Summary
Este protocolo describe una técnica de diferenciación endotelial de las células progenitoras cardíacas. Se centra especialmente en cómo la concentración del suero y la densidad de siembra de células afectan el potencial de diferenciación endotelial.
Abstract
Las células progenitoras cardíacas (CPCs) pueden tener potencial terapéutico para la regeneración cardiaca después de la lesión. En el corazón mamífero adultos, CPCs intrínsecos son muy escasos, pero CPCs ampliadas podrían ser útiles para la terapia celular. Un requisito previo para su uso es su capacidad para distinguir de forma controlada en los diferentes linajes cardiacos utilizando protocolos definidos y eficientes. Además, en vitro expansión, CPCs aislaron de pacientes o modelos preclínicos de la enfermedad pueden ofrecer herramientas de investigación fructífero para la investigación de los mecanismos de la enfermedad.
Los estudios actuales utilizan diferentes marcadores para identificar CPCs. Sin embargo, no todos se expresan en los seres humanos, que limita el impacto traslacional de algunos estudios preclínicos. Protocolos de diferenciación que son aplicables independientemente de la expresión de la técnica y el marcador de aislamiento permitirá la expansión estandarizada y cebado de CPCs para propósito de la terapia celular. Aquí describimos que el cebado de CPC bajo condiciones de densidad celular baja y una concentración baja del suero bovino fetal (FBS) facilita la diferenciación endotelial de CPCs. utilizando dos subpoblaciones diferentes de ratón y rata CPCs, demostramos que eso laminin es más sustrato adecuado de fibronectina para este propósito bajo el siguiente protocolo: después de cultivo de 2-3 días en medio incluyendo suplementos que mantienen multipotencia y con 3.5% FBS, CPCs son sembradas en laminina en < 60% confluencia y cultivadas en medio sin suplemento con bajas concentraciones de FBS (0.1%) durante 20-24 horas antes de la diferenciación en medio de la diferenciación endotelial. Porque CPCs son una población heterogénea, las concentraciones séricas y tiempos de incubación deba ajustarse dependiendo de las propiedades de la subpoblación de CPC respectiva. Teniendo en cuenta esto, la técnica puede aplicarse a otros tipos de CPC así y proporciona un método útil para investigar el potencial y los mecanismos de diferenciación y cómo se ven afectados por la enfermedad al utilizar CPCs de modelos de la enfermedad respectiva.
Introduction
Estudios recientes apoyan la existencia de las células progenitoras cardíacas residentes (CPC) en el corazón mamífero adulto1,2,3, y CPC podría ser una fuente útil para la terapia de la célula después de lesión cardíaca4, 5. Además, CPCs ampliados pueden proporcionar un modelo fructuoso para la detección de drogas y la investigación de los mecanismos de la enfermedad cuando están aisladas de pacientes con cardiomiopatías raros, o de enfermedad respectiva modelos6,7.
CPCs aislados del corazón adulto poseen/progenitoras celulares características1,2,3,8 como son multipotentes, clonogenic, y tienen la capacidad de auto renovación. Sin embargo, hay muchas poblaciones diferentes (sub) de CPCs exhibir perfiles de diferentes marcadores de superficie, incluyendo, por ejemplo, c-kit, Sca-1 y otros, u obtenido por técnicas de aislamiento diferentes (tabla 1). Varios protocolos de diferenciación y cultura han sido establecidos1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Estos protocolos varían sobre todo con respecto al factor de crecimiento y contenido de suero, que se ajustan según el propósito del cultivo y que pueden conducir a diferencias en los resultados y los resultados, incluyendo la eficiencia de la diferenciación.
Técnicas de aislamiento basadas en marcadores:
CPC puede ser aislado basado en un marcador de superficie específico expresión1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Estudios previos sugieren que c-kit y Sca-1 son los mejores marcadores para aislar residente CPC1,11,14,19,20. Porque ninguno de estos marcadores es realmente específico para CPC, generalmente se aplican combinaciones de marcadores diferentes. Por ejemplo, mientras que los CPCs expresan bajos niveles de c-kit21, c-kit se expresa también por otros tipos celulares, incluyendo células de mástil22, células endoteliales23y de células progenitoras hematopoyéticas24. Un problema adicional es el hecho de que no todos los marcadores se expresan a través de todas las especies. Este es el caso de Sca-1, que expresa en ratón pero no en humanos25. Por lo tanto, utilizando protocolos que son independientes de los marcadores de aislamiento puede ser ventajoso a la vista de los ensayos clínicos y estudios con muestras humanas.
Técnicas de aislamiento independiente del marcador:
Existen varias técnicas importantes de aislamiento de la CPC, que son sobre todo independientes de la expresión superficial del marcador, pero que se puede refinar la selección consecutivos de subfracciones de marcador positivo específicos según sea necesario (ver también tabla 1). (1) la técnica de la población (SP) de lado originalmente se ha caracterizado en una población primitiva de las células madre hematopoyéticas, basado en la capacidad de emanación el tinte DNA Hoechst 3334226 de ATP-binding cassette (ABC) transportadores27. Células cardíacas de SP han sido aisladas por los distintos grupos y registrados para expresar una variedad de marcadores con algunas diferencias menores entre informes2,8,13,14. (2) células unidad formación de colonias de fibroblastos (CFU-Fs) originalmente se han definido en base a una células mesenquimales estromales (MSC)-como fenotipo. MSCs aislados se cultivan en los platos para inducir la formación de la Colonia. Formadoras de colonias MSC-como CFU-Fs puede ser aislado del corazón adulto y son capaces de diferenciarse en linajes cardíaca15. (3) Cardiosphere-las células derivadas de (enfermedades CDC) son las células derivadas de racimos de células de biopsias de tejido o explantes28,29,30,31. Recientemente fue demostrado que sobre todo la CD105+/CD90 /c-kit– –fracción de la célula exhibe cardiomiogenético y potencial regenerativo32.
Con SP-CPC aislado de ratones, presentamos un protocolo para la inducción eficiente de linaje endotelial basado en un estudio previo en el CPCs de rata y ratón CPCs SP33. El protocolo contiene adaptaciones específicas a la cultura y la técnica de expansión con respecto a la densidad celular, el contenido de suero del medio y el sustrato. Se puede aplicar no sólo a ratón SP-CPC pero distintos tipos de CPC para el propósito de inducir un cambio de destino de una amplificación a un CPC endoteliales comprometido, ya sea ante el trasplante de estas células o su uso para estudios mecanísticos en vitro .
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Protocol
El uso de ratones para propósito de aislamiento celular estaba de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y con la ley de protección Animal Suiza y fue aprobado por las autoridades cantonales suizas.
Nota: El aislamiento de Sca-1+/CD31– SP-CPC desde el corazón de ratón se hizo esencialmente descrita34 con algunas modificaciones. Para los materiales y reactivos utilizados, véase Tabla de materiales. Para todos los experimentos, SP-CPC cardiaco aislado de ratones era amplificado pasado y de célula línea-como forma. Pasos 7-20 se utilizaron para este estudio.
1. preparación de tejido
Nota: Todos los experimentos con ratones se realizarán según las normas y reglamentos. Este protocolo utiliza cuatro ratones. Placas que son de 100 mm de diámetro se describen como P100 y placas que son de 60 mm de diámetro se describen como P60 para las siguientes partes del protocolo.
- Inyectar cada ratón con 200 mg/kg de pentobarbital por vía intraperitoneal (i.p.) y espere hasta que totalmente está anestesiada comprobando su respuesta para dedos pellizcando.
- Limpie el pecho con etanol al 70%. Corte la piel y la pared torácica con unas tijeras para exponer la cavidad torácica.
- Levantar el corazón con unas pinzas y cortar en la base con unas tijeras. Poner el corazón en un P100 con 25 mL (5 mL para P60) de frío con tampón fosfato salino (PBS) (tres a cinco corazones por P100) o uno a dos corazones por P60.
- Bomba el corazón con unas pinzas para extraer la sangre de las cavidades (figura 1A).
- Poner el corazón en un P100 con 25 mL (5 mL para P60) de PBS frío para lavar. Retire las aurículas con unas tijeras pequeñas. Cortar el corazón en dos piezas longitudinales y lavarlos otra vez en PBS helado (25 mL/P100, 5 mL/P60).
- Transferencia de las piezas a un P100 nueva con 25 mL (5 mL para P60) de PBS frío. Cortar en trozos pequeños con unas tijeras pequeñas (figura 1B). Añadir una gota de colagenasa 1 mg/mL B diluido en solución salina balanceada de Hank (HBSS) y pique las piezas pequeñas con una hoja de afeitar estéril (figura 1).
2. la digestión
- Añadir 10 mL (2,5 mL en P60) de la solución de B de colagenasa 1 mg/mL en el plato de paso 1.6.
- Poner la solución de colagenasa B que contiene las piezas de corazón picado en una inclinada (30°) P100 (o P60) en una incubadora de 37 ° C (figura 1).
- Incubar las piezas de corazón picado para un máximo de 30 minutos; Homogeneizar por pasar repetidamente a través de una pipeta Pasteur cada 10 min durante la incubación (Figura 1E).
Nota: Es importante no superar los 30 min de incubación en total para el paso 1.3.
3. filtración
- Añadir 10 mL (5 mL para P60) de frío HBSS suplementado con 2% FBS a las piezas de corazón picada y homogeneizada.
Nota: HBSS suplementado con 2% FBS arrestina B colagenasa. - Filtrar las piezas de corazón con 100 μm filtro para eliminar el tejido no digerida y centrifugar a 470 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) (Figura 1F, filtros amarillo).
- Descarte el sobrenadante y resuspender el precipitado en 5 mL (3 mL para P60) de tampón de lisis de glóbulos rojos e incubar el sedimento durante 5 minutos con agitación ocasional en el hielo.
- Añadir 10 mL (5 mL para P60) de PBS (para detener la reacción de lisis) y filtrar la muestra a través de un filtro de 40 μm para excluir las celdas más grandes, incluyendo los cardiomiocitos residual (Figura 1F, filtros azul).
- Centrifugar el tubo a 470 x g durante 5 min a temperatura ambiente (sin freno). Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de DMEM incluyendo 10% FBS.
- Contar las células en una alícuota con un hemocitómetro. Resuspender las células con DMEM incluyendo 10% FBS, apuntando a una concentración celular final de 1 x 106 células/mL.
Nota: Aproximadamente 5 x 106 células agotadas de cardiomiocitos y eritrocitos pueden estimarse por ratón. - Distribuir las células en dos tubos (figura 2): en el tubo, agregar 1,5 mL para la tinción de Hoechst 33342 con verapamilo; en el tubo B, añadir 18,5 mL para la tinción de Hoechst 33342 y proceder a la mancha y ordenados células cardíacas de SP (pasos 4.1 y 4.2) por citometría de flujo.
4. clasificación de las células cardiacas SP mediante citometría de flujo
Nota: Verapamilo inhibe la emanación de Hoechst bloqueando la actividad de transportador ABC (MDR) la resistencia del multidrug. Hoechst 33342 es un tinte de unión al ADN que puede utilizarse para detectar el ciclo celular ya que se correlaciona con el contenido de ADN en las células vivas. Extrusión de Hoechst 33342 células aparecen en la parte baja de Hoechst de ambos canales de emisión (450 nm, azul de Hoechst; 650 nm, rojo de Hoechst), es decir, a un lado de la Hoechst-retener la "población principal del, dándoles su nombre"lado población". SP células están enriquecidas en células con propiedades de progenitoras y una alta expresión de transportadores de ABC multidrug-resistente (como MDR1 y ABCG2). Hoechst 33342 está escrito como Hoechst para las siguientes partes del protocolo. Es importante proteger los materiales sensibles a la luz para los resultados ideales.
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Tinción con Hoechst en presencia y ausencia de verapamilo
- Agregar verapamilo (con una concentración final de 83.3 μm) y Hoechst (con una concentración final de 5 μg/106 células) a la solución de la célula. Para el tubo, use Verapamil y Hoechst; tubo B, sólo para uso Hoechst. Incubar en un baño de agua (a 37 ° C) durante 90 minutos y revertir los tubos cada 20 min (figura 1).
- Centrifugar los tubos a 470 x g durante 5 min a TA. descartar el sobrenadante y resuspender cada precipitado en HBSS (1 x 106 células/mL).
- Tomar 1,5 mL alícuota para los stainings únicos y el control negativo del tubo B (figura 2): (i) isotiocianato de fluoresceína (FITC)-conjugado anti-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-conjugado anti-CD31; (iii) nonstained las células (control negativo).
Nota: Controles de isotipo se utilizan aquí para configurar el protocolo de aislamiento. - Centrifugar los tubos A y B y las alícuotas del control negativo y tinción solo 470 x g durante 5 min a temperatura ambiente para el lavado de Hoechst y verapamilo.
- Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet de tubo y (iii) el control negativo en 250 μl de HBSS y mantenerse en hielo en la oscuridad hasta la clasificación.
- Resuspender el precipitado de tubo B en 200 μL de la HBSS y la pelotilla (i, ii) las alícuotas manchas solo en 100 μl de HBSS. Añadir conjugado con FITC anti-Sca-1 (0,6 μg/107 células) y conjugado con APC anti-CD31 (0,25 μg/107 células). Incubar las pelotillas por 30 min en hielo y sacudirlas de vez en cuando en la oscuridad.
- Añadir 2 mL de HBSS a los tubos. Centrifugar los tubos a 470 x g durante 5 min a TA.
- Desechar el sobrenadante y resuspender los pellets con 1 mL de HBSS y centrifugue como arriba. Deseche el sobrenadante. Resuspender el precipitado de las alícuotas de manchas solo en 200 μL de HBSS. Resuspender el precipitado de tubo B en HBSS (20 x 106 células/mL).
- Mantener las muestras en hielo y protegidos de la luz hasta la clasificación.
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Clasificación con citometría de flujo
- Preparación estéril 1.5 mL clasificación tubos con 500 μl de HBSS incluyendo 2% FBS.
- Se tiñen las células con aminoactinomycin 7 D (7-AAD) (0,15 μg/106 células) en hielo durante 10 min a excluir las células muertas.
- Ordenar el SP cardiaco con la siguiente configuración: excitación Hoechst con 350 excitación nm (UV), recoger la emisión de fluorescencia con un filtro de paso de banda de 450/50 nm (Hoechst azul) y un filtro de paso banda 670/30 nm (Hoechst rojo) y utilizar un tamaño de boquilla de 100 μm y presión de 15 psi.
- Para el análisis, registro 5 x 105 eventos para las muestras de clasificación y 1 x 105 eventos para el control negativo, control de verapamilo y manche solo muestras.
Nota: La cardíaca es alrededor del 0.5% - 2% (figura 1 H) pero puede variar entre laboratorios y aislamientos. El Sca-1+/CD31– fracción está alrededor de 1% - 11% de la total SP cardiaca (figura 1I) pero puede variar entre laboratorios y aislamientos. SCA-1+/CD31– SP-CPC se escribe como SP-CPC para las siguientes partes del protocolo.
5. primaria cultura de SP aislado-CPC
Nota: Se utilizaron tres tipos diferentes de medios de comunicación en el presente Protocolo. Ellos se denominan medio 1 (según Noseda et al.) 8, medio 2 y 3 medio y están describen en la Tabla de materiales con respecto a su composición.
- Calentar medio 1 a 37 ° C antes de usarlo y enfriar el centrifugar a 4 ° C. Centrifugar los tubos clasificación a 4 ° C y 470 x g durante 6 min y resuspender las células en el medio 1.
- Poner las células en un plato de P60 permeables al gas con 4 mL de medio de 1. Cambiar el medio cada 3 d hasta que las células hayan alcanzado el 70% - 80% de confluencia.
Nota: Paso 5.2 puede tomar alrededor de 2-3 semanas.
6. expansión y diferenciación de SP-CPC
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Cultivo de células
- Cultura 3 x 105 CPCs SP en 8 mL de medio de 1 en un matraz T75.
- SP-CPC de incubar a 37 ° C con 5% CO2 hasta confluencia de 70% - 80%, cambiando el medio cada 2-3 d.
Nota: El número de celular debe ser modificado según el tipo de CPCs utilizados, el tiempo de duplicación y el tamaño de celda.
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SP-CPC crecimiento y viabilidad con concentraciones distintas de suero
- Cultura SP-CPC para 2-3 d en T75 frascos con 8 mL de medio de 1. Cuidadosamente aspirar el medio y lavar con 5 mL de caliente (37 ° C) HBSS.
- Tratar las células con 5 mL de tripsina-EDTA por 5 min en la incubadora de la célula, añadir 5 mL de medio 1 dejar la actividad de tripsina y transferir la suspensión de células a un tubo de 15 mL.
- Centrifugar las células a 470 x g durante 5 min a TA.
- Resuspender las células en medio 1 o 2 medio (medio de inducción de linaje) y placa de 2.5 x 105 SP-CPC P60 platos con 3 mL de medio con suero diferentes concentraciones.
- Recoger el medio del plato de paso 6.2.4 para la colección de células muertas en un tubo de 15 mL después de 2 d de cultivo en medio 1 y medio 2.
- Trypsinize células adherentes como en el paso 6.2.2 y recoger la suspensión de células en el tubo de 15 mL de paso 6.2.5. Centrifugar las células a 840 x g durante 5 min a TA.
- Aspirar el sobrenadante y agregar 1 mL de medio de 1 o 2 medio para el recuento celular. La mancha SP-CPC con azul de tripán (0.4%) y cuenta trypan azul positivo (muertos) y trypan azul negativo células (viables).
Nota: La viabilidad celular (paso 6.2.7) es dado como el número de la célula negativo azul de tripano en relación al número total de células.
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Inducción de la diferenciación endotelial
- Precapa una placa de cultivo (6-bien) con 10 μg/mL de laminina (LN) o fibronectina (FN).
- Hacer una solución de sustrato que contiene 10 μg/mL de LN o FN con medio de F12 (o PBS). Añadir 2 mL de solución sustrato a cada pocillo. Mantener la placa durante 30 min a 37 ° C.
- Aspire la solución de la placa y agregar 2 mL de PBS a cada pocillo hasta usarlo.
- Aspirar el medio de las células de paso 6.1.2, enjuague suavemente con 5 mL de caliente (37 ° C) HBSS, tratar con 5 mL de tripsina-EDTA por 5 min en la incubadora de la célula, añadir 5 mL de medio 1 dejar la actividad de tripsina y transferir la suspensión de células a un tubo de 15 mL.
- Centrifugar las células a 470 x g durante 5 min a TA. aspirar el sobrenadante y añadir 2 medio para el recuento celular.
- Semilla 8 x 104 células por pozo de la placa revestida con 3 mL de medio 2 y mantienen a 37 ° C durante 20-24 h. cambio el medio a 3 mL de medio de 3.
Nota: Recomendamos usar el medio con una concentración baja del suero y sin suplementos, para las primeras 20 a 24 h. Se recomienda utilizar < 60% confluencia de células (es decir, el número de células de paso 6.3.4 debe ser ajustada dependiendo de la tasa de crecimiento y tamaño celular). - Las células de 21 d la cultura y cambiar el medio cada 3 d.
- Verificar la naturaleza endotelial de las células diferenciadas por tinción con un marcador endotelial como von Willebrand Factor (FvW) y realizar microscopía de fluorescencia.
- Lavar las células con 1 mL de PBS y fijar las células en 3.7% de formaldehído durante 2 min a TA.
- Permeabilizar las células con 0,1% Triton X en ddH2O (o PBS) durante 30 min y bloque con 10% de suero de cabra de 1 h a TA.
- Incubar las células con el anticuerpo de anti-von Willebrand factor (1: 100) por 48 h a 4 ° C
- Lavar las células 3 x con 1 mL de PBS durante 10 minutos cada vez. Incubar con Alexa Fluor 546 anticuerpo secundario de cabra anti-conejo (1: 500) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Lave otra vez 3 x, de 10 minutos cada uno, con 1 mL de PBS. Teñir los núcleos celulares con 4'6-diamidino-2-phenylindole, diclorhidrato (DAPI; 1: 500) por 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Lavar las células 3 x, 5 minutos cada uno, con 1 mL de PBS. Montaje de las células y almacenar a 4 ° C
Nota: Las condiciones de cultivo (sustrato, medio, reactivos suplementarios y concentración FBS) de medidas 6.1 y 6.3 se describen en la figura 3.
- Precapa una placa de cultivo (6-bien) con 10 μg/mL de laminina (LN) o fibronectina (FN).
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Ensayo de formación de tubo
- Preparar una matriz de la membrana del sótano (p. ej., Matrigel, en adelante denominado matriz) placa.
- Descongelar la matriz a 4 ° C durante la noche.
- Cubrir una placa de 96 pocillos con 100 μl de la matriz en el hielo.
Nota: Es importante evitar las burbujas en la matriz. Las placas tienen que ser cubierto en hielo para evitar la gelificación de la matriz. - Mantener la placa a 37 ° C durante 30 minutos.
- Aspirar el medio de las células (después de la terminación del paso 6.3.5) suavemente enjuague las celdas con 5 mL de caliente (37 ° C) HBSS y tratarlos con tripsina-EDTA por 5 min en la incubadora de la célula. Añadir medio 3 para detener la actividad de tripsina y transferir la suspensión de células a un tubo de 15 mL.
- Centrifugar las células a 470 x g durante 5 min a TA. Aspire el sobrenadante, agregar 1 mL de medio 3 y pipetee suavemente.
- Si las células se agregan del filtro con un tamiz de 35 μm celular, las células.
- Contar las células y 2 x 103 4 x 103 células en 100 μl de medio de 3 en cada matriz-cubrió bien la semilla. Mantenga la placa a 37 ° C en la incubadora de la célula durante 16 h.
- Tome una foto con un microscopio de campo brillante con 2 aumentos.
Nota: En el caso de una incompleta tripsinización, prolongar el tiempo de exposición a tripsina-EDTA a un máximo de 7-8 minutos.
- Preparar una matriz de la membrana del sótano (p. ej., Matrigel, en adelante denominado matriz) placa.
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Representative Results
Aislamiento de SP-CPC del ratón:
En este estudio, utilizamos el CPC de ratón aislado según el fenotipo de SP, mientras que resultados de rata CPCs son modificados y añadidos de un anterior informe con permiso (figura 8)33.
Proliferación celular en celulares alta y baja densidad y con concentraciones distintas de suero:
Nuestro estudio anterior mostró que la expresión del mRNA de marcadores cardiacos linaje cambiado dentro de las primeras 24 h de cultivo de paso. Se sabe que la matriz extracelular afecta las decisiones de destino de la célula, incluyendo diferenciación endotelial35. Para explorar las condiciones adecuadas para facilitar el compromiso de linaje endotelial del CPCs, utilizamos FN y LN (ambos 10 μg/mL) en una placa de 6 pozos (zona de crecimiento: 9,6 cm2/well) en este estudio. Porque las decisiones de destino de ciclo celular y la célula están estrechamente relacionadas, estamos buscando la condición que exhibe una tasa de proliferación celular bajo en ausencia de muerte celular, como tal condición puede reflejar la transición de la proliferación celular a la diferenciación. Por lo tanto, aplica las siguientes condiciones y en comparación con las tasas de proliferación celular: para la densidad celular, confluencia alta (80% - 90%) y baja (< 60%) confluency y para la concentración del suero, las condiciones de cultivo normales (en este estudio 3.5% FBS) y suero bajo condiciones (≤0. 1% FBS). En primer lugar, hemos probado la condición de densidad baja de la célula. No hubo diferencias significativas de viabilidad celular y proliferación en la densidad celular baja 3.5% FBS entre LN y FN, mientras que una densidad baja de la célula con 0.1% FBS demostró una proliferación celular disminuida en LN en comparación con el FN pero ningún aumento en la muerte celular ( Figura 4). En contraste, bajo condiciones de densidad celular alta, las concentraciones séricas de 3.5% y 0.1% no mostraron diferencias en la proliferación celular y en la muerte celular entre los dos sustratos (figura 5).
Estos resultados indican que una densidad baja de la célula en LN con 0.1% de suero disminuye proliferación sin afectar la viabilidad de la CPC.
Cambios en la forma de la célula en el medio de diferenciación endotelial:
Aunque requiere más estudios para comprender el significado y mecanismos subyacentes, aparecen cambios en la forma de la célula es un indicador de las condiciones de cultivo adecuadas como cambios específicos puede observarse tempranamente en las culturas, en el cual endotelial la diferenciación va a ser exitoso (figura 6). Como se muestra en los círculos blancos y discontinuos en la figura 6, en 7-14 d en el medio de diferenciación endotelial, culturas exitosas contuvieron las células que eran más grandes y morfología diferente a las otras células. Curiosamente, estas células desaparecieron hacia el final de la fase de diferenciación y también aparecieron en números más bajos y en más puntos del tiempo en las culturas de alta densidad en LN y FN mientras que nosotros no caracterizar estas células, este protocolo sugiere la forma de la célula de seguimiento cada 2-3 d hasta alrededor del día 14. Si tales células no aparecen, debe reducirse el número de células sembradas.
Evaluación de la capacidad endotelial con un ensayo de formación de tubo:
El ensayo de formación de tubo es una técnica útil para evaluar la eficacia de diferenciación endotelial de CPC mediante la medición de la capacidad de formación de tubo de células diferenciadas. Por lo tanto, realizamos el ensayo de formación de tubo con células diferenciadas según las condiciones descritas. Curiosamente, formación de tubo éxito fue demostrada por células plateado en baja densidad y se distinguir en LN, mientras que formación de tubo no pudo sobre todo en las células plateadas en LN en alta densidad (Figura 7A). Del mismo modo, formación de tubo prosperó sobre todo en células cultivadas en FN independientemente de la densidad celular, aunque las células diferenciadas en FN a baja densidad a veces forman tubos rudimentarios, dependiendo de la condición de la célula (por ejemplo, aislar o paso número, figura 7B). Para confirmar la naturaleza endotelial de las células, células sobre cubreobjetos se distinguen según el protocolo descrito y mancharon para el vWF. Una vez más, la expresión del vWF fue más homogénea y más pronunciado en CPC distinguieron en LN en comparación con FN (figura 7D). La figura 8 muestra los resultados de ensayo de formación de tubo realizado estudios anteriores con CPCs de la rata bajo el mismo protocolo como aquí describen33. Estos resultados muestran que la formación del tubo es más eficiente en células diferenciadas en LN en comparación con el FN cuando plateado bajo condiciones de densidad celular baja y con baja del suero (0,1% SBF) de 20-24 h antes de la diferenciación en medio de la diferenciación endotelial. Estos resultados sugieren que este protocolo podría ser útil para varios tipos de células e independiente de las especies.
Figura 1: ilustración de aislamiento específico de pasos para obtener una suspensión celular de cardiomiocitos-agotado de corazones de ratón aislados y flujo representativo lecturas de cytometry de la SP cardiaca (A) este panel muestra la eyección de la sangre residual de las cavidades del corazón a través de repetidos leve presión aplicada utilizando pinzas pequeñas. (B) este panel muestra el corte de los corazones en trozos pequeños con unas tijeras pequeñas. (C) este panel muestra el picado de las piezas de corazón con una navaja. (D) este panel muestra la incubación de los corazones picadas con colagenasa B en placas inclinadas a 37 ° C. (E) este panel muestra la homogeneización de los corazones picadas utilizando una pipeta Pasteur durante la etapa de incubación. (F) este panel muestra el filtrado del tejido digerido a través de un filtro μm 100 (amarillo) y 40 filtro μm (azul) para la eliminación de residuos sin digerir tejido y cardiomiocitos. (G) este panel muestra la inversión suave de un tubo cónico de 50 mL que contiene la suspensión celular de cardiomiocitos-agotado y envolver en papel de aluminio para protección de la luz después de la adición de Hoechst. (H) este panel muestra representativa flujo cytometry lecturas de células con tinción de Hoechst en presencia y en ausencia de la ABC transporter inhibidor verapamilo para la identificación de la SP () este panel muestra una trama de puntos representativos de SP las células según la positividad CD31 y Sca-1 para la identificación de la Sca-1+/CD31– subfracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: esquema Resumen de la preparación de las muestras previas a la clasificación de SP cardiaca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: protocolo para la inducción del linaje endotelial y diferenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: proliferación de ratón SP-CPC al plateado con una densidad baja de la célula con concentraciones distintas de suero en LN y FN (A y B) Estos paneles muestran el número de células en día 2. (C y D) Estos paneles muestran la viabilidad en el día 2. Los datos se muestran como la media ± el error estándar de la media (SEM); N = 5; diferentes pasajes; p < 0.05 por de Student t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: proliferación de ratón SP-CPC cuando plateado en una alta densidad celular con concentraciones distintas de suero en LN y FN (A y B) Estos paneles muestran el número de células en día 2. (C y D) estos paneles muestran la viabilidad en el día 2. Los datos se muestran como la media ± SEM; N = 5; diferentes pasajes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: morfología en 14 y 17 d durante el proceso de diferenciación de la célula. Esta figura muestra el campo claro (BF) imágenes del ratón SP-CPC sin semillas en platos LN o FN recubierto con un low (bajo) o una alta (High) densidad celular y con medio 2 h 20, seguido por medio 3 14 o 17 d. blanco círculos discontinuos marcan las zonas que contienen ingenio de células en forma de ronda h un tamaño más grande de la célula. La proyección de imagen se realizó con microscopio de campo brillante. Magnificación = 2 X; la barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: tubo de formación y vWF coloración después de diferenciación endotelial del SP-CPCs en LN y FN (A y B) Estos paneles muestran la formación del tubo. (C y D) Estos paneles muestran la coloración del vWF. Las células fueron sembradas en 10 μg/mL de platos recubiertos de LN o FN con una densidad celular baja o alta y media 2 h 20, seguidas de 3 medio durante 21 d, cosechadas con tripsina y sembradas en la matriz de la membrana del sótano. Todas las fotos fueron tomadas después de 16 h. La proyección de imagen se realizó con microscopio de campo brillante y la ampliación = 2 X para los paneles A y B. La proyección de imagen se realiza con microscopía fluorescente y la magnificación = 10 X para los paneles C y D. Paneles A y C muestran platos recubiertos de LN. Paneles B y D muestran platos recubiertos de FN. La barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: tubo de formación después de la diferenciación endotelial de rata CPCs. CPCs de rata fueron sembradas a una densidad celular baja en 10 μg/mL de platos recubiertos de LN o FN con medio de F12 que contiene FBS 0,1% de 20 h, seguido de otro d 21 en 3 medio y luego cosechó con tripsina. En la matriz de la membrana del sótano en una placa de 96 pocillos, 4 x 104 células fueron sembradas en 100 μL de medio de 3. La proyección de imagen se realizó con microscopio de campo brillante. Magnificación = 2 X; la barra de escala = 50 μm. Esta figura es modificada basado en un anterior estudio33. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Especies | Aislamiento, marcador de detección | Referencia |
| Humana, rata, ratón | /Lin c-kit+-, c-kit+/CD45-, c-kit+/CD45 /CD31–– | Beltrami, celular de 2003; Bolli, Lancet 2011; Ellison, celular de 2013; Smith, Nat Protoc 2014; Vicinanza, muerte celular difieren 2017 |
| Perros mestizo | Lin-, plus: c-kit+, MDR1+ o Sca-1+ | Linke, PNAS 2005 |
| Ratón | SCA-1+ | Oh, PNAS 2003 |
| Ratón | Población de lado, además de: Abcg2+, Sca-1+/CD31-, /PDGFRa de Sca-1++ | Hierlihy, FEBS Lett 2002; Martin, Dev Biol 2004; Pfister, Circ Res 2005; Noseda, Nat Commun 2015 |
| Ratón | Unidad de formación de Colonia - del fibroblasto, además: CD45-, CD31-, Sca-1+, PDGFRa+ | Pelekanos, vástago de la célula Res 2012 |
| Ratón, rata, humanos | ISL-1+ *, plus: CD31-, c-kit-, Sca-1-, Gata4+, Nkx2.5+ | Laugwitz, naturaleza 2005; Bu, Nature 2009 |
| * Isl-1 se encuentra en el miocardio embrionario o fetal, no en el corazón adulto. | ||
Tabla 1: Técnicas de aislamiento y los marcadores de las células progenitoras cardíacas.
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Discussion
Ventajas de este protocolo:
Este protocolo proporciona una técnica de diferenciación endotelial del CPCs. Hemos encontrado que una concentración baja del suero y densidad celular baja podrían mejorar la eficiencia de diferenciación endotelial, por el que LN demostró para ser un sustrato más adecuado que el FN en estas condiciones. Utilizamos dos tipos distintos de CPC: rata CPCs, que fueron utilizadas en una línea como forma de la célula y el ratón SP-CPC, que fueron aislados y ampliado. En particular, el protocolo era aplicable a ambos tipos de CPCs. corriente técnicas permiten a los científicos aislar y ampliar primarias CPCs de ratones modificados genéticamente y de modelos preclínicos de la enfermedad, así como de los seres humanos28,36. Usando este protocolo CPCs aislados podría ser útil para la investigación de los mecanismos no sólo de la enfermedad sino también para la exploración de nuevas dianas terapéuticas.
CPC está actualmente en ensayos clínicos para celular terapia4,5, por el que las células son aisladas de pacientes y trasplantados atrás después en vitro de amplificación. En este sentido, el protocolo que presentamos podría ayudar a identificar estrategias para mejorar el potencial de diferenciación de esto CPC antes del trasplante. Sin embargo, terapia celular sufre aún de eficacia limitada debido a la baja retención, supervivencia y engraftment de células trasplantadas. Mecanicista en vitro estudios basados en este protocolo y sus adaptaciones tienen el potencial para contribuir a una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que conduce el proceso de diferenciación-en particular, los mecanismos relacionados con la densidad celular , sustrato y factores de crecimiento. Nuevo conocimiento obtenido de estos estudios en última instancia, puede utilizarse para la reprogramación celular y aplica para influir directamente en residente CPCs para distinguir después de lesión.
Limitaciones del presente Protocolo:
CPCs primarias aisladas son poblaciones heterogéneas que muestran fenotipos diferentes con respecto al tamaño de la célula y tasa de crecimiento de la célula dependiendo del aislamiento, incluso cuando se utiliza los mismos marcadores y la técnica de aislamiento idéntico. Por lo tanto, es necesario definir los siguientes tres puntos: (1) el sembrador de celular los números según el tamaño de la célula, (2) la concentración ideal (< 0,5%) y (3) el tiempo de incubación para el primer paso (inducción de linaje) con una concentración muy baja del suero. Aquí, mostramos las diferencias en eficiencia de diferenciación dependiendo de la densidad celular. Sin embargo, aunque se compararon bajo del suero (0,1% FBS) versus las concentraciones séricas de cultura (3,5% FBS), no examinamos otras concentraciones en el < 0,5% rango de FBS. Además, dependiendo de los marcadores usados en el aislamiento y la especie, puede variar la eficacia de la inducción de compromiso de linaje. Por lo tanto, el protocolo debe ser optimizado para cada tipo de célula.
Técnicas de inhibición/inducción farmacológica y genética podrían ser utilizadas para examinar los mecanismos de la enfermedad con este protocolo, en vez de transgénicos o modelos animales de enfermedad. En este caso, el Protocolo debería ser rediseñado: antes del tratamiento con medio que contiene el suero de baja, las células serán tratadas con reactivos específicos o herramientas genéticas. Como consecuencia, las células pueden ser más vulnerables que las células no tratadas. Utilizando suero bajo en el primer paso es el punto clave de este protocolo. Por lo tanto, una validación cuidadosa del tiempo de incubación y concentración de suero para el primer paso frenar la proliferación de la célula manteniendo la viabilidad bajo privación de suero es fundamental si este protocolo puede ser un éxito o no.
Resumen:
En Resumen, CPCs aislados de los modelos animales proporcionan una herramienta valiosa para estudios cardiacos de la enfermedad y la regeneración. Expansión, CPCs humanos también pueden ser utilizados directamente para terapia celular. Nosotros, aquí, proporcionar un protocolo para la inducción del linaje endotelial eficiente y diferenciación de CPC basado en adaptaciones cuidadosa de las concentraciones de suero y densidad celular. La ventaja de este protocolo es su aplicabilidad a diferentes tipos de CPC y su potencial para contribuir con una base para el estudio de o el establecimiento de otras herramientas de la nueva regeneración cardiaca.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Vera Lorenz por su apoyo a útil durante los experimentos y el personal de la instalación de citometría de flujo del Departamento de Biomedicina (DBM), Universidad y Universidad Hospital de Basilea. Este trabajo fue apoyado por el estancia en pista programa de la Universidad de Basilea (Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster es apoyado por una beca de la Swiss National Science Foundation (grant número 310030_156953).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
| Thrombin | 0.0005 U/mL | All necessary components included in the kit | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | All necessary components included in the kit |
References
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- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
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