laser-induceret decay) for opsplitning af peptid og vælg forløber masserne af 2 - og 4-gange carbamidomethylated arter. Behandle og vurdere MALDI data for at bekræfte den ønskede disulfid connectivity.

8. NMR eksperimenter og struktur analyse

  1. Opløs ca. 0,3-2 mg ren peptid produkt i 500 µL af H2O/D2O (90:10) og overføre blandingen til en NMR microtube.
  2. Forberede målinger på et NMR-spektrometer prøven
  3. Post 2-dimensionelle [1H,1H] - DQF - hyggelig (dobbelt quantum filtreret korrelation spektroskopi), [1H,1H] - TOCSY (samlede korreleret spektroskopi), [1H,1H] - NOESY (nuklear Overhauser ekstraudstyr spektroskopi), og [1H,13C]-HSQC (heteronuclear enkelt quantum sammenhæng) spectra bruge vand undertrykkelse.
  4. Tildele proton resonanser af de registrerede spektre og oprette atom tildeling fra NOESY spektre. Sammenligne intensiteterne i NOESY spektre at indstille øvre grænse afstand begrænsninger mellem forskellige atomer i peptid. Bruge intensiteten af germinale protoner for peak-intensitet kalibrering.
  5. Udføre struktur beregning og raffinement med et edb-program for Molekylær visualisere og bruge identificerede disulfid connectivities af Step 7 som yderligere begrænsninger (figur 3).
  6. Vælg strukturer med de laveste energi og bruge det til molekylær dynamik (MD) simuleringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

15 forskellige disulfid bro isomerer af µ-conotoxin PIIIA er syntetiseret og kendetegnet detaljeret (figur 1). Disulfidbroer er identificeret ved delvis reduktion og efterfølgende MS/MS analyse (figur 2). NMR analyse af de forskellige isomerer udføres (figur 3) til at afsløre de enkelte peptid strukturer. Især, er en kombination af RP HPLC, MS/MS fragmentering og NMR analyse nødvendig for entydig identifikation af disulfid connectivity.

Figure 1
Figur 1 : Selektiv disulfid obligation dannelsen af indfødte µ-PIIIA via den beskytte gruppe strategi. (A) deprotection af de Trt-beskyttet cysteines under peptid kavalergang fra harpiks. (B) den første disulfid bro dannelsen af de ubeskyttede cysteines. (C) Deprotection og disulfid bro dannelsen af Acm beskyttet cysteines. (D) Deprotection og disulfid bro dannelsen af tBu beskyttet cysteines. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Delvis reduktion arbejdsgang for disulfid obligation tildeling af MS/MS analyse. (A) delvis reduktion og alkylering af peptid. (B) HPLC rensning af forskellige reaktion kontrolprøver. (C) reduktion af renset prøverne. Delvist carbamidomethylated arter (to peptider i midten) havnen oplysninger om disulfid connectivity, som bestemmes af MS/MS analyse. Dette tal er blevet tilpasset med tilladelse fra Heimer, P. et al. Konformationelle µ-Conotoxin PIIIA isomerer Revisited: virkningen af cystein parring på disulfid obligation tildeling og struktur udredning. Analytisk kemi. 90 (5), 3321-3327 (2018). Ophavsret (2018) American Chemical-Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Den sekventielle gang og den deraf følgende NMR løsning struktur af en stiv (venstre) og en fleksibel (højre) µ-PIIIa isomer. De 20 strukturer med de laveste energi samt disulfid tilslutning af forskellige isomerer er vist. Sammenligning af kvadratiske afvigelse (RMSD) værdier præciserer, at en stiv peptid for det meste fører til en bedre løst NMR struktur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den metode beskrevet heri for syntesen af cystein-rige peptider som µ-PIIIA repræsenterer en mulighed for at producere selektivt disulfid-bonded isomerer fra den samme aminosyresekvens. Derfor etablerede metoder såsom Fmoc-baseret solid fase peptid syntese18 og en defineret beskytte gruppe strategi for regioselective dannelsen af svovlbroer blev brugt16. Solid faststadie peptidsyntese kan producere aminosyresekvenser på en polymer støtten (harpiks) via automatiseret syntese. Disse aminosyrer er beskyttet mod uønskede side reaktioner under sekvens forsamling at beskytte specialgrupper på deres sidekæder, der - afhængig af protokol brugt - deprotected ved peptid kavalergang fra harpiks. Denne beskyttelse gælder også cystein sidekæder inden for peptid kæde, fx., trityl beskyttelse. Dog særskilt beskytte grupper for individuelle par af cysteines som acetamidomethyl og tert-butyl er ikke samtidig kløvet gennem denne fjernelse trin. Disse beskytter grupper kan være kløvet på betingelser, som tillader efterfølgende oxidation af danner disulfid obligationer fra deprotected thiol grupper. På denne måde, kan alle 15 disulfid isomerer af et peptid, der indeholder seks cystein rester være selektivt dannede7,16. Den begrænsende faktor, men er der med et stigende antal forskellige ortogonale beskytte grupper de syntetiske indsats stigninger, som har en høj effekt på udbyttet af den ønskede disulfid bro peptid. I udvalgte tilfælde, navnlig for mindre kan komplekse peptider besidder kun én eller to svovlbroer den oxidative selvstændige folde tilgang faktisk således foretrukne over den beskytte gruppe strategi.

Heri, fjernes Trt grupper af én cystein par af handlingen i TFA efter afslutningen af peptid forsamling og endelige Fmoc-deprotection af den N-terminale aminosyre. De sure betingelser, dog forlade Acm og tBu beskytte grupper på de andre to par af cystein restkoncentrationer intakt. Efterfølgende, udføres rensning af den lineære peptid indeholdende to ubeskyttede cysteines, ved hjælp af forberedende HPLC lidt sure betingelser for at opretholde thiol grupper i formen protonated. Protokollen fortsætter med den første oxidation skridt efter analytiske HPLC og MS analyse verificeret vellykket syntese og deprotection af Trt på cystein par af interesse. De videre skridt af deprotection og oxidation af anden og tredje disulfid obligation er gennemført og bekræftet på samme måde ved hjælp af den relevante protokol til Acm og tBu, henholdsvis. Disse oxidation reaktioner er således simple våde-kemiske reaktioner udført i løsning som ikke kræver dyre reagenser. Ulempen er imidlertid, at visse reaktioner, dvs., forbindelser af forskellige cystein rester, ikke går glat og helt fører til biprodukter af scrambled disulfid connectivity. Da disse ikke fjernes efter afslutningen af de enkelte oxidation reaktioner, kan sådanne biprodukter ophobes i rå produkt blandingen. Nogle af disse kan have lignende fysisk-kemiske egenskaber som den faktiske peptid, fx., HPLC eluering, hvilket øger indsatsen til rensning af den korrekt foldet peptid. Selv om syntese og rensning kunne være svært, som er tilfældet for µ-PIIIA, denne metode kan med succes bruges, men kræver god manual og observation færdigheder. Endelig skal det overvejes at hver peptid sekvens er forskellige og derfor kan behandles forskelligt for at få succes med at skabe den korrekte disulfid connectivity.

Ud over den udfordrende syntese, er det vigtigt at kontrollere, om disulfid obligationer produceret er korrekte, dvs., repræsenterer den tilsigtede version af den respektive disulfid isomer. Dette udføres heri ved hjælp af en kombination af MALDI MS/MS analyse og NMR struktur udredning. MS/MS analyse udføres ved hjælp af forskellige delvist reduceret og alkylerede derivater (carbamidomethylation) af fuldt oxideret peptid17. I MALDI MS/MS låg TOF/TOF fundet spectra et lige antal carbamidomethylated cysteines er altid, dvs., 2-, 4- eller 6-gange carbamidomethylated. Dette kan forklares ved en trinvis reduktion af de fuldstændig oxideret peptider, siden i hver lejlighed to thiol funktioner pr. disulfid obligation er altid reduceret (åbnet), og i situ alkylerede ved hjælp af iodoacetamide. Denne carbamidomethylation af to cysteines hver kan påvises i MALDI MS/MS-spektre, og til gengæld refererer til den respektive disulfid obligation disse cysteines blev engageret i den intakte peptid. For eksempel, forekomsten af fire carbamidomethylated cysteines i en sekvens med tre disulfid obligationer hjælper med at identificere en bestemt obligation, nemlig den ene dannet mellem de to ikke-alkylerede cysteines, som ikke var åbnes under reaktionstid for de delvis reduktion tilstrækkeligt at åbne to andre obligationer. Således er MALDI MS/MS analyse af de forskellige 2 - og 4-gange carbamidomethylated derivater af peptid disulfid isomer, kan disulfid connectivities være helt belyst og bekræftet.

En anden mulighed for at belyse disulfid obligation mønster er MS/MS analyse af enzymatisk fordøjet peptider, hvor peptid skal kløves proteolytically på forskellige aminosyrer til at producere mindre fragmenter. Disse korte fragmenter kan stadig være knyttet via disulfid obligationer, hvilket er grunden til at disulfid mønsteret kan blive belyst fra MS/MS analyse af disse sammenkædede fragmenter. I tilfælde af µ-PIIIA, dog kunne denne strategi ikke anvendes, fordi nogle cysteines af sekvensen er direkte støder op til hinanden og derfor fordøjelsen af peptider ikke adskille cysteines fra hinanden. Identifikation af den specifikke disulfid bro er derfor vanskelig.

Struktur udredning af 2D NMR-analyse er klart lettere i tilfælde af en kendt disulfid connectivity, fordi denne viden giver mulighed for overdragelse af nukleare Overhauser effekt (NOE'S) til specifikke protoner, dvs., henvisende til den rumlige afstand mellem to atomer fastlagt ud fra intensiteten af NOESY signalerne (gennem rummet NMR eksperiment). Analyse, men starter med den sekventielle gang19 anvendes til HYGGELIGE, TOCSY og NOESY spektrene, på denne måde er det muligt at tildele et bestemt signal til den tilsvarende H-atom af aminosyrer (spin system) i rækkefølgen. Ovennævnte afstand begrænsninger fra NOESY eksperiment der bruges i beregningen struktur af peptid7. Flere signaler identificeret, jo mere nøjagtig struktur vil være. Dog stiger svært af denne tildeling med antallet af aminosyrer i peptid og forekomsten af tilstødende cysteines, som sandsynligheden stiger, signaler af flere atomer overlapper hinanden og kan ikke længere være netop tildelt skulle lukke nærhed. Fleksibilitet af peptid-kæden er desuden afgørende for, om signalerne i NMR er let eller næppe kan identificeres. Jo mere fleksibelt et peptid region, mere konformationelle ændringerne sker, giver flere signaler skal fremstilles for den samme atom. Således aftager intensiteten med antallet af konformationer, som forårsager signaler til at forsvinde i baggrundsstøj. Dette betyder, at tre-dimensionelle struktur udredning via NMR bliver meget lettere, hvis sekvensen er for begrænset.

Endelig gør denne protokol det muligt at generere flere disulfid bro peptider ved at overvåge disulfid obligation dannelsen af MALDI MS/MS analyse og ledsagende 2D NMR struktur udredning7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke A. Resemann, F. J. Mayer og D. Suckau fra Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts og C. Thiele fra Darmstadt University of Technology; O. Ohlenschläger fra FLI Jena, M. Engeser fra universitetet i Bonn; K. Kramer, A. Harzen og H. Nakagami fra Max Planck Institute for Breeding planteforskning, Köln; Susanne Neupert fra Institut for zoologi, Köln; og biomolekylær Kernemagnetisk resonans-spektroskopi faciliteter af universitetet i Frankfurt for teknisk støtte, uddannelsesmoduler, samt adgang til instrumenter. Finansiel støtte ved universitetet i Bonn til di erkendes taknemmeligt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin Varian, Inc. PL3867-3764 AmphiSpheres 40 RAM
Pyr(Boc) Bachem A-3850
Arg(Pbf) Iris Biotech FSC1010
Asn(Trt) Bachem B-1785
Asp(tBu) Iris Biotech FSP1020
Hyp(tBu) Iris Biotech FAA1627
Lys(Boc) Bachem B-1080
Ser(tBu) Iris Biotech FSC1190
Gln(Trt) Iris Biotech FSC1043
Glu(tBu) Iris Biotech FSP1045
Trp(Boc) Iris Biotech FSC1225
Tyr(tBu) Sigma Aldrich 47623
Thr(tBu) Iris Biotech FSP1210
His(Trt) Iris Biotech FDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat Sigma Aldrich 8510060 Flammable
DMF Fisher Scientific D119 Flammable, Toxic
DCM Fisher Scientific D37 Carcinogenic
Piperidine Alfa Aesar A12442 Flammable, Toxic, Corrosive
N-Methyl-Morpholin Sigma Aldrich 224286
Cys(Acm) Iris Biotech FAA1506
Cys(Trt) Bachem E-2495
Cys(tBu) Bachem B-1220
trifluoruacetic acid Sigma Aldrich 74564 Toxic, Corrosive
phenol Merck 1002060 Toxic
thioanisol Alfa Aesar A14846
ethanedithiol Fluka Analytical 2390
diethyl ether VWR 100,921 Flammable
tert-butanol Alfa Aesar L12338 Flammable
acetonitrile Fisher Scientific A998 Flammable
water Fisher Scientific W5
isopropanol VWR ACRO42383 Flammable
sodium hydroxide AppliChem A6579,1000 Corrosive
iodoacetamide Sigma Aldrich I6125
iodine Sigma Aldrich I0385
Hydrochloric acid Merck 110165 Corrosive
ascorbic acid Sigma Aldrich A4403
diphenylsulfoxide Sigma Aldrich P35405
anisol Sigma Aldrich 96109 Flammable
trichloromethylsilane Sigma Aldrich M85301 Flammable
sample dilution buffer Laborservice Onken
sodium dihydrogen phosphate Sigma Aldrich 106370
disodium hydrogen phosphate Sigma Aldrich 795410
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706
citric acid Sigma Aldrich 251275
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
tris-acetate Carl Roth,  7125
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E26282 
peptide calibration standard II Bruker Daltonics GmbH 8222570
Name of Equipment Company
solid-phase peptide synthesizer Intavis Bioanalytical Instruments AG EPS 221
lyophilizer  Martin Christ GmbH  Alpha 1-2 Ldplus
semipreparative HPLC Jasco system PV-987
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) Knauer 25QE181E2J purification of the linear peptide
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) Hichrom-VWR HICH218TP1022 purification of the oxidized peptide
analytical HPLC  Shimadzu system LC-20AD
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm)  Hichrom-VWR HICH218TP54 analytical column
ground steel target (MTP 384) Bruker Daltonics GmbH NC0910436 MALDI preparation 
C18-concentration filter (ZipTip) Merck KGaA ZTC18S096 MALDI preparation 
MALDI mass spectrometer Bruker Daltonics GmbH ultraflex III TOF/TOF
amino acid analyzer Eppendorf-Biotronik GmbH LC 3000 system
NMR spectrometer Bruker Avance III Bruker Daltonics GmbH Bruker Avance III 600 MHz
computer program for molecular visualising YASARA Biosciences GmbH Yasara structures NMR structure calculation
computer program for MALDI data evaluation  Bruker Daltonics GmbH flexAnalysis, BioTools MS/MS fragmentation
analog vortex mixer VWR VM 3000
Microcentrifuge Eppendorf 5410
Centrifuge Hettich EBA 20
Rotational vacuum concentrator Christ 2-18 Cdplus
Analytical Balance A&D Instruments GR-202-EC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
  2. Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  3. Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
  4. Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
  5. Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
  6. Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
  7. Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
  8. Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).
  9. Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
  10. Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
  11. Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
  12. Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
  13. Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
  14. Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
  15. Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
  16. Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
  17. Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
  18. Kates, S. A., Albericio, F. Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , Marcel Dekker Inc. New York. (2000).
  19. Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).

Tags

Kemi spørgsmål 140 peptider cystein-rige disulfid connectivity syntese beskytte gruppe strategi struktur analyse 2D NMR (nuclear magnetic resonance) MS/MS (tandem massespektrometri)

Erratum

Formal Correction: Erratum: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities
Posted by JoVE Editors on 11/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for:Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.

Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

to:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

Step 1.2 in the Protocol section was updated from:

NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.

to:

NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.

Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:

HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).

to:

HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).

The first item in the Materials table was updated from:

Fmoc Rink amide resin Novabiochem 855001

to:

PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin Varian, Inc. PL3867-3764 AmphiSpheres 40 RAM
Syntese og struktur bestemmelse af µ-Conotoxin PIIIA isomerer med forskellige disulfid Connectivities
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heimer, P., Schmitz, T., Bäuml, … More

Heimer, P., Schmitz, T., Bäuml, C. A., Imhof, D. Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. J. Vis. Exp. (140), e58368, doi:10.3791/58368 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter