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Chemistry

Síntesis y determinación estructural de μ-Conotoxina PIIIA isómeros con disulfuro diferentes conectividades

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58368
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Pharmaceutical Biochemistry and Bioanalytics, Pharmaceutical Institute, University of Bonn
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Péptidos ricos en cisteína doblan en estructuras tridimensionales distintas dependiendo de la conectividad de disulfuro. Específicas síntesis de isómeros individuales disulfuro es necesario oxidación de búfer no conduce a la conectividad deseada disulfuro. El protocolo aborda la síntesis selectiva de péptidos 3-disulfuro-consolidado y su análisis estructural mediante estudios NMR y MS/MS.

Abstract

Péptidos con un elevado número de cisteínas son influenciados generalmente con respecto a la estructura tridimensional por su conectividad de disulfuro. Por lo tanto es muy importante para evitar la formación de Enlace disulfuro no deseados durante la síntesis de péptidos, porque puede dar lugar a una estructura completamente diferente de péptidos y en consecuencia alterado bioactividad. Sin embargo, la correcta formación de múltiples enlaces de disulfuro en un péptido es difícil de obtener mediante métodos auto plegables estándar tales como protocolos de la oxidación del tampón convencional, porque pueden formar varias conectividades de disulfuro. Este protocolo representa una avanzada estrategia necesaria para la síntesis específica de múltiples péptidos puente disulfuro que no pueden ser sintetizados vía oxidación de búfer en alta calidad y cantidad. El estudio demuestra la aplicación de una estrategia de grupo protección distinta para la síntesis de todos los isómeros posibles péptidos 3-disulfuro-consolidado de μ-Conotoxina PIIIA una manera específica. Los péptidos son preparados por síntesis de péptidos de fase sólida basado en el Fmoc utilizando una estrategia de protección del grupo para la formación del Enlace disulfuro definida. Los respectivos pares de cisteínas están protegidos con trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) y terc-butilo (tBu) proteger grupos para asegurarse de que durante cada paso de oxidación sólo las cisteínas requiere deprotected y vinculados. Además la síntesis específica, una combinación de varios métodos analíticos se usa para aclarar el plegamiento correcto y la generación de las estructuras de péptido deseado. La comparación de los diferentes isómeros 3-disulfuro-consolidado indica la importancia de la determinación precisa y el conocimiento de la conectividad de disulfuro para el cálculo de la estructura tridimensional y para la interpretación de lo biológico actividad de los isómeros del péptido. La caracterización analítica incluye la aclaración de Enlace disulfuro exacta vía análisis de espectrometría de masas (MS/MS) de tándem que se realiza con derivados alkylated y parcialmente reducidos del isómero intactas péptido producido por un protocolo adaptado. Además, las estructuras de péptidos se determinan mediante experimentos 2D de resonancia magnética nuclear (RMN) y el conocimiento obtenidos del análisis MS/MS.

Introduction

El uso de péptidos bioactivos en investigación farmacéutica y desarrollo es altamente reconocido, debido a que representan compuestos potentes y altamente selectivos para objetivos biológicos específicos1. Para su bioactividad, sin embargo, la estructura tridimensional es de gran importancia para realizar la estructura y actividad relación estudios2,3,4. Aparte de la secuencia primaria del aminoácido que influye en la conformación general, enlaces de disulfuro estabilizan significativamente la estructura de péptidos ricos en cisteína5. Varios péptidos puente disulfuro incluyen conotoxinas como μ-PIIIA de Conus purpurascens que contiene seis cisteínas en su secuencia. Este contenido de cisteína alta permite teóricamente la formación de 15 isómeros de disulfuro. La conectividad de disulfuro correcto es muy importante para la actividad biológica6,7. ¿Sin embargo, la pregunta que surge es si existe más de una conformación bioactivo péptidos naturalmente y si por lo tanto, cuál de los isómeros posee la más alta actividad biológica? En el caso de μ-conotoxinas, los blancos biológicos son canales de sodio voltaje-bloqueado del ion, y μ-PIIIA en particular es más potente para los subtipos de NaV1.2, NaV1.4 y NaV1.73.

La síntesis de péptidos puente disulfuro puede lograrse usando varios métodos. El método más conveniente para la formación de enlaces disulfuro dentro de un péptido es el llamado enfoque auto plegable oxidativo. Aquí, el precursor lineal del péptido cíclico deseado se sintetiza primero usando la síntesis de péptidos de fase sólida, que es después de la ruptura del soporte polimérico sometidos a oxidación en un sistema de buffer. Agentes redox activos como el glutation reducido y oxidado (GSH/GSSG) se agregan a menudo para promover la formación de los enlaces de disulfuro. La principal desventaja de buffer compatible auto plegable es que los enlaces de disulfuro se forman no selectivamente de manera gradual. Comparado con el péptido nativo, que a menudo isómero disulfuro específica solo se describe, es posible obtener numerosos otros isómeros con este enfoque8. Μ-PIIIA ya se ha demostrado para dar lugar a isómeros diferentemente doblados por lo menos tres a uno plegable en un anterior estudio3. La separación de una mezcla de isómero es algo difícil debido a los tiempos de retención similares si el uso de métodos de purificación cromatográfica9. La síntesis específica de un isómero específico, por tanto, es ventajosa. En concreto produce que un isómero con conectividad de disulfuro definido, una estrategia especial se requiere que el disulfuro de bonos sucesivamente están cerrados. Por lo tanto, el precursor lineal llevando grupos distintos de protección en los pares individuales de cisteína se sintetiza en el soporte de polímero. Después de la eliminación, los pares de cisteína individual y sucesivamente deprotected y vinculados en una reacción de oxidación para producir la deseada disulfuro bonos10,11,12,13, 14 , 15 , 16. después de la síntesis y la purificación del producto de la reacción, es necesaria para confirmar la identidad y la conectividad de disulfuro por métodos analíticos apropiados. Numerosos métodos analíticos están disponibles para la elucidación de la secuencia primaria de aminoácidos, por ejemplo., MS/MS, mientras que la determinación de la conectividad de disulfuro sigue siendo mucho menos investigada. Aparte de la complejidad de tales múltiples péptidos disulfuro-consolidado, impurezas relacionadas con el producto (ej., de disulfuro el revolver), debido a la muestra de preparación y el work-up pueden complicar más análisis. En este trabajo, nos muestran que el uso de una combinación de diferentes técnicas analíticas es necesario aclarar inequívocamente la identidad de los enlaces de disulfuro en los isómeros de μ-PIIIA. Hemos combinado métodos de cromatografía con espectrometría de masas y siempre las mismas muestras para espectroscopia de RMN. En desorption/ionization(MALDI) láser asistida por matriz de análisis MS/MS, identificamos el disulfuro mediante reducción parcial y derivatización de Yodoacetamida porque análisis de arriba hacia abajo no es posible que este péptido. Se realizaron experimentos de NMR 2D para obtener una estructura tridimensional de cada isómero. Así, combinando distintos métodos analíticos sofisticados, es posible dilucidar adecuadamente el disulfuro conectividad y estructura tridimensional del complejo de múltiples péptidos disulfuro-consolidado7.

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Protocol

Nota: Todos los aminoácidos en este documento fueron en la configuración L. Se utilizan las abreviaturas de los aminoácidos y derivados de aminoácidos según las recomendaciones de la Comisión del IUB de nomenclatura y de la Comisión conjunta de IUPAC-IUB de nomenclatura bioquímica.

1. síntesis de péptidos fase sólida (SPPS)

Nota: Realizar la síntesis con un sintetizador de péptidos de fase sólida. Realizar la síntesis de los precursores del péptido lineal de la secuencia general de ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2 usando un protocolo estándar para la química 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc). Aplicar los siguientes aminoácidos protegidos: Pyr (Boc (tert-butyloxycarbonyl)), Arg (Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonilo)), Asn(Trt), Asp(tBu), Hyp(tBu), Lys(Boc), Ser(tBu), Gln(Trt), Glu(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), Thr(tBu) y su (Trt). Proteger los pares de cisteína con Trt, Acm o tBu-grupos según la conectividad de disulfuro previsto.

  1. Preparación
    1. Secar la resina Fmoc pista-amida (carga: 0,28 mmol/g) con un liofilizador durante la noche.
    2. Introduzca la secuencia de péptido deseado (código 1-Letras) en el programa del sintetizador. El programa calcula la cantidad necesaria para cada reactivo individual e indica las cantidades de solvente.
    3. Pesar los reactivos individuales (aminoácidos, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorofosfato)) según el protocolo y disolverlas en dimetilformamida (DMF) para una concentración final de 2,4 M (aminoácidos) y de 0,6 M) HBTU), respectivamente.
    4. Transferencia de los diferentes reactivos (aminoácidos, HBTU, N-methylmorpholine (NMM, 50% en DMF), piperidina (20% en DMF), DMF, diclorometano (DCM)) a los recipientes correspondientes y colocarlos en las raquetas adecuadas del sintetizador de péptidos de fase sólida.
    5. Añadir 100 mg de resina seca a las columnas de reacción y ponerlos en la raqueta del sintetizador. Iniciar la síntesis del peptide de la fase sólida.
  2. SPPS-protocolo (proporcionado por el sintetizador)
    Nota: El protocolo se aplica a 100 mg de resina (carga: 0,28 mmol/g) añadido a la columna una reacción para 28 μmol escala.
    1. Preparación de la resina
      1. Enjuagar la resina con 2500 μl de DMF, 1400 μl de DCM y 1400 μl de DMF.
      2. Lavar la resina con aire hasta que el solvente es eliminado y enjuagar la resina con 2500 μl de DMF.
    2. Escote de la Fmoc protección de grupo
      1. Agregar 20% piperidina en DMF (1000 μL) a la resina y esperar 6 minutos retirar la solución de la resina. Repita el paso 1.2.2.1.
      2. Enjuagar dos veces con DMF (1st 4000 μl, 2nd1400 μL), lavar la resina con aire hasta que el solvente se elimina y enjuague dos veces con 2000 μl de DMF.
    3. Reacción de acoplamiento
      1. Mezclar los reactivos siguientes en un frasco separado: HBTU (450 μl; 0,6 M en DMF; 270 μmol; 9.6 EQ.), NMM (125 μl; 50% en DMF; 568 μmol; 20 EQ.), Fmoc-aminoácido (420 μl; 2,4 M en DMF; 1.01 mmol; 36 EQ.). Añadir la mezcla de la resina y esperar 13 minutos Retire la solución de la resina. Repita el paso 1.2.3.1.
      2. Lave con 3000 μl de DMF. Lavar dos veces con 1400 μl de DMF. Lavar dos veces con 2000 μl de DMF.
      3. Repita los pasos del 1.2.2 y 1.2.3 según el número de aminoácidos en la secuencia del péptido.
    4. Lavado final de resina y escote de Fmoc
      1. Agregar 20% piperidina en DMF (1000 μL) a la resina y esperar 6 minutos retirar la solución de la resina. Repita el paso 1.2.4.1.
      2. Enjuague dos veces con DMF (1st 4000 μl, 2nd 1400 μL) y lavar la resina con el aire. Enjuague dos veces con 2000 μl de DMF, 4 veces con 1400 μl de DCM y enjuague dos veces con el aire.
  3. El work-up
    1. Liofilizar la resina de la reacción columnas durante la noche después de que la síntesis sea completa.

2. escote péptido de la resina (figura 1A)

Nota: Durante el procedimiento de escote, todas cadenas laterales de aminoácidos excepto Cys(Acm) y Cys (tBu) a deprotected. El protocolo se aplica a 100 mg de resina.

  1. Combinar la resina liofilizada en un tubo de 12 ml y enfriar a 0 ° C en hielo.
  2. Añadir 150 μL de una mezcla de carroñero (preparado a partir de 0.75 g fenol, tioanisol 0,5 mL, 0,25 mL Etanoditiol) y 1 mL de ácido trifluoroacético (TFA, 95% en agua (H2O)) en el hielo a la resina. Dejar agitando suavemente durante 3 horas a temperatura ambiente.
  3. Filtrar la mezcla a través de una frita de vidrio y recoger el filtrado en tubos individualmente llenado de helado éter dietílico (1 mL de mezcla de escote por 8-10 mL de éter etílico). El péptido se precipita como un sólido blanco.
  4. Enjuague el producto de filtración con TFA adicional (95% de H2O, aprox. 1-3 mL).
  5. Cerrar los tubos que contiene el precipitado y centrifugar (3400 x g) las suspensiones durante 1 min, decantar el sobrenadante y lavar el pellet con 8-10 mL de éter dietílico helado. Repetir este paso 3 veces.
  6. Deje las pastillas de pie sin tapón durante 5 min para eliminar resto de éter dietílico. Disolver los pellets de producto crudo en 1 mL de terc-butanol (80% de H2O). Secado por congelación los péptidos (-80 ° C).

3. purificación del Precursor lineal con semi-preparativa alta cromatografía líquida (HPLC)

Nota: Purificar los péptidos crudos semi-preparativa fase reversa (RP) HPLC equipado con una columna C18 (5 μm de tamaño de partícula, 100 Å tamaño del poro, 250 mm x 32 mm) y un loop de inyección de 3,6 mL. Utilizan un sistema de gradiente de elución de 0,1% TFA en H2O (eluyente A) y 0.1% TFA en acetonitrilo (MeCN) / h2O (9:1, eluyente B). Detectar los picos a 220 nm.

  1. Añadir unos 70 mg del péptido crudo a un tubo de 15 mL y disolver el sólido péptido en el volumen del bucle de muestra HPLC (e.g., 3,6 mL). Use una mezcla de 0.1% TFA en MeCN/H2O (1:1). Vortex hasta completa disolución y centrífuga (3400 x g) la solución durante 1 minuto.
  2. Elaboración de la muestra (3,6 mL) en jeringa de 5 mL e inyectar la muestra sin burbujas de aire en el circuito de inyección. Inyectar en el sistema HPLC. Separar la mezcla de péptidos mediante un gradiente de 0-50% eluyente B durante 120 min a un flujo de 10 mL/min.
  3. Recoger las fracciones en tubos individuales que aparecen. Una vez finalizado el plazo, preparar las fracciones para espectrometría de masas (MS) y el análisis HPLC (paso 6.1-6.2). Las fracciones por congelación y almacenarlos a-20 ° C.
  4. Tras el análisis de MS y HPLC, combinar las fracciones puras de péptido lineal y preparar las muestras para la primera oxidación.

4. selectiva formación de los enlaces de disulfuro

  1. 1 st oxidación (figura 1B)
    Nota: Durante la hendidura del péptido de la resina, el Cys(Trt) son deprotected, llevando a dos residuos de Cys sin protección que posteriormente se someten a la oxidación para formar el primer enlace de disulfuro. El siguiente protocolo se aplica a 15 mg de lineal péptido purificado (2864.5 g/mol; 5,2 μmol; 1 EQ.).
    1. Disolver el péptido lineal (15 mg) en 105 mL de un isopropanol/H2O mezcla (1:2; 0.05 m pH 8.5 ajustado con hidróxido de sodio (NaOH)) y dejar temblando suavemente en el aire bajo condiciones básicas durante 12-48 h.
    2. Vigilar la reacción de oxidación mediante HPLC y MS. confirmar la formación del primer puente por derivatización Yodoacetamida (IAA) (paso 6).
    3. El péptido por congelación y uso sin una posterior purificación para la oxidación de 2nd .
  2. 2nd oxidación (figura 1C)
    Nota: Durante la segunda oxidación, la desprotección de las cisteínas protegidas de Acm y la formación del segundo puente son catalizadas por yodo. El protocolo se aplica a 15 mg de péptido después de la oxidación dest 1 (2862.5 g/mol; 5,2 μmol; 1 EQ.)
    1. Disolver el péptido (15 mg; concentración final de 0.05 m) en 105 mL de un isopropanol/H2O/1 M mezcla de ácido clorhídrico (HCl) (80:12.5:7.5).
    2. Añadir 158 μl de una solución de yodo de 0.1 M en metanol (MeOH) (15.7 μmol; 3 EQ.) a la solución. Revuelva la reacción a temperatura ambiente durante 3-52 h, es decir., hasta que se complete la oxidación.
    3. Vigilar la reacción de oxidación mediante HPLC y MS. confirmar la formación del segundo enlace de disulfuro por derivatización Yodoacetamida (IAA) (paso 6).
    4. Detener la reacción agregando 79 μl de una solución de ácido ascórbico de 1 M de H2O (78.8 μmol; 15 EQ.). Congelación de la mezcla de reacción y el polvo para la oxidación de 3rd .
  3. 3 oxidación derd (figura 1D)
    Nota: La última oxidación conduce a la desprotección de las cisteínas protegidas Bu ty a la formación del tercer puente disulfuro. El protocolo se aplica a 15 mg de péptido después de la oxidación de 2nd (2718.3 g/mol; 5.5 μmol; 1 EQ.).
    1. Disolver el péptido (15 mg, la concentración final de 1 mM) en 5,5 mL de TFA. Contiene una mezcla de limpiador de 11,2 mg de diphenylsulfoxide (μmol 55; 10 EQ.), 60.2 μl de anisole (0.6 mmol; 100 EQ.) y 97.2 μl de trichloromethylsilane (0,8 mmol; 150 EQ.). Removemos la mezcla durante 3-5 horas a temperatura ambiente.
    2. Vigilar la reacción de oxidación mediante HPLC y MS. confirmar la formación del Enlace disulfuro tercera por derivatización Yodoacetamida (IAA) (paso 6).
    3. Precipitar el péptido en los tubos que contienen éter dietílico frío (0 ° C, 1 mL de solución de reacción por 8-10 mL de éter etílico).
    4. Centrifugar las suspensiones (3400 x g, 1 min), decantar el sobrenadante y lavar el pellet repetidamente (4 veces) con 8-10 mL de éter dietílico frío (0 ° C). Que la granza seca al aire (3 min).
    5. Disolver el pellet en 1 mL de 80% terc-butanol (en H2O), el péptido por congelación y almacenar a-20 ° C.

5. péptido purificación

Nota: Purificar los péptidos oxidados por semi-preparativo RP HPLC equipado con una columna C18 (10 μm de tamaño de partícula, 300 Å tamaño del poro, 250 x 22 mm) y un loop de inyección de 3,6 mL. Utilizan un sistema de gradiente de elución de 0,1% TFA en H2O (eluyente A) y 0.1% TFA en MeCN/H2O (9:1, eluyente B). Detectar los picos a 220 nm.

  1. Añadir 15 mg del producto crudo liofilizado de paso 4.3.5 a un tubo de 15 mL. Disolver el producto crudo en el volumen del bucle de muestra HPLC (e.g., 3,6 mL). Use una mezcla de 0.1% TFA en MeCN/H2O (1:1). Vortex hasta completa disolución y centrífuga (3400 x g) la solución durante 1 minuto.
  2. Elaboración de la mezcla de 3,6 mL en una jeringa de 5 mL e inyectar la muestra sin burbujas de aire en el circuito de inyección. Iniciar la inyección en el sistema HPLC. Purificar la mezcla de péptidos mediante un gradiente de 0-50% eluyente B durante 120 min a un flujo de 10 mL/min.
  3. Recoger las fracciones en tubos individuales que aparecen. Una vez finalizado el plazo, preparar fracciones seleccionadas para el análisis de MS y HPLC (paso 6.1-6.2). Todas aquellas fracciones por congelación y almacenarlos a-20 ° C.
  4. Una vez finalizado el plazo, preparar fracciones seleccionadas para el análisis de MS y HPLC (paso 6.1-6.2). Todas aquellas fracciones por congelación y almacenarlos a-20 ° C.

6. péptido Analytics

  1. HPLC analítica
    Nota: Confirmar la pureza de un péptido por RP analítica HPLC equipado con una columna C18 (5 μm de tamaño de partícula, 300 Å tamaño del poro, 250 x 4.6 mm) y un loop de inyección de 500 μl. Utilizan un sistema de gradiente de elución de 0,1% TFA en H2O (eluyente A) y 0.1% TFA en MeCN (eluyente B). Detectar los picos a 220 nm.
    1. Transferir una muestra de las fracciones de péptidos o los controles de la reacción en un HPLC frasco y disuelvan en una mezcla de 0.1% TFA en MeCN/H2O (1:1, 300-500 μl). Coloque el frasco HPLC en el muestreador automático de la RP HPLC analítico.
    2. Inyecte 250 μl de cada muestra. Utilizan un sistema de gradiente de elución de 0,1% TFA en H2O (eluyente A) y 0.1% TFA en MeCN (eluyente B). Purificar el péptido con una inclinación de 10-40% eluyente B más de 30 min a un flujo de 1.0 mL/min.
  2. Espectrometría de masas MALDI TOF
    Nota: Para confirmar la identidad de un péptido de espectrometría de masas MALDI TOF (tiempo de vuelo) con α- ciano-4-hidroxicinámico ácido como matriz.
    1. Transferir una cantidad visible del péptido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y disolver en 10 μl de una solución de ácido 37 mM α- ciano-4-hidroxicinámico en una mezcla de 0.1% TFA en H2O/MeCN (1:1).
    2. Vórtice de la solución por 10 s, 2 μl de la muestra se aplica a un destino de suelo de acero y secar la muestra.
    3. Utilice el modo de reflector para las medidas y una péptido calibración estándar para las masas molares por debajo de 6000 g/mol.
  3. Derivatización de Yodoacetamida
    Nota: Como Yodoacetamida reacciona con grupos tiol, Yodoacetamida derivatización de los péptidos indica grupos tiol libre. Por lo tanto, la ausencia de grupos tiol libre sirve como un control de reacción mediante MS durante la oxidación dest 1.
    1. Disolver el péptido en 10 mM de tampón fosfato (100 μl; 0,05 mM; pH 7.8) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Añada 100 μl de Yodoacetamida en tampón fosfato 10 mM (4 mM) a la solución del péptido y sacuda suavemente la reacción 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Congelación de la mezcla de reacción y almacenar a-20 ° C.
    2. Una punta de pipeta de plástico del filtro de C18-concentración y condición de la punta con 10 μl de 80% (3 veces), 50% (3 veces), 30% (3 veces) y 0% MeCN (3 veces) en H2O (+ 0.1% TFA).
    3. Disolver la muestra de paso 6.3.1 en 1 μl de 0.1% TFA en H2O y añadir la solución a la punta de la pipeta de filtro. Pipetee cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo para que el péptido se une al talón. Retire el H2O de la punta de la pipeta y enjuague la punta de la pipeta de filtro con 10 μl de 0.1% TFA en H2O.
    4. Añadir 2 μl de 0.1% TFA en H2O/MeCN (1:1) con la otra punta de la pipeta (sin filtro) en la parte superior del grano que contiene el péptido. Aplique el filtrado en el destino del suelo acero y secar la muestra.
    5. Aplicar 1 μl de una solución ácido α-ciano-4-hidroxicinámico de 37 mM en una mezcla de 0.1% TFA en H2O/MeCN (1:1) para el acero de la planta de destino con la muestra y secar la muestra.
    6. Utilice el modo de reflector para las medidas y una péptido calibración estándar para las masas molares por debajo de 6000 g/mol.
  4. Análisis del aminoácido
    Nota: Analizar la concentración de péptido exacto así como la composición de aminoácidos del péptido con un analizador de aminoácidos.
    1. Transferir 100 μg del péptido puro (2604 g/mol; 0.04 μmol) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y disolver el polvo en 200 μL de HCl M 6.
    2. Transfiera 200 μL de la solución en una ampolla de vidrio y enjuague dos veces el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con 200 μL de 6 M de HCl. transferir la solución de enjuague en la ampolla de vidrio, así.
    3. Cerca de la ampolla al calentar el cuello de la ampolla con una llama de mechero de Bunsen. Poner la ampolla en un tubo de vidrio. Colocar en un bloque de calentamiento durante 24 h a 110 ° C para la hidrólisis.
    4. Abrir la ampolla y transferir la solución a un tubo de microcentrífuga de 2 mL. Lave la ampolla (3 x 200 μL) y el tapón (3 x 100 μL) con agua destilada doble H2O y ponerlo en el tubo de microcentrífuga.
    5. Centrifugue la solución durante 6 h a 60 ° C y 210 g de x en un concentrador de vacío rotatorio. Disolver el producto hidrolizado en 192 μl de tampón de dilución de la muestra (200 μm) y transferir la solución a un filtro de micro centrífuga.
    6. Centrifugar la muestra durante 1 minuto a 2300 x g y transferir 100 μl del filtrado en un tubo de muestras de análisis de aminoácidos. Coloque el tubo en el analizador del aminoácido y comenzar el análisis. Un estándar de aminoácidos se utiliza para la calibración.

7. MS/MS análisis de conectividad de disulfuro

  1. Reducción y alquilación parcial17
    1. Disolver 600 μg del péptido puro (2604 g/mol; 0,23 μmol) en 1,2 mL de tampón de citrato de 0,05 M (pH 3,0; concentración de péptido de 0,14 mM) que contiene 7,5 mg de tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP; 0,02 M; 0.03 mmol).
    2. Incubar la mezcla a temperatura ambiente y tomar la reacción varias muestras de control (100 μL) desde 0 min hasta 30 minutos.
    3. Mezclar las muestras en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con 300 μL de tampón de alquilación (0.5 M tris-acetato; pH 8.0; ácido de 2 mM etilendiaminotetracético (EDTA); Yodoacetamida de 1.1 M) para detener la reacción y realizar carbamidomethylation de los grupos tiol libre.
    4. Detener la reacción después de 5 minutos mediante la adición de 100 μl de 10% TFA (H2O) y almacenar las muestras en hielo seco. Preparar muestras HPLC como se describe en el paso 6.1.2 e inyectar 400 μl. (figura 2A)
    5. Utilizan un sistema de gradiente de elución de 0,1% TFA en H2O (eluyente A) y 0.1% TFA en MeCN (eluyente B). Analizar los péptidos utilizando la combinación de una separación isocrática (eluyente B del 10% durante 15 min) y luego una pendiente posterior de 10-35% eluyente B durante 25 min a un flujo de 10 mL/min detectar los picos a 220 nm.
    6. Recoger las fracciones en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y los péptidos por congelación. (Figura 2B)
    7. Transferir una pequeña cantidad de cada fracción a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para análisis de MS/MS de las formas oxidadas (continuar a paso 7.1.12).
    8. Disolver el péptido restante (10-100 μg) en 0.1% TFA en H2O (10-50 μL) y añadir un volumen apropiado de solución 100 mM TCEP (en H2O) para obtener una concentración final de TCEP de 10 mM.
    9. Incubar la reacción por 1 h a 37 ° C (figura 2C). Congelación de la mezcla de reacción y almacenar a-20 ° C.
    10. Preparar muestras de MS/MS como se describe en el paso 6.3.2-6.3.5.
    11. Realizar las mediciones de MS/MS en un espectrómetro de masas MALDI TOF/TOF. TAPA de MS/MS (descomposición inducida por láser) de fragmentación del péptido y seleccionar las masas precursor de especies carbamidomethylated de 2 y 4 veces. Procesar y evaluar los datos MALDI para confirmar la conectividad deseada disulfuro.

8. RMN experimentos y análisis de la estructura

  1. Disolver aproximadamente 0.3-2 mg del producto péptido puro en 500 μl de H2plástico2O (90: 10) y la transferencia de la mezcla en un microtubo de NMR.
  2. Preparar la muestra para las medidas de un espectrómetro de RMN
  3. Registro 2-dimensional [1H,1H] - DQF - COSY (doble espectroscopia de correlación de la cuántica filtrada), [1H,1H] - TOCSY (Espectroscopia de correlación total) [1H,1H] - NOESY (nuclear Overhauser enhancement Espectroscopia) y [1H,13C]-espectros HSQC (coherencia de quantum sola heteronuclear) con supresión de agua.
  4. Asignar las resonancias de protones de los espectros grabados y crear la asignación de átomo de espectros NOESY. Comparar las intensidades en los espectros NOESY establecer las restricciones de límite superior distancia entre átomos diferentes en el péptido. Utilizar la intensidad de los protones de germinales para la calibración de la intensidad máxima.
  5. Cálculo de estructura y refinamiento con un programa de computadora para la visualización molecular y las conectividades de disulfuro identificados de paso 7 como restricciones adicionales (figura 3).
  6. Seleccionar las estructuras con las energías más bajas y utilizar para simulaciones de dinámica molecular (MD).

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Representative Results

15 diferentes isómeros puente disulfuro de la μ-Conotoxina PIIIA sintetizados y caracterizados en detalle (figura 1). Enlaces de disulfuro son identificados por reducción parcial y posterior análisis de MS/MS (figura 2). Análisis de NMR de los isómeros diferentes se lleva a cabo (figura 3) para revelar las estructuras de los péptidos. En particular, una combinación de RP HPLC, fragmentación de MS/MS y NMR análisis es necesaria para la identificación inequívoca de la conectividad de disulfuro.

Figure 1
Figura 1 : La formación de Enlace disulfuro selectiva de μ-PIIIA nativo a través de la estrategia protección del grupo. (A) la desprotección de las cisteínas protegidas Trt durante la escisión del péptido de la resina. (B) la primera disulfuro puente formación de cisteínas sin protección. (C) formación de puente de disulfuro de la Acm y desprotección protegen cisteínas. (D) formación de puente disulfuro de tBu y desprotección protegen cisteínas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Flujo de trabajo de reducción parcial de la asignación de Enlace disulfuro por MS/MS de análisis. (A) parcial reducción y alquilación del péptido. (B) purificación de HPLC de las muestras de control de reacción diferente. (C) reducción de las muestras purificadas. Parcialmente carbamidomethylated especies (dos péptidos en el medio) albergan información sobre la conectividad de disulfuro que es determinada por el análisis por MS/MS. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Heimer, p. et al. Μ-Conotoxina conformacionales isómeros PIIIA revisitados: impacto de cisteína emparejamiento en asignación de Enlace disulfuro y elucidación de la estructura. Química analítica. 90 (5), 3321-3327 (2018). Derechos de autor (2018) Sociedad Americana de química. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : La caminata secuencial y la estructura resultante de la solución de NMR de una rígido (izquierda) y un isómero de la flexible (derecha) μ-PIIIa. Se muestran las 20 estructuras con las energías más bajas, así como la conectividad de disulfuro de los isómeros diferentes. La comparación de los valores de desviación (RMSD) raíz cuadrada media aclara que un péptido rígido sobre todo conduce a una mejor estructura resuelta de NMR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El método descrito en este documento para la síntesis de péptidos ricos en cisteína como μ-PIIIA representa una posibilidad para producir selectivamente disulfuro-consolidado isómeros de la misma secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, estableció métodos como sólida base de Fmoc fase de síntesis de péptido18 y una estrategia de grupo de protección definida para la formación regioselectiva de disulfuro fueron utilizadas16. La síntesis del peptide de la fase sólida puede producir secuencias de aminoácidos en un soporte de polímero (resina) a través de síntesis automatizada. Estos aminoácidos están protegidos contra reacciones secundarias no deseadas durante el montaje de la secuencia por grupos de protección especiales en sus cadenas laterales, que son - según el protocolo usado - deprotected con escote de péptido de la resina. Esta protección se aplica también a las cadenas laterales de cisteína dentro de la cadena peptídica, por ej., protección del trityl. Sin embargo, proteger a distintos grupos de pares individuales de cisteínas como acetamidomethyl y terc-butilo no son troceados concomitante a través de este paso de la eliminación. Estos grupos de protección pueden ser troceados apagado bajo condiciones que permiten la posterior oxidación formando disulfuro de los grupos tiol deprotected. De esta manera, todos los isómeros de disulfuro 15 de un péptido que contiene seis residuos de cisteína pueden ser selectivamente formado7,16. El factor limitante, sin embargo, es que con un número creciente de grupos protección ortogonales de los aumentos de esfuerzo sintético, que tiene un alto impacto en la producción del péptido deseado disulfuro puente. Así, en casos seleccionados y en particular por menos péptidos complejos que poseen sólo uno o dos enlaces de disulfuro el enfoque auto plegable oxidativo de hecho podría ser preferido sobre la estrategia del grupo protección.

En este documento, los grupos de Trt de par una cisteína se eliminan por la acción de TFA después de la finalización de la Asamblea de péptido y Fmoc-desprotección final del aminoácido N-terminal. Las condiciones ácidas, sin embargo, dejan la Acm y tBu grupos protección en los otros dos pares de residuos de cisteína intacto. Posteriormente, purificación del péptido lineal que contiene dos cisteínas sin protección se realiza mediante HPLC preparativa en condiciones ligeramente ácidas a mantener los grupos tioles en la forma protonada. El protocolo sigue con el primer paso de la oxidación después de Análisis analítico de HPLC y MS verificado síntesis exitosa y desprotección de la Trt en el par de cisteína de interés. Los pasos más de desprotección y oxidación del Enlace disulfuro de la segunda y la tercera se realizó y confirmó de la misma manera usando el protocolo apropiado para Acm y tBu, respectivamente. Estas reacciones de oxidación son reacciones simples wet-chemical en solución que no requieren de costosos reactivos. La desventaja, sin embargo, es que ciertas reacciones, es decir., las conexiones de los residuos de cisteína distinto, no se debe proceder suavemente y completamente dando lugar a subproductos de revueltos conectividad de disulfuro. Ya que estas no se quitan después de la terminación de las reacciones de oxidación individuales, estos subproductos pueden acumularse en la mezcla de producto crudo. Algunos de estos pueden poseer propiedades fisicoquímicas similares como el péptido real, por ejemplo., elución HPLC, que aumenta el esfuerzo para la purificación de péptidos correctamente doblada. Aunque la síntesis y purificación pueden ser difíciles, como es el caso de μ-PIIIA, este método puede ser utilizado con éxito, pero requiere de buenas habilidades manual y la observación. Finalmente, debe considerarse que cada secuencia de péptido es diferente y por lo tanto podría ser un trato diferente para tener éxito en la generación de la conectividad de disulfuro correcto.

Además de la difícil síntesis, es fundamental para verificar si los enlaces de disulfuro que produce son correctos, es decir., representan la versión prevista del isómero respectivo disulfuro. Esto se realiza en el presente documento utilizando una combinación de análisis por MALDI MS/MS y NMR estructura elucidación. Análisis MS/MS se realiza utilizando diversos derivados alkylated y parcialmente reducidos (carbamidomethylation) del péptido completamente oxidado17. En el tapa de MS/MS de MALDI TOF/TOF espectros que siempre es un número par de cisteínas de carbamidomethylated encontraron, es decir, carbamidomethylated 2, 4 o 6 veces. Esto puede explicarse por la reducción gradual de los péptidos totalmente oxidados, puesto que en cada ocasión siempre se reducen dos funciones tiol por Enlace disulfuro (abierto) y en situ alquilados con Yodoacetamida. Esta carbamidomethylation de dos cisteínas cada uno puede ser detectada en los espectros de MS/MS de MALDI y, a su vez, se refiere al enlace de disulfuro respectivos que estas cisteínas se dedicaban en el péptido intacto. Por ejemplo, la ocurrencia de cuatro cisteínas de carbamidomethylated en una secuencia con disulfuro de tres bonos de ayuda para identificar un enlace específico, es decir, uno formado entre las dos cisteínas no alquiladas, que no fueron abiertos durante el tiempo de reacción de la reducción parcial suficiente para abrir los otros dos bonos. Así, por MALDI MS/MS análisis de los diferentes derivados de carbamidomethylated de 2 y 4 veces del isómero de disulfuro de péptido, las conectividades de disulfuro pueden ser totalmente esclarecida y confirmado.

Otra posibilidad para dilucidar el patrón de enlace de disulfuro es el MS/MS análisis de péptidos digeridos enzimáticamente, donde el péptido debe ser proteolíticamente en distinto aminoácidos para producir fragmentos más pequeños. Estos fragmentos cortos se pueden todavía vinculados mediante enlaces disulfuro, que es la razón por la que el patrón de disulfuro puede ser aclarado de análisis MS/MS de estos fragmentos vinculados. En el caso de μ-PIIIA, sin embargo, esta estrategia podría no aplicarse porque algunas cisteínas de la secuencia son directamente adyacentes uno al otro y por lo tanto la digestión de los péptidos no separa las cisteínas de uno al otro. Identificación del puente disulfuro específicas por lo tanto es difícil.

La elucidación de la estructura mediante el análisis de NMR 2D se facilita claramente en el caso de una conectividad de disulfuro conocido, porque este conocimiento permite la asignación de efecto nuclear de Overhauser (NOE) a protones específicos, es decir., haciendo alusión a lo espacial distancia entre dos átomos determinados de las intensidades de las señales NOESY (experimento NMR de a través de espacio). El análisis, sin embargo, empieza con el paseo secuencial19 aplicado a los espectros COSY, TOCSY y NOESY, de esta manera, es posible asignar una señal específica para el correspondiente átomo de H de los aminoácidos (sistema del centrifugado) en la secuencia. Las restricciones de la distancia precedentemente indicada del experimento NOESY se utilizan en el cálculo de la estructura del péptido7. Las señales más identificadas, más precisa la estructura será. Sin embargo, la dificultad de esta tarea aumenta con el número de aminoácidos en el péptido y la ocurrencia de cisteínas adyacentes, al aumentar la probabilidad de que las señales de varios átomos se superponen y pueden no ser precisamente asignadas debidas al cierre proximidad. Además, la flexibilidad de la cadena peptídica es decisiva para señales en la RMN sean fácil o difícilmente identificables. Más flexible una región del péptido, se producen los cambios conformacionales más, permite que varias señales para átomo de la misma. Por lo tanto, la intensidad disminuye con el número de conformaciones, que provoca las señales desaparecen en ruido de fondo. Esto significa que la elucidación de la estructura tridimensional mediante NMR se convierte mucho más fácil si la secuencia está restringida conformationally.

Finalmente, este protocolo hace posible generar múltiples péptidos puente disulfuro mediante el control de la formación de Enlace disulfuro por el análisis por MALDI MS/MS y concomitante 2D NMR estructura aclaración7.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a A. Resemann, F. J. Mayer y D. Suckau de Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts y Thiele C. de la Universidad Tecnológica de Darmstadt; O. Ohlenschläger de la Jena FLI, M. Engeser de la Universidad de Bonn; K. Kramer, A. Harzen y H. Nakagami del Instituto Max Planck para la investigación de crianza de planta, Colonia; Susanne Neupert del Instituto de Zoología de la Colonia; y las instalaciones de espectroscopia de resonancia magnética Biomolecular de la Universidad de Francfort para técnico soporte, módulos, de formación y acceso a instrumentos. Se agradece el apoyo financiero de la Universidad de Bonn a D.I..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin Varian, Inc. PL3867-3764 AmphiSpheres 40 RAM
Pyr(Boc) Bachem A-3850
Arg(Pbf) Iris Biotech FSC1010
Asn(Trt) Bachem B-1785
Asp(tBu) Iris Biotech FSP1020
Hyp(tBu) Iris Biotech FAA1627
Lys(Boc) Bachem B-1080
Ser(tBu) Iris Biotech FSC1190
Gln(Trt) Iris Biotech FSC1043
Glu(tBu) Iris Biotech FSP1045
Trp(Boc) Iris Biotech FSC1225
Tyr(tBu) Sigma Aldrich 47623
Thr(tBu) Iris Biotech FSP1210
His(Trt) Iris Biotech FDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat Sigma Aldrich 8510060 Flammable
DMF Fisher Scientific D119 Flammable, Toxic
DCM Fisher Scientific D37 Carcinogenic
Piperidine Alfa Aesar A12442 Flammable, Toxic, Corrosive
N-Methyl-Morpholin Sigma Aldrich 224286
Cys(Acm) Iris Biotech FAA1506
Cys(Trt) Bachem E-2495
Cys(tBu) Bachem B-1220
trifluoruacetic acid Sigma Aldrich 74564 Toxic, Corrosive
phenol Merck 1002060 Toxic
thioanisol Alfa Aesar A14846
ethanedithiol Fluka Analytical 2390
diethyl ether VWR 100,921 Flammable
tert-butanol Alfa Aesar L12338 Flammable
acetonitrile Fisher Scientific A998 Flammable
water Fisher Scientific W5
isopropanol VWR ACRO42383 Flammable
sodium hydroxide AppliChem A6579,1000 Corrosive
iodoacetamide Sigma Aldrich I6125
iodine Sigma Aldrich I0385
Hydrochloric acid Merck 110165 Corrosive
ascorbic acid Sigma Aldrich A4403
diphenylsulfoxide Sigma Aldrich P35405
anisol Sigma Aldrich 96109 Flammable
trichloromethylsilane Sigma Aldrich M85301 Flammable
sample dilution buffer Laborservice Onken
sodium dihydrogen phosphate Sigma Aldrich 106370
disodium hydrogen phosphate Sigma Aldrich 795410
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706
citric acid Sigma Aldrich 251275
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
tris-acetate Carl Roth,  7125
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E26282 
peptide calibration standard II Bruker Daltonics GmbH 8222570
Name of Equipment Company
solid-phase peptide synthesizer Intavis Bioanalytical Instruments AG EPS 221
lyophilizer  Martin Christ GmbH  Alpha 1-2 Ldplus
semipreparative HPLC Jasco system PV-987
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) Knauer 25QE181E2J purification of the linear peptide
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) Hichrom-VWR HICH218TP1022 purification of the oxidized peptide
analytical HPLC  Shimadzu system LC-20AD
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm)  Hichrom-VWR HICH218TP54 analytical column
ground steel target (MTP 384) Bruker Daltonics GmbH NC0910436 MALDI preparation 
C18-concentration filter (ZipTip) Merck KGaA ZTC18S096 MALDI preparation 
MALDI mass spectrometer Bruker Daltonics GmbH ultraflex III TOF/TOF
amino acid analyzer Eppendorf-Biotronik GmbH LC 3000 system
NMR spectrometer Bruker Avance III Bruker Daltonics GmbH Bruker Avance III 600 MHz
computer program for molecular visualising YASARA Biosciences GmbH Yasara structures NMR structure calculation
computer program for MALDI data evaluation  Bruker Daltonics GmbH flexAnalysis, BioTools MS/MS fragmentation
analog vortex mixer VWR VM 3000
Microcentrifuge Eppendorf 5410
Centrifuge Hettich EBA 20
Rotational vacuum concentrator Christ 2-18 Cdplus
Analytical Balance A&D Instruments GR-202-EC

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References

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Tags

Protección de la conectividad de química número 140 péptidos ricos en cisteína disulfuro síntesis grupo estrategia análisis de la estructura 2D NMR (resonancia magnética nuclear) MS/MS (espectrometría de masas tándem)

Erratum

Formal Correction: Erratum: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities
Posted by JoVE Editors on 11/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for:Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.

Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

to:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

Step 1.2 in the Protocol section was updated from:

NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.

to:

NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.

Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:

HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).

to:

HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).

The first item in the Materials table was updated from:

Fmoc Rink amide resin Novabiochem 855001

to:

PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin Varian, Inc. PL3867-3764 AmphiSpheres 40 RAM
Síntesis y determinación estructural de μ-Conotoxina PIIIA isómeros con disulfuro diferentes conectividades
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Heimer, P., Schmitz, T., Bäuml, C. A., Imhof, D. Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. J. Vis. Exp. (140), e58368, doi:10.3791/58368 (2018).

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